CN1091804C

CN1091804C - 微生物检测法和试剂

Info

Publication number: CN1091804C
Application number: CN94195171A
Authority: CN
Inventors: D·J·斯奎勒尔
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1994-07-13
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2014-07-13
Also published as: CN1164259A

Abstract

一种用于检测样品中微生物和/或其细胞内物质的存在和/或含量的方法，包括借助于腺苷酸激酶在加入的镁离子存在时，将二磷酸腺苷(ADP)转变成三磷酸腺苷(ATP)的能力来测定样品中这种酶的含量，以及将这种测定与微生物和/或其细胞内物质的存在和/或含量相关联。这种方法提供了超过现有虫萤光素酶/虫萤光素测定法的更高的灵敏度。试剂包括纯化的ADP和无腺苷酸激酶的虫萤光素酶，它们与包括这些试剂的检测试剂盒和用于该方法自动化操作的装置一起被提供。

Description

微生物检测法和试剂

本发明涉及检测和测定微生物的方法，用于这种方法的试剂以及检测试剂盒，该试剂盒内包含实施本方法的主要试剂。

所有活的有机体都利用三磷酸腺苷(ATP)作为化学能源，并且已经知道可以用ATP驱动的虫荧光素酶/虫荧光素反应来测定ATP。这种酶促反应产生的光可以用光度计测定，并可使其与存在的ATP量相关联。自从二十世纪六十年代中期以来人们就已经知道ATP作为微生物数量指标的用途(见：微生物学中ATP发光的快速方法(ATP LuminescenceRapid Methods in Microbiology)(1989)Stanley等编辑；Blackwell科学出版社，London，1-10页)，其主要优点是快速和灵敏。应用这种形式的测定方法，简单的样品可以在大约几分钟内进行分析测定，对于复杂样品，通常也只需花费半个小时，所提供的检测灵敏度可低至10^-12M的ATP。但是，仍然需要提供更灵敏的方法用于测定微生物或者它们的内含物，并保持操作方法的快速、简便。

本发明人已经发现，通过将测定目标从ATP转向产生ATP的酶，特别是腺苷酸激酶，基于ATP方法的速度和灵敏度，有可能被显著提高。腺苷酸激酶是被所有的有机体用于将二磷酸腺苷(ADP)转变成三磷酸腺苷(ATP)的酶。以这种酶，而不是以ATP作靶标，并通过用本发明的优选方法、试剂和试剂盒，可以使测定细胞内标志物腺苷酸激酶的灵敏度至少降低到10^-20摩尔。

已经知道可用虫荧光素酶/虫荧光素***来测定腺苷酸激酶(见：Brolin等，生物化学和生物物理方法杂志，1，(1979)163-169，和Shutenko等，Biotekhnologiya，No 4.(1988)542-547)，用于检测这种酶的活性和对某些哺乳动物及植物组织进行研究(例如见Rodionova等，Fiziologiya Rastenii(1978)，25，4，P731-734)。但是，还没有人提出将这种测定***用于检测和测定微生物，并且研究这种酶本身的人们还不了解这样做的优越性，即该方法能提供更高的灵敏度。

虽然腺苷酸激酶的存在量比ADP或ATP小，但是用它作为微生物的生物学标志物，通过它产生的ATP来测定它的存在，将得到更高的灵敏度，典型地可获得400,000倍的放大作用，也就是说，在10分钟的温育时间内，每摩尔酶可使400,000摩尔ADP转变成ATP。这样，通过测定这种酶催化反应的底物或产物，估计可提供低至10^-20摩尔的检测灵敏度。

申请人的共同未决PCT申请WO 94/17202涉及根据样品将ADP转变成ATP的能力来测定样品中微生物的一般方法，并将这种能力与微生物或者其细胞内物质的存在相关联。此专利申请例示了一些方法，其中镁离子是两分子ADP与每个腺苷酸激酶活性位点反应所必需的，但方法中未以试剂形式加入镁离子，而是通过存在于细菌细胞中的Mg²⁺和作为其它试剂的杂质成分来提供镁离子。在应用这种技术的实施例中，所测定的细胞数量被证实为大约是10²，统计学上更合理的结果是10³或更多；并可得到发光计数与细胞数量之间的线性关系。

本发明涉及一种改进的技术，在对ADP转变反应提供镁离子的反应条件下，以最佳的方式对腺苷酸激酶的活性进行测定，并且对其中所用的试剂进行处理，除去腺苷酸激酶，使试剂达到较高纯度，借此，每200μl样品中可被测定的微生物数量是大约几十个，而不是几百个，并且细胞与ATP产生的光之间线性关系的读数，有可能降低至10个细胞。

