JP6473519B2 - ３−ヒドロキシピリジン化合物、その製造方法及び医薬品製造における使用 - Google Patents

Description

本発明は医薬品の分野に関し、具体的には、３−ヒドロキシピリジン化合物とその製造方法、及び該化合物のＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼを阻害するための医薬品の製造における用途に関する。

低酸素誘導因子（ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ，ＨＩＦ）は塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ，ｂＨＬＨ）及びＰＡＳ（Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍ）を含む活性化転写因子であり、生物細胞内において一連の遺伝子調節を経て細胞の低酸素状態に適応するものである（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｒ．，Ｈａｒｄｙ，Ａ及びＳｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｊ．，人体酸素感知装置及びその操作（Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２００８，３７，１３０８〜１３１９頁；Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｊｒ．，及びＲａｔｃｌｉｆｆｅ，Ｐ．Ｊ．，後生動物による酸素センサー：ＨＩＦヒドロキシラーゼ経路における中心的役割（Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ ｍｅｔａｚｏａｎｓ：ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＦ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００８，３０，３９３〜４０２頁；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｊ．，及びＲａｔｃｌｉｆｆｅ，Ｐ．Ｊ．，ＨＩＦヒドロキシラーゼを利用する酸素センサー（Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ ＨＩＦ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４，５，３４３〜３５４頁）。

１９９２年、Ｗａｎｇらがエリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｎｔｉｎ，ＥＰＯ）を研究する際に、低酸素状態となった細胞においてＥＰＯ生成を促進する活性化転写因子を発見し、後に該因子を低酸素誘導因子（以下、「ＨＩＦ」とも略称する）と名づけた。ＨＩＦは細胞の低酸素状態における適応性と生存率に極めて重要であり、細胞の酸素量が通常の２０％から１％に低下した場合であってもＨＩＦの作用下では細胞が生き残ることが、後の研究により実証されている。

ＨＩＦはＨＩＦ−αとＨＩＦ−βの２つの単位で構成され、ＨＩＦ−αは酸素依存性の分解ドメイン（ｏｘｙｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，ＯＤＤＤ）を含み、該ドメインは細胞の酸素量を特定するために必須な構成単位である。ＨＩＦ−αはＨＩＦ−βと安定なダイマーを形成することができ、該ダイマーが細胞の核内に移行して糖代謝関連酵素、ＧＬＵＴ−１、エリスロポエチン及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等といった重要な酵素又は酵素系の発現を促し、細胞が低酸素状態に適応できるようにする。ＨＩＦ−βは芳香族炭化水素受容体核内輸送体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ，ＡＲＮＴ）の一種であり、ＨＩＦ−αと結合してヘテロダイマーを形成し、下流遺伝子の転写を促進する。

現在、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、ＨＩＦ−３αの３種類のＨＩＦ−αサブタイプが発見されている。ＨＩＦ−１αは１９９５年にＷａｎｇらによって同定されたサブタイプであり、ヒトとマウスの複数箇所で発現する。ＨＩＦ−２αは１９９７年に単離、同定され、タンパク質配列がＨＩＦ−１αと４８％の類似性を示すと共に、ＨＩＦ−１αと似た機能を果たし、肺、内皮細胞及び頸動脈のみに発現する。ＨＩＦ−３αは最近になって新たに発見されたＨＩＦ−αサブタイプであり、該サブタイプに関する研究は未だ不十分である。

細胞内におけるＨＩＦ−αの発現は酸素含有量の影響を受けないが、通常の酸素量である場合であっても、細胞内におけるＨＩＦ−αの半減期は５分程度であり、安定に存在することができない。ＨＩＦ−αは低酸素状態に限って安定に存在し、下流の転写因子を活性化する役割を果たすことができる。一方、通常の酸素量の細胞内において、ＨＩＦ−αのＯＤＤＤ領域内における４０２番目と５６４番目の２つのプロリン残基が、プロリルヒドロキシラーゼによって４−ヒドロキシプロリンに酸化されることによってＨＩＦ−αとＨＩＦ−βとのダイマー形成を阻害すると同時に、ｐＶＨＬタンパク質と結合して速やかに分解され、低酸素環境に抵抗する機能を失ってしまう。ＨＩＦ−αの分解過程で重要な役割を果たすプロリルヒドロキシラーゼ（Ｐｒｏｌｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、以下、「ＰＨＤ」又は「ＥＧＬＮ」とも略称する）は、２−ケトグルタル酸（２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ，２−ＯＧ）依存性の酸素添加酵素である。ＰＨＤは２−ＯＧと二価鉄イオンを補因子とし、１個の酸素原子をプロリン分子の４位に結合させてヒドロキシプロリンを形成し、同時に２−ＯＧを１分子の二酸化炭素とコハク酸に変換する。２−ＯＧ類似体又は二価ニッケル、コバルト、マンガンイオンは、ＰＨＤによるＨＩＦ−αプロリン残基の酸化過程に拮抗してＨＩＦ−αの分解を抑制することができるため、ＨＩＦ−αとＨＩＦ−βとのダイマー形成を促して下流の転写因子を活性化させ、結果として低酸素環境に抵抗する機能を果たすことができる。ＰＨＤは３種のサブタイプに分けられ、それぞれＰＨＤ１、ＰＨＤ２及びＰＨＤ３である。更に、研究によってＰＨＤ１の抑制が骨格筋細胞の衰退の治療に有用であり、虚血状態において筋線維芽細胞を温存することにより炎症性腸疾患と大腸炎を治療することができ、並びに、心臓病及び腎臓病患者の心不全と虚血を治療できることが実証されている。一方、他の２種類のＰＨＤサブタイプについては、その機能において区分があるかどうかは未だ不明である。

