JP3059435B1 - cAMPおよびアデニル酸シクラ―ゼの酵素的蛍光定量アッセイ - Google Patents
cAMPおよびアデニル酸シクラ―ゼの酵素的蛍光定量アッセイInfo
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Abstract
チド類を含む生物学的試料中のcAMP量またはアデニ
ル酸シクラーゼ活性を、放射性試薬を使用することなく
迅速に測定する方法に関する。 【解決手段】内因性アデニル酸シクラーゼによって生成
されるcAMPと、ATP、AMP、ADPおよびこれ
らの混合物からなる群から選択される内因性の非環状ア
デニンヌクレオチド類を含む生物学的試料中のcAMP
量またはアデニル酸シクラーゼ活性の測定方法であっ
て、(1)上記試料中のcAMP以外の内因性非環状アデ
ニンヌクレオチドおよびグルコース-6-リン酸を酵素的
に除去するためにアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼ
およびアルカリフォスファターゼの有効量を混合し、
(2)cAMPをAMPに酵素的に変換し、(3)放射性物
質を用いることなくAMPの量を測定することを特徴と
する方法。
Description
アデニル酸シクラーゼによって生成されるcAMP(サ
イクリックアデノシン3',5'−一リン酸)と、ATP
(アデノシン−三リン酸)、AMP(アデノシン−一リン
酸))、ADP(アデノシン−二リン酸)およびこれらの混
合物からなる群から選択される内因性の非環状アデニン
ヌクレオチド類を含む生物学的試料中のcAMP量また
はアデニル酸シクラーゼ活性を、放射性試薬を使用しな
いで測定する方法を提供するものであり、要約すれば、
(1)上記試料中のcAMP以外の内因性非環状アデニン
ヌクレオチドおよびグルコース-6-リン酸を酵素的に除
去するためにアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよ
びアルカリフォスファターゼの有効量を混合し、(2)c
AMPをAMPに酵素的に変換し、(3)放射性物質を用
いることなくAMPの量を測定することを特徴とする方
法に関する。
ーゼ、アデニルシクラーゼ、EC4.6.1.1)は、Mg2+ま
たはMn2+の存在下で ATP → cAMP を触媒する酵素である。
おり、種々の基本的なホルモンおよび神経伝達物質のシ
グナル形質導入カスケードとして重要な役割を果たして
いる。例えば、アデニル酸シクラーゼ活性を測定するこ
とにより、ヒトの心臓移植や鬱血性心疾患時に現れる生
理学的変化を理解することができる[M.R.Bristow eta
l., New Engl.J.Med., 第307巻, 205頁(1982年);K.G.L
urie et al., J.Thorac.Cardiovasc.Surg., 第86巻, 19
5頁(1983年)]。
ル酸シクラーゼの触媒作用によりATPから合成される
cAMP量の変化を測定することによって求めることが
できる。しかし、cAMPの組織レベルでの変化をモニ
ターすることが困難であるため制限されている。
−一リン酸)は1957年、肝臓においてアドレナリン
およびグルカゴンの血糖上昇作用を仲介する因子として
見出され[E.W.Sutherland et al., J.Am.Chem.Soc.,
第79巻, 3608頁(1957年)]、その後、副腎皮質ホルモン
(ACTH)、黄体形成ホルモン(LH)、甲状腺刺激ホル
モン(TSH)、副甲状腺刺激ホルモン(PTH)などの種
々のホルモンやプロスタグランジンなどの生理活性物質
もcAMPを介して作用が発揮されることが明らかとな
った。すなわち、cAMPは、ペプチドホルモンや活性
アミンが分泌されて目標の細胞に到達した際,細胞内で
酵素反応を進めるための情報伝達を担い、いわゆるセカ
ンドメッセンジャーとしての機能を有している。
ル酸シクラーゼによってATPから合成され、ホスホジ
エステラーゼによって5'−AMPに分解される。細菌
や動物界に広く存在するが、非常に微量である(定常濃
度0.1〜1nモル/湿重量)。cAMPの定量法として
は、cAMP結合タンパク質を用いる方法または放射免
疫法が簡便である。cAMP含量は細胞の栄養、増殖、
分化、適応状態に左右され敏感に変動する。
織や体液中のcAMPを測定することは、細胞生存度、
内分泌ホルモン軸機能、アデニル酸シクラーゼ活性およ
びホスホジエステラーゼ活性を評価するための有用な方
法と成り得る。さらに、cAMP測定を利用して、シグ
ナル形質導入、リボソームタンパク質合成、発生期タン
パク質の転位および他の主要な細胞機能で重要な役割を
果たしているGタンパク質(グアニンヌクレオチド結合
タンパク質)ファミリーをはじめとする、多数のシグナ
ル形質導入タンパク質の活性を評価することができる
[Bourne et al., Nature, 第348巻, 125頁(1990
年)]。
織、器官または体液中の環状ヌクレオチドの値を変動さ
せる可能性のある他の内因性及び外来性化合物(例え
ば、一酸化二窒素)の評価に使用することができる。
である、エピネフリン、ノルエピネフリン、アドレノコ
ルチコトロピン(ACTH)、バソプレシン、グルカゴ
ン、チロキシン並びに甲状腺刺激及びメラノサイト刺激
ホルモンをはじめとする多数のホルモンは、セカンドメ
ッセンジャーとしてcAMPを使用する。これら全ての
ホルモンおよび調節物質の活性は、本発明の測定方法を
適用して組織、血清、体液および全ての細胞培養物(細
胞及び培地)中で測定することができる。これらホルモ
ンの測定は、ホルモン不均衡から特定の病状となる可能
性のある多種多様な疾病状態について実施することがで
きる。
セプターと相互作用すると、セカンドメッセンジャー
(cAMP)が、カスケードとして生成される。cAMP
の生成は場合によっては、特定のホルモンシグナル形質
導入経路の一部としてcAMPの減少を使用するホルモ
ンによって特異的に抑制することもできる。この調節タ
ンパク質またはホルモンとレセプターの相互作用の結果
は、(1)例えば、イオンチャンネルの変化による細胞透
過性の変動、(2)cAMP濃度に感受性の酵素触媒反応
速度の変動、(3)他の酵素の合成および分解を含むタン
パク質合成速度の変動が考えられる。cAMPの測定
は、ホルモンまたは調節タンパク質がレセプターと相互
作用した後に、これらの結果を直接および間接的に測定
するために使用することができる。
cAMPの分解を防止することによってアドレナリン作
動性神経系を刺激するアミノフィリンまたはテオフィリ
ンのような医薬品レベルのマーカーとして使用すること
ができる。細胞培養物中のcAMPの測定を使用して特
定のホルモン、調節タンパク質および医薬品を評価する
ことができ、その際cAMPはシグナル形質導入過程で
の生体結合を示す。
は調節タンパク質の不存在下あるいは存在下で細胞を試
験することによって、細胞の生存度および安定性を評価
するために使用することもできる。例えば、グルカゴン
による肝臓細胞(肝細胞)中のcAMPを測定することに
より、肝細胞の生存度を評価することができる。これ
は、例えば、器官および/または細胞の移植、例えば心
臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、皮膚および脳の細胞移植に
有用である。
せる多種多様なホルモン、調節タンパク質および医薬品
で活性化した後の生検試料から得られる細胞の応答性の
測定は、細胞機能を詳細に評価する方法として使用する
