JP2007075017A

JP2007075017A - Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出法

Info

Publication number: JP2007075017A
Application number: JP2005267757A
Authority: JP
Inventors: Takayoshi Momota; 隆祥百田
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2007-03-29

Abstract

【課題】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉを特異的、高感度かつ迅速に検出する方法を提供すること。
【解決手段】
ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅を検出することによるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法、並びにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出用キット。
【選択図】
なし

Description

本発明は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法に関し、さらに詳しくは遺伝子の、高感度な検出法を利用したＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ感染症の診断方法に関するものである。

カンピロバクターは感染型の食中毒細菌で、病原因子は確定されていないが、主たる病態は組織侵入性であると考えられている。「カンピロバクター」という名前はギリシャ語の「湾曲した桿菌」の意で、コイル状らせん型をした桿菌である。大きさは１．５〜５×０．２〜０．５μｍのグラム陰性桿菌で、１本の鞭毛が一極あるいは両極にあり、コルクスクリュー様に運動する。大気中では生育できず、酸素濃度が３〜１５％の微好気性環境で発育し生存する。

初めて分離されたカンピロバクターはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓで、１９１３年に牛の流産胎児から発見された。その形態から最初はビブリオ属として扱われていたが、１９３１年にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉが、１９４８年にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉがそれぞれ動物の腸炎から分離され、１９６３年にカンピロバクター属としてビブリオ属から独立した。

カンピロバクターがヒトに対し病原性があることが確認されたのは１９７２年であり歴史が浅い。１９７７年にスキローが開発した選択分離培地（スキロー寒天）により、便からの分離が容易となり、感染性腸炎の原因菌として広く認知されるに至った。日本では１９８２年にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉとＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉが食中毒原因菌に指定され、さらに２００３年に感染症法の中で定点把握の５類感染症の感染性胃腸炎の原因菌の一つとなった。

それゆえ、カンピロバクター食中毒が疑われる場合には２４時間以内に最寄の保健所に届けることが義務付けられている。しかし、カンピロバクター食中毒は潜伏期間は２〜１０日と比較的長く、その間に原因食品が消費あるいは廃棄されているケースが多いこと、少数菌でも感染が成立すること、通常の大気中では死滅しやすいことなどの理由より、感染源の特定は極めて困難なのが現状である。

腸炎の場合、感染源として肉類が重要であり、特に鶏肉からは高率に分離され、かつ報告事例も多い。また、汚染した鶏肉を調理した器具を洗浄せずに生野菜を調理して、生野菜へ二次汚染した例も確認されている。その一方、河川水中では比較的長期間生存でき、このため、井戸水の汚染で大規模に発生することもある。

先進国で多い炎症性の腸炎では、急性の腹痛と鮮血・粘液・白血球を含む水様性下痢が２、３日続き、前駆症状として発熱を起こす例も多い。まれに下痢発病の１〜２週間後にギランバレー症候群という重度の末梢神経炎を起こすことがある。通常の場合自然治癒するが、重症例では対処療法と化学療法が必要になる。

第一選択薬剤はエリスロマイシン等のマクロライド系薬剤である。セフェム系薬剤には自然耐性であり、ニューキノロン系薬剤に対しては耐性化が進んでいるので注意が必要となる。

カンピロバクターの標準的な検査法は分離培養法である。感染源を特定するには食材が、診断には便検体が使用される。他の多くの食中毒菌の検査と同様、分離培養法には直接分離培養法と増菌培養を加えた分離培養法がある。

増菌培養を加えた分離培養法を例にとると、前処理した食材を増菌培地で微好気下で４２℃・１日培養した後、選択分離用培地に接種、微好気下で４２℃・２日培養する。その後、カンピロバクターと疑わしいコロニーを位相差顕微鏡、あるいは暗視野顕微鏡により、形態観察、およびその運動性を調べる。それらの結果、カンピロバクターと疑われるコロニーを、選択剤を含まない血液寒天培地で純粋培養し、生化学性状を調べて同定を行う。

しかし、増菌から分離、同定するには５日程度の日数を必要とすることから、迅速性を図る目的でＰＣＲ法等の遺伝子診断技術が導入されつつある（非特許文献１）。このように、カンピロバクターの検査においてＰＣＲ法は迅速性の高い方法として認知されているが、さらなる迅速性と感度の向上、かつ簡便な遺伝子検出法が必要とされている。

本発明者らは、現在知られている方法、分離培養法やＰＣＲ法より迅速であり、高感度で特異的かつ簡便な検出方法、すなわちＬＡＭＰ法を用いることで、本発明の目的を達成できた。

