JP6637484B2 - 血小板を標的とするマイクロ流体細胞単離 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１４年８月７日に出願された米国特許仮出願第６２／０３４，５２２号の優先権を主張するものであり、その内容を参照により本明細書に援用する。

連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって認められた５−Ｕ０１−ＥＢ０１２４９３−０４号およびＥＢ００２５０３−０６Ａ１号のもとで、ならびにアメリカがん協会によって認められた１２５９２９−ＰＦ−１４−１３７−０１−ＣＣＥ号のもとで、米国政府の助成を受けて行われたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。

技術分野
本発明は、血液などの流体から有核細胞を単離することに関する。

背景技術
腫瘍細胞が原位置から離れた器官に拡がって増殖する転移は、癌のもっとも破壊的かつ致命的な属性であり、癌による死の９０％が転移によるものである。転移の生物学の体系的理解はまだ構築されていないが、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）の転移開始細胞としての重要性に関する認識が高まりつつあり、癌の進行の早期診断、特徴づけおよび監視のアクセス可能な情報源となる可能性がある。しかし、癌患者の血液からＣＴＣおよび他の有核細胞を確実に検出して非侵襲的に単離することは、存在自体が極めて稀（血球細胞１０億個以上に１個と非常に少ない）である上に、生物物理的および生化学的特性の不均一性もあって、依然として技術的に難しい。

サイズに関しては、ＣＴＣおよび他の希少な有核細胞は、僅か５〜８ミクロンというたとえば赤血球のサイズ、または８〜１８ミクロンというヒト白血球とほぼ同じサイズ、またはＣＴＣクラスターとしては１００ミクロン以上のサイズである。細胞表面の化学的特徴としては、一般的に陽性選択法で上皮細胞およびＣＴＣを標的とするのに広く用いられているバイオマーカーである上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）の発現は、臨床試料間で大きなばらつきを示しており、また癌が進行して上皮間葉転換（ＥＭＴ）が生ずると大幅に下方修正される場合もある。さらに、腫瘍細胞は、微小環境のホスト細胞、たとえば白血球や血小板などの血液細胞と、転移の発生中に能動的に相互作用するという報告もあり、ＣＴＣの検出および単離はますます難しくなり得る。

発明の概要
本開示は、循環性上皮細胞、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環性内皮細胞（ＣＥＣ）、循環性幹細胞（ＣＳＣ）、好中球、およびマクロファージなどの血小板関連有核標的細胞を、試料流体、たとえば血液、骨髄、各種浸出液、および腹水などの生物学的流体から、血小板に特異的に結合する結合部分を用いて単離する方法およびシステムを説明している。方法は、たとえばＣＴＣなどの血小板関連標的細胞を含む試料流体を、たとえば細胞捕捉チャンバなどのチャンバに、結合部分が試料中の任意の標的細胞、たとえばＣＴＣ、たとえば血小板被覆ＣＴＣに結合して複合体を形成できるような条件下で流すことと、次いでこれらの複合体から標的細胞を分離し回収し、そうすることで標的細胞を試料流体から単離することを含んでいる。

ある実施形態では、方法は、血小板を標的とする標的細胞の捕捉を達成するように設計されたシステム、たとえば１段または２段式マイクロ流体システムを用いて実施される。いくつかの実施形態では、まず、マイクロ流体減量デバイスで、流体、たとえば血液の試料から、遊離の未結合の血小板および赤血球（ＲＢＣ）を除去する処理をしてから、試料流体を細胞捕捉チャンバに流すことができる。減量デバイスは、流体力学的なサイズベースの選別を実施するための１つ以上のマイクロポスト・アレイを含み得る。こうして得られた標的細胞および白血球（ＷＢＣ）を含む試料流体は、次いで、ＣＴＣなどの血小板関連標的細胞を高処理能で捕捉できるように抗血小板抗体で官能化された細胞捕捉チャンバで処理され得る。いくつかの実施形態では、細胞捕捉チャンバは、試料流体中の任意の血小板関連標的細胞と血小板抗体との相互作用を高める混合構造を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような混合構造はいわゆる「ヘリンボーン」マイクロミキサーとして具現化される。

概して本開示は、本明細書で説明するようにして、血小板関連有核標的細胞、たとえば循環性上皮細胞、ＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＳＣ、好中球、およびマクロファージを試料流体から単離する方法を特徴とする。方法は、複数の結合部分を含む細胞捕捉チャンバを得ることであって、結合部分はチャンバの１つ以上の壁に結合しており、血小板に特異的に結合する、細胞捕捉チャンバを得ることと、結合部分が試料中の任意の血小板関連有核標的細胞に結合して複合体を形成する条件下で、試料流体を細胞捕捉チャンバに流すことと、複合体から標的細胞を分離し回収し、そうすることで試料流体から標的細胞を単離することを含んでいる。

いくつかの実装形態では、本明細書で説明する方法は、さらに、試料流体を細胞捕捉チャンバに流す前に試料流体を血小板阻害剤で処理することを含み得、血小板阻害剤は、未結合の血小板が他の細胞に接着するのを阻害する。たとえば、他の細胞は、血小板、赤血球、および／または白血球であり得る。様々な実装形態では、血小板阻害剤は、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール、アルガトロバン、および／またはプロスタグランジンＩ２であり得る。

本明細書で説明するどの実施形態でも、結合部分は、血小板に特異的に結合する抗体であり得る。

いくつかの実装形態では、方法は、さらに、試料流体を細胞捕捉チャンバに流す前に、試料流体中の血小板関連有核標的細胞は維持しつつ未結合の血小板を試料流体から選択的に減じることを含み得る。たとえば、血小板の減少は、決定論的横方向変位を実現するためにマイクロポスト・アレイを含むチャネルを含むマイクロ流体デバイス内で実施され得る。たとえば、マイクロポストは、複数の行で配置され得、各マイクロポストは、１行内では約３０〜約６０ミクロンの距離だけ、たとえば約３５ミクロン〜約５６ミクロンだけ互いに離間しており、次の行は前の行から約５ミクロン〜約１５ミクロンの距離だけ、たとえば約５．６ミクロン〜約９．０ミクロンだけ離間しており、各次の行のマイクロポストは、同じ行内のマイクロポスト間の間隔よりも小さい間隔だけ前の行のマイクロポストから横方向にオフセットしている。

他の実装形態では、血小板の減少は、マイクロ流体デバイス内で、遠心力もしくは慣性力またはその両方を用いて、あるいは密度勾配遠心分離により実施される。

いくつかの実施形態では、細胞捕捉チャンバとマイクロ流体デバイスは、両方１つの基板上に配置され得、または別々の基板上に配置され得、導管を介して流体接続されている。いくつかの実装形態では、細胞捕捉チャンバは、試料流体中に微小渦を生成するように配置された複数の山形構造を、内表面に含んでいる。

標的細胞を選択的に除去するように設計されているいくつかの実施形態では、結合部分は、結合対の第１のメンバーを含んでいるナノ構造体に結合しており、細胞捕捉チャンバの１つ以上の内表面は、結合対の複数の第２のメンバーで官能化されたゼラチンの層に結合しており、ナノ構造体は、結合対の第１のメンバーと第２のメンバーの結合相互作用によりゼラチンの最上層に結合している。これらの方法のいくつかの実装形態では、血小板関連有核標的細胞は、結合部分によりナノ構造体に結合しており、血小板関連有核標的細胞は、ゼラチンを高温で溶かすことでゼラチンからナノ構造体を放出させることにより単離される。あるいは、標的細胞は、ゼラチン層に局所的せん断応力をかけることで、または光標的光熱作用によりゼラチンからナノ構造体を放出させることにより単離される。

別の態様では、本開示は、ＣＴＣなどの血小板関連有核標的細胞を試料流体から単離するシステム、たとえば２段式マイクロ流体システムを特徴とする。これらのシステムは、第１のチャンバと、第２コンパートメントと、これら２つのコンパートメントを流体接続する導管を含んでいる。具体的には、導管は、第１のチャンバの産物出口を第２のチャンバの入口に流体接続している。