本发明的第一方面是提供了一种检测样品中微生物和/或其细胞内物质的存在和/或含量的方法，此方法的特征在于，样品中腺苷酸激酶的量是通过下述方法测定的：将样品与二磷酸腺苷(ADP)混合，确定通过样品ADP产生的三磷酸腺苷(ATP)的量，并将这样产生的ATP的量与腺苷酸激酶的存在/或含量相关联，进而与微生物和/或其细胞内物质的存在或含量相关联，其中ADP转变成ATP是在镁离子存在的条件下进行的，此镁离子的摩尔浓度足以容许ADP最大限度地转变成ATP。镁离子的优选含量足以对1摩尔ADP提供1摩尔镁，因而使所有的ADP分子都能与至少一个镁离子相关联。

在本发明这一方面的优选实施方案中，提供的样品是水悬液或溶液形式的，并且通过对样品加入ADP和镁离子来测定样品中的腺苷酸激酶，进而对微生物和/或其细胞内物质进行测定，在此条件下，样品中存在的所有腺苷酸激酶都将参与将ADP转变成ATP，对样品温育一个预定的时间以促进这种转变过程，加入虫荧光素酶和虫荧光素试剂，测定样品的发光量，并使之与腺苷酸激酶的存在和含量相联。

所加入的与样品混合的ADP的量，优选地足以在混合物中提供超过0.005mM的ADP浓度，更优选的是超过0.01mM，而最优选的是超过0.08mM，在转变步骤的混合物中，特别优选的ADP量是大约0.1mM。

在使用含有镁离子消除剂，例如用作螯合剂/多价螯合剂的EDTA和磷酸盐缓冲液等试剂的情况下，应该认识到，为了对ADP提供足够的镁离子，使之能达到最佳的转变，优选的是提供过量的镁离子。在ADP转变成ATP的过程中，对于上述优选的ADP浓度，悬液或溶液中优选的镁离子浓度是1mM或以上，更优选的是5mM或以上，而最优选的是10mM或以上。镁离子可以以任何镁盐的形式提供，优选的是醋酸镁。

本发明的一个优选的方案，是在温育开始时将虫荧光素/虫荧光素酶发光测定试剂加入到样品中，优选的是与ADP和镁离子源一起作为单一试剂加入。虫荧光素酶优选地应与提取剂分开贮存。

在本发明的方案中，当在ADP按此方式转变成ATP的转变过程开始时，就包含了所有的试剂，和/或作为一个单独的步骤，在加入虫荧光素/虫荧光素酶之后继续光度计计数测定，镁离子可以通过虫荧光素/虫荧光素酶试剂来提供。但是，由于镁离子能与EDTA和磷酸盐结合，有必要通过预备试验或计算来确定镁离子的含量。本领域的技术人员都会认识到，加入到给定的ADP、样品和虫荧光素/虫荧光素酶混合物中的最适镁盐量，可以用一个含有已知量细菌，如大肠杆菌(E.coli)的样品，通过常规的实验容易地测定出，这样可得到最大的信号。下面图3给出在以下实施例中加入到混合物中的醋酸镁的最适量的指标。

因为Mg²⁺离子会由于污染物腺苷酸激酶存在而促进ADP消耗，所以优选在使用之前，它们不应共同保存在溶液之中；螯合剂如EDTA可包含在ADP中，以阻止这个过程。镁离子和ADP可优选地在临使用之前混合，或者在ADP转变步骤中混合。当试剂合并在一起保存时，优选地是使它们保持在冷冻干燥状态，以避免ADP过早地转变成ATP。

如上所述，虽然可用其它测定方法，但ATP优选地用虫荧光素/虫荧光素酶***来测定，它能提供指示样品中ATP含量的光学可测定信号。本领域的技术人员都熟知用于测定ATP的虫荧光素/虫荧光素酶制剂和方法，并且它们是可购买到的(例如见Brolin等)。典型的制剂包含例如0.1-10mg/l的虫荧光素酶，15-1000μmol/l D-虫荧光素，以及如下试剂例如MgCl₂(2.5-25mmole)、EDTA、BSA和pH7的缓冲液(见例如EP 054676)。

对于在此所述的腺苷酸激酶测定法中的单一试剂，其pH优选地应调节至对两种酶都是最适的，这是为了在ADP转变成ATP的同时，能持续进行发光计数测定的一种折衷方案。该pH可以用一个已知菌数的样品，借助常规的实验来确定。