ことができる。
価するために心臓生検でcAMPを測定することが挙げ
られる。心筋症の心臓細胞は、β-アドレナリン作動性
刺激後のcAMP含有量が上昇しても応答しない。心疾
患の重篤度および幾つかの医薬品、例えばβ-アドレナ
リン作動性遮断剤およびアンギオテンシン変換酵素イン
ヒビターの有効性の診断は、正常な心臓と心筋症心臓か
ら得られる生検試料の応答性を比較することによって行
うことができる。更に、細胞内または動脈若しくは静脈
循環内へのcAMP放出は、虚血、低酸素症または医薬
品若しくはホルモン刺激のような種々の異なる生理学的
および非生理学的ストレスに対する器官および/または
組織の応答のインディケーターとして使用することがで
きる。組織若しくは体液中のcAMP値は、この方法を
用いて血球および血小板を含む殆ど全ての哺乳動物細胞
または体液中で測定することができる。幾つかの組織で
は、潜在的腫瘍細胞試料の場合に、腫瘍原性および/ま
たは侵入性に対する指標として特異的な刺激剤に応答す
るcAMP値を測定することができる。他の場合には、
cAMP合成または分解を変える可能性のある特異的な
治療法の有効性を決定するためにcAMPの測定を使用
することができる。
ンジャーとして細胞内情報伝達において、重要な役割を
果たしていると同時に、様々な生理的機能を有している
ことから、アデニル酸シクラーゼの触媒作用によりAT
Pから合成されるcAMP量を測定し、さらにアデニル
酸シクラーゼ活性を求めたり、cAMPの挙動を解明す
ることは、基礎医学研究分野のみならず、臨床医学の分
野においても非常に意義深いことといえる。
TPを基質として生成したcAMPを定量することによ
って行う。cAMPの定量は、(1)標識されたATPを
基質とする方法と(2)非標識ATPを基質として用いる
方法に区別することができる。
では、放射性同位元素で標識されたATP(例えば[α-
32P]ATP)を基質とし、アデニル酸シクラーゼの作
用により合成された放射性標識cAMP([32P]cA
MP)をATPから分離し、その放射活性を測定する
[Y.Salomon et al., Anal.Biochem., 第58巻, 541頁(1
974年);R.A.Johnson et al., In Method in Enzymolog
y, 第195巻, 3頁(1991年)]。この方法においては、イ
オン交換樹脂および酸化アルミニウムカラムを用いた連
続アフィニティクロマトグラフィーを用いて[α-
32P]ATPと[32P]cAMPを分離している。
反面、高価で危険性の高い放射性標識化合物を使用しな
ければならない。
いる方法は、非標識ATPから生成したcAMPを放
射性物質で標識したcAMPと競合的に対応する抗血清
に対して抗原抗体反応させ、結合抗体の放射活性を測定
してcAMPを定量する、いわゆるラジオイムノアッセ
イと、cAMP依存性プロテインキナーゼとcAMP
の特異的結合を利用し、cAMP依存性プロテインキナ
ーゼと結合した3H-cAMPの放射能を測定する、プロ
テインバインディングアッセイ[A.G.Gilman et al., P
roc.Natl.Acad.Sci.USA, 第67巻, 305頁(1970年)]に分
類することができる。
は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼによるcA
MPの分解を補正できないため、ホスホジエステラーゼ
活性の強い検体には不適当である。
慮すれば、このような放射性物質の使用は極力避けるべ
きである。従って、アデニル酸シクラーゼ活性およびそ
の指標となるcAMPの定量のため高感度の非放射性定
量法の開発が望まれていた。
において、cAMPの濃度は非常に低いため、放射性物
質を用いないで測定することは容易ではない。また、A
MPやADP、ATPなどの試料中の非環状アデニンヌ
クレオチド類が、cAMPの数百倍から数十万倍以上の
濃度で共存しており、しかも化学構造が類似しているこ
とから、妨害物質として作用し、cAMPの定量を一層
困難なものとしている。特にATPはcAMPの1億倍
の濃度で存在していることもあり、このような内因性の
ATPを完全に除去しない限り、正確なcAMPの測定
は実質的に不可能であった。
作用によりAMPに変換されるが、AMPの測定につい
ては、放射性物質を用いない方法が開示されている。Lo
wryらは、還元型ピリジンヌクレオチドの蛍光を用いた
高感度定量法[O.H.Lowry etal., A Flexible System o
f Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jovanovich,
New York(1972年);F.M.Matschinsky et al., J.Histoc
hem.Cytochem., 第16巻, 29頁(1968年)]を開示してい
る。これは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸(NADPH)の340nmにおける吸光度が0.1mm
olあたり0.617を示すことを利用し、試料の吸光度値か
らNADPHの絶対濃度を求める方法である。
酸に変換する酵素であるグリコーゲンホスホリラーゼが
無機リン酸(Pi)の存在下でAMPにより活性化される
ことを利用したAMPの測定も提案されている[E.Helm
reich et al., Biochemistry, 第52巻, 647頁(1964
年);同上, 第51巻, 131頁(1964年);M.Trus et al., D
iabetes, 第29巻, 1頁(1980年)]。この方法では、グリ
コーゲンがグルコース-1-リン酸に変換される量からグ
リコーゲンホスホリラーゼ活性を求め、この活性を指標
として、AMPの量を測定することができる。さらに、
AMPを高感度に測定する方法は、Lurie等によって開
発されている[K.Lurie et al., Ann.J.Physiol., 第25
3巻, H662頁(1987年)]。
度や特異性を高めるために、試料中の非環状アデニンヌ
クレオチド類を酵素分解および/またはクロマトグラフ
ィーにより除去する方法も知られている[N.D.Goldberg
et al., Anal.Biochem., 第28巻, 523頁(1969年);B.M
cL.Breckenridge, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 第52巻,15
80頁(1964年)]。
は、妨害物質である内因性のADPやATPを完全には
除去できないためcAMPの測定は不可能であると結論
されていた。それゆえ、放射性物質を使用することな
く、生物学的試料中のcAMP量およびそれに基づくア
デニル酸シクラーゼ活性を高感度に求める手段は実質的
にはなかったことになる。
デニル酸シクラーゼ活性の測定およびcAMP量の定量
方法の開発を試み、鋭意検討した結果、妨害物質である
ATPやADP、AMPなどの試料中の内因性非環状ア
デニンヌクレオチド類やグルコース-6-リン酸を酵素を
用いて選択的に除去した後、試料中のcAMPをAMP
に酵素的に変換し、さらにAMPをATPに変換し、そ
して、フルクトース-6-リン酸を経由してグルコース-
6-リン酸に変換した後、NADPHに変換し、このN
ADPH濃度を蛍光光度法で測定し、cAMP濃度と相
関させることにより、有害な放射性物質を用いることな
く、酵素反応・化学反応のみで、cAMP量およびそれ
