JP6506700B2 - 細胞レベルｆｉｓｈドットカウントのための方法及びシステム - Google Patents

Description

本発明は、細胞レベルＦＩＳＨドットカウントのためのコンピュータ実装方法及びシステムに関する。

蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）ドットカウントは、中間期細胞核の染色体異常を列挙する処理である。この処理は、生物医学研究の多くの分野で使用され、特に、癌の診断及び治療の決定において広く使用されている。例えば、乳癌は世界的に女性の最も一般的な癌である。アジュバント標的治療及び／又は化学療法投薬の適格性を決定する場合に、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）遺伝子のコピー数は乳癌患者にとって重要である。１つのＦＩＳＨ検査は、細胞がＨＥＲ２遺伝子の余分なコピーを有するかどうかを調べるために用いることができる。ＨＥＲ２遺伝子のより多くのコピーを有する細胞は、より多くのＨＥＲ２受容体を有することが知られており、それは乳癌細胞の増殖を刺激する信号を受け取る。この方法を用いると、細胞内の対象部分は蛍光顕微鏡下で有色ドットとなって現れる。ＨＥＲ２プローブは、染色体１７番動原体（ＣＥＰ１７）を調べる際には、オレンジ色に染色されたスポットとして見えるが、遺伝子ＨＥＲ２がある染色体は、緑色のスポットとして見える。カラードット可視化方法によれば、細胞内のドットをカウントすることによって、ＨＥＲ２遺伝子のコピー数を推定することができる。往々にして、ドットカウントは近似する必要があり、したがって手動で行われる。しかし、主観的であることに加えて、ＦＩＳＨドットの手動カウントは時間がかかり、疲労する。

何人かの研究者は、ＦＩＳＨドットの自動カウントのためのアルゴリズムを提案している。例えば、数学的モーフォロジー及び逆多重フラクタル解析に基づく方法が、トップハットフィルタ処理及び３Ｄ領域成長に基づく方法と同様に使用されている。別の手法は、実信号をノイズから分離するために、トップハットフィルタ処理及びそれに続くテンプレートマッチングを用いた。これらのアルゴリズムを用いても、自動によるＦＩＳＨドット検出は、特に背景アーチファクト（図１Ａ）、細胞核とＦＩＳＨドットとの密なクラスタ（図１Ｂ）、及び／又は低いＦＩＳＨドットコントラスト（図１Ｃを参照）が存在する場合には困難である。したがって、当技術分野の技術水準を前進させ、ＦＩＳＨドット検出及びカウントの課題に対処する自動検出及びカウントアルゴリズムを開発するための持続的なニーズがある。

本発明は、一般的には、生物学的サンプルの細胞レベルＦＩＳＨドットカウントのコンピュータ実装方法に関する。コンピュータはプロセッサを含み、本方法は、プロセッサによって、核の対比染色試薬で染色された生物学的サンプルの第１の画像を受け取るステップと、プロセッサによって、核の対比染色試薬からの信号の輝度に基づいて、生物学的サンプルの核をセグメンテーションすることによって、画像を核の対比染色試薬マスクに変換するステップと、プロセッサによって、蛍光インサイツハイブリダイゼーションプローブ（ＦＩＳＨプローブ）で染色された生物学的サンプルの第２の画像を受け取るステップと、プロセッサによって、ＦＩＳＨバイナリマスクを抽出するために、マルチレベル拡張ｈ最大値又はｈ最小値を画像に適用するステップと、検出された信号に従って、プロセッサによって、核の対比染色試薬マスク及びＦＩＳＨバイナリマスクを位置合わせして重ね合わせるステップと、任意に、プロセッサによって、極大値及びサイズ制限を用いて各核の内部のＦＩＳＨドットの数をカウントするステップとを含む方法である。