これらのシステムでは、第１コンパートメントは、入口と、廃棄物出口と、産物出口と、入口と各出口の間に配置されたマイクロポスト・アレイを有するマイクロチャネルを含んでおり、マイクロポストは複数行で配置され、赤血球および未結合の血小板が廃棄物出口へとデバイスを流れ、かつ血小板関連有核標的細胞をマイクロポスト・アレイによって産物出口へと横方向に変位させることができるような距離だけ互いに離間しており、各次の行のマイクロポストは、同じ行内のマイクロポスト間の間隔よりも小さい間隔だけ前の行のマイクロポストから横方向にオフセットしている。

第２のチャンバは、入口と出口を有するマイクロチャネルであって、該マイクロチャネル内を該入口から該出口へと流体が流れるマイクロチャネルと、試料流体中に微小渦を生成するために該マイクロチャネルの１つ以上の壁、床、および天井の内表面に画定され配置された複数の溝と、少なくとも１つの内表面に固定された結合部分であって、血小板に特異的に結合する結合部分を含んでいる。たとえば、結合部分は、血小板に特異的に結合する抗体であり得る。

これらのシステムの様々な実装形態では、各マイクロポストは、１行内では約３０〜約６０ミクロンの距離だけ、たとえば約３５ミクロン〜約５６ミクロンだけ互いに離間しており、次の行は前の行から約５ミクロン〜約１５ミクロンの距離だけ、たとえば約５．６ミクロン〜約９．０ミクロンだけ離間している。異なる実施形態では、第１のチャンバと第２のチャンバは、両方１つの基板上に配置されるか、または別々の基板上に配置されて導管を介して流体接続され得る。

いくつかの実施形態では、第２のチャンバの溝は、頂部と、Ｖ字型になるように頂部に接続された２本のアームを含んでおり、該溝は、試料流体がアームを通過して頂部へと流れるように配置されている。

これらのシステムのある実装形態では、結合部分は、結合対の第１のメンバーを含んでいるナノ構造体に結合しており、第２のチャンバの１つ以上の内表面は、結合対の複数の第２のメンバーで官能化されたゼラチンの層に結合しており、ナノ構造体は、結合対の第１のメンバーと第２のメンバーの結合相互作用によりゼラチンの最上層に結合している。

本明細書では、「結合部分」という用語は、粒子、分子、または細胞などの標的に接着できる任意の分子または剤を意味する。結合部分としては、たとえば、リガンド結合対のメンバー、抗体、アプタマー、または核酸分子が挙げられる。細胞表面の受容体または細胞表面マーカーなどの標的分子または剤に特異的に結合する結合部分もあれば、共通の特徴を持ち得る様々な標的に非特異的に結合する結合部分もある。

本明細書では、「特異的結合」という用語は、結合部分が、他の粒子や分子も含んでいる試料中の特定の粒子、分子、または細胞などの標的、たとえば細胞表面の分子に、選択的かつ優先的に結合することを意味する。

癌細胞の特殊な生物物理的および／または生化学的特性に依存する従来のＣＴＣ選別技法と比較すると、本明細書で説明する方法およびシステムは、癌転移中の能動的な細胞−細胞相互作用に焦点をあてるものであり、サイズ、癌の種類、または腫瘍表面抗原の発現レベルに制限されない。さらに重要なことには、本新規の方法およびシステムは、高い転移可能性と相関があるが他の技法で標的化することは難しい、ＣＴＣなどの有核標的細胞の非常に特殊な亜集団の単離を可能にするので、早期の癌診断のため、および癌の拡がり方についての理解を深めるために有益な情報を提供する。

具体的には、本明細書で説明する新規の方法およびシステムの１つの利点は、標的細胞の表面の特定のバイオマーカーに依存しないことである。現行の技法の多くは、陽性選択法で上皮細胞およびＣＴＣを標的とするのに広く用いられているバイオマーカーである上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）の発現に依存している。しかし、ＥｐＣＡＭの発現は、臨床試料間で大きなばらつきがあり、また癌が進行して上皮間葉転換（ＥＭＴ）が生ずると大幅に下方修正される場合もある。本方法およびシステムは、従来の方法のこの問題点を克服する。

特に断りがない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する業界の当業者が共通して理解する意味を有する。本明細書で説明するものと類似または均等の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、好適な方法および材料を以下に説明する。本明細書で言及するすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の資料は、その内容を参照により本明細書に援用するものとする。対立する場合には定義も含めて本明細書が優先する。また、材料、方法、および例はすべて説明のみを意図し、限定ではない。本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の詳細な説明で述べる。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および図面から、および請求項から明らかになろう。

血小板関連ＣＴＣを介する腫瘍転移の概略図である。 血小板を標的とするＣＴＣの捕捉を達成するように設計された２段式マイクロ流体プラットフォームの一実施形態の概略図である。 減量チップの一実施形態の概略図である。 減量チップのマイクロポスト・アレイの一実施形態の概略図である。 微小渦「ヘリンボーン」チップの一実施形態の概略図である。 図３の微小渦「ヘリンボーン」チップを流れる粒子、たとえば細胞または細胞クラスターの、流れパターンの一連の概略図である。 図３の微小渦「ヘリンボーン」チップを流れる粒子、たとえば細胞または細胞クラスターの、流れパターンの一連の概略図である。 図３の微小渦「ヘリンボーン」チップを流れる粒子、たとえば細胞または細胞クラスターの、流れパターンの一連の概略図である。 図３の微小渦「ヘリンボーン」チップを流れる粒子、たとえば細胞または細胞クラスターの、流れパターンの一連の概略図である。 ＥｐＣＡＭとＣＤ４１抗体を用いてそれぞれ捕捉された、転移肺癌患者の血液試料のＣＴＣ数を示すグラフである。 単細胞、１〜２個のＷＢＣのクラスター、および３個以上のＷＢＣのクラスターとしてのＣＴＣ数を示すグラフである。 ＥＤＴＡとプロスタグランジンＩ２を添加すると血小板−白血球凝集体の形成が減少したことを示すグラフである。 未処理（８Ａ）とプロスタグランジンＩ２処理（８Ｂ）の各血液試料の、微小渦「ヘリンボーン」チップ上で捕捉されたＷＢＣのヒートマップである。 未処理（８Ａ）とプロスタグランジンＩ２処理（８Ｂ）の各血液試料の、微小渦「ヘリンボーン」チップ上で捕捉されたＷＢＣのヒートマップである。

様々な図面の類似の参照符号は類似の要素を表す。
発明を実施する形態
図１Ａで概略的に示すように、腫瘍細胞と血小板との相互作用は、血液由来の転移にある役割を果たすと考えられている。もっとも強力な証拠として、いくつかの独立したマウス研究では、血小板を減じると転移が阻害され、血小板を元に戻すと転移の可能性も回復している。悪性腫瘍細胞が血小板を活性化して表面に凝集させる独自の能力は、腫瘍細胞誘発性血小板凝集（ＴＣＩＰＡ）というプロセスとして知られており、腫瘍にいくつか利点を与えて成功裏に転移させる。血小板は血管新生における血管リモデリング過程に貢献するだけでなく、血流中のせん断応力や免疫監視に対して腫瘍細胞を保護することにより、腫瘍細胞の生存率を大幅に上昇させることもある。

本明細書で説明する新規の方法およびシステムによると、多様な接着受容体を血小板表面に用いて、上皮細胞、ＣＴＣ、好中球、およびマクロファージなどの血小板関連有核標的細胞を、血液などの試料流体、たとえば全血から単離することができる。それに加えて、血小板と腫瘍細胞間のシグナル伝達に関する最近の研究では、血小板由来の増殖因子／サイトカインが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の誘発を補助し、さらに転移の可能性も高めていることが明らかになった。したがって、本新規の方法およびシステムは、高い転移の可能性をもつＣＴＣを単離することができ、したがって血小板と関連のない他のＣＴＣよりも優れた診断情報を提供できる。