に対応するアデニル酸シクラーゼ活性を測定することに
成功した(WO94/17198)。
ーダーの生物学的試料中のcAMP量をpmolまたはfmol
レベルで正確に定量することが可能となった[A.Sugiya
ma et al., Anal.Biochem., 第218巻, 20頁(1994年);
A.Sugiyama et al., J.Clin.Lab., 第8巻, 437頁(1994
年);A.Sugiyama et al., Anal.Biochem., 第225巻, 36
8頁(1995年);A.Sugiyama et al., Yamanashi Med.J.,
第10巻, 11頁(1995年)参照]。
レオチド類および内因性グルコース-6-リン酸の除去)
度を6000〜1万倍に増幅する)
Pの定量手段であり、かつ、理論的にも正確なものであ
るが、クリーニング反応に要する時間が長い、サイクル
反応後に加熱による酵素を失活させる際に、試料の白濁
が生じる、などの点で改良の余地があった。
迅速なcAMP量やアデニル酸シクラーゼ活性の測定手
段であって、しかも放射性物質を使用しない測定方法の
開発を目指して鋭意研究した結果完成されたものであ
る。
反応および蛍光光度法を採用したアデニル酸シクラーゼ
活性測定法およびcAMP定量法(WO94/1719
8)の改善を図ったものである。即ち、(1)クリーニン
グ反応において、5'-ヌクレオチダーゼの使用を取りや
めることにより、反応時間を1時間から5分乃至10分間
と劇的に短縮することに成功し、(2)サイクル反応にお
いて、反応後の酵素の失活方法を加熱に代えて、EDT
Aなどのキレート剤を用いて試料中のMg2+をキレート
処理して除去し、酵素を失活させることにより、試料の
白濁を防止した。これにより、続いて行う検出反応の精
度が向上した。また、(3)従来2段階であった変換反応
を1段階とすることで、より簡便な操作を可能とした。
そして、(4)検出反応において試薬等の濃度を再検討
し、最適化した。これらの改良を加えることによって、
生物学的試料中のcAMP量およびそれに対応するアデ
ニル酸シクラーゼ活性をより迅速、且つ高感度に測定で
きる酵素的蛍光定量アッセイまたは分光光度アッセイを
提供することが可能となった。
調節タンパク質およびcAMP特異的ホスホジエステラ
ーゼの活性を測定するために使用することもできる。
を以下に記載する。 ステップ1−クリーニング反応(試料中の内因性非環状
アデニンヌクレオチド類およびグルコース-6-リン酸の
除去)
1(フルクトース-6-リン酸の除去)
2(試料中の内因性グリコーゲンの除去)
P化反応)
光光度測定)
スホグルコノラクトンの分解)
光光度測定)
ADPサイクル反応による増幅(測定感度を6000〜1万
倍に増幅する))
(ルシフェラーゼ反応)
内因性非環状アデニンヌクレオチド類およびグルコース
−6−リン酸の除去) 本発明は、アピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよび
アルカリホスファターゼの混合物により、試料中のcA
MP以外の内因性非環状アデニン残基を有する化合物
(アデノシン、ATP、ADPおよびAMP)を酵素的に
除去する工程を含む。そして、好ましくは、アルカリホ
スファターゼを用いて試料中のグルコース-6-リン酸を
グルコースへ酵素的に変換する工程を含む(クリーニン
グ反応)。
り遙かに高濃度であり、除去しなければ実質的にブラン
クを高めるおそれのある全ての試料中の内因性ATP、
ADPおよびAMPを除去することができる。グルコー
ス-6-リン酸は後に検出反応で生成するので、試料中の
グルコース-6-リン酸をあらかじめ酵素的に除去してお
くことは、本測定方法の精度を向上させるので好まし
い。これらのクリーニング反応は、検出感度の向上のた
めに重要である。
に用いられていた4種類の酵素(アピラーゼ、5'-ヌク
レオチダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアデノシ
ンデアミナーゼ)のうち、5'-ヌクレオチダーゼの使用
を取りやめることにより、反応時間が著しく短縮され
た。すなわち、約1時間を要していた反応時間が僅か5
分乃至10分間程度に著しく短縮できることを見出した。
1(フルクトース−6−リン酸の除去) また、同様にサイクル反応および検出反応で生成するフ
ルクトース-6-リン酸もアルカリフォスファターゼで加
水分解し、除去しておくのが好ましい。
2(試料中の内因性グリコーゲンの除去) さらに好ましくは、グルコースオキシダーゼ、グリコー
ゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスファターゼを用
いて、グルコース-6-リン酸に変換される試料中の内因
性グリコーゲンを除去する(オプション反応)。これによ
り、ステップ3−検出反応1(NADPHの蛍光光度測
定)において既知量のグリコーゲンを添加する際の妨害
物質となる内因性グリコーゲンが消失する。
ゼを作用させ、cAMPをAMPに変換する(変換反
応)。
光光度測定) 上記変換反応後、グリコーゲンおよび無機リン酸を添加
し、AMPがグリコーゲンホスホリラーゼを活性化して
グリコーゲンからグルコース-1-リン酸を生成する程度
を指標として、AMPを定量する。即ち、グルコース-
1-リン酸は、ホスホグルコムターゼによりグルコース-
6-リン酸に変換され、グルコース−6−リン酸は最終
的に6-ホスホグルコノラクトン、NADPH及びH+に
酵素的に変換される。最後に、NADPH濃度を例えば
Trusらの方法[M.Trus et al., Diabetes, 第29巻, 1頁
(1980年)]に従い、蛍光定量法を用いて測定する。
ホスホグルコノラクトンの分解)また、6-ホスホグルコ
ノラクトンは、水性溶媒中、in vitroで加熱して6-ホ
スホグルコン酸に変換することができ、さらに6-ホス
ホグルコン酸は、NADP+の存在下でin vitroでNA
DPH、およびリブロース-5-リン酸に変換することが
できる。これにより、NADPHの濃度を高めることが
できる。このNADPH濃度を上記と同様に例えばTrus
らの方法[M.Trus et al., Diabetes, 第29巻, 1頁(198
0年)]に従い、蛍光定量法を用いて測定する。
る、刺激されたアデニル酸シクラーゼ活性を修正Salomo
n放射活性方法およびアルカリホスファターゼを用いな
い蛍光定量法の両方で測定したところ、測定結果は類似
していた[A.Sugiyama et al.,Anal.Biochem., 第218
巻, 20頁(1994年);A.Sugiyama et al., Anal.Bioche
m.,第225巻, 368頁(1995年);A.Sugiyama et al., Yama
nashi Med.J., 第10巻, 11頁(1995年)]。放射活性測定
法と蛍光定量法から得られた結果を比較すると、絶対的
な比活性は異なっているが、アデニル酸シクラーゼの刺
激倍率は類似している。比活性の差異は恐らくアデニル
酸シクラーゼ反応混合物における些細なファクターによ
るものと思われる。即ち、放射活性測定では試料中ホス
ホジエステラーゼによる[32P]cAMP分解を防ぐた
めに非標識cAMPが使用され、一方、蛍光定量法で
は、新たに合成されるcAMPの試料中ホスホジエステ
ラーゼによる分解を抑制するためにテオフィリンが使用
されている。
で示したATP-ADPサイクル反応を使用したアデニ
ル酸シクラーゼの測定によって、絶対的な比活性は放射