別の態様では、本発明は、コンピュータに、上記の方法を実行させることができる非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、細胞レベルＦＩＳＨドットカウントのためのシステムを提供し、システムは、プロセッサと、プロセッサに結合され、画像データを受け取るように構成された入力と、プロセッサに結合され、コンピュータ実行可能命令を含むメモリとを含み、コンピュータ実行可能命令は、プロセッサによって実行される場合に、プロセッサに対して、上記の方法を実行させる。

本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しつつ以下の詳細な説明を読めば、よりよく理解されよう。添付の図面では、図面の全体にわたって、類似する符号は類似する部分を表す。

背景アーチファクトを示す乳癌画像の例を示す顕微鏡写真であり、Ａは雑音及びアーチファクトを含むＨＥＲ２ ＦＩＳＨ画像、Ｂは高密度な核及びＦＩＳＨドットのグレースケール合成画像、Ｃは低いコントラストのＨＥＲ２ ＦＩＳＨ画像である。白い矢印は、ＨＥＲ２ ＦＩＳＨドットを示す。 細胞レベルＦＩＳＨカウントアルゴリズムのフローチャートである。 トップハットフィルタ処理を用いた背景減算の結果を示す顕微鏡写真である。 サンプルのＦＩＳＨドット検出結果を示す一連のグレースケール顕微鏡写真である。 アルゴリズム１、すなわち細胞毎に最良のレベルを設定するためのルールベースのアルゴリズムを示す図である。 最終ＦＩＳＨカウントステップを示す図であり、（Ａ）は細胞の輪郭が重畳されたＨｅｒ２ ＦＩＳＨ画像からの細胞、（Ｂ）はトップハットフィルタ処理の結果、（Ｃ）はＦＩＳＨ（前景）検出、（Ｄ）は検出された極大点、（Ｅ）は９ドットから８ドットが検出された初期ドット分離、（Ｆ）は９ドットのサイズベースの制約結果を用いた最終的なカウントを示す。 カウント方法及び選択されたＦＩＳＨドット検出結果の対応する顕微鏡写真である。

生物学的サンプルの２次元蛍光画像のＦＩＳＨドットの細胞レベルカウントのための方法を開示する。本明細書で用いられる用語「生物学的サンプル」は、生物学的被検体から得られたサンプルを指し、インビボ又はインビトロで得られた生物学的組織又は流体に由来するサンプルを含む。このようなサンプルは、これらに限定されないが、体液（例えば、血液、血漿、血清、又は尿）、器官、組織、画分、ヒト及び細胞小器官を含む哺乳動物から分離された細胞であってもよい。また生物学的サンプルは、組織（例えば器官又は組織の断面部分）を含む生物学的サンプルの一部分を含んでもよい。また生物学的サンプルは、生物学的サンプルからの抽出物を含んでもよい。生物学的サンプルは、タンパク質、炭水化物、又は核酸を含んでもよい。

生物学的サンプルは、原核生物由来、古細菌由来、又は真核生物由来（例えば、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、爬虫類）であってもよい。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルが哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ロバ、モルモット、又はウサギ）である。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、霊長類由来（例えば、チンパンジー又はヒト）である。

特定の実施形態では、図２に示すように、カウントの方法は、核の対比染色試薬により生物学的サンプルを染色し、画像を取得するステップを含む。核の対比染色試薬の非限定的な例としては、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）等の青色蛍光対比染色試薬、並びにプロピジウムヨウ素等の緑色、黄色、オレンジ、又は赤色の蛍光対比染色試薬が挙げられる。本方法は、さらに、核の対比染色試薬マスクを生成するために画像をセグメンテーションされた画像に変換するステップを含み、例えばＤＡＰＩを使用する場合には、ＤＡＰＩマスクが生成される。特定の実施形態では、対比染色試薬マスクは、細胞核を画定するための２次元ウェーブレットベースのセグメンテーションアルゴリズムを用いて取得されてもよい。この後に、ＦＩＳＨドット検出及びカウントが続き、これによって、様々な画像コントラストを考慮するマルチレベルｈ最小変換手法を用いることができる。このステップに先立って、画像ノイズをきれいにし（ノイズ除去又は画像のノイズ除去と呼ぶことができる）、背景を減算し、ＦＩＳＨドットのコントラストを向上させるために、メジアン及びトップハットフィルタを用いる画像前処理を行ってもよい。マルチレベルｈ変換後に、ＦＩＳＨドットカウントが進行することができ、クラスタ化したＦＩＳＨドットが検出に基づく極大値を用いて分離される。特定の実施形態では、制約条件に基づくＦＩＳＨドットサイズのフィルタリングは、密にクラスタ化したドットの大きな連結成分を明らかにするために使用されてもよい。