可将样品、ADP和镁离子源混合于能提供适合于腺苷酸激酶反应的pH值的任何缓冲液；不需要其他试剂。因此，能提供pH5.5-8.5的缓冲液都可以使用，而最佳pH范围是在pH6-7之间，优选的是pH6.5。适用的缓冲液的实例包括Tris缓冲液和磷酸缓冲液。最适当的做法是将样品在这种缓冲液中收集和/或稀释，为实施本发明的测定作好准备。

同其他放大测定法一样，本发明的腺苷酸激酶测定法的灵敏度也受到试剂纯度的限制。在本测定中，有重要影响的污染物是ADP底物中的ATP和虫荧光素酶制剂中的腺苷酸激酶。为了用于灵敏的微生物测定法，特别是当这些微生物可能是有害的，并需要在微量情况下进行测定时，对于本测定法中与之反应的物质，每种试剂的纯度都必须尽可能地高。

对于第一个问题，优选地是使用高纯度的商品ADP(纯度＞99.5％)，使用前用柱层析作进一步纯化处理。这样做是必要的，因为即使少量的ATP污染都可能引起高背景读数。例如，可用二乙氨基乙基纤维素层析柱并用0.02mM盐酸作洗脱液。与ADP相比较，ATP更慢地从层析柱中被洗脱出，达到使二者基本上分开的程度。使用其它层析介质和洗脱液组合也可以达到类似的效果，例如可用Nucleosil(注册商标，RTM)柱填充物(可以从Technicol，Stockport Cheshire UK得到)，如Nucleosil3(RTM)和Nucleosil 5(RTM)，用pH6的含有5mM硫酸四丁铵的以77∶23v/v的比率配制的0.06M KH₂PO₄：甲醇作洗脱液，通过高效液相色谱法(HPLC)进行分离。收集具有高ADP/ATP比率的级分备用，其纯度可通过虫荧光素/虫荧光素酶试剂介导的生物发光来测定，在腺苷酸激酶作用后测定ADP含量，在没有腺苷酸激酶作用时测定ATP污染物含量。

还可以用优选的Econopaq Q(RTM)强阴离子交换凝胶柱(Biorad-RTM)，以20mM磷酸钾在pH4.6下平衡，作KPi梯度洗脱，浓度至400mM，发现ADP被稳固地保留(strongly retained)，可作为一个连续的峰被洗脱出，ATP随后被洗脱出。按这种方法，可得到含有ATP摩尔百分数上限为2×10^-8的ADP。本申请人从文献知道的最纯的ADP是0.001％(见上述Shutenko等)，而本发明方法中提供的ADP，含有摩尔百分数小于0.001的ATP，更优选的是摩尔百分数小于2×10^-8或更少。

从底物ADP中除去ATP的另一个方法是使用能特异性降解ATP的酶，如虫荧光素酶或腺苷三磷酸双磷酸酶。这些酶可以用于进一步纯化已层析纯化的ADP，或者按另一种方法，可将经酶纯化过的ADP再用柱层析纯化处理。应该注意到，腺苷三磷酸双磷酸酶也是一种ADP酶，但是因为它对ATP具有更高的活性，并且ADP的浓度非常高，因此不存在大问题。

对于第二个问题，基本上作为一种“管家(housekeeping)”酶的腺苷酸激酶，实际上存在于所有的有机体内，因此通常也存在于虫荧光素酶制剂中。虽然可能只是微量的污染，但是因为测定的目标就是样品中浓度非常低的腺苷酸激酶，所以它在虫荧光素酶中的存在可能是一个限制因素。实际上本申请人已经测出(定义这种酶的1个活性单位(U)为：在20℃，pH7.8，存在0.5mM ADP和4.5mM Mg²⁺时，每分钟将1μmolADP转变成1μmol ATP的酶量)，市售虫荧光素酶可能含有10^-7U/ml或更高的腺苷酸激酶活性，而在它的底物虫荧光素中如果有的话，含量也非常低。因此，通常需用稳定剂使虫荧光素酶试剂稳定化，稳定剂通常是一种蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)，本申请人测定过的这种市售制剂，都具有显著的腺苷酸激酶活性。