活性および蛍光定量法の両方で同一であることが明らか
になった。
料中のcAMP量を測定することができ、そして1fmol
未満のcAMP/試料を測定することができる。また、
本発明においては、生物学的試料に既知量のATPを添
加し、このATPを試料中のアデニル酸シクラーゼの作
用でcAMPに変換させ、次にクリーニング反応により
内因性のATPなどのアデニンヌクレオチド類を全て除
去した後、変換したcAMP量を求めることによってア
デニル酸シクラーゼ活性を算出することもできる。
ら生成したアンモニウムイオンは一連のクリーニング反
応を本質的に完了させ、試料中のヌクレオチド類が再形
成するのを妨げる。これらの操作により、これまでの蛍
光定量アッセイからは予期できない顕著な改善効果が得
られる。[Weign et al.,Anal.Biochem., 第208巻,217
頁(1993年)]。
生物学的試料は、好ましくは哺乳動物由来のものであ
り、これには組織、血球、骨が含まれ、さらに尿、血
液、髄液などの生物学的流体が含まれる。これらの試料
は、新鮮なものであるか、または冷凍保存されていても
よい[Lowry et al., A Flexible System of Enzymatic
Analysis,Harcourt Brace Jovanovich, New York(1972
年)]。
段階を含んでいる。 ステップ1−クリーニング反応(試料中の内因性非環状
ヌクレオチド類およびグルコース−6−リン酸の除去) cAMP、グルコース-6-リン酸および少なくとも1種
の非環状アデニンヌクレオチド類、即ちATP、AD
P、AMPまたはこれらの混合物からなる群から選択さ
れるものを含んでいる生物学的試料を、アピラーゼ、ア
デノシンデアミナーゼおよびアルカリホスファターゼの
混合物を含む水性緩衝液と混合して、非環状アデニンヌ
クレオチド類(ATP、ADPおよび/またはAMP)お
よびグルコース-6-リン酸を酵素的に変換して除去す
る。
ていたクリーニング反応が約5〜10分以内に、すなわ
ち、1/12〜1/6、少なくとも1/6の反応時間に
短縮されることをいう。
2 そして任意に、上記反応混合物をグルコースオキシダー
ゼ、グリコーゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスフ
ァターゼと混合して全ての試料中のグリコーゲンを分
解、除去する。これにより、ステップ3−検出反応1
(NADPHの蛍光光度測定)において既知量のグリコ
ーゲンを添加する際の妨害物質となる内因性グリコーゲ
ンが消失する。このときcAMPは反応混合物中にその
まま保持される。
中のcAMPをAMPに変換する。
光光度測定) さらに、グリコーゲンおよび無機リン酸の存在下でグリ
コーゲンホスホリラーゼと接触させてグルコース-1-リ
ン酸を上記反応混合物中で生成させ、上記反応混合物中
でホスホグルコムターゼと反応させ、グルコース-6-リ
ン酸を生成させる。ついで、6-ホスホグルコノラクト
ン、NADPH及びH+に酵素的に変換し、上記反応混
合物中のNADPH濃度を蛍光定量法で測定する。そし
て、このNADPHの濃度が上記試料中のアデニル酸シ
クラーゼ活性、cAMP量またはAMP濃度と相関す
る。
5'-ホスホジエステル結合の開裂によって生成するAM
Pが、グリコーゲンホスホリラーゼ活性を刺激するとい
う原理に基づいている。すなわち、cAMPおよびアデ
ニル酸シクラーゼ活性の量はcAMPから生成したAM
Pがグリコーゲンホスホリラーゼを活性化し最終的に得
られたNADPHの吸光度に対応する。
関係は、例えば検量線によって求めることができる(図
2参照)。
グ反応後に、加熱してクリーニング反応で使用した酵素
を不活性化する。
ニング反応に続いて、ホスホジエステラーゼ、グリコー
ゲンホスホリラーゼ、グルコース-1,6-二リン酸、無
機リン酸、グリコーゲン、NADP+、グルコース-6-
リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコムターゼおよび
Mg2+からなる液を反応混合物に添加し、上記変換反応
および検出反応の工程をin vitroで連続的に実施する。
ホスホグルコノラクトンの分解) 任意に、ステップ3−検出反応1の反応混合物を加熱し
て6-ホスホグルコノラクトンを順次6-ホスホグルコン
酸に変換し、その後、Mg2+の存在下でNADP+およ
び6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼと反応させ、
上記で示されるように、リブロース-5-リン酸、NAD
PH、H+およびCO2として上記工程(4)で生成される
NADPHの濃度を高めることもできる。
度は、これをサイクル反応系で使用することによって数
オーダー増加させることができる。即ち、α-ケトグル
タル酸の存在下でNADPHはNADP+およびグルタ
ミン酸に変換される。NADP+は順次、添加されたグ
ルコース-6-リン酸を6-ホスホグルコノラクトンおよ
びNADPHに変換する。上記したように、6-ホスホ
グルコノラクトンは加水分解され(H2O、加熱)、6-ホ
スホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびMg2+の存在下
でリブロース-5-リン酸およびNADPHに変換するこ
とができる[Lowry et al., A Flexible System of Enz
ymatic Analysis, HarcourtBrace Jovanovich, ニュー
ヨーク(1972年)]。
P化) あるいは、cAMPから生成するAMPは、痕跡量のA
TPの存在下でミオキナーゼと混合することによりAD
Pに変換することができる。次に生成したADPは2-
ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼで
処理することにより、ATPとピルビン酸に変換され
る。この反応により、1分子のAMPから1分子のAT
Pが生成する(ATP化反応)。
してATPへ至る、ステップ2−変換反応およびステッ
プ2−変換オプション反応1は、1段階で行うことがで
きる。
光光度測定) さらにATPは、まずフルクトースの存在下でヘキソキ
ナーゼで処理されフルクトース-6-リン酸およびADP
に変換される。生成したフルクトース-6-リン酸はホス
ホグルコイソメラーゼの作用によりグルコース-6-リン
酸に変換され、最終的に6-ホスホグルコノラクトン、
NADPH及びH+に酵素的に変換される。そして、同
様に、NADPH濃度をTrusらの方法[M.Trus et al.,
Diabetes,第29巻, 1頁(1980年)]に従い測定する。
して6-ホスホグルコン酸に更に変換し、この6-ホスホ
グルコン酸をNADP+の存在下で、NADPH、H+、
CO2およびリブロース-5-リン酸に変換してもよい。
−ADPサイクル反応による増幅) そしてさらにATPは、ATP-ADPサイクル反応に
供される。即ち、ATPは、まずフルクトースの存在下
でヘキソキナーゼで処理されフルクトース-6-リン酸お
よびADPに変換される。次にこのADPは、ホスホエ
ノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼの作用によ
りATPおよびピルビン酸となる。ここで生成したAT
Pは再びフルクトース-6-リン酸およびADPに変換さ
れる。この反応が繰り返されることにより、最終的にフ
ルクトース-6-リン酸が蓄積する。