単一細胞レベルでの正確なドット定量化結果を達成するために、重要なステップは、細胞核の正確なセグメンテーションを得ることである。このように、ほぼ少なくとも３つの核の対比染色試薬で染色された（例えばＤＡＰＩで染色された）画像の３次元スタックは、生物学的サンプルによる様々な焦点深度で取得することができる。各スタックは、いくつかの焦点が合ったスライスのみを含むことができる。したがって、特定の実施形態では、最も良く焦点が合ったスライスは、各画像／スライスのブレナー勾配値を計算することによって選択される。それから、ウェーブレットベースのセグメンテーションアルゴリズムを、選択された焦点が合ったスライスに適用することができる。

ウェーブレットベースの手法は、いくつかの理由で有利であり得る。すなわち、ウェーブレットは、効果的なスケール空間分析を可能にする空間ドメイン及び周波数ドメインの両方に画像を分解し、複数のスケールにまたがってウェーブレットの計算が高速で、コンピュータ処理上効率的であり、パラメータの数を制限することができる。画像のノイズを除去し、細胞をセグメンテーションするために、画像のシフト不変型ウェーブレットフレーム変換に基づくアルゴリズムを、非突出ウェーブレット係数のフィルタ処理と同様に使用することができる。各レベルの間引き動作が省略される以外は、ウェーブレットフレームは、標準的なウェーブレット変換と同じである。分解は、次の式１及び２のように表される。

分解を用いることで、ウェーブレット係数空間において、直接的に画像のノイズ除去をすることができる。画像ノイズが加法的なものであるとすると、対応するウェーブレット変換は、基礎となる信号Ｗⁱにより生成された係数及び画像ノイズＷ^Nに対応する係数になる。

このウェーブレットベースのセグメンテーションアプローチは、比較的低い対ノイズコントラストが存在する場合、及びゆっくり変化する背景として現れる平坦な場の影響が存在する場合であっても、セグメント画像に使用することができる。

生物学的サンプルの核の対比染色に加えて、生物学的サンプルの核のセグメンテーション、ＦＩＳＨ染色も同時に又は逐次的に行うことができる。ＦＩＳＨ染色は、色素の吸収／発光波長の違いに基づいて、核の対比染色と区別することができる。

ＦＩＳＨ検出及びカウントステップは、１）画像前処理及び背景減算、２）前景抽出、並びに３）カウントの３つのステップを含む。

特定の実施形態では、画像前処理及び背景減算は、核の対比染色画像の変換と同様である。このように、ほぼ少なくとも３つのＦＩＳＨ画像、好ましくは少なくとも５つの、より好ましくは少なくとも１０のＦＩＳＨ画像の３次元スタックが、生物学的サンプルにより様々な焦点深度で取得される。わずかな数の画像が焦点が合っている。最も良く焦点が合っているスライスは最大のブレナー値を有しており、それを見つけるために、３次元画像スタックのブレナー勾配値が計算される。そのスライスに加えて、前後のスライスが抽出され、最大２次元投影が適用される。それから、画像ノイズを低減する、又はノイズ除去を行うために、メジアンフィルタ処理を最大投影像に適用する。最後の前処理ステップは、トップハットフィルタ処理を用いる背景減算／クリーニングである。ＦＩＳＨドットは小さな輝点として現れるので、トップハットフィルタを用いることができる。それは、グレースケール又は２値画像に形態学的フィルタ処理を行う。それは最初に画像の形態学的オープニングを計算して、近似的な背景画像を生成するが、ここで背景とは非ＦＩＳＨドット信号を意味する。それから、それは原画像から背景画像を減算する。数学的には、これは次の式５のように表される。