虫荧光素酶和腺苷酸激酶的分子量显著不同，分别是61kD和21kD。而且，虫荧光素酶是一种膜结合蛋白质，因此是相对疏水的，而腺苷酸激酶是可溶性酶。这样就可以通过例如分子排阻层析法，反相层析法，或者同时运用这二种方法，从虫荧光素酶制剂中除去腺苷酸激酶。另一方面，或者除此之外，对腺苷酸激酶污染虫荧光素酶的问题，还可以通过在临检测之前或者刚刚开始检测时加入生物发光试剂(虫荧光素酶和虫荧光素)来避免，这样任何污染的腺苷酸激酶都没有时间产生显著的影响。

纯化虫荧光素酶的适当方法是通过柱层析进行分级分离，例如可用低孔隙度的凝胶如葡聚糖G-25(RTM)(Sephadex G-25)(见Nielsen和Rasmussen，Acta Chemica Scandinavica，22(1968)P1757-1762)；还可以依次使用Sephadex(RTM)柱和琼脂糖(Sepharose，RTM)柱(如Blue Sepharose)层析，和/或通过SDS电泳来纯化(见Devine等，生物化学和生物物理学报1172(1993)121-132)，或者通过提高环境温度使酶在其中老化(aging)一段时间。

为了从试剂如牛血清白蛋白中除去腺苷酸激酶活性，同样可以用柱层析法。在这方面已证明有效的另一种处理方法是对BSA作化学处理，处理后其稳定虫荧光素酶的能力仍然保留，但是腺苷酸激酶活性降低或完全消除了。任何用于消除蛋白质中酶活性的常规化学处理法，都可以同样地用于这个目的。另一方面，非蛋白质虫荧光素酶稳定剂，如甘油，可以用作BSA的补充或替代品。

例如，本申请人经测定确定，仅通过在酸性或碱性pH下作加热处理，就可以使市售的BSA中的腺苷酸激酶活性降低到其原有活性的2％以下或更低些。恰当而有效的处理是，在pH5.6或pH10下，50℃对BSA加热24小时。无腺苷酸激酶BSA的另一来源是化学处理的乙酰化BSA试剂，可从Sigma和BDH得到。本领域的技术人员将意识到，用其它方法化学处理的BSA也是适用的。

为了使所有与靶微生物有关的腺苷酸激酶都能与本发明的ADP、镁离子和虫荧光素酶/虫荧光素测定试剂相作用，有必要将微生物裂解，使之释放出细胞内物质或者使之易受试剂的作用。这种裂解处理可以用机械方法如超声波发生器来实现，还可应用渗透压冲击法，任选地结合冷冲击法，或者使用溶菌酶试剂，或更方便地是使用去污剂来实现。这种去污剂可以购买得到，通常被称为“提取剂(extractant)”。典型的提取剂包括通用的阳离子去污剂如CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，以及专利产品如Biotrace(RTM)XM提取剂(可以从Biotrace，Bridgend，UK获得)，CelcisUK阳离子提取剂和Lumac NRM(RTM)(核苷酸释放剂，可从LumacBV，Holland获得)。当使用CTAB时，适宜的制剂包括0.01-1％的CTAB水溶液，例如可用0.2％，但本领域的技术人员还可使用其他浓度。

因此，在将ADP和虫荧光素酶/虫荧光素试剂加入到怀疑含有微生物的待测样品中之前，优选地是通过使用裂解剂将微生物裂解，使其细胞内含物能与发光测定试剂接触。如果要求区分靶细胞和其它如真菌孢子细胞，可同时作两组测定，一组用非离子去污剂处理，其只能裂解那些孢子和多细胞动物“体”细胞(例如Triton TX-100(RTM))，另一组用上述的阳离子去污剂“提取剂”处理，能使所有细胞裂解。如果在用去污剂处理/加虫荧光素酶/进行测定的循环过程之间加入ATP酶，如腺苷三磷酸双磷酸酶，这两组测定将可在同一样品上进行，在循环的第一步骤中一个循环用非离子去污剂处理，另一个用阳离子去污剂处理，二者之间有过滤步骤。

已经知道，提取剂对虫荧光素酶/虫荧光素***的作用是重要的(见例如Simpson等(1991)，J.Biolumin Chemilumin 6(2)PP 97-106)，已知阳离子去污剂能使反应加强，但会引起虫荧光素酶逐渐失活，阴离子去污剂会抑制反应，而非离子型去污剂和两性离子去污剂能广泛地促进反应。发现将0.15％阳离子去污剂和0.25％叔二胺表面活性剂(从Celcis，Cambridge，UK获得)的混合物，用于本目的是令人满意的，但是，本领域的技术人员无疑会找到其它“提取剂”，当使之共存于同一溶液时，形成腺苷酸激酶和虫荧光素酶活性的最适混合。