Ｄ．Ｋ．Ｗｉｎｔｅｒｓ，ｅｔ．ａｌ．， "ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ"１１：２６７−２７１（１９９７）

本発明は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ感染の検査のために、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉを検出させることを目的とする。また、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉによって汚染した食材中、また調理器具上のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの有無を検査することも目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子配列を増幅することで、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）配列番号１で示されるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の塩基配列の、１９９番〜４３０番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（２）ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の塩基配列から選ばれた配列番号２〜９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む（１）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（３）ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする（１）〜（２）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
（４）ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子に特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１）〜（３）記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号６の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号７の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
（５）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法。
（６）ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする（５）記載のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法。
（７）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅの有無を検出することを特徴とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法。
（８）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法において、（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。

本発明により、特異的、高感度かつ迅速にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉを検出できる。以下、本発明を詳細に説明する。

核酸増幅によるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの同定の検体としては、臨床検査材料、たとえば培養した菌体、糞便、吐瀉物、尿、血液、組織など、また食品材料や拭き取り検体でも良い。

これら糞便、吐瀉物、尿、血液、組織等の臨床検体材料、又は食品材料や拭き取り検体をＬＡＭＰ法の試料に用いるには、タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後、フェノール及びクロロホルムを用いた方法等一般的なＤＮＡ抽出・精製法はもちろん、既に市販されている抽出キット（例えばキアゲン社のＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅＫｉｔや、Ｇｅｎｔｒａ社のＰｕｒｅＧｅｎｅＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉｔ等）を用いて得られた抽出核酸を検体とする。もしくは、迅速な検出のため、未精製の状態のままの試料処理液を検体として使用できる場合も含む。

このような生体由来の核酸を増幅するためには、近年、納富らが開発した、ＰＣＲ法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（特許公報国際公開第００／２８０８２号パンフレット）で達成できる。

このＬＡＭＰ法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。

また、ＬＡＭＰ法では、プライマーの３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度にかつ特異性の高い核酸増幅反応を可能にしている。

ＬＡＭＰ法の核酸増幅で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計６領域、すなわち３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって、各々インナープライマーＦ及びＢ、アウタープライマーＦ及びＢと呼ぶ。また、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補的な塩基配列をＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の相補的な塩基配列をＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃとそれぞれ呼ぶ。

インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」及び「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下ＩＰＦ）、そして「Ｂ２より選ばれた塩基配列」と「Ｂ１ｃより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下ＩＰＢ）と呼ぶ。インナープライマーは、「Ｆ２より選ばれた塩基配列」と「Ｆ１ｃより選ばれた塩基配列」の間、あるいは「Ｂ２より選ばれた塩基配列」と「Ｂ１ｃより選ばれた塩基配列」の間に、塩基数０〜５０の任意の塩基配列を持っても良い。

一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「Ｆ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下ＯＰＦ）、「Ｂ３より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下ＯＰＢ）と呼ぶ。

ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方Ｂとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。

ＬＡＭＰ法の核酸増幅においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いることができる。ループプライマー（ＬｏｏｐＰｒｉｍｅｒ）は、ダンベル構造の５’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（特許文献国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。

ループプライマーの塩基配列は、上述のダンベル構造の５’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは１種類でも２種類でも良い。

本発明者らは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉに由来する塩基配列より、配列番号１で示されるＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の塩基配列から、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの特異的な塩基配列を迅速に増幅できるＬＡＭＰ法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、下記のプライマーセットを選定した。

ＩＰＦ：5'-AAGCACTAGCTAGCTGATTATCGACTAAAGATGAGCAAGGAGAAG-3' （配列番号１０）
ＯＰＦ：5'-TTAAGTGCAGCCTGTGAA-3' （配列番号４）
ＩＰＢ：5'-AGAGAATATATGCAAGGGCCTTTCATCTTTGCGTTGCATAGGAG-3' （配列番号１１）
ＯＰＢ：5'-GAGCATTTTCTTCAAGAGCA-3' （配列番号１２）
ＬＰＦ：5'-CGCCTAAACCTATAGCTC-3' （配列番号１３）
ＬＰＢ：5'-CCGAACAAGGCTATCAAA-3' （配列番号９）

核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。

ＬＡＭＰ法による核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特許文献特開２００１−２４２１６９号公報）を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。

また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼で確認できる程度に白濁する。したがって、反応中の濁度上昇経過や反応終了後の濁度を光学的に観察できる分光光度計等の測定機器を用いて確認することも可能である（特許文献国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。