試料流体から標的細胞−血小板クラスターを単離する方法
本方法およびシステムは、特定の有核標的細胞、たとえばＣＴＣと血小板との独特な相互作用を利用し、そのような標的細胞に関連する、たとえば標的細胞の表面に結合しているかたとえば被覆されている血小板を偏在性の細胞ベースのマーカーとして用いて、これらの標的細胞を標的とし血液などの試料流体、たとえば全血から単離する。

一般に、本新規の方法は、当該チャンバの１つ以上の壁に結合した複数の結合部分を含むチャンバであって、該結合部分は血小板に特異的に結合する、チャンバと、標的細胞（あれば）を含む試料流体を、試料中の任意の血小板関連標的細胞に結合部分が結合して複合体を形成できるような条件下で、チャンバに流すことと、複合体から標的細胞を分離し回収し、そうすることで標的細胞を試料流体から単離することを用いる。さらに、方法はまた、試料流体を細胞捕捉チャンバに流す前に、試料流体中の血小板関連標的細胞は維持しつつ未結合の血小板および／または赤血球（ＲＢＣ）などの他の汚染細胞を試料流体から選択的に減じるステップおよび／またはチャンバ内で混合して血小板と結合部分の接触を増大させるステップを含み得る。

ＴＣＩＰＡは、腫瘍細胞とホストである微小環境に固有の相互作用に端を発する一般的な現象なので、血小板を標的とする方法は、腫瘍の膜エピトープとは無関係の、血液由来の転移における多様な有核標的細胞を検出し単離する可能性を有している。

ＷＢＣ汚染を低下させ、かつＣＴＣ純度を上げるために、検査前に血液試料に血小板阻害剤を添加して血液を安定化させることができる。血液の安定化には、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール、アルガトロバン、およびプロスタグランジンＩ２などの様々な血小板阻害剤を用いることができる。特にＥＤＴＡとプロスタグランジンＩ２の組合せは血小板−白血球凝集（ＰＬＡ）の形成を有効に阻害し、血液試料中の汚染ＷＢＣ数を９０％低下させることができる。

血小板関連標的細胞に結合する結合部分
試料流体中の血小板に結合させるのに様々な結合部分を用いることができる。たとえば、ＣＤ４１およびＣＤ６１（インテグリンα２ｂβ３のサブユニット）、ＣＤ４２ｂおよびＣＤ４２ｃ（フォンヴィルブランド因子（νＷＦ）の主要な受容体）、グリコプロテインＶＩ（ＧＰ ＶＩ）（コラーゲン受容体）、ならびにトロンボポエチン受容体（ＴＰＯ−Ｒ）を含む様々な抗体が、異なる血小板表面受容体を標的とすることが知られている。なかでも抗ＣＤ４１抗体は、血小板の捕捉効率は高いが、非特異的結合性は低いため、有効に用いることができる。

結合部分は、ＰＤＭＳまたはガラス表面などの固体支持体上に、シラン化学反応などの様々な方法で官能化させることができる。アミン、アルデヒド、またはチオール末端基を有する異なるシラン前駆物質を酸素プラズマ処理したＰＤＭＳ／ガラス表面と架橋結合させることができ、これをさらに異なる結合部分に結合させてもよい。一具体例では、マイクロ流体チャネルとしての固体支持体を３−メルカプトプロピルトリメトキシシランで修飾した後、Ｎ−ｙ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステルをリンカーとして添加し、最後にニュートラアビジンと結合させる。次いで、ビオチン化血小板抗体などの任意のビオチン化結合部分を、アビジン−ビオチン化学反応により、デバイス上に容易に官能化させることができる。

結合部分を有するチャンバに試料流体を流す
表面の官能化後、デバイスは、典型的には、非特異的結合を防止するため、剤で、たとえば十分な量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、たとえば３％ＢＳＡでブロックされる。それから、特定量の、たとえば１〜１０ｍＬ、たとえば２、３、４、５、または６ｍＬの試料流体、たとえば血液、たとえば全血、またはバフィーコートをシステム内に流す。試料流体は、典型的には、１〜５ｍＬ／時、たとえば１、２、３、または４ｍＬ／時の流量で、たとえば０．０３〜０．１５ｐｓｉ、たとえば０．０５、０．０７５、または０．１ｐｓｉの設定圧力下で、室温で処理される。

試料流体を減量して未結合の血小板を除去する
全血中には血小板が豊富にあり（約１０^５／μＬ）、結合部分が飽和する効果も考えられるので、血液試料はまず、遊離の未結合の血小板を除去する処理をされ得る。それに加えて、赤血球（ＲＢＣ）の一部または大半を除去すると有益である。減量は、たとえば密度勾配遠心分離またはマイクロ流体ベースの細胞分離によりなされ得る。

密度勾配遠心分離は通常、ポリエステルゲルと密度勾配液と一緒に抗凝血剤を含むＣＰＴチューブに採取された血液試料に対して行う。遠心分離後、有核細胞を液面からピペットで注意深く回収して、赤血球や血小板の汚染を最小限にとどめることができる。

マイクロ流体ベースの血液減量は、当分野で知られている他の設計や技法でも実施可能である。たとえば、カーブしている、たとえば蛇行しているマイクロ流体チャネルで慣性力を利用して、遠心力もしくは慣性力により（たとえば慣性力により集中させる）、またはその両方（たとえば米国特許第８，８０７，８７９号を参照のこと）により、細胞を差動的に集めてサイズに基づき選別することができる。それに加えて、水泳動型濾過および／または音響定在波により異なるサイズの細胞を選別してもよい。

別の実装形態では、未結合の血小板は、マイクロ流体減量デバイスを用いて試料流体から除去され得る。そのようなデバイスは、後に詳述するが、流体力学的なサイズベースの選別を実施するように、１つ以上のマイクロポスト・アレイで構成され得る。一般に、これらのマイクロ流体減量デバイスは、流体力学的なサイズベースの選別により、全血の低せん断力のマイクロ流体減量を達成する。ＲＢＣ、血小板、および血漿タンパク質は廃棄されるが、有核細胞（ＷＢＣおよびＣＴＣ）は保持されて、第２段の標的細胞、たとえばＣＴＣの捕捉に供される。マイクロ流体減量の動作原理は、流体力学的なサイズ依存の決定論的横方向変位に基づき、細胞含有液と細胞非含有液を同時にマイクロポスト・アレイに流すと、直ちにサイズベースの分離が行われる（たとえば米国特許第８，９８６，９６６号および米国特許第８，５８５，９７１号を参照のこと）。Ｏｚｋｕｍｕｒらの“Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５（１７９）：１７９ｒａ４７（ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００５６１６）（２０１３）も参照されたい。

アレイの構成（マイクロポスト間の間隙またはスペース、および前後の行間のシフトを含む）および流量を最適化することにより、有核細胞の大半を維持しつつ、遊離の未結合の血小板を５ｌｏｇより多く減じることができる。有核標的細胞および白血球（ＷＢＣ）を含んだ流体産物は、次に、本明細書で説明するような血小板に特異的な結合部分を含むチャンバに送られる。

試料流体を混合して結合相互作用を高める
試料流体中の任意の血小板関連標的細胞とチャンバ内の結合部分との相互作用を高めるため、チャンバ内に混合構造を含めることができる。たとえばジグザグ、蛇行、または捩じれたチャネルを含む異なるチャネル構造設計を用いて、受動的混合を行うことができる。それに加えて、音響、圧力摂動、または誘電泳動技法による能動的なマイクロ混合を組み込んで混合性能をさらに高めることも可能である。