在所有的基本步骤完成之后，即ADP转变成ATP，虫荧光素酶作用于虫荧光素后，从混合物中发出的光可通过将全部样品保留在例如光检测器内的光度计管中来测定，在加入虫荧光素酶和虫荧光素，或其它能促进此基本步骤的试剂之后立即或同时进行测定。

本发明第二方面提供了一个检测试剂盒，它包含本发明方法所需要的主要试剂，即二磷酸腺苷、一种镁离子源以及优选的虫荧光素酶和虫荧光素。该试剂盒优选地应包括所有这些试剂，并且虫荧光素酶和虫荧光素是作为单独的试剂溶液提供的，试剂盒中还带有适合于裂解待测靶细胞的去污剂。通常用于检测微生物时只需要阳离子去污剂，而如果真菌孢子和体细胞可能占优势，为了测定它们的数量，还可以包括非离子去污剂，该试剂盒优选地是一个独立包装形式，附有关于如何操作本发明方法的说明书，试剂被提供在容器内，其浓度适于直接使用或稀释后使用。

如果要在ADP开始转变成ATP之前加入镁离子，那么，与虫荧光素酶/虫荧光素试剂一起加入镁离子可能是适当的，但是，在这种情况下，镁离子应该过量，超过在试剂中结合于EDTA或磷酸盐的镁离子量，并且应该是既适合腺苷酸激酶又适合虫荧光素酶需要的最佳量。用于测定微生物时，镁离子优选地是随样品收集或稀释缓冲液一起加入，但对于特殊的应用，优选地采用其它的方式。最方便的是镁离子随样品收集或稀释缓冲液一起加入，ADP随去污剂和表面活性提取剂一起加入，还可任选地加入稳定剂如EDTA，虫荧光素酶与虫荧光素同时加入，这样就提供了一种三试剂的检测试剂盒。或者按另一种方法，可以采用冷冻干燥的单一试剂形式来提供这些试剂，这样它们在使用之前不会发生相互作用而引起如ADP的降解。

本发明优选的检测试剂盒包括纯度高于99.999％的ADP，以及含有BSA的，并基本上没有腺苷酸激酶活性的虫荧光素酶/虫荧光素试剂，另一方面，所采用的虫荧光素酶/虫荧光素的量的比例，应该使虫荧光素酶能够充分快速地作用于虫荧光素底物，使得在初始的发光结束之后，所有的虫荧光素酶都能与腺苷醛激酶产物ATP相结合，这个比例和/或它们的相对浓度在试剂盒的使用说明书中有注明，由此，产生腺苷酸激酶的微生物将通过快速的动力学反应，而污染物ATP通过发光被指示出来。

优选的纯化试剂可通过上述的方法得到。应该指出，虫荧光素酶中的腺苷酸激酶活性还可以通过将虫荧光素酶放置几个月或几年的时间来消除。

现在将仅根据如下非限制性实施例和附图，通过实例对本发明的方法、仪器、试剂和试剂盒进行说明。对于本领域的技术人员将可按照这些进一步构思出本发明的其他实施方案。

附图：

图1：用本发明改进的测定法，对200μl样品中的大肠杆菌(E.coli)进行测定，分别温育1分钟和5分钟之后加入虫荧光素/虫荧光素酶，以光度计检测信号的对数对大肠杆菌菌数的对数作曲线。

图2：在不存在镁离子时以光度计检测信号的对数对大肠杆菌细胞数的对数作曲线。

图3：显示镁离子浓度对光度计检测信号的影响，信号是在pH7.5和pH8.0时，从固定数量的绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)中测出，表明比未加入镁离子时信号增强了10倍。

实施例1：纯化的二磷酸腺苷试剂的制备

用液相色谱法进一步纯化高纯度(＞99.95％)商品ADP(Sigma)，用5ml Econopac Q提取柱(cartridge)(RTM)(Biorad-RTM)，以20mMpH4.6磷酸钾平衡，装入5ml 1mM的ADP(2.1mg)。进行KPi梯度洗脱，浓度至400mM，ADP被稳固地保留在柱上，并可在大约340mMKPi作为一个峰被洗脱出。一个泵(5ml/分钟)和一个梯度混合器被装在此***上，在200ml总量中形成50到1M KPi的梯度，以5ml为一个收集级分。ADP在级分12和17之间作为一个锐峰被洗脱出，在该梯度的终点开始出现ATP，在[KPi]浓度至1M之间洗脱出残留的ATP。从柱上得到的最纯ADP级分仅含有摩尔百分数少于2×10^-8的ATP。