特定の実施形態では、画像前処理及び背景減算に続いて、ＦＩＳＨバイナリマスクを画像から抽出する。前のステップで述べたように、ＦＩＳＨドットは小さな輝点であると予想される。したがって、ｈ最大値及びｈ最小値などの形態学的方法は、双対演算であり、ＦＩＳＨ検出を助けることができる。しかし、このセクションで後述するように、コントラストが変化するドット及び／又は画像の密なクラスタを扱う場合には、これらの方法をそのまま適用することは失敗するおそれがある。

これらの限界を克服するために、マルチレベル拡張ｈ最小値変換（又はｈ最大値）を用いるＦＩＳＨドット検出方法を、自動レベル選択により用いることができる。単一レベル拡張ｈ最小値変換は、ｈ最小値変換の局所的最小値を抽出する。それは、深さが輝度値ｈよりも小さい画像中の全ての最小値を抑制するために、レベルｈでｈ最小値変換を適用することにより開始する。それから、得られる画像の局所的最小値を抽出する。ｈの値が慎重に設定されている場合には、ｈ最小値変換は、非ＦＩＳＨドット画素について均一な背景を生成する。その場合には、局所的最小値を抽出することは、画像内の非ＦＩＳＨ画素の全てを抽出する。逆をすることで、ＦＩＳＨドットマスク（レベルｈ）が得られる。数学的には、これは、式６のように表される。

上記の単一レベル手法の主な限界は、画像内の様々な（不均一な）コントラストを扱うことである。その場合には、大きなｈ値（高いレベル）を用いることにより、非常に明るいスポットのみを検出するおそれがある。非常に小さなｈ値（低いレベル）を用いる場合には、低コントラスト領域のより暗い（又は薄暗い）ドットのみを検出するおそれがある。しかし、それは高コントラストの画像領域において誤った検出をする可能性が高くなり得る。一例を図４に示しており、２つの関心領域（ＲＯＩ１及びＲＯＩ２）が同じ画像から抽出され、３つのｈ値を用いて処理された。明らかなように、より高いｈ値（低感度）は第１のＲＯＩに対してより良好な検出結果を生成したが、しかし、より低いｈ値（高感度）は第２の（低コントラスト）ＲＯＩに対してより良好な検出結果を生成した。このことが、マルチレベル手法を開発する動機になった。

マルチレベル手法では、画像は、３つのｈ値（ｈ₀：低感度、ｈ₁：中感度、及びｈ₂：高感度）を用いて処理される。それから、細胞毎に最良の感度レベルが他の細胞とは独立して選択される。細胞ｉのレベルｊの受容又は拒絶は、コントラストスコア（式６ａ）を計算することによって行われる。

所与の細胞についてのコントラストスコアは、閾値より大きいその細胞内の画素の比を示す。閾値は、細胞の背景（非ＦＩＳＨ）画素の輝度統計を用いて計算される。数学的には、Ｐ_iは、次のように定義される（式７）。

２つの閾値、すなわち受入閾値Ｔ₁（０．６に設定）及び高検知閾値Ｔ₂（０．９に設定）を定義する。それから、図５に示すようなアルゴリズム１で説明したように、細胞毎に最良のレベルを自動的に選択するためにルールベース法が使用される。

３つのｈレベルは、上記の手法を適用する前に定義する必要がある。したがって、これらのレベルを自動的に推定する簡易な方法を開発した。この方法は３段階で進行する。

特定の実施形態では、プロセッサは、１以上のステップを自動化することが可能であり、データ解析を可能にするように構成することができる。またプロセッサは、コントローラによって実行された場合に、多重化デバイスに対して、説明した解析方法を実行させる命令を含む機械可読媒体を含んでもよい。