ＨＩＦの１つの重要な役割は、生体内においてエリスロポエチン（ＥＰＯ）の発現を促進することである。ＥＰＯは糖タンパク質ホルモンであり、赤血球の増殖、分化及び成熟を刺激することができる。更に、ＥＰＯは、骨髄の造血機能を刺激して、赤血球数を適時且つ効果的に増加させ、血液の酸素運搬能を向上させることができ、同時に、生体の酸素に対する結合、輸送と供給能力を高めて低酸素状態を改善することができる。正常な生理状況においては、ＥＰＯは主に腎臓組織で合成されて放出されるため、腎不全患者は体内でＥＰＯを普通に合成できず、常に虚血症状に苦しめられる。ＥＰＯは、２０世紀の１９８０年代末にＡｍｇｅｎ社によって初めて製品化され、その後、慢性腎不全、エイズ、癌及び化学療法に起因する貧血の治療に利用されるようになっている。現在、ＥＰＯの製造と応用面で大きな進展を成し遂げているが、外因性ＥＰＯの供給応用は依然として幾つかの問題を抱えている。かかる問題として、例えば、１）ＥＰＯの使用費用が高く、長期使用の患者にとっては相当重い負担を強いられ、２）ＥＰＯは大分子量の糖タンパク質であるため生体利用度が低く、さらに生体内における半減期が短く、消化管内の酵素系によって分解されやすいといった特徴があり、ＥＰＯ注射によって頻繁に投与せざるを得ず、患者自らが適宜決めうる服用形態が制限され、患者に不便を感じさせ、３）産業規模で合成したＥＰＯは免疫原性の問題を回避できず、薬品使用に一定のリスクがある等が挙げられる。

外因性大分子量のＥＰＯは使用面において上記の多くの問題を抱えているため、低分子量のＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤の開発が急務となっている。よって、外因性ＥＰＯの使用の代わりにＨＩＦ−αの分解の抑制と、更に、生体内における内因性ＥＰＯの生成の促進により、患者により多くの選択肢をもたらすことが期待されている。

現在、Ａｋｅｂｉａ社のＡＫＢ−６５４８、Ｆｉｂｒｏｇｅｎ社のＦＧ−４５９２の２種類のＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼが既に第ＩＩ段階の試験段階に入っている（ＷＯ２０１２１７０３７７Ａ１，ＵＳ２０１０３３１３７４Ａ１，ＵＳ２０１０３０５０９７Ａ１，Ｐ＆ＧＵＳ２００７２９９０８６Ａ１，ＵＳ２００４２５４２１５Ａ１，ＵＳ２００７２９８１０４Ａ１，ＵＳ２００９０８２３５７Ａ１，ＵＳ２０１０１１３４４４Ａ１，ＷＯ２０１３１３４６６０，ＷＯ２０１００５９５５２Ａ１）。

したがって、本発明の目的は、新規構造を有する３−ヒドロキシピリジン化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、上記化合物を製造する方法を提供することである。
また、本発明のもう１つの目的は、上記化合物を含んでなる医薬組成物を提供することである。

更に、本発明のもう１つの目的は、上記化合物又はその薬学的に許容可能な塩の医薬品製造における用途を提供することである。

本発明の目的は、下記の技術思想によって実現される。つまり、下記化学式（Ｉ）で表される構造を有する化合物又はその薬学的に許容可能な塩であって、

（Ｉ）

そのうち、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立した水素であり、
Ｒ３は水素、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分岐鎖状又は環状アルキルであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立したＣ１〜Ｃ７アルキル、ハロゲン置換のＣ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、ハロゲン置換のＣ１〜Ｃ３アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、水素、アミノ、ニトロ、シアノ置換又は非置換の芳香環又はヘテロ芳香環である。

また、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が互いにオキソブリッジを介して結合することで、下記化学式（ＩＩ）で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を形成することができ、

（ＩＩ）

式（ＩＩ）において、ｎは１、２、３又は４の整数であり、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立した酸素、炭素又は窒素原子から選択される。

上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表される化合物の薬学的に許容可能な塩として、好ましくは、前記化合物と薬学的に許容可能な塩基が反応して得られる塩であり、前記薬学的に許容可能な塩基としては水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、酸化カルシウム等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において、特に好ましい化合物は下記の表に示される化合物である。

上記式（Ｉ）の化合物は、以下の反応経路を経て合成される。

本発明の１つの側面において、本発明に係る化合物の製造方法は、以下のステップを含む。

ステップ１：メタノールの存在下において、下記式の−ブロモ−３−フロオロピリジル−２−ホルモニトリルとナトリウムメトキシドを反応させ、５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル（中間体ＩＩＩ）を生成する。

（ＩＩＩ）

ステップ２：ステップ１で得られた中間体（ＩＩＩ）、Ａｒ０Ｈ及びリガンドを溶媒に混合して加熱し、触媒の作用下で下ウルマン反応を経てエーテル系中間体（ＩＶ）を生成する。

（ＩＶ）

そのうち、Ａｒは下記式で表される官能基であり、式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ７アルキル、ハロゲン置換のＣ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、ハロゲン置換のＣ１〜Ｃ３アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、水素、アミノ、ニトロ、シアノ置換又は非置換の芳香環又はヘテロ芳香環から選択される。

ステップ３：ステップ２で得られた中間体（ＩＶ）とＨＢｒを加熱還流しながら反応させ、加水分解して３−ヒドロキシピリジン−２−ギ酸誘導体（Ｖ）を生成する。

（Ｖ）

ステップ４：ステップ３で得られた中間体（Ｖ）とα−Ｒ_３置換のアミノ酸ベンジルエステル（ＶＩ）を、縮合剤の存在下で反応させてアミド化することにより、３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸ベンジルエステル中間体（ＶＩＩ）を生成する。

（ＶＩＩ）

ステップ５：ステップ４で得られた中間体（ＶＩＩ）を水素化分解の条件、溶媒及び触媒の存在、室温条件下で水素化分解することでベンジルエステル保護基を除去し、上記化学式（Ｉ）の化合物を生成する。

上記ステップ１において使用する原料としての５−ブロモ−３−フロオロピリジン−２−ホルモニトリルは、市販ルートで購入可能であり、例えば、Ｓｉｇｍａ社製又はＪ＆Ｋ社製のものを使用することができ、前記反応は室温で行われる。

上記ステップ２において、触媒としてヨウ化第一銅（Ｉ）が好ましく，金属リガンドとしてＮ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ−メチルプロリン、Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン等が好ましく、反応溶媒として１，４−ジオキサン、トルエン、テトラヒドロフランが好ましい。また、７０℃〜１２０℃の温度で反応を行うことが好ましい。