めに、キレート剤を添加する。キレート剤はEDTAの
ようなポリアミノカルボン酸、クエン酸のようなオキシ
カルボン酸などが用いられる。好ましくは、EDTAで
ある。
よびホスホエノールピルビン酸から得られるフルクトー
ス-6-リン酸は、ホスホグルコースイソメラーゼにより
グルコース-6-リン酸に変換される。このグルコース-
6-リン酸をグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼお
よびNADP+で処理することによって6-ホスホグルコ
ノラクトンおよびNADPHに変換される。そして、N
ADPH濃度をTrusらの方法[M.Trus et al., Diabete
s, 第29巻, 1頁(1980年)]に従い、測定する(ステップ
3−検出反応2参照)。
ション反応1のATP化反応で生成したATPをルシフ
ェラーゼ反応またはホタルルシフェリンを使用する化学
的蛍光分析法を用いて吸光度測定によって検出してもよ
い[Wulff et al., Methods of Enzymatic Analysis,
H.U.Bergmeyer編集, VCH(1985年)]。ATPの測定値か
ら、AMPおよびcAMP濃度ならびにそれに対応する
アデニル酸シクラーゼ活性を算出することができる。
応収率(発光した光子数と変換されたATP分子数の比
率として定義される)はほぼ100%である。発光強度はA
TP濃度と正比例し、582nmで測定される。
あれば、AMP以外の物質に適用することができる。例
えば、GMPに対応する酵素を適応することにより、グ
アニル酸シクラーゼ活性やサイクリックグアノシン-
3',5'-一リン酸(cGMP)およびグアノシン-3',5'
-一リン酸(GMP)の定量に用いることもできる。用い
られる反応式を下記に示す。
スファターゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼおよびグア
ナーゼからなるクリーニング混合物が使用される。アル
カリホスファターゼは、cGMPの測定中にブランク値
を高める可能性のある化合物、例えばグルコース-6-リ
ン酸や非環状ヌクレオチドを脱リン酸化にも用いられ得
る(クリーニング反応)。
MP+2Piに変換された後、グアノシンとPiに変換さ
れる。グアノシンはグアニンとリボース-1-リン酸に変
換され、そしてグアニンは、キサンチンとアンモニアに
変換される。cAMPの測定におけるクリーニング反応
と同様に、最終クリーニング反応におけるアンモニウム
(またはNH4 +)は、一連のクリーニング反応を本質的に
終了させ、その結果、干渉ヌクレオチドを確実に除去す
る。
る酵素は次のステップ(ii)−変換反応の前に、例えば加
熱によって不活化される。
cGMPをGMPに変換する。GMPをグアニンモノホ
スフェートキナーゼの存在下でATPと混合するとグア
ノシン-5'-二リン酸(GDP)とADPが得られる。
ル-CoAおよび無機リン酸(Pi)の存在下で一定量のピ
ルビン酸を生じる(サイクル反応)。
変換される既知量のNADHを添加して間接的に定量さ
れる。かくして、インジケーター試料の蛍光は、cGM
P、GMP又はグアニル酸シクラーゼについてアッセイ
される試料中で生成するピルベートの量に正比例して減
少する。
いて、グアニンモノホスフェートキナーゼによって分解
するATP量を測定して、GMP量を求めることもでき
る。ATPは上記で示したような、公知の方法で測定す
ることができる。
クラーゼ活性またはグアニル酸シクラーゼ活性の測定
は、高感度であり、費用も顕著に安く、また短時間で結
果を得ることができる。さらに放射性物質を使用しない
ので、オペレーターにとって安全であり、そして環境に
対しても良好である。
料中または外来性のホスホジエステラーゼの量を測定す
るように適合させることも容易である。即ち、cAMP
の予め選択された単一量を未知濃度のホスホジエステラ
ーゼを含有する試料に添加する。この時、ホスホジエス
テラーゼに対する特異的なインヒビターを必要に応じて
添加してもよい。cAMPの予め選択された単一の過剰
量を種々の予め選択された既知量のホスホジエステラー
ゼに添加することによって標準曲線が得られる。添加さ
れたcAMPの幾らかがホスホジエステラーゼによって
AMPに転換される反応時間(5〜60分)後に、反応を停
止させる。cAMP標準曲線を同時に実施して反応が適
切に進行していることを証明することができる。クリー
ニング反応を開始して、非環状アデニンヌクレオチドを
すべて分解する。残存cAMPは天然+添加ホスホジエ
ステラーゼに反比例する。次に、cAMPを通常の方法
でAMPに変換し、測定する。
(0.5MのNaCl、0.03Mのトリス、2mMのE
DTA)に溶解し、2倍量のPDE混合物(50mMの
トリス、50μMのcAMP)を添加し、37℃で20
分間インキュベーションする。この反応混合物を80℃
で30分間加熱する。組織に対して4倍量のクリーニン
グ反応混合物を添加し、37℃で1時間インキュベーシ
ョンする。この反応混合物を80℃で30分間加熱す
る。次に組織に対して10倍量の変換反応混合物を添加
し、室温で1時間インキュベーションした後、検出反応
により、NADPHの蛍光強度を測定する。
等が予めキット化された製剤として提供される。この場
合、クリーニング反応混合物キット、変換反応混合物キ
ット、サイクル反応混合物キット、検出反応混合物キッ
トのように、各反応工程毎にキット化すると便利であ
る。
製またはプラスチック製容器のバイアル、アンプルに、
例えば液剤、凍結乾燥剤または固形剤の形状で充填さ
れ、提供される。
で溶解されていてもよい。あるいは、複室容器に酵素と
溶解液を別々に収容しておき、使用直前に混合してもよ
い。
賦形剤、pH調整剤などの添加物を加えることもでき
る。
増幅反応を使用する他、適当な自動分析装置を用いて行
ってもよい。
よびcAMP並びにcAMP特異的ホスホジエステラー
ゼ活性およびG調節タンパク質の生物学的活性に関する
非放射性の酵素的蛍光定量法を提供する。また、本発明
は、グアニル酸シクラーゼ活性およびcGMPの非放射
的測定を提供する。
ニル酸シクラーゼ活性等の測定方法に比べて幾つかの利
点を有する。即ち、本発明は、Y.Salomonらによって開
示された従来法[Anal.Biochem., 第58巻, 541頁(1974
年);Adv.Cyclic NucleotideRes., 第10巻, 35頁(1979
年)]と異なり、放射性物質を一切使用しない。加え
て、本発明の測定方法は、従来法に比べ高感度で、操作
がより簡単である。
応を用いた測定方法[A.Sugiyama et al., Anal.Bioche
m., 第218巻, 20頁(1994年);A.Sugiyama et al., J.Cl
in.Lab., 第8巻, 437頁(1994年);A.Sugiyama et al.,
Anal.Biochem., 第225巻, 368頁(1995年);A.Sugiyama
et al., Yamanashi Med.J., 第10巻, 11頁(1995年)]と
比較しても、反応時間が著しく短縮され、操作もより簡
便なものとなっている。また、従来方法では回避できな
かった試料の白濁化をEDTAなどのキレート剤を用い
ることで解決した。そして、この方法を用いることで、
μgオーダーの生物学的試料中のcAMP量をpmolまた
はfmolレベルで正確に定量することが可能である。
り遙かに高濃度であり、除去しなければ実質的にブラン
クを高めるおそれのある全ての試料中の内因性ATP、