实施例2：无腺苷酸激酶的虫荧光素酶试剂的制备

对购进的虫荧光素/虫荧光素酶试剂(Biotrace HM，RTM)，通过老化处理消除其中的腺苷酸激酶活性，包括以干燥状态放置12个月，其中在高环境温度(大约30℃)下放置数个月。

实施例3：无激酶虫荧光素酶试剂的另一种制备方法

按Devine等(1993)的方法，用使用上述Blue Sepharose(RTM)柱的柱层析法纯化购进的虫荧光素酶。

实施例4：无腺苷酸激酶的BSA的制备

用Sigma Fraction V(RIA Grad，Cat.No.A-7888)BSA，在200ml无菌水中配制成1％(重量/体积)的溶液，使其初始pH为5.6。取两个50ml的BSA样品，分别置于100ml的Duran瓶内，剩下的BSA溶液用5M NaOH调节至pH10，分别取50ml置于另两个Duran瓶内。加入乙基汞硫代水杨酸钠，使其终浓度为0.02％，以作为防腐剂阻止微生物生长，再将此瓶在37℃或50℃下温育24小时，然后恰当地用5M HCI或5MNaOH将每个瓶的pH调至7.6。腺苷酸激酶活性的测定方法如下：将100μl如上制备的BSA样品与100μl 30mM醋酸镁溶液混合，将此混合物置于光度计的35ml光度计管内，加入100μl在实施例1中制备的ADP溶液和100μl虫荧光素/虫荧光素酶试剂(Celcis，Cambridge UK)，该试剂已通过用柱层析和加入化学处理的BSA进行了去腺苷酸激酶活性处理，经5秒钟的延迟之后，可检测累计10秒以上的发光并贮存在计算机内，总共进行10次连续的10秒钟读数以测定ATP产生的速率，并进行重复测定。对从10ng/ml的ATP水溶液5μl(91飞摩尔)中的发光作4次重复测定，计算得：每飞摩尔的平均信号为2950。

结果：BSA样品在37℃温育后仍然清亮，而在50℃温育后则生成沉淀，在pH10沉淀轻微，在pH5.6沉淀非常严重。在pH10和50℃有轻微的变色。残留在这些样品中的腺苷酸激酶活性如表1所示，以每分钟的光度计读数表示。

建议使用更加温和的灭活形式，使用较长的时间间隔，或者如果打算长时间存放，BSA应立即被冷冻干燥，因为在pH10，50℃下仅2周之后就会由于变色作用的增加而不能使用了。在37℃下样品不会发生这种变化，因此，这就提供了一个较好的机会，可通过增加温育时间来减少稳定的无腺苷酸激酶BSA。Biotrace HM(RTM)试剂以干燥状态在40℃存放之后丧失了活性，这一事实表明了这种可能性。

表1： d[ATP]/dt处理计数t5-15 t95-105 差值 (fm.sec^-1)
表1： d[ATP]/dt处理计数t5-15 t95-105 差值 (fm.sec^-1)	37/5.6 9350 41727 23207 7.19845 26041 (平均值)11896 3294537/10 7192 30602 17943 5.55047 205574469 1937750/5.6 606 1191 595 0.18343 94850/10 460 1014 500 0.15342 847314 754

实施例5：带有BSA的虫荧光素/虫荧光素酶试剂的制备

虫荧光素/虫荧光素酶的商品制剂通常含有B5A，将上面实施例4中化学处理的BSA或购得的乙酰化-BSA(如从BDH或Sigma购得)，与无腺苷酸激酶的虫荧光素酶按正常比例混合，并掺入其它一些标准Celcis试剂，从而提供一种在其测定体积中(即300μl)腺苷酸激酶活性小于10^-9单位(U)的Celcis LDR虫荧光素/虫荧光素酶发光试剂。

实施例6：本发明的检测试剂盒

本发明提供了由下列部分组成的检测试剂盒：

(i)一个装有用于样品收集或稀释的15mM醋酸镁溶液的容器；

(ii)一个装有纯化的ADP溶液的容器(对于ATP来说，溶液中ADP的纯度＞99.99999998％)，溶液如实施例1中所述制备，在磷酸钾(7.5mM，pH6.5)缓冲液内，浓度为0.3mM，并含有0.2mM EDTA和由0.15％阳离子去污剂和0.25％叔二胺表面活性剂组成的混合提取剂。

