JP6518110B2 - クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiellapneumoniae)を検出するためのプライマー及び方法 - Google Patents
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiellapneumoniae)を検出するためのプライマー及び方法 Download PDFInfo
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Description
(1)等温核酸増幅法によってクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)を検出するためのプライマーセットであって、
該セットが、標的配列である、配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入を含む塩基配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、下記の(a)及び(b)のプライマーを含み、かつ、下記の(c)〜(e)のプライマーのいずれか一つ以上を含む、プライマーセット:
(a)プライマーの3’末端側にF2配列を含み、5’末端側にF1c配列を含むプライマー;
(b)プライマーの3’末端側にR2配列を含み、5’末端側にR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むプライマー;
(c)前記標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含むプライマー及び/又は前記標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含むプライマー;
(d)F3配列を含むプライマー;
(e)R3配列を含むプライマー。
(2)等温核酸増幅法が、LAMP法又はSmartAmp法である、(1)に記載のプライマーセット。
(3)(a)のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列、又は配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列である、(1)又は(2)に記載のプライマーセット。
(4)(a)のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号12若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号12若しくは13によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列である、(3)に記載のプライマーセット。
(5)(b)のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号3によって表される塩基配列、又は配列番号3によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列である、(1)〜(4)のいずれかに記載のプライマーセット。
(6)(b)のプライマーにおいて、折り返し配列が、配列番号8若しくは9によって表される塩基配列、又は配列番号8若しくは9によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列である、(1)〜(5)のいずれかに記載のプライマーセット。
(7)(c)のプライマーが、配列番号4若しくは7によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは7によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載のプライマーセット。
(8)(d)のプライマーにおいて、F3配列が配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列である、(1)〜(7)のいずれかに記載のプライマーセット。
(9)(e)のプライマーにおいて、R3配列が配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列である、(1)〜(8)のいずれかに記載のプライマーセット。
(10)(1)に記載の(a)〜(e)のプライマーにおいて、F1c配列、F2配列、R1c配列又は折り返し配列、R2配列、配列A、B、C、又はD、F3配列、及びR3配列の組合せが、以下の表の組合せ1〜17のいずれかである、(1)又は(2)に記載のプライマーセット。
(12)(1)〜(10)のいずれかに記載のプライマーセットを用いて等温核酸増幅法によりサンプル由来の核酸を増幅する工程、及び増幅産物の量又は存在を測定する工程を含む、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)の検出方法。
(13)等温核酸増幅法がLAMP法又はSmartAmp法である、(12)に記載の方法。
(14)配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)を特異的に検出する方法。
(15)前記核酸を増幅する工程を含む、(14)に記載の方法。
(16)増幅を等温核酸増幅法により行う、(14)又は(15)に記載の方法。
一態様において、本発明は、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae、以下、「K.pneumoniae」とも称する)を検出するためのプライマーセットに関する。本発明において、K.pneumoniaeを検出するための標的配列は、特に配列番号1によって表される、K.pneumoniaeのhemolysinをコードするDNA配列である。
一態様において、本発明は、上記標的配列から設計されたプライマー又はプライマーセットに関する。例えば、本発明は、上記標的配列の一部と同一又は相補的な塩基配列を含むか若しくはからなるプライマー、又は該プライマーを二種以上含むプライマーセットに関する。
配列番号Xによって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された塩基配列;