ADPおよびAMPを除去することができる。さらに、
同様に妨害物質として作用する試料中のグルコース-6-
リン酸およびグリコーゲンも全て除去することができ
る。これらのクリーニング反応は、検出感度の向上のた
めに重要である。
に用いられていた4種類の酵素(アピラーゼ、5'-ヌク
レオチダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアデノシ
ンデアミナーゼ)のうち、5'-ヌクレオチダーゼの使用
を取りやめることにより、1時間を要していた反応時間
が僅か5分乃至10分間程度に著しく短縮できることを見
出した。
Mg2+をトラップするので、加熱することなく過剰の酵
素が不活性化することができ、試料が白濁しない。
少させることによって高めることもできる。この感度
は、Meinrich等またはE.Helmrich等[E.Helmrich et a
l., Biochemistry, 第52巻, 647頁(1964年)]の方法を
用いることにより、反応混合物中のグリコーゲンおよび
無機リン酸の濃度を変えることによって更に高めること
もできる。本発明は、10μg程度の微量の哺乳動物組織
の膜タンパク質中のアデニル酸シクラーゼ活性を測定す
ることが可能である。
びクロマトグラフィー分離などの容量サイズによって感
度が制限される放射活性測定方法とは異なって、本発明
の蛍光定量方法においては、感度を高めることに対して
顕著な障害は存在していない。例えば、cAMPは広範
な濃度範囲(1fmol〜1mmol)で測定可能である。
明される。これらの実施例においては使用した酵素、基
質およびコファクターは、Boehringer Mannheim社から
入手した。ただし、アピラーゼおよび5'-ヌクレオチダ
ーゼはSigma社から入手した。[α-32P]ATP、3H-
cAMPおよびアクアゾルシンチレーションカクテルは
New England Nuclear社から購入した。Neutral Chromat
ographic AluminaWN-3はBio-Rad社製を用いた。
mol/tube)を10×57のPyrex(商品名)製分析管に加えた。
室温にて、クリーニング反応混合物(100mMのトリス-H
Cl、pH8.0;2mMのMgCl2;2U/mLのアピラー
ゼ;10U/mLのアデノシンデアミナーゼ;40U/mLのア
ルカリホスファターゼ)25μLを各分析管に加えた。こ
の混合物を37℃でインキュベートした(0、5、10、15
および20分間)。以下、ステップ2−変換反応(AMP化
反応)および変換オプション反応(ATP化反応)、ステ
ップ3−検出サイクル反応2を行い、340nmにおける吸
光度を測定し、ATPが完全に消失するインキュベーシ
ョン時間を求めた。結果を図1に示す。その結果、少な
くとも10分間のインキュベーションで妨害物質のATP
はほぼ消失することが判った。
を用いたクリーニング反応とを比較するために行われ
た。 5'−ヌクレオチダーゼを含むクリーニング反応混合物
の調製 トリス−HCl(pH8.0)、MgCl2、5'−ヌク
レオチダーゼ、アピラーゼ、アデノシンデアミナーゼお
よびアルカリホスファターゼに水を加えて全量25μL
とし、表1に示す最終濃度を有するクリーニング反応混
合物を調製した。
とができる。
1の方法に準じてクリーニング反応を行った。3μLの
ATP標準品(0、10、100、1000および10
000pmol/tube)を10×57のPyrex製分析管に加え
た。室温にて、上記で調製したクリーニング反応混合物
(100mMのトリス−HCl(pH8.0);2mM
のMgCl2;2U/mLのアピラーゼ;2.5U/mL
の5'-ヌクレオチダーゼ;0.1U/mLのアデノシン
デアミナーゼ;20U/mLのアルカリホスファター
ゼ)25μLを各分析管に加えた。この混合物を37℃
でインキュベートした。以下、実施例2に記載の変換反
応、サイクル化反応および検出反応を行い、340nm
における吸光度を測定し、ATPが完全に消失するイン
キュベーション時間を求めた。その結果、ATPを完全
に消失させるためには、およそ1時間を要した。
定量による微量cAMP測定 (1)試料および反応混合物の調製 A.生物学的試料の調製(心室筋細胞の調製) 初代培養で増殖させた1日齢のラットの心臓から心室筋
細胞を採取した。心臓あたり約500万個の心筋細胞が生
存していた。100mmあたり約100万個の細胞密度で播いた
後、皿細胞を5%ウシ血清細胞を含有するハンクスの平
衡塩類溶液を有する最少必須培地中で増殖させた[Simp
son et al., Cir.Res., 第51巻, 787頁(1982年)]。4
日目に培地を交換した。培養物は90%以上の心筋細胞を
含有しており、細胞数は期間中一定であった[Simpson
et al., Cir.Res., 第51巻, 787頁(1982年);Rocha-Sin
gh et al., J.Clin.Invest., 第88巻, 204頁(1991年);
Rocha-Singh et al., J.Clin.Invest., 第88巻, 706頁
(1991年)]。6プレートの筋細胞を2群(n=3プレー
ト/群)に無作為抽出した。ホスホジエステラーゼイン
ヒビター、3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBM
X)を各群の培地に2μMの最終濃度となるように添加
した。5分後、一方の群にイソプロテレノールを1μM
の最終濃度となるように添加し、刺激群とした。他方の
群には追加的な薬品を加えなかった。5分後、6つの全
プレートの細胞および細胞なしの培養培地プレートを合
計5mLの100%エタノールで溶出した。各皿から得られ
る溶出物の10分の1(0.5mL)を採り、12×75mmのホウケ
イ酸ガラス管中で風乾し、−80℃で貯蔵した。残りの4.
5mLも同様に風乾し、貯蔵した。測定時に、ペレットを
解凍し、0.5Nの過塩素酸100μLに再度懸濁した。抽出
物を4℃で2分間撹拌し、超音波処理器(Branson Clean
ing Equipment社、A Smith-Kline社、米国)を使用して
1分間超音波処理した。抽出物を25μLの2N KOH
で中和し、2000gで30分間遠心した後、上清液80μLを
分析用に採取した。
ップ1クリーニング反応参照) 1Mのトリス-HCl(pH8.0)400μL、0.2MのMgC
l240μL、500U/mLのアピラーゼ32μL、400U/mL
のアデノシンデアミナーゼ100μLおよび4000U/mLの
アルカリホスファターゼ40μLに水を加えて全量4mL
とし、クリーニング反応混合物を調製した(表2)。
胞調製物を氷冷した後、0.4μLのステップ1−クリ
ーニングオプション反応混合物(100mMトリス−H
Cl(pH8.0)、3mMのMgCl2、3U/mLの
アピラーゼ、150μg/mLのアデノシンデアミナー
ゼ、30U/mLのアルカリフォスファターゼ、および
75μg/mLのグリコーゲンホスフォリラーゼ−α)
を加えて、すべての内因性アデニンヌクレオチド、グリ
コーゲン、およびグルコース−6−リン酸を除去した。
37℃で1時間インキュベーションした後、80℃で3
0分間加熱して、酵素を不活性化した。
変換反応およびステップ2−変換オプション反応参照) 1Mのトリス-HCl(pH8.0)400μL、0.2MのMgC
l240μL、4%のウシ血清アルブミン10μL、1Mの
KCl600μL、0.1Mのジチオトレイトール80μL、0.