本発明の一実施形態において、前記ステップ３は、更に臭化水素酸・氷酢酸において中間体（ＩＶ）の保護基を除去し、同時に加水分解させて３−ヒドロキシピリジン−２−ギ酸中間体（Ｖ）を生成することを含む。このとき、臭化水素酸と氷酢酸の比としては２：１〜１：３が好ましく、反応温度としては９０〜１４０℃の範囲が好ましく、加熱反応時間としては６〜１２時間が好ましい。

ステップ４において、上記α−Ｒ_３アミノ酸ベンジルエステル（ＶＩ）をその塩酸塩の形で得ることができ、上記アミノ酸α−Ｒ３ベンジルエステル塩酸塩としてはグリシンベンジルエステル塩酸塩、（α−又はβ−）アラニンベンジルエステル塩酸塩、（α−又はβ−）バリンベンジルエステル塩酸塩、（α−又はβ−）ロイシンベンジルエステル塩酸塩、（α−又はβ−）イソロイシンベンジルエステル塩酸塩等が挙げられ、溶媒としてはジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン等が好ましく、アミド化反応で使用する触媒としては１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等が挙げられ、塩基としてはトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが好ましい。本発明の一実施形態において、中間体（Ｖ）とアミノ酸ベンジルエステル塩酸塩（ＶＩ）と縮合剤を混合して、室温で１０時間以上かけて撹拌しながら反応させることで該ステップの反応を遂行する。

ステップ５において、触媒としてはパラジウム（０）／炭素、水酸化パラジウム（ＩＩ）、水酸化パラジウム（ＩＩ）／炭素、二酸化白金（ＩＶ）等が好ましく、水素化分解反応で使用する溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル等が好ましい。

本発明は、更に、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩のＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼを阻害するための医薬品、並びに内因性ＥＰＯの生成を促進するための医薬品の製造における用途を提供する。また、本発明は、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩の低酸素誘導因子αを安定させるための医薬品、並びに慢性疾患に伴う貧血を治療するための医薬品の製造における用途を提供し、そのうち、前記慢性疾患に伴う貧血とはリウマチ性関節炎、リウマチ熱又は炎症性腸疾患を指す。また、本発明は、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩の炎症性サイトカイン生成を促進するための医薬品の製造における用途を提供し、そのうち、前記炎症性サイトカインとは腫瘍壊死因子、インターロイキン又はインターフェロンを指すものである。また、本発明は、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩の化合物の貧血の対象に対して、外部からエリスロポエチンを投与する際の抵抗性を改善する医薬品の製造における用途を提供し、そのうち、前記化合物の投与によって、造血前駆細胞の前記エリスロポエチンに対する反応を改善することができる。また、本発明は、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩の鉄摂取、鉄輸送及び鉄利用率向上に必須な因子の生成を促進するための医薬品の製造における用途を提供し、そのうち、前記因子としては、赤芽細胞アミノレブリン酸シンターゼ、トランスフェリン、トランスフェリン受容体及びセルロプラスミンが挙げられる。

本発明は、更に、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することによりＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼを阻害する方法、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与して内因性ＥＰＯの生成を促進する方法、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することにより低酸素誘導因子αを安定させる方法、並びに、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することにより慢性疾患に伴う貧血を治療する方法を提供し、そのうち、前記慢性疾患に伴う貧血とは、リウマチ性関節炎、リウマチ熱又は炎症性腸疾患を指すものである。

本発明は、更に、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することにより炎症性サイトカイン生成を促進する方法を提供し、そのうち、前記炎症性サイトカインとは、腫瘍壊死因子、インターロイキン又はインターフェロンを指すものである。

本発明のもう１つの側面において、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することにより、貧血対象に対して外部からエリスロポエチンを投与する際の抵抗性を改善する方法を提供し、そのうち、前記化合物の投与によって造血前駆細胞の前記エリスロポエチンに対する反応を改善することができる。

本発明は、更に、本発明に係る化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することにより鉄摂取、鉄輸送及び鉄利用率の向上に必須な因子の生成を促進する方法を提供し、そのうち、前記因子としては赤芽細胞アミノレブリン酸シンターゼ、トランスフェリン、トランスフェリン受容体及びセルロプラスミンが挙げられる。

以下、実施例に基づき本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明を例示したに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨と範囲から逸脱しない前提でこれらの実施例について適宜変更を加えることができることは言うまでもない。

実施例１：２−（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ−２−ピリジンホルミルアミノ）酢酸の合成

ステップ１：５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
室温においてナトリウムメトキシド９．７ｇ（０．１８ｍｏｌ)を含むメタノール溶液５０ｍＬを、５−ブロモ−３−フロオロピリジン−２−ホルモニトリル３０ｇ（０．１５ｍｏｌ)を含むメタノール懸濁液１５０ｍＬに滴下し、滴下終了後、反応液が透明になるまで室温で２時間反応させた。反応液に少量の氷酢酸を加えてｐＨを７〜８に調整し、氷水３００ｍＬを加えた。反応液を濃縮して固形物が析出するようにし、冷却して２時間静置することでより徹底的に固形物を析出させた。析出した固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄して回収し、室温で自然乾燥して５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの白色固形物を２４ｇ、収率７５％で得た。

ステップ２：３−メトキシ−５−フェノキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル１．３３ｇ（１４．１ｍｍｏｌ）、フェノール１ｇ（４．７ｍｍｏｌ）、ヨウ化第一銅２６６ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン１４４ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム２．３ｇ（７．０５ｍｍｏｌ）及び１，４−ジオキサン１０ｍＬを混合した後、窒素ガス雰囲気、１２０℃で撹拌しながら一晩反応させた。反応液を濃縮した後に酢酸エチル５０ｍＬと水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、酢酸エチル層を回収して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製することで３−メトキシ−５−フェノキシピリジン−２−ホルモニトリルの固形物を７６９ｍｇ、収率７２％で得た。

ステップ３：３−ヒドロキシ−５−フェノキシピリジン−２−ギ酸の製造
３−メトキシ−５−フェノキシピリジン−２−ホルモニトリル６００ｍｇを氷酢酸１５ｍＬに溶かし、臭化水素酸液１５ｍＬを加えて１２０℃で８時間反応させた。反応液を２５℃に冷却し、８時間静置することで固形物を析出させた。固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄した後に回収し、減圧乾燥して３−ヒドロキシ−５−フェノキシピリジン−２−ギ酸の白色固形物を３７０ｍｇ、収率６０％で得た。