一つの便利な設計がいわゆる「ヘリンボーン」マイクロミキサーであり、ＣＴＣなどの血小板関連標的細胞を高処理能で捕捉できるように血小板抗体で官能化されたチャンバの内側の壁、床、または天井の１つ以上に含まれている（たとえばＰＣＴ出願２０１０／０３６９１２号を参照されたい）。一般に、１〜１０ｍＬの試料流体、たとえばバフィーコートまたは減量済み血液がシステム内に流される。試料流体を、継続的に揺すりながら、典型的には流量１〜２ｍＬ／時で、室温で、０．０３〜０．１５ｐｓｉ、たとえば０．０５、０．０７５、または０．１ｐｓｉで、デバイスで処理した。

チャンバで捕捉した標的細胞の処理
細胞捕捉デバイスで捕捉したすべての細胞は、たとえば染色アッセイ、たとえば４色染色アッセイにより特定する処理をして、標的細胞の特定と血小板の特徴づけを同時に行うことができる。腫瘍マーカー（たとえばＥｐＣＡＭ、サイトケラチン、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、カドヘリン−１１、および４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））陽性であり、また随意で造血マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１６など）陰性でもある捕捉細胞がＣＴＣとされる。本新規の方法を用いるとＣＴＣを確実に捕捉することができ、計数される個数は全血試料で０．４〜８．５ＣＴＣ／ｍＬの範囲である。別のマーカーにより、別の標的細胞を特定することもできる。たとえば、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、およびＣＤ３２６で上皮細胞を、ＣＤ１５、ＣＤ１６、およびＣＤ６６ｂで好中球を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、およびＣＤ１６３でマクロファージを検出することができる。それに加えて、ＣＤ３４およびＣＤ１４６で循環性内皮細胞（ＣＥＣ）を、ＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＡＬＤＨ１で循環性幹細胞（ＣＳＣ）を特定することができる。

従来技法を用いるマイクロ流体デバイス、たとえばＥｐＣＡＭ抗体などの抗上皮マーカー抗体で官能化されたデバイスでＣＴＣを捕捉すると、本発明の方法と比較して陽性ヒット数が一貫してより低い結果となる。後に実施例２で詳述するが、図５を見ると、本明細書で説明する細胞捕捉システムは、腫瘍起源が上皮（肺、***）でも非上皮（メラノーマ）でも転移癌患者のＣＴＣを単細胞としてまたはクラスターとして確実に捕捉する能力がある。血小板を標的とする本アプローチの方がＣＴＣ数が多いのは、一つには、上皮の性質を失っている可能性があるためＥｐＣＡＭ抗体などの抗上皮マーカー抗体ではさらに標的とし難くなっている肺腫瘍および他の種類の上皮腫瘍からＣＴＣを捕捉できるからである。

従来のＥｐＣＡＭを標的とするアプローチでは、通常、関連血小板が僅かしかないＣＴＣが得られるが、本明細書で説明する新規の方法で得られるＣＴＣは、血小板／フィブリンで完全に被覆された特殊なＣＴＣの亜集団を含む多様な血小板の被覆範囲を示す。これらの血小板被覆ＣＴＣは、血小板が腫瘍細胞の生存と増殖を増進するため、高い転移可能性を有する前駆物質であるという仮説があるが、腫瘍表面抗原を標的とする従来の陽性選択法で捕捉するのは極めて難しい。定量画像法により、ＣＴＣ表現型と血小板分布の相関関係をさらに調査することができる。発明者らのグループが最近開発した細胞放出制御ストラテジーと組み合わせれば、単細胞レベルの遺伝子型の研究ができる可能性もあり、癌転移についての知識が深まることが期待される。

本新規の方法により血小板関連ＣＴＣが捕捉されると、乳癌ＣＴＣは肺癌試料のプロトコルと同じプロトコルにより特定され得、メラノーマＣＴＣはメラノーマ特異的抗原を標的とする抗体または抗体カクテル（たとえば抗ＣＳＰＧ４、ＭＣＡＭ、ＴＹＲＰ１、およびα−ＳＭＡ抗体のいずれか１つ以上）で染色して特定される。

捕捉された標的細胞の選択的放出による精製
保存全血などの一部の試料流体では、本新規の方法により血小板関連標的細胞とともに単離される血小板関連ＷＢＣ細胞の大きな集団が存在し得る。

いくつかの実施形態では、本新規の方法は、結合部分を含むチャンバに結合したＣＴＣなどの標的細胞を選択的に放出するステップを含み得る。たとえば、国際出願公報２０１４／１２１２０４号で説明されているように、細胞捕捉チャンバは、結合対の第１のメンバーを自体が含むナノ構造体に結合した結合部分を含み得、チャンバの１つ以上の内表面は、結合対の複数の第２のメンバーで官能化されたゼラチンの層に結合しており、ナノ構造体は、結合対の第１のメンバーと第２のメンバーの結合相互作用によりゼラチンの最上層に結合している。標的細胞（それが関連している血小板により、ナノ構造体に結合している結合部分に結合している）は、次に、２つの放出機構のいずれかによりチャンバから放出され得る。

第１の放出機構では、ＣＴＣなどの標的細胞は、ゼラチンを高温で溶かすことでゼラチンからナノ構造体を放出させることにより、細胞捕捉チャンバから単離され除去され得る。温度を上げることで、たとえば３０℃を超えて、たとえば３７℃にすることで、捕捉された標的細胞はまとめて放出され得る。あるいは、第２の放出機構では、標的細胞は、局所的せん断応力をゼラチン層に加えることでゼラチンから放出され得る。ゼラチン中の局所的せん断応力を増加させることで、たとえば振動デバイス、たとえばＰＣＴ ＷＯ２０１４／１２１２０４号で説明されているような、たとえばマイクロチップ・デバイスを用いて、振動数制御された力を加えることで、単細胞が選択的に細胞捕捉チャンバから放出され得る。

単細胞としてのＣＴＣ（約５５％）に加えて、本新規の方法は、血小板を標的とするプラットフォームで、種々のサイズの細胞クラスターも単離する。実に４０％を超える捕捉されたＣＴＣがＣＴＣ／ＷＢＣクラスターの形態であった。図６を見ると、ＣＴＣの約３０％がＷＢＣ１〜２個とクラスターを形成し、ＣＴＣの約１５％がＷＢＣ３個以上とクラスターを形成したことがわかる。相互作用するＷＢＣの数は、ＣＴＣを囲む血小板の被覆範囲とともに増加した。このアプローチが単細胞ＣＴＣとＣＴＣ／ＷＢＣクラスターの両方を標的とする能力は、とくに、従来の親和性ベースの陽性または陰性の選択方法ではクラスターを単離することは極めて難しいので、非侵襲性血液バイオプシーによる癌転移の総合的な特徴づけを可能にしようし、また、特化された微小環境でＣＴＣ生存／増殖が向上する結果、ＣＴＣ培養などの下流の用途で新たな機会も開かれよう。

ＣＴＣ／ＷＢＣを単離する能力は、他の従来のＣＴＣ単離技法では失われるような細胞集団の単離をもたらす。たとえば、陰性選択ＣＴＣ単離技法は、抗体ベースの結合を利用し、磁性物質と接着したＷＢＣを標的とする。これらの方法では、ＷＢＣに特異的に結合するように磁性粒子を官能化し、これを流体試料に加えてから、この流体試料をマイクロ流体システムに流す。次いで流体試料は「偏向チャネル」に入って、磁性粒子およびそれらに結合した任意の細胞を特定の方向に偏向するように向けられた磁気勾配を受ける。１つ以上の磁性粒子に結合した標的細胞／粒子を含んだ流体試料が偏向チャネルに入ると、周りの磁石が発する磁力が磁性粒子（および付着した細胞／粒子）を磁気勾配の方向に引く。陰性選択ＣＴＣ単離の場合、この分離でＷＢＣはそれに付着した任意の他の細胞／粒子と一緒に「廃棄物」チャネルへと逸れていくので、非結合のＣＴＣを「産物」チャネルで単離できる。この方法では、磁性粒子に結合したＷＢＣに結合したＣＴＣがすべて廃棄物チャネルへと失われる。