1μMのATP16μL、0.5Mのホスホエノールピルビン
酸24μL、2U/mLのホスホジエステラーゼ24μL、72
0U/mLのミオキナーゼ24μLおよび2000U/mLのピル
ビン酸キナーゼ160μLに水を加えて全量4mLとし、変
換反応混合物を調製した(表3)。
3−検出サイクル反応2) 1Mのトリス-HCl(pH8.0)400μL、0.2MのMgCl
240μL、4%のウシ血清アルブミン10μL、0.1Mのフ
ルクトース30μLおよび1500U/mLのヘキソキナーゼに
水を加えて全量4mLとし、サイクル反応混合物を調製
した(表4)。
検出反応2参照) 1Mのトリス-HCl(pH8.0)2000μL、0.2MのED
TA320μL、0.1MのNADP+120μL、3500U/mLの
ホスホグルコイソメラーゼ6μLおよび1750U/mLのグ
ルコース-6-リン酸デヒドロゲーゼ6μLに水を加えて
全量4mLとし、検出反応サイクルを調製した(表5)。
よる微量cAMP測定 Aで調製した心室筋細胞調製物を試料とし、クリーニン
グ反応、変換反応、サイクル反応および検出反応からな
る一連の酵素的蛍光定量法によりcAMPを求めた。
ニング反応) 中和した3μL容量の筋細胞抽出物(100mmプレートから
得られる総溶出物の2.4%または0.24%のいずれか)また
は3μLのcAMP標準品(0、3.6、7.2、14.4、21.6
および28.8pmol/20μL)を10×57のPyrex製分析管(岩城
硝子製)に加えた。室温にて、Bで調製した25μLのク
リーニング反応混合物(100mMのトリス-HCl(pH8.
0);2mMのMgCl2;2U/mLのアピラーゼ;10U/m
Lのアデノシンデアミナーゼ;40U/mLのアルカリホス
ファターゼ)を各分析管に加えた。この混合物を37℃で1
0分間インキュベートした。次に、90℃で30分間加熱し
て酵素を不活化した。同様に内部組織ブランクを調製し
た。
P化反応)および −変換オプション反応(ATP化反応)) クリーニング反応の各分析管に、Cで調製した変換反応
混合物(100mMのトリス-HCl(pH8.0);2mMのMg
Cl2;0.01%のウシ血清アルブミン; 150mMのKCl;
2mMのジチオトレイトール;40nMのATP;3mMの
ホスホエノールピルビン酸;12mU/mLのホスホジエス
テラーゼ;4.5U/mLのミオキナーゼ;80U/mLのピル
ビン酸キナーゼ)25μLを添加した。室温で一晩インキ
ュベーションした。分析管を90℃で5分間加熱して反応
を終了させた。
ル反応2) 変換反応の各分析管に、Dで調製したサイクル反応混合
物(100mMのトリス-HCl(pH8.0);2mMのMgC
l2;0.01%のウシ血清アルブミン;3mMのフルクトー
ス;60U/mLのヘキソキナーゼ)25μlを添加した。反応
当たりの酵素濃度が高いことを考慮して、これらの反応
物を0℃にセットして全てのアッセイ管の開始時間を確
実に同一にすることが重要であった。37℃で2時間イン
キュベート(およそ4000〜10000サイクル)した。
物(100mMのトリス-HCl、pH8.0;3.2mMのEDT
A;0.6mMのNADP+;1U/mLのホスホグルコイソ
メラーゼ;0.5U/mLのグルコース-6-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ)125μLを添加した。室温で20分間反応後、フ
ルオロメーター(Optical Technology Devises社、ニュ
ーヨーク)を使用してNADPHの最終濃度を測定し
た。フルオロメーターは、10蛍光単位の読み取りが緩衝
液(50mMのトリス-HCl、pH8.0)900μL中1nmolの
NADPHと等価になるようにセットした。なお、個々
の分析過程は、既知濃度の適当な基質を使用する内部対
照を同時に分析することにより確認した(例えば、クリ
ーニング反応をチェックするためにATPを追加して使
用し、変換反応を評価するためにAMP標準直線を使用
し、サイクル反応を評価するためにはATP標準直線を
使用した)。
7.2、14.4、21.6および28.8pmol/20μL)から図2に示
される標準cAMP直線が得られた。
て、追加的な薬剤を加えなかった対照群およびイソプロ
テレノール刺激群中のcAMP含量を、各試料のプレー
トの1/10の溶離液に関し、得られた標準cAMP直
線(図2)を用いて測定し、cAMP680pmol/100mmプ
レートの実測値を得た。
ム・インターナショナル製)および放射免疫測定キット
(アマシャム・インターナショナル製)を用いて測定し
た結果を図3に示す。cAMP含量の測定結果は、公知
の方法の放射活性測定法により得られた結果とよく一致
しており、その差は通常の5%以下であった。
酸シクラーゼ活性を、本発明の方法、放射免疫測定法、
およびSalomon法により求めた。その結果を図4に示
す。アデニル酸シクラーゼ活性は、1分間あたりのタン
パク質1mgにおけるcAMPの生成量(pmol)で示し
た。
1MのK2HPO4、0.1MのAMP、4000U/mLのアル
カリホスファターゼ、および10mg/mLのグリコーゲンホ
スホリラーゼの適量を採り、水を加えて最終濃度が以下
になるように、クリーニング反応混合液を調製した。 クリーニング反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-HCl(pH8.0) 100mM MgCl2 2mM K2HPO4 5mM AMP 0.1mM アルカリホスファターゼ 20U/mL グリコーゲンホスホリラーゼ 10μg/mL H2O −
のMgCl2、1MのK2HPO4、0.1MのAMP、0.1
Mのジチオトレイトール、1mMのグルコース−1,6
−二リン酸、4%のウシ血清アルブミン、0.1MのNA
DP、10mg/mLのグリコーゲンホスホリラーゼ、10mg/m
Lのホスホグルコムターゼ、および5mg/mLのグルコー
ス−6−リン酸デヒドロゲナーゼの適量を採り、水を加
えて最終濃度が以下となるように、変換反応混合物を調
製した。 変換反応混合物 化合物 最終濃度 トリス-HCl(pH8.0) 100mM MgCl2 2mM K2HPO4 5mM AMP 0.1mM ジチオトレイトール 1mM グルコース−1,6−二リン酸 4μM ウシ血清アルブミン 0.01% NADP 0.2mM グリコーゲンホスホリラーゼ 20μg/mL ホスホグルコムターゼ 4μg/mL グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ 2μg/mL H2O −
ーニングオプション反応2) 206μMのグリコーゲンを含有するグリコーゲン溶液を
調製し、12本のPyrex製分析管(岩城硝子製:10×57m
m)に分注し(0、20、40および80μLを各3本)、蒸
留水を加えて全量を80μLとした。室温にて、500μL
のクリーニング反応混合液(100mMのトリス-HCl
(pH8.0);2mMのMgCl2;5mMのK2HPO4;0.