(iii)一个装有虫荧光素/虫荧光素酶LDR(Celcis，Cambridge，UK)生物发光试剂的容器，试剂中的腺苷酸激醇活性小于10^-8U/100μl。

在试剂盒包装内，还可任选地包括一个装有非离子去污剂溶液(TritonX-100(TRM)，0.2％或等价物)的容器，和/或一个装有ATP酶如腺苷三磷酸双磷酸酶的容器，这种酶是用于分解由于非离子去污剂对样品作用而释放的ATP，使之适用于通过加入阳离子去污剂进行再测定。

实施例7：用本发明的方法测定已知量E.coli

用培养1周的E.coli(大肠杆菌)肉汤培养物作原菌液(stock)，其每200μl pH7.4的磷酸盐缓冲的溶液中含有大约2.2×10⁷个微生物，用含有镁离子的样品收集/稀释试剂(实施例6中的(i)作10次连续稀释，得到每200μl样品中含有10⁷至0.1个微生物的系列样品。

将200μl样品加到3.5ml的光度计管中，加入100μl ADP/提取剂(实施例6中的(ii))，混合物总量为300μl，在室温下温育1分钟或5分钟。温育完成后立即加入100μl改进的Celcis LDR生物发光试剂(实施例6中的(iii))，用Biotrace M3(RTM)光度计，先测定第一个10秒间隔的发光，然后每10秒间隔测定一次，直到1分钟，以累计的方式测定发光的增加。从最后的读数中减去起始信号值，得到的信号测定结果以每分钟的读数表示。

参考图1可以看出本发明方法的效能，由图可见，对于每份样品含10个和10个以上细菌的样品与ADP混合温育5分钟之后，以及每份样品含100个和100个以上细菌的样品与ADP混合温育1分钟之后，在E.coli的数量与样品发光之间都可得到符合统计学的线性响应，这两种情况的测定极限都是大约10个细菌。本方法与WO 94/17202的方法相比，显得非常优越，后者对含有100个细菌的样品温育1分钟之后仅有26cpm(每分钟计数)差值，对含有1000个细菌的样品仅有67cpm差值，仅在1000个或1000个以上细胞的情况下才能得到线性响应。相比之下，按本发明的方法，每份含有1000个细胞的样品，1分钟温育后可得到几千cpm的信号增加值。

应该意识到，为了对一个未知微生物数量的样品用本方法进行测定，可以如图1和图2(例如以对数值)所示，以微生物的已知数量对发光计数作图，制作一条标定曲线，用同样的测定方案，从含有未知数量的微生物(包括零个微生物)样品得到计数，则可估算出样品中微生物的数量，该数量与曲线上相同的读数值相对应。

本领域的技术人应该认识到，存在于某一特殊微生物，如细菌中的腺苷酸激酶的量，可能与其它微生物的不同。例如，根据其大小，酵母菌比细菌含有较多的腺苷酸激酶，实际上，可用此方法测出单个酵母。因此，对于某一给定的微生物，可能需要制作一条特定的标定曲线，并且对于不同状态的相同微生物，如被减弱的微生物、处于pH或氧紧张状态的微生物，也可能需要制作特定的标定曲线。但是，本发明方法优于现有的以ATP为基础的方法的另一个优点是，腺苷酸激酶的含量同在细胞代谢中被消耗的高度可变的ATP含量相比较，与细胞的数量有更紧密的关系。

Claims

1.一种测定样品中微生物和/或其细胞内物质的存在和/或含量的方法，此方法的特征在于，样品中腺苷酸激酶的含量是由下述方法测定的：使样品与二磷酸腺苷(ADP)和作为试剂加入的镁离子源混合，检测样品由ADP生成的三磷酸腺苷(ATP)的量，并将产生的ATP的量与微生物和/或其细胞内物质的存在和/或含量相关联。

2.权利要求1的方法，其中镁离子以足以使ADP最大限度地转变为ATP的摩尔浓度加入。

3.权利要求1的方法，其中加入的镁离子的含量足以对1摩尔ADP提供1摩尔镁，使所有的ADP分子都可能与至少一个镁离子相关联。

4.权利要求1的方法，其中样品是以水悬液或溶液的形式提供的，微生物和/或其细胞内物质的测定是按下述方法进行的：向样品加入ADP和镁离子，所用的条件使得任何存在的腺苷酸激酶都将使ATP转变成ATP，对样品温育一个预定的时间，以促进这种转变过程，加入虫萤光素酶和虫萤光素试剂，测定来自样品的发光量，并使之与微生物和/或其细胞内物质的存在和含量相关联。