実験
一例では、各々がいくつかの乳癌（スライドあたり１２〜２４点の範囲）の組織サンプルを含む１９のスライドについて、合計で３００スポット／画像より多くが処理された。提案するＦＩＳＨドットカウントアルゴリズムの性能を定量的に評価するために、自動カウント結果を、１９個のスライドから得られた１６７スポット／画像から選択された８８０個の細胞の手動カウントと比較した。手動カウントは、画像を調査した専門家によって、拡大／縮小することができ、３次元スタックをナビゲートすることができ、さらに選択的にチャネルをオン／オフさせる能力を有し、複数のチャネルを同時に観察することができる画像可視化ツールを用いて行われた。細胞レベルのドットカウント精度を評価するために、２つのメトリックが定義された。第１のメトリック（タイプＡ誤差）は、細胞の分類一致である。２つクラス、すなわち正常及び癌性が定義された。正常な細胞（非癌性）は、３以下のＨＥＲ２及びＣＥＰ１７ドットを有するものとして定義された。それ以外は、細胞は癌性として分類される。第２のメトリック（タイプＢ誤差）は、ドットカウントマッチであり、絶対カウント数の２０％より大きい差は誤差としてみなされる。例えば、手動で１０ドットが見いだされた場合には、８〜１２ドットの範囲の自動カウントはタイプＢ誤差とみなされない。

このようなＦＩＳＨカウントの結果を図６に示してあり、画像は最終的なＦＩＳＨカウントステップを示す。図６では、画像（Ａ）は、細胞の輪郭が重畳されたＨｅｒ２ＦＩＳＨ画像からの細胞の拡大顕微鏡写真である。顕微鏡写真（Ｂ）は、トップハットフィルタ処理の結果である。顕微鏡写真（Ｃ）はＦＩＳＨ（前景）検出を示し、（Ｄ）は検出された極大点を示す。顕微鏡写真（Ｅ）は、９ドットから８ドットが検出された初期ドット分離の結果である。顕微鏡写真（Ｆ）は、９ドットのサイズベースの制約結果を用いた最終的なカウントを示す。

アルゴリズムによって、８８％の細胞毎の分類一致（タイプＡ）、及びドットカウントマッチ（タイプＢ）について正確に同じレート（８８％）が得られた。分類一致誤差及びカウントマッチ誤差を結合する（和集合をとる）と、全体の精度は８１％である（１６５の誤差）。表１は、正常組織及び腫瘍組織の両方について、誤差タイプの百分率によりカウント結果をまとめたものである。より高い値は、より大きい誤差を示す。タイプＡ誤差又はタイプＢ誤差を用いて別々に測定した場合は、両方とも約１２％の全体的な誤差率となる。両方が実施される場合には、誤差率は１９％まで増大し、それらが異なる誤差を測定することを示している。

図７は、検出されたドットが重畳された、セグメンテーションされた核のギャラリーを示す。細胞毎に、合成画像、ＨＥＲ２及びＣＥＰ１７チャネル、並びに自動及び手動によるドットカウント数を比較する表を示す。本アルゴリズムの精度をさらに検討するために、カウント誤差を検査し、核のセグメンテーション誤差により生じる１６５個の誤差のうち３５個を見いだした。それらの細胞を除いて、本アルゴリズムは、８４．６％の全体的な精度が得られた。本アルゴリズムは、計算上高価なステップを含んでおらず、効率的かつ高速である。平均して、２．６７ Ｃｏｒｅ ｉ７プロセッサ及び４ＧＢのメモリを備えたデスクトップを用いて、１２スライスの２０４８×２０４８画像／スタックを処理するのに３０秒かかる。

記載した方法が、所与の組織サンプルにおけるその存在が癌の指標及び／又は患者の転帰の予測となり得る、細胞タイプの位置及び識別を可能にすることができることを理解されたい。重要であることが判明した細胞タイプは、細胞スタックモンタージュによるバイオマーカー署名及びそのメンバーの無作為選択を可視化することにより調査することができる。結果は、疾患進行の機構に関する仮説を生成するために使用することができる。