ステップ４：２−（３−ヒドロキシ−５−フェノキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸ベンジルエステルの製造
３−ヒドロキシ−５−フェノキシピリジン−２−ギ酸８９ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）、グリシンベンジルエステル塩酸塩１１６ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ １１０ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ ５２ｍｇ（０．３８５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５ｍＬに加えて懸濁液にし、該懸濁液にジイソプロピルエチルアミン７５ｍｇ（０．５７８ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で８時間反応させた。反応液にジクロロメタン５０ｍＬを加えて希釈し、更に水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、有機相を回収して有機溶媒を留去した。残留物をカラムクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルと石油エーテルとが１：４の混合液で溶出することで２−（３−ヒドロキシ−５−フェノキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸ベンジルエステルを１０６ｍｇ、収率７３％で得た。

ステップ５：２−（３−ヒドロキシ−５−フェノキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の製造
２−（３−ヒドロキシ−５−フェノキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸ベンジルエステル１０６ｍｇをメタノール１０ｍＬに溶かし、窒素ガス雰囲気で１０％の水酸化パラジウム（ＩＩ）／炭素１０ｍｇを加えた後、水素ガスを流して室温で撹拌しながら１０時間反応させた。減圧濾過することで触媒を除去し、濾液を濃縮して２−（３−ヒドロキシ−５−フェノキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の固形物を４６ｍｇ、収率５７％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．５５（ｓ，１Ｈ），９．２１（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．１７（ｍ，３Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）。

実施例２：２−（５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の合成

ステップ１：５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
室温においてナトリウムメトキシド９．７ｇ（０．１８ｍｏｌ)を含むメタノール溶液５０ｍＬ）を、５−ブロモ−３−フロオロピリジン−２−ホルモニトリル３０ｇ（０．１５ｍｏｌ)を含むメタノールの懸濁液１５０ｍＬに滴下し、滴下終了後、反応液が透明になるまで室温で２時間反応させた。反応液に少量の氷酢酸を加えてｐＨを７〜８に調整し、氷水３００ｍＬを加えた。反応液を濃縮して固形物が析出するようにし、冷却して２時間静置することでより徹底的に固形物を析出させた。析出した固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄して回収し、室温で自然乾燥して５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの白色固形物２４ｇ、収率７５％で得た。

ステップ２：５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル４２６ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ，１．０Ｎ）、２，３−ジメチルフェノール７３３ｍｇ（６．０ｍｍｏｌ，３．０Ｎ）、ヨウ化第一銅１１４ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ，０．３Ｎ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン６１．８ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ，０．３Ｎ）、炭酸セシウム１．３ｇ（４．０ｍｍｏｌ，２．０Ｎ）及び１，４−ジオキサン６ｍＬを混合した後、窒素ガス雰囲気、１２０℃で撹拌しながら一晩反応させた。反応液を濃縮した後に酢酸エチル５０ｍＬと水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、酢酸エチル層を回収して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製することで５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの淡黄色固形物４１０ｍｇ、収率８０．７％で得た。

ステップ３：５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸の製造
５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル４１０ｍｇ（１．６１ｍｍｏｌ）を氷酢酸２ｍＬに溶かし、臭化水素酸液６ｍＬを加えて１２０℃で８時間反応させた。反応液を２５℃に冷却し、８時間静置することで固形物を析出させた。固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄した後に回収し、減圧乾燥して５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸の赤褐色固形物を３５０ｍｇ、収率８３．９％で得た。

ステップ４：｛［５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの製造
５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸２５０ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ，１．０Ｎ）、グリシンベンジルエステル塩酸塩２９１．０ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩２７７．０ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１９５．８ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）をジクロロメタン１０ｍＬに加えて懸濁液にし、該懸濁液にジイソプロピルエチルアミン１８７．０ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）を滴下し、室温で８時間反応させた。反応液にジクロロメタン５０ｍＬを加えて希釈し、更に水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、有機相を回収して有機溶媒を留去した。残留物をカラムクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルと石油エーテルとが１：４の混合液で溶出することで｛［５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの油状物を１００ｍｇ、収率２５．６％で得た。

ステップ５：２−（５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の製造
｛［５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステル１００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶かし、窒素ガス雰囲気下で１０％の水酸化パラジウム（ＩＩ）／炭素２０ｍｇを加えた後、水素ガスを流して室温で撹拌しながら１０時間反応させた。減圧濾過することで触媒を除去し、濾液を濃縮して２−（５−（２，３−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の白色固形物を３９ｍｇ、収率４９．４％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．５３（ｓ，１Ｈ），９．１７（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２５−７．０７（ｍ，２Ｈ），７．０１−６．９４（ｍ，１Ｈ），６．５５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ）。

実施例３：２−（５−（３−クロロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の合成

ステップ１：５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
室温においてナトリウムメトキシド９．７ｇ（０．１８ｍｏｌ)を含むメタノール溶液５０ｍＬを、５−ブロモ−３−フロオロピリジン−２−ホルモニトリル３０ｇ（０．１５ｍｏｌ)を含むメタノール懸濁液１５０ｍＬに滴下し、滴下終了後、反応液が透明になるまで室温で２時間反応させた。反応液に少量の氷酢酸を加えてｐＨを７〜８に調整し、氷水３００ｍＬを加えた。反応液を濃縮して固形物が析出するようにし、冷却して２時間静置することでより徹底的に固形物を析出させた。析出した固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄して回収し、室温で自然乾燥させて５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの白色固形物を２４ｇ、収率７５％で得た。

ステップ２：５−（３−クロロフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル４００ｍｇ、３−クロロフェノール５００ｍｇ、ヨウ化第一銅１２０ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン８０ｍｇ、炭酸セシウム１．５ｇ（４．０ｍｍｏｌ，２．０Ｎ）及び１，４−ジオキサン２ｍＬを混合した後、窒素ガス雰囲気、１２０℃で撹拌しながら一晩反応させた。反応液を濃縮した後に酢酸エチル５０ｍＬと水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、酢酸エチル層を回収して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製することで５−（３−クロロフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの淡黄色固形物３９０ｍｇを得た。