本明細書で説明する２段式マイクロ流体プラットフォームには、上述したような問題がない。

標的細胞を試料流体から単離するマイクロ流体システム
上述したように、ＣＴＣなどの血小板関連有核標的細胞を試料流体から単離する方法は、当該チャンバの１つ以上の壁、床、および／または天井に結合した複数の結合部分を含む細胞捕捉チャンバを用い、結合部分は血小板に特異的に結合する。標的細胞を含む流体試料は、結合部分が試料中の任意の血小板関連標的細胞と結合して複合体を形成できるような条件下で、チャンバに流される。この処理は、ＣＴＣなどの標的細胞を複合体から分離し回収し、そうすることで標的細胞を試料流体から単離することを可能にする。さらに、図１Ｂに示すように、システムは、試料流体を細胞捕捉チャンバ（第２段１２０）に流す前に、血小板関連ＣＴＣは試料流体中に維持しつつ未結合の血小板および他の細胞、たとえば赤血球（ＲＢＣ）を試料流体から選択的に減じる上流コンポーネント（第１段１１０）を含み得る。

図１Ｂに示すように、システムへの入力流体は全血１３０であり得る。第１段１１０は、未結合の血小板および他の細胞、たとえばＲＢＣ１４０を有核細胞（１５０）から分離し、それは血小板を標的とする捕捉チャンバ（１２０）に入るまでシステム内で続く。

第１段 赤血球および血小板を試料流体から除去する減量デバイス
システム全体は、第１段として減量デバイス２００を含み得、これはたとえば、より小さい血小板およびＲＢＣは廃棄物としてデバイスから出ていくが、より大きいＷＢＣおよびＣＴＣおよび細胞クラスターは細胞捕捉チャンバである第２段に入ることを可能にする流体力学的なサイズベースの選別により、全血からＲＢＣおよび遊離血小板を除去するための、１つ以上のマイクロポスト・アレイで構成される、マイクロ流体デバイスである。

図２Ａに示すように、第１段のシステムは、１つのチップ２００上に製造され得る。いくつかの実施形態では、チップは入口２０２と、１つ以上のマイクロポスト・アレイ２０５（この図では２つ）と、出口２０３を含み得る。

図２Ｂに示すように、システムの第１段は、サイズ、形状、または変形性に基づき粒子を選択的に通過させるマイクロポスト・アレイ２０５を用いて細胞を分離する流体力学的選別デバイスであり得る。マイクロポスト・アレイ内のスペースのサイズ、形状、または変形性が、アレイを通過できる細胞の種類を決定する。２つ以上のマイクロポスト・アレイを直列または並列に配置して、たとえば、よりサイズが大きい細胞を続けて除去できる。そのようなマイクロ流体システムの説明は、たとえば米国特許第８，９８６，９６６号、米国特許第８，５８５，９７１号および前掲のＯｚｋｕｍｕｒら（２０１３）を参照されたい。

本明細書で説明するデバイスでは、様々なマイクロポスト２１０のサイズ、幾何形状、および配置を用いることができる。マイクロポストの異なる形状、たとえば、断面が円形、正方形、長方形、楕円、または三角形のマイクロポストを使用できる。マイクロポスト間の間隙２２０のサイズ、およびマイクロポストの形状は、分離が速やかに効率よく行われるように最適化され得る。たとえば、ＲＢＣのサイズの範囲はおよそ５〜８μｍであり、血小板のサイズの範囲はおよそ１〜３μｍである。すべてのＷＢＣのサイズは１０μｍよりも大きい。このような寸法を考慮すると、マイクロポスト間の間隙が大きいと、ＲＢＣと血小板がアレイを通過する速度は上がるが、ＷＢＣを失うリスクも高まる。間隙のサイズが小さいと、ＷＢＣをより効率よく捕捉できるのは確かだが、ＲＢＣと血小板の通過速度は落ちる。用途のタイプによって異なる幾何形状を用いることができる。この方法では、マイクロポストの直径は約１０〜３０μｍ、たとえば約１５〜２４μｍ、たとえば１０、１２、１５、１７、２０、２２、２４、２５、または２７μｍが便利である。マイクロポスト間の間隙またはスペースは、約１０〜４０μｍ、たとえば２０〜３２μｍ、たとえば１５、２０、２５、３０、３５、または４０μｍが効果的である。

マイクロポスト・アレイは様々な方法で製造できる。たとえば、マイクロポスト・アレイは、成形、電鋳、エッチング、またはガラス、金属、もしくはポリマーなどの基板の穴あけにより形成できる。たとえば、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）ソフトリソグラフィ、ポリマー鋳造（たとえばエポキシ、アクリル樹脂、またはウレタンを用いる）、射出成形、ポリマー熱エンボス加工、レーザーマイクロ加工、薄膜表面のマイクロ加工、ガラスとシリコン両方のディープエッチング、電鋳、およびステレオリソグラフィなどの３−Ｄ製造技法のような簡単なマイクロ製造技法により、本明細書で説明するデバイスのチャネルおよびマイクロポスト・アレイを製造できる。これらの製法のほとんどで、マイクロ要素の複製にフォトマスクを用いる。

要素のサイズが５μｍよりも大きい場合、トランスペアレンシーベースのエマルジョンマスクが使用できる。要素のサイズが２〜５μｍの場合はガラスベースのクロムフォトマスクが必要であり得る。さらに小さい要素では、ガラスベースの電子ビーム直接描画マスクが使用できる。マスクは次に、シリコンまたはガラスの場合はエッチング用のフォトレジストパターンを決定するか、またはたとえばＳＵ−８フォトレジストを用いてネガティブのレプリカを決定するのに使用され、このレプリカは、次にＰＤＭＳ、エポキシ、およびアクリル樹脂のような高分子材料のレプリカ成形マスターとして使用され得る。次に、製造されたチャネルをガラスのような硬い基板に接着して、デバイスを完成させることができる。当分野では他の製造方法も知られており、本明細書で説明するデバイスは、単一の材料で製造することも複数の材料を組み合わせて製造することもできる。

具体的な第１段流体力学的選別チップを設計して、シリコンウエハに深堀り反応性イオンエッチングした。陽極接合したガラスカバーでチップを密封して、マイクロ流体減量コンポーネントを形成した。特製のポリカーボネート製マニフォールドで、基板と第２段細胞捕捉チャンバとの流体接続部を形成した。

第２段 細胞捕捉チャンバ
様々な実施形態で、細胞捕捉チャンバは、１つ以上の壁および／または床が血小板結合部分で官能化されている単純なマイクロ流体チャネルであるか、またはより複雑な、試料流体中の血小板関連ＣＴＣが血小板結合部分と接触する回数を増やすための混合構造を含むものであり得る。

図３に示すように、細胞捕捉チャンバは、血小板関連ＣＴＣを高処理能で捕捉するために、抗血小板抗体で官能化された、微小渦を生成する「ヘリンボーン」チャンバ（または「チップ」）として形成され得る（たとえばＰＣＴ出願公報ＷＯ２０１０／０３６９１２号を参照のこと）。この実施形態では、チャンバはマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルとして形成され、チャネルを流れる流体の流れパターンを造るために該マイクロチャネルの壁に食い込んでいる溝（または壁から張り出している突起）が形成されており、流体中に懸濁されている任意の細胞と該チャネルの壁の内表面との相互作用を促進する。相互作用が増えるとチャネル内で捕捉されるＣＴＣの数も増えるので、マイクロ流体デバイスの全体的な捕捉効率も高くなる。この実施形態では、マイクロ流体デバイスの捕捉効率は、チャネル内で捕捉されたＣＴＣ数とチャネルを流れた細胞総数の比として定義されている。