本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

実施例１．検出感度の確認
ＬＡＭＰ法と、ＰＣＲ法の検出感度の比較を行った。

１．試料及び試薬の調製
（１）試料の調製
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ６５３２株を血液寒天培地を用い微好気条件下で培養した。増殖したコロニーを滅菌した綿棒で採取後、生理食塩水中に懸濁し、６２０ｎｍでの吸光度からマクファーランド１に調製して３×１０^８ｃｆｕ／ｍＬの菌懸濁液を作成し、その後にＴＥ緩衝液（ニッポンジーン社製）で２５倍希釈して１．２×１０^７ｃｆｕ／ｍＬの菌懸濁液を調製した。該懸濁液を１０倍ずつＴＥ緩衝液で段階的に希釈を行い、９５℃・５分間加熱処理したものを鋳型ＤＮＡを含む検体として用いた。

（２）ＰＣＲ法に用いるプライマーと方法
ＰＣＲ法はＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子をターゲットとするＤ．Ｋ．Ｗｉｎｔｅｒｓらが開発したｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法、つまり上流側プライマー（配列番号１４）と同下流側プライマー（配列番号１６）で反応後、その産物を用いて再度上流側プライマー（配列番号１４）と同下流側プライマー（配列番号１５）で反応を行う方法を用いた。

（３）ＬＡＭＰ法に用いるプライマー
プライマーとしてＩＰＦ（配列番号１０）、ＯＰＦ（配列番号４）、ＩＰＢ（配列番号１１）、ＯＰＢ（配列番号１２）、ＬＰＦ（配列番号１３）、ＬＰＢ（配列番号９）を用いた。

２．核酸増幅法による反応
（１）ＰＣＲ法による反応
ＰＣＲ反応は、非特許文献１に記載の方法で行った。
＜１ｓｔＰＣＲの反応溶液組成及び反応条件＞
１反応あたり各試薬が下記になるよう調製した。
・１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０２．５μＬ
・１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ２．５μＬ
・２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ_２２．０μＬ
・１００ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ０．５μＬ
・１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００５．０μＬ
・２．５ｍＭｄＮＴＰｓｍｉｘｔｕｒｅ４．０μＬ
・ｄＤＷ（滅菌超純水）２８．１７μＬ
・１００ｐｍｏｌ／μＬＣ−１（配列番号１４）０．１４μＬ
・１００ｐｍｏｌ／μＬＣ−４（配列番号１６）０．１４μＬ
・５Ｕ／μＬＴａＫａＲａＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．０５μＬ

反応溶液に各希釈段階の検体５．０μＬを加え、最終反応液量５０．０μＬとして各ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の温度サイクル条件は、９５℃３分静置後、熱変性９５℃１分、アニーリング５６℃１分、ポリメラーゼ伸長反応７２℃１分を１サイクルとして計２４サイクル行い、最後に７２℃１分間静置後、反応を終了した。所要時間は約２時間であった。

＜２ｎｄＰＣＲの反応溶液組成及び反応条件＞
１反応あたり各試薬が下記になるよう調製した。
・１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０２．５μＬ
・１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ２．５μＬ
・２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ_２２．０μＬ
・１００ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ０．５μＬ
・１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００５．０μＬ
・２．５ｍＭｄＮＴＰｓｍｉｘｔｕｒｅ４．０μＬ
・ｄＤＷ（滅菌超純粋）３２．１７μＬ
・１００ｐｍｏｌ／μＬＣ−１（配列番号１４）０．１４μＬ
・１００ｐｍｏｌ／μＬＣ−２（配列番号１５）０．１４μＬ
・５Ｕ／μＬＴａＫａＲａＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．０５μＬ

反応溶液に１ｓｔＰＣＲの産物１．０μＬを加え、最終反応液量５０．０μＬとして各ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の温度サイクル条件は、９５℃３分静置後、熱変性９５℃１分、アニーリング５３℃１分、ポリメラーゼ伸長反応７２℃１分を１サイクルとして計２４サイクル行い、最後に７２℃１分間静置後、反応を終了した。所要時間は約２時間であった。反応終了後の反応溶液２μＬを２％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色した。

（２）ＬＡＭＰ法による反応
ＬＡＭＰ法による増幅のため、最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。なお、プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）精製したものを使用した。