ステップ３：５−（３−クロロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸の製造
５−（３−クロロフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル３９０ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）を氷酢酸１ｍＬに溶かし、臭化水素酸液３ｍを加えて１２０℃で８時間反応させた。反応液を２５℃に冷却し、８時間静置することで固形物を析出させた。固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄した後に回収し、減圧乾燥して５−（３−クロロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸の赤褐色固形物３００ｍｇを得た。

ステップ４：｛［５−（３−クロロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの製造
５−（３−クロロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸３００ｍｇ、グリシンベンジルエステル塩酸塩５６０ｍｇ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩４６０ｍｇ及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール３３０ｍｇをジクロロメタン８ｍＬに加えて懸濁液にし、該懸濁液に更にジイソプロピルエチルアミン３４０ｍｇを滴下した後、室温で８時間反応させた。反応液にジクロロメタン５０ｍＬを加えて希釈し、更に水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、有機相を回収して有機溶媒を留去した。残留物をカラムクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルと石油エーテルとが１：４の混合液で溶出することで、｛［５−（３−クロロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの淡黄色油状物１５０ｍｇを得た。

ステップ５：２−（５−（３−クロロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の製造
｛［５−（３−クロロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステル１５０ｍｇをメタノール１０ｍＬに溶かし、窒素ガス雰囲気下で１０％の水酸化パラジウム（ＩＩ）／炭素１５ｍｇを加え、水素ガスを流して室温で撹拌しながら１０時間反応させた。減圧濾過することで触媒を除去し、濾液を濃縮して２−（５−（２，３−ジフルオロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の白色固形物７０ｍｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．５７（ｓ，１Ｈ），９．２４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５６−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．１４（ｍ，１Ｈ），７．１２−６．９４（ｍ，２Ｈ），３．９６（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）。

実施例４：２−（３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の合成

ステップ１：５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
室温において、ナトリウムメトキシド９．７ｇ（０．１８ｍｏｌ)を含むメタノール溶液５０ｍＬを、５−ブロモ−３−フロオロピリジン−２−ホルモニトリル３０ｇ（０．１５ｍｏｌ)を含むメタノール懸濁液１５０ｍＬに滴下し、滴下終了後、反応液が透明になるまで室温で２時間反応させた。反応液に少量の氷酢酸を加えてｐＨを７〜８に調整し、氷水３００ｍＬを加えた。反応液を濃縮して固形物が析出するようにし、冷却して２時間静置することでより徹底的に固形物を析出させた。析出した固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄して回収し、室温で自然乾燥させて５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの白色固形物を２４ｇ、収率７５％で得た。

ステップ２：３−メトキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−ホルモニトリルの製造
５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル３２０ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ，１．０Ｎ）、２−ナフトール６４９ｍｇ（４．５ｍｍｏｌ，３．０Ｎ）、ヨウ化第一銅８５．５ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ，０．３Ｎ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン４６．４ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ，０．３Ｎ）、炭酸セシウム９７８ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ，２．０Ｎ）及び１，４−ジオキサン６ｍＬを混合した後、窒素ガス雰囲気、１２０℃で撹拌しながら一晩反応させた。反応液を濃縮した後に酢酸エチル５０ｍＬと水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、酢酸エチル層を回収して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製することで３−メトキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−ホルモニトリルの赤色固形物を３００ｍｇ、収率７２．５％で得た。

ステップ３：３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−カルボン酸の製造
３−メトキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−ホルモニトリル３００ｍｇを氷酢酸１．５ｍＬに溶かし、臭化水素酸液４．５ｍＬを加えて１２０℃で８時間反応させた。反応液を２５℃に冷却し、８時間静置することで固形物を析出させた。固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄した後に回収し、減圧乾燥して３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−カルボン酸の赤褐色固形物を２００ｍｇ、収率８１．８％で得た。

ステップ４：｛［３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの製造
３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−カルボン酸２５０ｍｇ（０．８９ｍｍｏｌ，１．０Ｎ）、グリシンベンジルエステル塩酸塩２６８．２ｍｇ（１．３３ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩２５４．０ｍｇ（１．３３ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１７９．６ｍｇ（１．３３ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）をジクロロメタン１０ｍＬに加えて懸濁液にし、該懸濁液に更にジイソプロピルエチルアミン１７１．６ｍｇ（１．３３ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）を滴下した後、室温で８時間反応させた。反応液にジクロロメタン５０ｍＬを加えて希釈し、更に水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、有機相を回収して有機溶媒を留去した。残留物をカラムクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルと石油エーテルとが１：４の混合液で溶出することで｛［３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの淡黄色油状物を１００ｍｇ、収率２５．４％で得た。

ステップ５：２−（３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の製造。
｛［３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステル１００ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶かし、窒素ガス雰囲気下で１０％の水酸化パラジウム（ＩＩ）／炭素２０ｍｇを加え、水素ガスを流して室温で撹拌しながら１０時間反応させた。減圧濾過することで触媒を除去し、濾液を濃縮して２−（３−ヒドロキシ−５−（ナフタレン−２−オキシ）ピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の白色固形物を４３ｍｇ、収率５６．２％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．５７（ｓ，１Ｈ），９．２５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７０−７．６８（ｍ，１Ｈ），７．６０−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．４６−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）。

実施例５：２−（５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の合成

ステップ１：５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
室温においてナトリウムメトキシド９．７ｇ（０．１８ｍｏｌ)を含むメタノール溶液５０ｍＬを、５−ブロモ−３−フロオロピリジン−２−ホルモニトリル３０ｇ（０．１５ｍｏｌ)を含むメタノール懸濁液１５０ｍＬに滴下し、滴下終了後、反応液が透明になるまで室温で２時間反応させた。反応液に少量の氷酢酸を加えてｐＨを７〜８に調整し、氷水３００ｍＬを加えた。反応液を濃縮して固形物が析出するようにし、冷却して２時間静置することでより徹底的に固形物を析出させた。析出した固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄して回収し、室温で自然乾燥して５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの白色固形物を２４ｇ、収率７５％で得た。

ステップ２：５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル４２６ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ，１．０Ｎ）、２，４−ジメチルフェノール７３３ｍｇ（６．０ｍｍｏｌ，３．０Ｎ）、ヨウ化第一銅１１４ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ，０．３Ｎ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン６１．８ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ，０．３Ｎ）、炭酸セシウム１．３ｇ（４．０ｍｍｏｌ，２．０Ｎ）及び１，４−ジオキサン６ｍＬを混合した後、窒素ガス雰囲気、１２０℃で撹拌しながら一晩反応させた。反応液を濃縮した後に酢酸エチル５０ｍＬと水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、酢酸エチル層を回収して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製することで５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの淡黄色固形物を２５０ｍｇ、収率４９．２％で得た。