1mMのAMP;20U/mLのアルカリホスファターゼ;10
μg/mLのグリコーゲンホスホリラーゼ)を各分析管に
加えた。この混合物を37℃で60分間インキュベートし
た。
Mのトリス-HCl(pH8.0);2mMのMgCl2;5m
MのK2HPO4;0.1mMのAMP;1mMのジチオトレイ
トール;4μMのグルコース−1,6−二リン酸;0.01
%のウシ血清アルブミン;0.2mMのNADP;20μg/m
Lのグリコーゲンホスホリラーゼ;4μg/mLのホスホグ
ルコムターゼ;2μg/mLのグルコース−6−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ)500μLを添加した。37℃で30分間イン
キュベーションした。各分析管につき励起波長340nmに
おける460nmの蛍光波長を測定した。その結果、グリコ
ーゲン溶液中のグリコーゲンがすべてクリーニング反応
により消失していることを確認した。
ない検出反応混合物(100mMのトリス-HCl、pH8.0;
0.6mMのNADP+;1U/mLのホスホグルコイソメラ
ーゼ;0.5U/mLのグルコース-6-リン酸デヒドロゲー
ゼ)125μLを添加し、90℃で30分間加熱し、酵素を失活
させた。試料液の白濁の程度を目視観察した。また、実
施例2で得られた検出反応混合物添加溶液(EDTA-室
温で酵素を失活させたもの)を対照とした。その結果、
加熱失活の場合は試料溶液が白濁したのに対し、EDT
Aを用いた場合は、試料溶液は澄明であった。
ン時間に対する蛍光光度測定値を示すグラフである。
測定値を示すグラフである。
定法を用いてcAMP値を比較測定した結果を示す棒グ
ラフである。
n法を用いてアデニル酸シクラーゼ活性を比較測定した
結果を示す棒グラフである。
Claims (20)
- 【請求項1】 生物学的試料中の内因性ATP、ADP
およびAMPからなる非環状アデニンヌクレオチド類お
よび内因性グルコース-6-リン酸をより迅速に除去する
方法であって、生物学的試料を非環状アデニンヌクレオ
チド類およびグルコース-6-リン酸を除去するのに効果
的な量のアピラーゼ、アルカリホスファターゼおよびア
デノシンデアミナーゼを用いて処理することを特徴とす
る方法。 - 【請求項2】 生物学的試料中のcAMP量またはアデ
ニル酸シクラーゼ活性の測定方法であって、 クリーニング反応:生物学的試料を内因性ATP、AD
PおよびAMPからなる非環状アデニンヌクレオチド類
およびグルコース-6-リン酸を除去するのに効果的な量
のアピラーゼ、アルカリホスファターゼおよびアデノシ
ンデアミナーゼを用いて処理する工程、 変換反応:生物学的試料中のcAMPをAMPに酵素的
に変換する工程、 検出反応:放射性試薬を用いることなくAMP量を測定
する工程、 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項3】 上記クリーニング反応において、上記試
料にさらに、有効量のグルコースオキシダーゼ、グリコ
ーゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスファターゼを
加えて処理し、上記試料から内因性グリコーゲンを酵素
的に除去することを含む、請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 上記変換反応が上記試料を有効量のホス
ホジエステラーゼによる処理により行われる、請求項2
記載の方法。 - 【請求項5】 cAMPからAMPへの上記変換反応の
酵素がcAMPを変換させた後にキレート剤により不活
性化される、請求項2記載の方法。 - 【請求項6】 キレート剤がEDTAである、請求項5
記載の方法。 - 【請求項7】 上記検出反応が、上記試料に添加された
グリコーゲン及び無機リン酸の存在下、グリコーゲンホ
スホリラーゼと接触させて、グルコース-1-リン酸に変
換されることを含み、そしてこの変換が上記AMPによ
ってin vitroで活性化されるものである、請求項2記載
の方法。 - 【請求項8】 上記検出反応において、さらに、グルコ
ース-1-リン酸をグルコース-6-リン酸に変換させるの
に有効な量のホスホグルコムターゼで上記試料を処理
し、ついでグルコース−6−リン酸を6-ホスホグルコ
ノラクトンに変換するのに有効な量のグルコース-6-リ
ン酸デヒドロゲナーゼおよびNADP+で上記試料を処
理することによって、グルコース-1-リン酸を6-ホス
ホグルコノラクトンおよびNADPHに変換する、請求
項7記載の方法。 - 【請求項9】 上記検出反応において、さらに、上記試
料を水の存在下で加熱して、6-ホスホグルコノラクト
ンを6-ホスホグルコン酸に変換し、ついでこの6-ホス
ホグルコン酸をリブロース-5-リン酸およびNADPH
に変換するのに有効な量のNADP+を添加することを
含む、請求項8記載の方法。 - 【請求項10】 生物学的試料中のcAMP量またはア
デニル酸シクラーゼ活性の測定方法であって、 クリーニング反応:生物学的試料を、上記試料中のcA
MP以外の内因性非環状アデニンヌクレオチド類、およ
び内因性グルコース-6-リン酸を酵素的に除去するのに
有効な量のアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよび
アルカリホスファターゼで処理する工程、 変換反応:生物学的試料中のcAMPをATPに酵素的
に変換する工程、 検出反応:ATPをフルクトース-6-リン酸に酵素的に
変換し、フルクトース-6-リン酸を6-ホスホグルコノ
ラクトンおよびNADPHに酵素的に変換後、放射性物
質を用いずにNADPH濃度を測定する工程 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項11】 上記クリーニング反応において、さら
に、上記試料を有効量のグルコースオキシダーゼ、グリ
コーゲンホスホリラーゼおよびアルカリホスファターゼ
で処理し、上記試料から内因性グリコーゲンを酵素的に
除去することを含む、請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 上記検出反応において、フルクトース
-6-リン酸を6-ホスホグルコノラクトンおよびNAD
PHに酵素的に変換後、さらに、引き続き反応混合物を
加熱し、そして上記反応混合物に6-ホスホグルコン酸
デヒドロゲナーゼおよびNADP+を添加することによ
って上記6-ホスホグルコノラクトンをリブロース-5-
リン酸およびNADPHに変換することを含む、請求項
10または11記載の方法。 - 【請求項13】 上記クリーニング反応のcAMP以外
の内因性非環状アデニンヌクレオチド類が、ATP、A
DP、AMPの1種またはそれ以上の混合物である、請
求項10記載の方法。 - 【請求項14】 上記変換反応において、cAMPから
ATPの変換が有効量のホスホジエステラーゼ、ミオキ
ナーゼおよびピルビン酸キナーゼの組み合わせで行われ
る、請求項10記載の方法。 - 【請求項15】 上記検出反応において、ATPからフ
ルクトース-6-リン酸の変換がヘキソキナーゼおよびピ
ルビン酸キナーゼの組み合わせで行われる、請求項10
記載の方法。 - 【請求項16】 上記検出反応において、フルクトース
-6-リン酸から6-ホスホグルコノラクトンおよびNA
DPHの変換がホスホグルコイソメラーゼおよびグルコ
ース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの組み合わせで行われ
る、請求項10記載の方法。 - 【請求項17】 上記検出反応において、ATPをフル
クトース−6−リン酸に変換する酵素が非環状アデニン
ヌクレオチド類の変換後にキレート剤により不活性化さ
れる、請求項10記載の方法。 - 【請求項18】 キレート剤がEDTAである、請求項
17記載の方法。 - 【請求項19】 上記生物学的試料が、哺乳動物組織で
ある、請求項1、2または10記載の方法。 - 【請求項20】 上記生物学的試料が、生物学的液体で
ある請求項1、2または10記載の方法。
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