反応溶液組成
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８
１０ｍＭＫＣｌ
８ｍＭＭｇＳＯ_４
１．４ｍＭｄＮＴＰｓ
１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
０．８ＭＢｅｔａｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
１．６μＭＩＰＦ
１．６μＭＩＰＢ
０．４μＭＯＰＦ
０．４μＭＯＰＢ
０．８μＭＬＰＦ
０．８μＭＬＰＢ
８ＵＢｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）

ＬＡＭＰ反応は上記試薬２０μＬに、各濃度の試料溶液５μＬを加え、最終反応溶液２５μＬとして、０．２ｍＬの専用チューブ内で６５℃で６０分間、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学）を用いて、リアルタイムに反応を検出した。図１に示したように、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉを６ｃｆｕ／ｔｅｓｔまで希釈したものまで６０分以内に検出することが可能であった。比較として行ったｎｅｓｔｅｄＰＣＲは、６ｃｆｕ／ｔｅｓｔまで希釈したものまで検出可能であった（図２）。検出感度はＬＡＭＰ法とｎｅｓｔｅｄＰＣＲで同等であったが、１ｓｔＰＣＲと２ｎｄＰＣＲで合計約４時間の増幅反応とさらに電気泳動分析が必要なｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法と比較して、迅速性でＬＡＭＰ法が優れていた。

実施例２．プライマーの評価（特異性試験）
表１に示したＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ１６株、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉ２株及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓ１株は血液寒天培地を用い微好気条件下で培養した。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、生理食塩水中に懸濁し、６２０ｎｍでの吸光度により、各菌体濃度を１．２×１０^６ｃｆｕ／ｍＬになるように調製した。該懸濁液を９５℃・５分間加熱処理したものを鋳型ＤＮＡを含む検体として用いた。

また、表２に示した非カンピロバクター属菌３７菌種３７株は血液寒天培地を用い好気条件下で培養した。ただし、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉは微好気条件下で培養し、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属はＢＣＹＥα寒天培地で培養した。増殖した各菌体のコロニーを滅菌した綿棒で採取後、生理食塩水中に懸濁し、６２０ｎｍでの吸光度により、菌体濃度を測定した。それぞれ一定量の菌体量（２×１０^９ｃｅｌｌｓ）から、ＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（キアゲン社製）を用い、キット能書記載の操作でＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸光度により濃度を測定し、すべての菌種由来のＤＮＡを２ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調製し、検体として用いた。

なお、核酸増幅法は実施例１に準じて行った。

表１に示すように、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ１６株全てにおいて陽性になり、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉ２株及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓ１株は陰性となった。また、表２に示した非カンピロバクター属菌３７菌種３７株は全てにおいて陰性となった。ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ法においても同様の成績が得られ、特異性では両法とも同じ結果だった。

本発明によれば、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法によりＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉに特異的な塩基配列を増幅することで、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉを特異的、高感度かつ迅速に検出することができる。

リアルタイム濁度法によるＬＡＭＰ法の検出感度を示す。横軸は時間（分）、縦軸は６５０ｎｍでの吸光度（濁度）である。

ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法による検出感度を示す電気泳動図。

符号の説明

レーン１：マーカー（TaKaRa 100bp Ladder Marker）
レーン２：６×１０^４ｃｆｕ／ｔｅｓｔ
レーン３：６×１０^３ｃｆｕ／ｔｅｓｔ
レーン４：６×１０^２ｃｆｕ／ｔｅｓｔ
レーン５：６×１０^１ｃｆｕ／ｔｅｓｔ
レーン６：６×１０^０ｃｆｕ／ｔｅｓｔ
レーン７：ＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ

Claims

配列番号１で示されるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の塩基配列の、１９９番〜４３０番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列、又はそれらと相補的な塩基配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の塩基配列から選ばれた配列番号２〜９で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する１５塩基を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の標的核酸上の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという塩基配列領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補的塩基配列をＦ３、Ｆ２、Ｆ１、そしてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃとしたときに、以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜２記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のＦ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のＦ３領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のＢ２領域を３’末端側に有し、５’末端側に標的核酸のＢ１ｃ領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のＢ３領域を有する塩基配列。
ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子に特異的な塩基配列を増幅でき、５’末端から３’末端に向かい以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）５’−（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号３の塩基配列）−３’。
（ｂ）５’−（配列番号６の塩基配列）−（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）−（配列番号７の塩基配列に相補的な塩基配列）−３’。
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法。
ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の標的核酸領域の増幅反応がＬＡＭＰ法であることを特徴とする請求項５記載のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法。
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子の標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉのＯｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅの有無を検出することを特徴とするＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法。
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出方法において、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。