ステップ３：５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸の製造
５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル２５０ｍｇ（０．９８ｍｍｏｌ）を氷酢酸１．５ｍＬに溶かし、臭化水素酸液４．５ｍＬを加えて１２０℃で８時間反応させた。反応液を２５℃に冷却し、８時間静置することで固形物を析出させた。固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄した後に回収し、減圧乾燥して５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸の赤褐色固形物を１８５ｍｇ、収率７３．１％で得た。

ステップ４：｛［５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの製造
５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸１８５ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ，１．０Ｎ）、グリシンベンジルエステル塩酸塩２１５．４ｍｇ（１．０７ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩２０４．４ｍｇ（１．０７ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１４４．４ｍｇ（１．０７ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）をジクロロメタン１０ｍＬに加えて懸濁液にし、該懸濁液に更にジイソプロピルエチルアミン１３８ｍｇ（１．０７ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）を滴下した後、室温で８時間反応させた。反応液にジクロロメタン５０ｍＬを加えて希釈し、更に水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、有機相を回収して有機溶媒を留去した。残留物をカラムクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルと石油エーテルとが１：４の混合液で溶出することで｛［５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの淡黄色油状物を５０ｍｇ、収率１７．３％で得た。

ステップ５：２−（５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の製造
｛［５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステル５０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶かし、窒素ガス雰囲気下で１０％の水酸化パラジウム（ＩＩ）／炭素１０ｍｇを加え、水素ガスを流して室温で撹拌しながら１０時間反応させた。減圧濾過することで触媒を除去し、濾液を濃縮して２−（５−（２，４−ジメチルフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の白色固形物を２０ｍｇ、収率５１．４％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．５２（ｓ，１Ｈ），９．１７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２３−７．１８（ｍ，１Ｈ），７．１５−７．０７（ｍ，１Ｈ），７．０６−６．９４（ｍ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ）。

実施例６：２−（５−（２，３−ジフルオロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の合成

ステップ１：５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
室温においてナトリウムメトキシド９．７ｇ（０．１８ｍｏｌ)を含むメタノール溶液５０ｍＬを、５−ブロモ−３−フロオロピリジン−２−ホルモニトリル３０ｇ（０．１５ｍｏｌ)を含むメタノール懸濁液１５０ｍＬに滴下し、滴下終了後、反応液が透明になるまで室温で２時間反応させた。反応液に少量の氷酢酸を加えてｐＨを７〜８に調整し、氷水３００ｍＬを加えた。反応液を濃縮して固形物が析出するようにし、冷却して２時間静置することでより徹底的に固形物を析出させた。析出した固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄して回収し、室温で自然乾燥して５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの白色固形物を２４ｇ、収率７５％で得た。

ステップ２：５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの製造
５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル４２６ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ，１．０Ｎ）、２，３−ジフルオロフェノール７８６ｍｇ（６．０ｍｍｏｌ，３．０Ｎ）、ヨウ化第一銅１１４ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ，０．３Ｎ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン６１．８ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ，０．３Ｎ）、炭酸セシウム１．３ｇ（４．０ｍｍｏｌ，２．０Ｎ）及び１，４−ジオキサン６ｍＬを混合した後、窒素ガス雰囲気、１２０℃で撹拌しながら一晩反応させた。反応液を濃縮した後に酢酸エチル５０ｍＬと水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、酢酸エチル層を回収して濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製することで５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリルの淡黄色固形物を１６０ｍｇ、収率３０．５％で得た。

ステップ３：５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸の製造
５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル１６０ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）を氷酢酸１ｍＬに溶かし、臭化水素酸液３ｍＬを加えて１２０℃で８時間反応させた。反応液を２５℃に冷却し、８時間静置することで固形物を析出させた。固形物を減圧濾過し、濾過ケーキを水で洗浄した後に回収し、減圧乾燥して５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸の赤褐色固形物を１５０ｍｇ、収率９２．０％で得た。

ステップ４：｛［５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの製造
５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸１５０ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ，１．０Ｎ）、グリシンベンジルエステル塩酸塩１６９．４ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩１６０．４ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１１３．４ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）をジクロロメタン８ｍＬに加えて懸濁液にし、該懸濁液に更にジイソプロピルエチルアミン１０８．４ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ，１．５Ｎ）を滴下した後、室温で８時間反応させた。反応液にジクロロメタン５０ｍＬを加えて希釈し、更に水３０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、有機相を回収して有機溶媒を留去した。残留物をカラムクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルと石油エーテルとが１：４の混合液で溶出することで｛［５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステルの淡黄色油状物を７０ｍｇ、収率２０．１％で得た。

ステップ５：２−（５−（２，３−ジフルオロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の製造
｛［５−（２，３−ジフルオロ−フェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボニル］アミノ｝酢酸ベンジルエステル７０ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶かし、窒素ガス雰囲気下で１０％の水酸化パラジウム（ＩＩ）／炭素１５ｍｇを加え、水素ガスを流して室温で撹拌しながら１０時間反応させた。減圧濾過することで触媒を除去し、濾液を濃縮して２−（５−（２，３−ジフルオロフェノキシ）−３−ヒドロキシピリジン−２−ホルミルアミノ）酢酸の白色固形物を３０ｍｇ、収率５４．５％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．８２（ｓ，１Ｈ），１２．５９（ｓ，１Ｈ），９．２５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．３５（ｍ，１Ｈ），７．３４−７．２５（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．１８（ｍ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）。