効率は、たとえば、デバイス基板材料、チャネルおよび溝の寸法などを含むマイクロ流体デバイスの構造要素、ならびに粒子タイプおよび粒子が懸濁されている流体のタイプに基づく流量などの流体流パラメータを調整することにより、さらに高めることができる。

図３を参照すると、ソフトリソグラフィ技法で製造されたそのようなマイクロ流体デバイスの一例が説明されている。以下に説明するように、マイクロチャネルの壁、床、および／または天井の１つ以上に溝を形成することと、マイクロチャネルの壁、床、および／または天井の内表面に血小板結合部分をコーティングすることと、試料流体をマイクロチャネルに流すことにより、血小板関連ＣＴＣが細胞捕捉チャンバのマイクロチャネル内で捕捉される。

図３は、デバイス３００のチャネル３１５の上部壁（または天井）に食い込んでいる溝３３５、３４０を有するマイクロ流体デバイス３００を例示している。いくつかの実施形態では、細胞捕捉チャンバは、チャネル３１５の壁に食い込んでいる溝ではなく、壁から外向きに張り出している突起（たとえばＶ字型の突起）を含んでいる。いくつかの実施形態では、対称的な溝３３５は、２本のアームを含んでおり、アームはそれぞれ、第１の端部３５０から頂部３４５までの長さ、第２の端部３５５から頂部３４５までの長さに亘っている。例示の実施形態では、２本のアーム間の角度αは９０°である。いくつかの実施形態では、アーム間の角度αは、１０°〜１７０°の範囲である。いくつかの実装形態では、マイクロ流体デバイス３００は、下部基板３１０に接合された上部基板３０５を含み得、これらの基板はそれぞれ適切な材料で製造され得る。たとえば、上部基板３０５は、たとえばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのエラストマーで製造され得、下部基板は、ガラス、ＰＤＭＳ、または別のエラストマーで製造され得る。

あるいは、またはそれに加えて、基板は、たとえばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）などのプラスチックで製造され得る。一般に、上部基板と下部基板を製造するのに選択される材料は、製造しやすく、たとえばエッチングしやすく、試験が容易にできるような光学特性を提供でき、たとえば光学的に明瞭であり得、また基板に接着した細胞に有害な影響がないように非毒性であり得る。それに加えて、自発蛍光がまったくないか、またはほとんどない材料が好ましい。さらに、材料は、基板に分析対象物が接着できるように容易に官能化できる材料であり得る。さらに、材料は、マイクロ流体デバイス３００に強度を提供できるように、機械的強さのある材料であり得る。上部基板３０５は、以下に説明するように、マイクロチャネルが間に形成された状態で、下部基板３１０にしっかりと固定され得る。

いくつかの実装形態では、マイクロチャネル３１５は、上部基板３０５に形成された２つの側壁３２０、３２５と、上部壁３３０を含む長方形断面を有し得る。たとえば「上部」や「下部」などの相対的な位置を表す用語は、説明の便宜上使用するものであり、諸要素の必須の相対位置ではなく、図中の位置を指している。たとえば、デバイスは、溝がチャネルの底表面にくるような、またはチャネルの中心軸線が垂直方向に延びるような向きにできる。あるいは、マイクロチャネル３１５の断面は、限定ではないが、三角形、台形、半月形などを含むいくつかの形状のうちの１つであり得る。下部基板３１０は、上部基板３０５に接合されると、マイクロチャネル３１５の下部壁を形成できる。いくつかの実装形態では、マイクロチャネル３１５は、マイクロチャネル３１５の上部壁３３０に形成された複数の溝３３５を含んでいる。あるいは、溝３３５は、マイクロチャネル３１５の壁のうちのいずれかに、および／または１つ以上の壁に形成され得る。溝３３５は、壁の全長に亘り得、または壁の一部分だけに亘り得る。

図４Ａ〜４Ｄは、平坦な壁を有するマイクロチャネルを流れる粒子懸濁液と、壁に溝が形成された別のマイクロチャネルを流れる粒子懸濁液とを例示する概略図である。図４Ａは、長方形断面を有するマイクロチャネル４０５を含んでいるマイクロ流体デバイス４００を示している。マイクロチャネル４０５の壁は、マイクロ流体デバイス３００を参照して説明したような溝を含んでおらず、すなわち壁表面は平坦である。流体中に懸濁された血小板関連標的細胞４２５を含んでいる粒子懸濁液がマイクロチャネル４０５を流れる様子が例示されている。これに対して、図４Ｂは、マイクロ流体デバイス３００を流れる同様の懸濁液を示している。

マイクロチャネル３１５内で溝３３５をコラム状に配置することで形成されたヘリンボーンパターンを流体が流れるとき、流体の流路にある溝３３５は流体の流れを乱す。いくつかの実施形態では、流速と溝の寸法に応じて、具体的には、たとえば溝のサイズおよび溝の２本のアーム間の角度に応じて、流体流の乱れが流体中の微小渦の生成につながる。微小渦が生成されるのは、溝が、流体が流れる主要な方向すなわち軸線方向を横切る方向に、流体流を誘導するからである。いくつかの実施形態では、微小渦は生成されないが、溝３３５、３４０は、流体の一部の流路を変更させるのに十分な乱れを誘発して、壁−粒子相互作用を増加させる。

溝なしでは、図４Ｃに示すように、流体中に懸濁されている血小板関連標的細胞４２５は、平坦なマイクロチャネル４０５内をほぼ直線的に通過するので、おそらくは流れ野の端部付近の（たとえばマイクロチャネル４０５の壁にぴったりと接する）粒子４２５しかマイクロチャネル２０５の壁に結合した抗体と相互作用しない。これに対して、図４Ｄに示すように、ヘリンボーン溝パターンを通過する血小板関連標的細胞４２５の流路は、流体中の微小渦により乱されるので、細胞と壁および／または溝に結合した抗体との相互作用の数は増加する。微小渦は、マイクロ流体デバイス３００の上部壁３３０に形成された各溝３３５の構造要素に影響される。

第２段ヘリンボーンチップは、前述したようにソフトリソグラフィ技法を用いて、ガラス基板に接合されたＰＤＭＳで作製され得る。次に、チップ表面は、アビジン−ビオチン化学反応を利用して抗ＣＤ４１抗体（Ａｂｃａｍ社）で官能化され得る。

第１段流体力学的選別チップと第２段ヘリンボーンチップは、１つのチップ上に製造され得、または別々のチップとして製造されて、プラスチックまたは他の管などの導管により接続され得る。

実施例
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、それらの実施例は請求項で説明する本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ 臨床試料からのＣＴＣ単離
本方法を試験して、異なる種類の癌からＣＴＣを単離する有効性を判定した。

施設内審査委員会（ＩＲＢ）により承認されたプロトコルにしたがって、進行肺癌、乳癌、およびメラノーマ癌の患者を集めた。検体はすべて、抗凝血剤ＥＤＴＡが入ったバキュテナー（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）チューブに採取して、血液採取から４時間以内にマイクロ流体チップで処理した。テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール、アルガトロバンおよびプロスタグランジンＩ２などの追加の血小板阻害剤は、血液採取の直後に添加した。固定された血液試料を直接Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ（登録商標）ＢＣＴチューブ（Ｓｔｒｅｃｋ社）内に収集した。

上述した２段式マイクロ流体システムに試料を供した。具体的には、第１段流体力学的選別チップは、シリコンウエハに深堀り反応性イオンエッチングして製造した。陽極接合したガラスカバーでチップを密封して、マイクロ流体チャンバを形成した。特製のポリカーボネート製マニフォールドで、このマイクロチップに流体接続部を形成した。試験したのは２つの異なるアレイ構成で、マイクロポスト間の間隙は２０μｍか３２μｍであった。２０μｍの間隙を有するアレイは、汚染ＲＢＣは最小限で有核細胞を実質的に全部保持するが、２１μｍよりも大きい細胞は遮断されるので、大径のＣＴＣまたはＣＴＣクラスターを失う可能性がある。これに対して、３２μｍの間隙を有するアレイは、８〜３０μｍと、より広い細胞の動作範囲を有するが、ＷＢＣは６０％しか保持しない。３２μｍの間隙のアレイで失った細胞は、報告されているＣＴＣサイズよりも小さい顆粒球とリンパ球だったので、このアレイをＣＴＣ単離システムとして選択した。