5.权利要求1的方法，其中与样品混合的ADP的量足以在混合物中提供超过0.005mM的ADP浓度。

6.权利要求5的方法，其中ADP超过0.08mM。

7.权利要求5的方法，其中ADP的浓度是大约0.1mM。

8.权利要求1的方法，其中在ADP转变成ATP的过程中，镁离子在悬液或溶液中的浓度是1mM或更高。

9.权利要求8的方法，其中镁离子在悬液或溶液中的浓度是10mM或更高。

10.权利要求1中任一权项的方法，其中镁离子是以醋酸镁的形式提供的。

11.权利要求4中任一权项的方法，其中虫萤光素/虫萤光素酶发光试剂是在温育开始时，作为带有ADP和镁离子源的单一试剂加入样品中的。

12.权利要求1中任一权项的方法，其中镁离子源和ADP在使用前是以干燥的形式或在单独的溶液中保存，在临使用之前，或在ADP的转变步骤中，将它们混合或制成水溶液。

13.权利要求1的方法，其中镁离子源和样品是在加ADP之前被混合的。

14.权利要求13的方法，其中样品是在含有镁离子源的溶液中被收集或稀释的。

15.权利要求1的方法，其中ADP转变成ATP的过程是在pH5.5-8.5的条件下进行的。

16.权利要求1的方法，其中ADP含有的ATP的摩尔百分数低于0.001％。

17.权利要求16的方法，其中ADP含有2×10^-8摩尔％ATP或更少。

18.权利要求16的方法，其中ADP在使用之前被保存在有螯合剂的条件下，以防止污染物腺苷酸激酶过早地将它转变成ATP。

19.权利要求4的方法，其中虫萤光素酶/虫萤光素试剂含有少于10^-7U/ml的腺苷酸激酶。

20.权利要求19的方法，其中虫萤光素酶/虫萤光素试剂含有经化学处理消除了其腺苷酸激酶活性的牛血清白蛋白。

21.权利要求1的方法，其中样品用裂解微生物细胞的提取剂处理，使它们的腺苷酸激酶与ADP和镁离子接触。

22.权利要求21的方法，其中细胞是真菌孢子或真核细胞，提取剂含有非离子去污剂。

23.权利要求21的方法，其中要对全部细胞进行检测和/或定量，提取剂含有阳离子去污剂。

24.权利要求23的方法，其中提取剂还包含表面活性剂。

25.权利要求21的方法，其中细胞是细菌细胞，而其中从被阳离子去污剂和表面活性剂释放的ATP中减去被非离子去污剂释放的ATP，剩余量与细菌细胞数量相关联。

26.一种用权利要求1-25中任一权项的方法检测和/或定量测定微生物和/或其细胞内物质的检测试剂盒，其包括ADP和镁离子源，以及一种提取剂，微生物腺苷酸激酶与它们接触使得ADP转变为ATP。

27.权利要求26的检测试剂盒，其还包括以生物发光试剂形式存在的虫萤光素酶和虫萤光素，当ATP存在时它们能发光。

28.权利要求27的检测试剂盒，其包括一种作为样品收集或稀释溶液的镁离子源。

29.权利要求28的检测试剂盒，其中收集或稀释缓冲液包含醋酸镁。

30.权利要求27-29中任一权项的检测试剂盒，其中ADP与去污剂和/或表面活性剂提取剂共同存在。

31.权利要求27-30中任一权项的检测试剂盒，其中的ADP、镁离子源和生物发光试剂是用三个独立的容器提供的。

32.权利要求27-30中任一权项的检测试剂盒，其中的全部试剂是以单一的冷冻干燥试剂形式提供的。

33.权利要求26-32中任一权项的检测试剂盒，其中对于ATP来说，ADP的纯度高于99.999％。

34.权利要求26的检测试剂盒，该试剂盒包含一种腺苷酸激酶活性小于10^-7U/ml的生物发光试剂。

35.权利要求33的检测试剂盒，其中生物发光试剂包含经化学处理而消除了腺苷酸激酶活性的牛血清白蛋白。

36.权利要求26-35中任一权项的检测试剂盒中所用的试剂，其中对于ATP来说，其所含的ADP的纯度高于99.999％。

37.权利要求36的试剂，其还包含足以防止污染的腺苷酸激酶将ADP转变为ATP的螯合剂。

38.权利要求37的试剂，其中螯合剂包括EDTA。