測定例１：体外におけるＨＩＦ−ＰＨＤ２阻害剤系化合物の肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂのエリスロポエチン発現に対する促進作用
実験用肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂ（中国典型培養物保存センター、ＣＣＴＣＣ）の培養に必要な完全培地として、ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製、Ｃａｔ番号ＧＮＭ４１５００、杭州吉諾生物医薬技術有限会社より購入）に１０％の血清ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製、Ｃａｔ番号１００９９−１４１）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃａｔ番号ＧＮＭ１５１４０、杭州吉諾生物医薬技術有限会社より購入）を加えたものを使用し、細胞培養には、３７℃、ＣＯ_２が５％のインキュベーターを用いた。実験用試薬として、ＤＭＳＯ（分子生物学実験用、純度＞＝９９．９％、Ｃａｔ番号Ｄ８４１８）はシグマ社製であり、測定用ＥＬＩＳＡキット（ヒトエリスロポエチン定量用ＩＶＤ ＥＬＩＳＡ、商品コードＤＥＰ００）はＲ＆Ｄシステムズ社製であった。測定用対照物としてＡＫＢ−６５４８は、自ら作製するか、商業ルートで購入した。測定試料は、遮光密封して−２０℃に保存した。

測定試料及びポジティブコントロールを、遮光条件下で、滅菌水又はＤＭＳＯに完全に溶かし、濃度がそれぞれ１０^−１ｍｏｌ／Ｌ、１０^−２ｍｏｌ／Ｌの保存液を調製して−２０℃に保存した。ＦＢＳ濃度が０．５％のＭＥＭ培地を希釈液として、前記測定試料の保存液を希釈し、濃度がそれぞれ１００μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌの測定用希釈液を調製した。９６ウェルプレートに、２００μＬ／ウェル（１．５又は２．０×１０^４細胞／ウェル）の量で肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂの完全培地懸濁液を加え、温度３７℃、ＣＯ_２濃度５％のインキュベーターで一晩培養した。９６ウェルプレート中の古い培養液を捨て、細胞を０．５％のＦＢＳのＭＥＭ培地で１回洗った後、遮光条件下で２００μＬ／ウェルの量で測定試料を加えて、濃度がそれぞれ１００μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌとなるようにし、各濃度には２つのウェルを設けてそれぞれ測定用ウェル及び予備用ウェルとした。また、測定液の代わりに希釈液を加えて細胞対照ウェル（測定試料と溶媒を含まず）とした。また、測定液の代わりに同じ濃度の溶媒（ＤＭＳＯ）を含む希釈液を用い、溶媒対照ウェル（測定試料を含まず）とした。温度３７℃、ＣＯ_２濃度５％のインキュベーターで２４時間培養した後、上清を捨てサンプルとして−２０℃に冷凍保存した。停止液を１００μＬ／ウェルの量で加えた後、マイクロプレートリーダーを用いてＡ４５０ｎｍ〜Ａ６００ｎｍの範囲でＯＤ値を測定し、検量線に基づいて測定試料のＥＰＯ発現に対する促進活性（ｍＩＵ／ｍＬ）を算出した。測定結果を下記表３に示す。

測定例２：本発明に係る化合物のＰＨＤ２に対する抑制効果（ＩＣ_５０）の測定
蛍光偏光法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ＦＰ）を利用して低酸素誘導因子ＨＩＦ−１αとＶＢＣ複合体（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ−ＥｌｏｎｇｉｎＢ−ＥｌｏｎｇｉｎＣ，ＶＢＣ）との相互作用を測定し、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ｐｒｏｌｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ２，ＰＨＤ２）阻害剤化合物の酵素阻害活性を測定した。

アスコルビン酸２００μＭ、α−ケトグルタル酸２０μＭ、ＦｅＣｌ_２ １００μＭを含むＮＥＴＮ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＮＰ−４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ）緩衝液に、遮光条件下で、終濃度が１μＭのＦＡＭ−ＨＩＦ（５５６〜５７５）を加えた。そして、特定濃度の測定化合物及び陽性化合物（ネガティブコントロール及びポジティブコントロールとして、化合物の代わりに緩衝液を用いる）を加え、最後に終濃度が０．５μｇ／μＬのＰＨＤ２（ネガティブコントロールとしてＰＨＤ２の代わりに緩衝液を用いる）を加えた。十分混合した後、室温、遮光条件下で静置することにより３０分間反応させ、その後９５℃のウォーターバスに１分間置いて反応を停止させた。温度が室温に戻るまで待ち、試料を次の測定に備えて一時保存した。黒色の９６ウェルプレートにＥＢＣ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１２０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ ＮＰ−４０）を加え、更に終濃度が３００ｎＭのＧＳＴ−ＶＢＣ複合体（ブランク対照としてウェルにＥＢＣ緩衝液のみを入れる）を加えた。そして、遮光してＰＨＤ２プロリンヒドロキシル化反応のサンプルを、終濃度が１００ｎＭとなるように加え、反応基質とした。十分混合した後、全波長マルチモードプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００）を用いて励起波長４０７ｎＭ、発光波長５１８ｎＭの条件下で横手方向及び長手方向の蛍光強度値を測定した。蛍光偏光度（ｍＰ）は、下記式１に従って算出した。

＜式１＞
蛍光偏光度（ｍＰ）＝１０００×（横手方向の蛍光強度値−Ｇ因子×長手方向の蛍光強度値）／（横手方向の蛍光強度値＋Ｇ因子×長手方向の蛍光強度値）
そのうち、横手方向の蛍光強度値＝測定ウェルの横手方向における蛍光強度値−ブランク対照の横手方向における蛍光強度値
長手方向の蛍光強度値＝測定ウェルの長手方向における蛍光強度値−ブランク対照の長手方向における蛍光強度値

また、下記式２に従って測定化合物のＰＨＤ２阻害率（％）を算出した。

＜式２＞
阻害率（％）＝１−（ｍＰ測定ウェル−ｍＰネガティブコントロールウェル）／（ｍＰポジティブコントロールウェル−ｍＰネガティブコントロールウェル）

ＩＣ_５０はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ４．０ソフト（Ｇｏｌｄｅｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｇｏｌｄｅｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）を利用し、非線形回帰法を用いて算出した。

Claims (25)

1. 下記化学式（Ｉ）で表される構造を有する化合物又はその薬学的に許容可能な塩であって、
   

   

   （Ｉ）
   
   そのうち、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立した水素であり、
   Ｒ３は水素、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分岐鎖状又は環状アルキルであり、
   Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立したＣ１〜Ｃ７アルキル、ハロゲン置換のＣ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、ハロゲン置換のＣ１〜Ｃ３アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、水素、アミノ、ニトロ、シアノ、置換若しくは非置換の芳香環、又は置換若しくは非置換のヘテロ芳香環であり、
   又は、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が互いにオキソブリッジを介して結合することで下記官能基を形成することができ、
   