特定の実施形態では、記載した解析方法は、薬物治療の有効性を判定し、薬物の分子経路を解析し、又は環境暴露もしくは他の可能な癌の原因物質の可能な原因及び効果を解析する等の予測結果についての研究に用いることができる。このように、本方法は、研究、予測、又は治療の用途を有することができる。

Claims (21)

1. 生物学的サンプルの細胞レベルＦＩＳＨドットカウントのコンピュータ実装方法であって、コンピュータがプロセッサを含んでいて、当該方法が、
   ａ．プロセッサによって、核の対比染色試薬で染色された生物学的サンプルの第１の画像を受け取るステップと、
   ｂ．プロセッサによって、核の対比染色試薬からの信号の輝度に基づいて、生物学的サンプルの核をセグメンテーションすることによって、画像を核の対比染色試薬マスクに変換するステップと、
   ｃ．プロセッサによって、蛍光インサイツハイブリダイゼーションプローブ（ＦＩＳＨプローブ）で染色された生物学的サンプルの第２の画像を受け取るステップと、
   ｄ．プロセッサによって、ＦＩＳＨバイナリマスクを抽出するために、マルチレベル拡張ｈ最大値又はｈ最小値を画像に適用するステップであって、細胞（ｉ）毎の最良のｈレベルが、ルールベース法を用いて、プロセッサによって選択され、ルールベース法が、レベルを受容又は拒絶するため、以下に定義するコントラストスコアをプロセッサによって計算することを含んでいる、ステップと、
   
   ｅ．検出された信号に従って、プロセッサによって、核の対比染色試薬マスク及びＦＩＳＨバイナリマスクを位置合わせして重ね合わせるステップと、
   ｆ．任意に、プロセッサによって、極大値及びサイズ制限を用いて各核の内部のＦＩＳＨドットの数をカウントするステップと
   を含んでいる、方法。
2. 前記ルールベース法は、前記コントラストスコアを受入閾値及び高検出閾値と比較することを含む、請求項１記載の方法。
3. 核の対比染色試薬で染色された生物学的サンプルの第１の画像が、生物学的サンプルによる３つ以上の焦点深度で取得された一連の画像を表し、生物学的サンプルの核をセグメンテーションするステップが、
   プロセッサによって、画像の各々のブレナー勾配値を計算するステップと、
   ブレナー勾配値に基づいて、最も良く焦点が合っている画像を選択するステップと、
   プロセッサによって、多重スケールで画像をウェーブレット係数に分解するために、ウェーブレットベースのセグメンテーションアルゴリズムを画像に適用するステップと
   を含んでいる、請求項１記載の方法。
4. 蛍光インサイツハイブリダイゼーションプローブで染色された生物学的サンプルの第２の画像が、生物学的サンプルによる３つ以上の焦点深度で取得された一連の画像を表す、請求項１記載の方法。
5. 一連の画像が、プロセッサによって強化されるステップを含み、
   プロセッサによって、画像の各々のブレナー勾配値を計算するステップと、
   ブレナー勾配値を用いて、最も良く焦点が合っている画像を選択するステップと、
   プロセッサによって、画像のノイズを低減するためにメジアンフィルタを用いてノイズ除去するステップと、
   プロセッサによって、画像のコントラストを強化するために、トップハットフィルタ処理を用いて画像の背景減算を実行するステップと
   によって強化される、請求項１記載の方法。
6. 個々のＦＩＳＨドットをカウントするステップは、プロセッサによって、クラスタ化したＦＩＳＨドットを個別のＦＩＳＨドットに分離し、得られたオブジェクトを個々のＦＩＳＨドットとして分類するステップをさらに含んでいる、請求項１記載の方法。
7. プロセッサによってＦＩＳＨドットをカウントするステップが、
   検出されたＦＩＳＨマスク内の極大値を検出するステップと、
   接触するドットを分離するためにシード分水嶺アルゴリズムを適用するステップと、
   任意に、所定の最大面積に基づいて残りの大きなオブジェクトをさらに分割するために、面積ベースの手法を適用するステップと
   を含む、請求項６記載の方法。
8. コンピュータ実行可能命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、コンピュータ実行可能命令は、コンピュータによって実行された場合に、コンピュータに対して、
   ａ．核の対比染色試薬で染色された生物学的サンプルの第１の画像を受け取る処理と、
   ｂ．核の対比染色試薬からの信号の輝度に基づいて、生物学的サンプルの核をセグメンテーションすることによって、画像を核の対比染色試薬マスクに変換する処理と、
   ｃ．蛍光インサイツハイブリダイゼーションプローブ（ＦＩＳＨプローブ）で染色された生物学的サンプルの第２の画像を受け取る処理と、
   ｄ．ＦＩＳＨバイナリマスクを抽出するために、マルチレベルに拡張されたｈ最大値又はｈ最小値を画像に適用する処理であって、細胞（ｉ）毎の最良のｈレベルが、ルールベース法を用いて、プロセッサによって選択され、ルールベース法が、レベルを受容又は拒絶するため、以下に定義するコントラストスコアをプロセッサによって計算することを含んでいる、処理と、
   