第２段ヘリンボーンチップを、前述したようにソフトリソグラフィ技法を用いて、ガラス基板に接合されたＰＤＭＳで作製した。チップ表面は、アビジン−ビオチン化学反応を利用して抗ＣＤ４１抗体（Ａｂｃａｍ社）で官能化した。

結果を、ＥｐＣＡＭとＣＤ４１抗体によりそれぞれ捕捉された転移肺癌患者の３２例の血液試料のＣＴＣ数を示すグラフ（左側）として図５に示す。チップ上の捕捉細胞はすべて、４色染色アッセイで処理して、ＣＴＣの特定と血小板の特徴づけを同時に行った。腫瘍マーカー（ＥｐＣＡＭ、カドヘリン−１１）およびＤＡＰＩ陽性であり、かつ造血マーカー（ＣＤ４５）陰性だった捕捉細胞がＣＴＣとされた。３２例中２１例（６６％）で信頼性のあるＣＴＣ捕捉が達成され、計数した個数は０．４〜８．５ＣＴＣ／ｍＬの範囲であった。

これと比較して、同時進行の、ＥｐＣＡＭ抗体で官能化したマイクロ流体デバイスでのＣＴＣ捕捉は、一貫して低い陽性ヒット数を示した（図５の右側）。血小板を標的とするアプローチのほうが高いＣＴＣ数であったのは、上皮の性質を失っている可能性があるためＥｐＣＡＭ抗体では標的とし難い肺ＣＴＣを捕捉する本方法の能力による。

血小板をＣＤ６１抗体で染色して、ＣＴＣ表面での分布を特徴づけた。本新規のシステムにより捕捉されたＣＴＣは、血小板／フィブリンで完全に被覆されたＣＴＣの亜集団を含む、広範な血小板被覆を示している。これらの血小板被覆ＣＴＣは、血小板が腫瘍細胞の生存と増殖を増進するため、高い転移可能性を有する前駆物質であるという仮説があるが、腫瘍表面抗原を標的とする従来の陽性選択法で捕捉するのは極めて難しい。したがって、本新規のシステムおよび方法は、これらのＣＴＣを捕捉するための新規の改良された技法を提供する。

実施例２ 異なる癌種の単離
マイクロ流体プラットフォームを、癌種が異なる患者、つまり腫瘍起源が上皮（***）の癌患者と非上皮（メラノーマ）の癌患者のＣＴＣ単離にも用いた。***ＣＴＣは、肺癌患者試料のプロトコルと同じプロトコルにより特定し、メラノーマＣＴＣは、先に報告したように、メラノーマ特異的抗原を標的とする抗体カクテル（ＣＳＰＧ４、ＭＣＡＭ、ＴＹＲＰ１、およびα−ＳＭＡ）で染色した。予備調査結果では、どちらの癌種でも信頼性のあるＣＴＣ捕捉が示されている（乳癌試料では５例中３例、計数した個数は０．９〜２．７ＣＴＣ／ｍＬの範囲であり、メラノーマ試料では６例中５例、計数した個数は１．４〜１７ＣＴＣ／ｍＬの範囲）。肺癌での結果と同様に、本アプローチで捕捉されたＣＴＣはすべて、様々な程度の血小板被覆と関連がある。

上述したように、肺ＣＴＣおよび***ＣＴＣは、上皮および間葉マーカーとしてＥｐＣＡＭ／カドヘリン−１１（緑）により特定し、メラノーマＣＴＣは、ＣＳＰＧ４、ＭＣＡＭ、ＴＹＲＰ１、およびα−ＳＭＡ（緑）抗体のカクテルで染色した。ＷＢＣと血小板はそれぞれＣＤ４５（赤）とＣＤ６１（金色）で染色した。顕微鏡画像では、各種のＣＴＣが捕捉されたことが明瞭に示された（結果は図示せず）。

このように、試験したシステムは、腫瘍起源が上皮（肺、***）でも非上皮（メラノーマ）でも、単細胞またはクラスターとして転移癌患者から確実にＣＴＣを捕捉する能力がある。これらの結果は、血小板を標的とするＣＴＣ捕捉は、複数の癌種に有効であることを示している。

実施例３ 抗凝血剤とＣＴＣ純度
血小板を標的とするアプローチの性能を制限し得る主な問題は、ＣＴＣの純度が他の技法と比べて相対的に低いことである。大量の汚染ＷＢＣ（＞１０^５／ｍＬ）がチップ上で観察されており、下流の解析が非常に困難になる。血小板特異的抗体での染色によると、捕捉されたＷＢＣの大半に血小板被覆もみられた。これらのいわゆる血小板−白血球凝集体（ＰＬＡ）の形成は、血小板の自発的な活性化から始まり、次いでｐ−セレクチンが発現し、これが白血球表面のＰＳＧＬ−１受容体に結合する。ＰＬＡはサイズベースの選別では除去されないが、抗血小板抗体により血小板関連ＣＴＣとともに捕捉される。

ＷＢＣ汚染を低下させ、かつＣＴＣ純度を上げるために、血液の安定化のためテオフィリン、アデノシン、ジピリダモール、アルガトロバンおよびプロスタグランジンＩ２などの様々な血小板阻害剤を試した。ＥｐＣＡＭベースの捕捉を対照として用いて、血液試料１ｍＬあたりのＷＢＣ数を評価した。これらの結果を図７の左側のコラムに示す。ＥｐＣＡＭベースの捕捉の結果は、ＷＢＣ汚染は概して少ないが、同ＣＴＣ単離法には上述したようないくつかの欠点がある。様々な血小板阻害剤を用いて血小板ベースの捕捉を試験した結果を図７の右側のコラムに示す（塗りつぶした丸は未処理試料を表す）。ＥＤＴＡとプロスタグランジンＩ２の組合せ（グラフでは白抜きの三角形として示す）がＰＬＡ形成の阻害に有効であることが見出され、汚染ＷＢＣの数も９０％減少していた（図７）。

ＰＬＡ形成を完全に阻害するために、処理の２４時間前に、血液試料をＣｙｔｏ−Ｃｈｅｘ（登録商標）ＢＣＴチューブ内で固定したところ、血小板ベースの捕捉で最高のＣＴＣ純度が得られた。これらの試料を「固定血液」と呼んだ（白抜きの丸）。

図８Ａおよび図８Ｂは、マイクロ流体デバイス上の相対位置にマッピングされた個々の捕捉されたＷＢＣ（黒い斑点）を含む、マイクロ流体デバイスのヒートマップを示している。未処理血液試料では、デバイス入口に位置する捕捉された細胞の大半には、強い減衰パターンがあり、表面血小板を介してＷＢＣとＣＤ４１抗体の特異的相互作用があったことが示唆された（図８Ａ）。これに対して、プロスタグランジンＩ２で処理した血液試料のヒートマップは、デバイス全体にランダムに分布しているより少ない捕捉細胞を示した（図８Ｂ）。

さらに、市販の血液安定化液（たとえばＳｔｒｅｃｋ社のＣｙｔｏ−Ｃｈｅｘ（登録商標）ＢＣＴチューブ）で血液試料を徐々に固定することにより、血小板が完全に不活性化されるので、処理中のＰＬＡ形成をほぼ抑制でき、ＣＴＣ純度が大幅に改善され、一般的なＥｐＣＡＭを標的とする捕捉に匹敵するほどになる。ＴＣＩＰＡは生体内条件下で生じており、血小板関連凝集体は血液採取以前に既に形成されていたので、これらの研究ではＣＴＣの捕捉に影響はなかった。