   

   そのうち、ｎは１、２、３又は４の整数であり、Ａ１及びＡ２は、酸素、炭素又は窒素原子からそれぞれ独立に選択される、化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
2. 下記化学式（ＩＩ）で表される構造を有する化合物又はその薬学的に許容可能な塩であって、
   

   

   （ＩＩ）
   
   そのうち、ｎは１、２、３又は４の整数であり、Ａ１及びＡ２は、酸素、炭素又は窒素原子からそれぞれ独立に選択される、化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
3. 前記薬学的に許容可能な塩は、前記化合物と薬学的に許容可能な塩基が反応して得られる塩である、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
4. 下記化合物１〜化合物３５から選択される化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
   

   

   
5. 請求項１に記載の化合物の製造方法であって、下記ステップ1〜ステップ５を含み、
   ステップ１：メタノールの存在下において、下記式の５−ブロモ−３−フロオロピリジル−２−ホルモニトリルとナトリウムメトキシドを反応させ、５−ブロモ−３−メトキシピリジン−２−ホルモニトリル（中間体ＩＩＩ）を生成し、
   

   

   

   （ＩＩＩ）
   
   ステップ２：ステップ１で得られた中間体（ＩＩＩ）、Ａｒ０Ｈ及びリガンドを溶媒に混合して加熱し、触媒の作用下で下ウルマン反応を経てエーテル系中間体（ＩＶ）を生成し、
   

   

   （ＩＶ）
   
   ステップ３：ステップ２で得られた中間体（ＩＶ）を、ＨＢｒ／氷酢酸において加熱還流しながら加水分解させ、３−ヒドロキシピリジン−２−ギ酸誘導体（Ｖ）を生成し、
   

   

   （Ｖ）
   
   ステップ４：ステップ３で得られた中間体（Ｖ）とα−Ｒ_３置換のアミノ酸ベンジルエステル（ＶＩ）を、縮合剤の存在下で反応させてアミド化することにより、３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸ベンジルエステル中間体（ＶＩＩ）を生成し、
   

   

   （ＶＩ）
   
   

   

   （ＶＩＩ）
   
   ステップ５：ステップ４で得られた中間体（ＶＩＩ）を水素化分解の条件、溶媒及び触媒の存在下、室温条件で水素化分解することでベンジルエステル保護基を除去し、上記化学式（Ｉ）又は化学式（ＩＩ）で評される化合物を生成し、
   そのうち、Ａｒは下記式で表される官能基であり、
   

   

   式中、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４〜Ｒ８は、請求項１と同じである、製造方法。
6. 前記ステップ２において、触媒はヨウ化第一銅（Ｉ）であり、金属リガンドはＮ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ−メチルプロリン及びＮ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミンからなる群より選択され、反応溶媒は１，４−ジオキサン、トルエン、テトラヒドロフランからなる群より選択され、反応は７０℃〜１２０℃の範囲に加熱することで行われ、
   前記ステップ３において、臭化水素酸と氷酢酸の比は２：１〜１：３の範囲であり、反応温度は９０〜１４０℃の範囲であり、加熱反応時間は６〜１２時間の範囲であり、
   前記ステップ４において、前記α−Ｒ_３置換のアミノ酸ベンジルエステル（ＶＩ）は、グリシンベンジルエステル塩酸塩、（α−又はβ−）アラニンベンジルエステル塩酸塩、（α−又はβ−）バリンベンジルエステル塩酸塩、（α−又はβ−）ロイシンベンジルエステル塩酸塩、（α−又はβ−）イソロイシンベンジルエステル塩酸塩からなる群より選択され、前記溶媒はジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンからなる群より選択され、前記アミド化反応で使用する触媒は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミドからなる群より選択され、
   前記ステップ５において、触媒はパラジウム（０）／炭素、水酸化パラジウム（ＩＩ）、水酸化パラジウム（ＩＩ）／炭素、二酸化白金（ＩＶ）からなる群より選択され、水素化分解反応で使用する溶媒はメタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチルからなる群より選択される、請求項５に記載の製造方法。
7. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
8. ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼを阻害するための医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用。
9. 内因性ＥＰＯの生成を促進するための医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用。
10. 低酸素誘導因子αを安定させるための医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用。
11. 慢性疾患に伴う貧血を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用。
12. 前記慢性疾患に伴う貧血は、リウマチ性関節炎、リウマチ熱又は炎症性腸疾患である、請求項１１に記載の使用。
13. 炎症性サイトカインの生成を促進するための医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用。
14. 前記炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子、インターロイキン又はインターフェロンである、請求項１３に記載の使用。
15. 貧血対象に対して外部からエリスロポエチンを投与する際の抵抗性を改善する医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用であって、
    前記化合物の投与によって造血前駆細胞のエリスロポエチンに対する応答を改善する、使用。
16. 鉄摂取、鉄輸送及び鉄利用率向上に必須な因子の生成を促進するための医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の使用であって、
    前記因子は、赤芽細胞アミノレブリン酸シンターゼ、トランスフェリン、トランスフェリン受容体及びセルロプラスミンからなる群より選択される、使用。
17. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼを阻害する方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
18. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、内因性ＥＰＯの生成を促進する方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
19. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、低酸素誘導因子αを安定させるための方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
20. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、慢性疾患に伴う貧血を治療するための方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
21. 前記慢性疾患に伴う貧血は、リウマチ性関節炎、リウマチ熱又は炎症性腸疾患である、請求項２０に記載の方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
22. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、炎症性サイトカインの生成を促進する方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
23. 前記炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子、インターロイキン又はインターフェロンである、請求項２２に記載の方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
24. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与すること含み、
    前記投与によって造血前駆細胞のエリスロポエチンに対する応答を改善する、貧血対象に対して外部からエリスロポエチンを投与する際の抵抗性を改善する方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
25. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、
    前記投与によって鉄摂取、鉄輸送及び鉄利用率向上に必須な因子の生成を促進し、
    前記因子は、赤芽細胞アミノレブリン酸シンターゼ、トランスフェリン、トランスフェリン受容体及びセルロプラスミンからなる群より選択される、鉄摂取、鉄輸送及び鉄利用率向上に必須な因子の生成を促進する方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。