   ｅ．検出された信号に従って、核の対比染色試薬マスク及びＦＩＳＨバイナリマスクを位置合わせして重ね合わせる処理と、
   ｆ．任意に、極大値及びサイズ制限を用いて各核の内部のＦＩＳＨドットの数をカウントする処理とを実行させる、コンピュータ可読媒体。
9. 前記ルールベース法は、前記コントラストスコアを受入閾値及び高検出閾値と比較することを含む、請求項１記載のコンピュータ可読媒体。
10. 核の対比染色試薬で染色された生物学的サンプルの第１の画像が、生物学的サンプルによる少なくとも３つの焦点深度で取得された一連の画像を表し、コンピュータによって実行される場合に、コンピュータに対して、
    画像の各々のブレナー勾配値を計算する処理と、
    ブレナー勾配値を用いて、最も良く焦点が合っている画像を選択する処理と、
    多重スケールで画像をウェーブレット係数に分解するために、ウェーブレットベースのセグメンテーションアルゴリズムを画像に適用する処理と
    を実行させるコンピュータ実行可能命令をさらに含む、請求項８記載のコンピュータ可読媒体。
11. 蛍光インサイツハイブリダイゼーションプローブで染色された生物学的サンプルの第２の画像が、生物学的サンプルによる３つ以上の焦点深度で取得された一連の画像を表す、請求項８記載のコンピュータ可読媒体。
12. 当該コンピュータ可読媒体が、コンピュータによって実行される場合に、コンピュータに対して、
    画像の各々のブレナー勾配値を計算する処理と、
    ブレナー勾配値を用いて、最も良く焦点が合っている画像を選択する処理と、
    画像のノイズを低減するためにメジアンフィルタを用いてノイズ除去する処理と、
    画像のコントラストを強化するために、トップハットフィルタ処理を用いて画像の背景を減算する処理と
    を実行させるコンピュータ実行可能命令を含む、
    請求項１１に記載のコンピュータ可読媒体。
13. コンピュータによって実行される場合に、コンピュータに対して、クラスタ化したＦＩＳＨドットを個別のオブジェクトに分離し、得られたオブジェクトを個々のＦＩＳＨドットとして分類する処理を実行させるコンピュータ実行可能命令をさらに含む、請求項８記載のコンピュータ可読媒体。
14. ＦＩＳＨドットをカウントする処理が、
    検出されたＦＩＳＨバイナリマスク内の極大値を検出する処理と、
    接触するドットを分離するためにシード分水嶺アルゴリズムを適用する処理と、
    任意に、所定の最大面積に基づいて残りの大きなオブジェクトをさらに分割するために、面積ベースの手法を適用する処理と
    を実行させる命令を含む、請求項１３記載のコンピュータ可読媒体。
15. 細胞レベルＦＩＳＨドットカウントのためのシステムであって、当該システムが、
    プロセッサと、
    プロセッサに結合され、画像データを受け取るように構成された入力と、
    プロセッサに結合され、コンピュータ実行可能命令を含むメモリと
    を含んでおり、コンピュータ実行可能命令が、プロセッサによって実行される場合に、プロセッサに対して、
    ａ．核の対比染色試薬で染色された生物学的サンプルの第１の画像を受け取る処理と、
    ｂ．核の対比染色試薬からの信号の輝度に基づいて、生物学的サンプルの核をセグメンテーションすることによって、画像を核の対比染色試薬マスクに変換する処理と、
    ｃ．蛍光インサイツハイブリダイゼーションプローブ（ＦＩＳＨプローブ）で染色された生物学的サンプルの第２の画像を受け取る処理と、
    ｄ．ＦＩＳＨバイナリマスクを抽出するために、マルチレベル拡張ｈ最大値又はｈ最小値を画像に適用する処理であって、細胞（ｉ）毎の最良のｈレベルが、ルールベース法を用いて、プロセッサによって選択され、ルールベース法が、レベルを受容又は拒絶するため、以下に定義するコントラストスコアをプロセッサによって計算することを含んでいる、処理と、
    