血小板−ＷＢＣ凝集体についてのこの解決策により、血小板を標的とするＣＴＣの捕捉を達成するように設計された２段式マイクロ流体プラットフォームの結果が改善される。

他の実施形態
本発明の実施形態をいくつか説明してきたが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことが可能であると理解されよう。したがって、他の実施形態も以下の請求項の範囲内とする。

Claims (28)

1. 血小板関連有核標的細胞を試料流体から単離する方法であって、
   未結合の血小板が他の細胞に接着するのを阻害する血小板阻害剤で、試料流体を処理することと、
   複数の結合部分を含む細胞捕捉チャンバを得ることであって、前記結合部分は前記チャンバの１つ以上の壁に結合しており、血小板に特異的に結合する、細胞捕捉チャンバを得ることと、
   前記結合部分が試料流体中の任意の血小板関連有核標的細胞に結合して複合体を形成する条件下で、処理された前記試料流体を前記細胞捕捉チャンバに流すことと、
   前記複合体から血小板関連有核標的細胞を分離し回収し、そうすることで前記試料流体から血小板関連有核標的細胞を単離することを含む、方法。
2. 前記血小板関連有核標的細胞には、循環性上皮細胞、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環性内皮細胞（ＣＥＣ）、循環性幹細胞（ＣＳＣ）、好中球、およびマクロファージのうちのいずれか１つ以上が含まれる、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料流体には、生物学的流体が含まれる、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記他の細胞には、血小板、赤血球、および白血球が含まれる、請求項１に記載の方法。
5. 前記血小板阻害剤には、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール、アルガトロバン、またはプロスタグランジンＩ２が含まれる、請求項１に記載の方法。
6. 前記結合部分は、血小板に特異的に結合する抗体を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. さらに、前記試料流体を前記細胞捕捉チャンバに流す前に、前記試料流体中の血小板関連有核標的細胞は維持しつつ、未結合の血小板を前記試料流体から選択的に減じることを含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記血小板の減少は、決定論的横方向変位を実現するためにマイクロポスト・アレイを含むチャネルを含むマイクロ流体デバイス内で実施される、請求項７に記載の方法。
9. 前記マイクロポストは、複数の行で配置され、１行内では約３０〜約６０ミクロンの距離だけ、たとえば約３５ミクロン〜約５６ミクロンだけ互いに離間しており、次の行は前の行から約５ミクロン〜約１５ミクロンの距離だけ、たとえば約５．６ミクロン〜約９．０ミクロンだけ離間しており、各次の行のマイクロポストは、同じ行内のマイクロポスト間の間隔よりも小さい間隔だけ前の行のマイクロポストから横方向にオフセットしている、請求項８に記載の方法。
10. 前記血小板の減少は、マイクロ流体デバイス内で遠心力もしくは慣性力またはその両方を用いて実施される、請求項７に記載の方法。
11. 前記血小板の減少は、密度勾配遠心分離により実施される、請求項７に記載の方法。
12. 前記細胞捕捉チャンバと前記マイクロ流体デバイスの両方が１つの基板上に配置される、請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記細胞捕捉チャンバと前記マイクロ流体デバイスは、別々の基板上に配置されて、導管を介して流体接続される、請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記細胞捕捉チャンバは、前記試料流体中に微小渦を生成するように配置された複数の山形構造を、内表面に含む、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記結合部分は、結合対の第１のメンバーを含んでいるナノ構造体に結合しており、前記細胞捕捉チャンバの１つ以上の内表面は、前記結合対の複数の第２のメンバーで官能化されたゼラチンの層に結合しており、前記ナノ構造体は、前記結合対の第１のメンバーと第２のメンバーの結合相互作用により前記ゼラチンの最上層に結合している、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記血小板関連有核標的細胞は、前記結合部分により前記ナノ構造体に結合しており、前記血小板関連有核標的細胞は、前記ゼラチンを高温で溶かすことで前記ゼラチンから前記ナノ構造体を放出させることにより単離される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記血小板関連有核標的細胞は、前記結合部分により前記ナノ構造体に結合しており、前記血小板関連有核標的細胞は、前記ゼラチン層に局所的せん断応力をかけることで、前記ゼラチンから前記ナノ構造体を放出させることにより単離される、請求項１５に記載の方法。
18. 前記血小板関連有核標的細胞は、前記結合部分により前記ナノ構造体に結合しており、前記血小板関連有核標的細胞は、光標的光熱作用により前記ゼラチンからナノ構造体を放出させることにより単離される、請求項１５に記載の方法。
19. 前記血小板関連有核標的細胞は、循環性腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）である、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記生物学的流体には、血液、骨髄、各種浸出液、または腹水が含まれる、請求項３から請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記生物学的流体には、血液が含まれる、請求項３から請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
22. 血小板関連有核標的細胞を試料流体から単離する２段式マイクロ流体システムであって、当該システムは、
    第１のチャンバであって、
    入口と、廃棄物出口と、産物出口を有するマイクロチャネルと、
    前記入口と前記廃棄物出口および前記産物出口との間に配置されたマイクロポスト・アレイを含んでおり、前記マイクロポストは複数行で配置され、赤血球および未結合の血小板が前記廃棄物出口へと前記デバイスを流れ、かつ血小板関連有核標的細胞を前記マイクロポスト・アレイによって前記産物出口へと横方向に変位させることができるような距離だけ互いに離間しており、各次の行のマイクロポストは、同じ行内のマイクロポスト間の間隔よりも小さい間隔だけ前の行のマイクロポストから横方向にオフセットしている、第１のチャンバと、
    第２のチャンバであって、
    入口と出口を有するマイクロチャネルであって、前記マイクロチャネル内を前記入口から前記出口へと試料流体が流れるマイクロチャネルと、前記試料流体中に微小渦を生成するために前記マイクロチャネルの１つ以上の壁、床、および天井の内表面に画定され配置された複数の溝と、前記マイクロチャネルの少なくとも１つの前記内表面に固定された結合部分であって、血小板に特異的に結合する、結合部分を含んでいる、第２のチャンバと、
    前記第１のチャンバの前記産物出口を、前記第２のチャンバの前記入口に流体接続する導管を含んでいる、システム。
23. 前記マイクロポストは、１行内では約３０ミクロン〜約６０ミクロンの距離だけ、たとえば約３５ミクロン〜約５６ミクロンだけ互いに離間しており、次の行は前の行から約５ミクロン〜約１５ミクロンの距離だけ、たとえば約５．６ミクロン〜約９．０ミクロンだけ離間している、請求項２２に記載のシステム。
24. 前記第１のチャンバと前記第２のチャンバの両方が１つの基板上に配置される、請求項２２および請求項２３のいずれか１項に記載のシステム。
25. 前記第１のチャンバと前記第２のチャンバは、別々の基板上に配置されて、前記導管を介して流体接続される、請求項２２および請求項２３のいずれか１項に記載のシステム。
26. 前記溝は、頂部と、Ｖ字型になるように前記頂部に接続された２本のアームを含み、前記溝は、前記試料流体が前記アームを通過して前記頂部へと流れるように配置される、請求項２２から請求項２５のいずれか１項に記載のシステム。
27. 前記結合部分は、結合対の第１のメンバーを含んでいるナノ構造体に結合しており、前記第２のチャンバの１つ以上の内表面は、前記結合対の複数の第２のメンバーで官能化されたゼラチンの層に結合しており、前記ナノ構造体は、前記結合対の第１のメンバーと第２のメンバーの結合相互作用により前記ゼラチンの最上層に結合している、請求項２２から請求項２６のいずれか１項に記載のシステム。
28. 前記結合部分は、血小板に特異的に結合する抗体を含んでいる、請求項２２から請求項２７のいずれか１項に記載のシステム。