配列番号Xによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列;
配列番号Xに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列(特に配列番号Xによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列);或いは
配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号X(ただし配列番号Xが配列番号8又は9である場合を除く)によって表される塩基配列と、配列番号Xによって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列
に置き換えられてもよい。これらの塩基配列については、(a)〜(e)のプライマーに関して説明した通りである。
一態様において、本発明は、本発明のプライマー又はプライマーセットを含む、K.pneumoniaeを検出するためのキットに関する。本発明のキットは、上記プライマー又はプライマーセットに加えて、例えば、バッファー、酵素、及び/又は使用説明書等を含んでもよい。
一態様において、本発明は、上記標的配列、例えば配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)を特異的に検出する方法に関する。特に、該方法は、該核酸を増幅する工程を含み、増幅は等温核酸増幅法により行われるのが好ましいが、PCR法等の公知の核酸増幅法により行ってもよい。ここで、該部分配列は、例えば、配列番号1の配列の連続する少なくとも50塩基、60塩基、70塩基、80塩基、90塩基、又は100塩基を含む塩基配列、例えば配列番号1の1番目〜350番目の塩基配列、1番目〜300番目の塩基配列、1番目〜250番目の塩基配列、1番目〜200番目の塩基配列、好ましくは1番目〜150番目の塩基配列、特に好ましくは9番目〜127番目の塩基配列、又はこれらの配列において、1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入を含む塩基配列を含む、又はからなるものであってよい。
配列番号2の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー;
配列番号10の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー;
配列番号11の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー;を使用することができる。
本発明の方法は、設計したプライマー、DNAポリメラーゼ、増幅しようとする標的遺伝子を含むサンプル、及びバッファーを混合する工程、並びに該混合物をインキュベーションする工程を含む。この方法により、遺伝子増幅反応が進行し、増幅産物を得ることができる。
高い特異性を有するプライマーを取得するため、本発明者らは、まずK. pneumoniaeのhemolysin遺伝子と、K. pneumoniaeの近縁種(14種)のhemolysin遺伝子の塩基配列を、Genetyx(株式会社ゼネティックス)を用いて比較した。比較を行った生物種と、そのhemolysinの配列のAccession numberを以下の表3に示す。
以下の方法に従って、設計した各プライマーにより、K. pneumoniae由来精製DNAを等温核酸増幅が可能か、リアルタイム蛍光測定法により評価した。
1)試料
K. pneumoniae(ATCC 13883)培養液から、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて、添付の取り扱い説明書に従ってDNAを精製し、精製DNAを鋳型として等温核酸増幅反応を実施した。
以下の表4に示す反応溶液25 μL中に、各50 μMに調製したプライマーをTP(Turn back Primer)、FP(Folding Primer)、FIP(Foward Inner Primer)、BIP(Back Inner Primer)の場合は1.6 μL、BP(Boost Primer)、LP(Loop Primer)の場合は0.8 μL、OF(Outer Foward primer)、OR(Outer Reverse Primer)、F3プライマー、及びB3プライマーの場合は0.1 μL添加した。
以下の表5に示すプライマーを用いた。本実施例で用いた各プライマーは、以下の表5に示す配列のみからなる。例えば、組合せ1において、TPは5'末端側のターンバック部及び3'末端側のアニール部からなり、ターンバック部は配列番号12からなり、アニール部は配列番号2からなる。同様に、組合せ1において、FPは5'末端側のフォールディング部及び3'末端側のアニール部からなり、フォールディング部は配列番号8からなり、アニール部は配列番号3からなる。同様に、組合せ1において、BPは配列番号4からなる。表5に示す他の組合せ2〜18についても同様である。
表5に示したように、プライマー組合せ1〜17にて60℃において、60分以内で増幅反応が確認された。SmartAmp法による増幅反応においては、プライマーとしてTP及びFPのみを用いた場合には増幅が検出されなかったが(比較例1、組合せ18)、TP及びFPに加えてBP、OF、及びORのいずれか1種以上があれば、増幅反応が生じることを確認した(組合せ1〜17)。また、5種全てのプライマーを使用した場合、速い増幅反応が確認された(例えば、組合せ4〜8及び10等)。
以下の方法に従って、設計したプライマーの検出感度を評価した。
1)試料
実施例1と同様の方法により精製したK. pneumoniae (ATCC 13883)精製DNAを段階的に希釈し、鋳型として増幅反応を実施した。
すなわち、K. pneumoniaeのゲノムDNAが約6fg/copyであることを考慮して、実施例1の方法で得られた精製DNA溶液(60ng/μl)を段階的に(10倍ずつ)希釈し、各鋳型DNA濃度(100〜104copy/μL)となるように調製を行った。
表5に記載した、組合せ4のプライマーセット(TP(ターンバック部:配列番号12、アニール部:配列番号2)、FP(フォールディング部:配列番号8、アニール部:配列番号3)、BP(配列番号4)、OF(配列番号5)、OR(配列番号6))を用いて増幅反応を実施した。反応溶液の組成及び増幅反応の条件は、実施例2に従った。