    ｅ．検出された信号に従って、核の対比染色試薬マスク及びＦＩＳＨバイナリマスクを位置合わせして重ね合わせる処理と、
    ｆ．任意に、極大値及びサイズ制限を用いて各核の内部のＦＩＳＨドットの数をカウントする処理と
    を実行させる、システム。
16. ルールベース法が、コントラストスコアを受入閾値及び高検出閾値と比較する、請求項１０記載のシステム。
17. ＤＡＰＩで染色された生物学的サンプルの第１の画像は、生物学的サンプルによる３つ以上の焦点深度で取得された一連の画像を表し、コンピュータ実行可能命令は、プロセッサによって実行される場合に、プロセッサに対して、
    画像の各々のブレナー勾配値を計算する処理と、
    ブレナー勾配値を用いて、最も良く焦点が合っている画像を選択する処理と、
    多重スケールで画像をウェーブレット係数に分解するために、ウェーブレットベースのセグメンテーションアルゴリズムを画像に適用する処理と
    を実行させる、請求項１５記載のシステム。
18. 蛍光インサイツハイブリダイゼーションプローブで染色された生物学的サンプルの第２の画像が、生物学的サンプルによる３つ以上の焦点深度で取得された一連の画像を表す、請求項１５記載のシステム。
19. 当該システムが、プロセッサによって実行される場合に、プロセッサに対して、
    画像の各々のブレナー勾配値を計算する処理と、
    ブレナー勾配値を用いて、最も良く焦点が合っている画像を選択する処理と、
    画像のノイズを低減するためにメジアンフィルタを用いてノイズ除去する処理と、
    画像のコントラストを強化するために、トップハットフィルタ処理を用いて画像の背景を減算する処理と
    を実行させるコンピュータ実行可能命令を含んでいる、請求項１５に記載のシステム。
20. 当該システムが プロセッサによって実行される場合に、プロセッサに対して、
    クラスタ化したＦＩＳＨドットを個別のオブジェクトに分離し、得られたオブジェクトを個々のＦＩＳＨドットとして分類する処理を実行させるコンピュータ実行可能命令をさらに含んでいる、請求項１５に記載のシステム。
21. ＦＩＳＨドットをカウントする命令が、プロセッサによって実行される場合に、プロセッサに対して、
    検出されたＦＩＳＨバイナリマスク内の極大値を検出する処理と、
    接触するドットを分離するためにシード分水嶺アルゴリズムを適用する処理と、
    任意に、所定の最大面積に基づいて残りの大きなオブジェクトをさらに分割するために、面積ベースの手法を適用する処理と
    を実行させるコンピュータ実行可能命令を含んでいる、請求項２０に記載のシステム。