増幅反応は、ブロックインキュベータMiniT100H(Hangzhou Allsheng Instruments)を用い、60℃、60分間にて実施した。増幅の評価は、特開2013-247968に記載の核酸目視検出法に従って、反応後の溶液に1 μLの核酸検出試薬(0.1%ゲンチアナバイオレットB/2.0%亜硫酸ナトリウム/1.2%βシクロデキストリン/40%エタノール)を加え、溶液の色調変化から核酸増幅の有無を解析することにより行った。
プライマー組合せ4にて等温下60分以内で、102 copy相当以上の鋳型DNAが含まれる反応液で増幅反応が生じたことを示す青色を呈した(図2、D)。また、増幅反応前の溶液(データ示さず)及び鋳型DNAを含まない反応溶液(図2、A)においては、色調変化は確認されなかった。以上より、設計したプライマーセットを用いれば、特別な解析装置や煩雑な菌体前処理を必要とせずに、102 copy相当のK. pneumoniaeに由来するDNAを検出することができることが明らかとなった。
K. pneumoniae菌体懸濁液から直接核酸を増幅することが可能であるか、また、その増幅が菌種に特異的なものであるか検討した。
1)試料
ヒツジ血液寒天培地にて37℃、24時間培養したK. pneumoniae(ATCC 13883)、Klebsiella oxytoca、Escherichia coli、Enterobacter cloacae、Citrobacter spp.、及びSeratia marcescensのコロニーを10 μLの蒸留水に懸濁し、懸濁液1μLを鋳型として増幅反応を実施した。対照として、菌体懸濁液を含まない反応溶液も作成した。
表5に記載した、組合せ4のプライマーセット(TP(ターンバック部:配列番号12、アニール部:配列番号2)、FP(フォールディング部:配列番号8、アニール部:配列番号3)、BP(配列番号4)、OF(配列番号5)、OR(配列番号6))を用いて増幅反応を実施した。以下の表6に示す反応溶液25 μL中に、各50 μMに調製したプライマーをTP、FPは1.6 μL、BPは0.8 μL、OF、ORは0.1 μL添加した。
Claims (6)
- 等温核酸増幅法によってクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)を検出するためのプライマーセットであって、
該セットが、標的配列である、配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入を含む塩基配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、下記の(a)及び(b)のプライマーを含み、かつ、下記の(c)〜(e)のプライマーのいずれか一つ以上を含み:
(a)プライマーの3’末端側にF2配列を含み、5’末端側にF1c配列を含むプライマー;
(b)プライマーの3’末端側にR2配列を含み、5’末端側にR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むプライマー;
(c)前記標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含むプライマー及び/又は前記標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含むプライマー;
(d)F3配列を含むプライマー;
(e)R3配列を含むプライマー;かつ、
(a)のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列、又は配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列であり、
(a)のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号12若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号12若しくは13によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列であり、
(b)のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号3によって表される塩基配列、又は配列番号3によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列であり、
(b)のプライマーにおいて、折り返し配列が、配列番号8若しくは9によって表される塩基配列、又は配列番号8若しくは9によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列であり、
(c)のプライマーが、配列番号4若しくは7によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは7によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列を含み、
(d)のプライマーにおいて、F3配列が配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列であり、
(e)のプライマーにおいて、R3配列が配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び/若しくは挿入された配列である、プライマーセット。 - 等温核酸増幅法が、LAMP法又はSmartAmp法である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)を検出するためのキット。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて等温核酸増幅法によりサンプル由来の核酸を増幅する工程、及び増幅産物の量又は存在を測定する工程を含む、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)の検出方法。
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