JP6464745B2 - 生理活性物質の担持力を向上させたナノ粒子の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生理活性物質の担持力を向上させたナノ粒子の製造方法に関する。

天然物由来のゼラチンは、豚や牛、魚の軟骨成分より抽出したタンパク質であり、食品のゲル化剤、増粘剤、安定剤等としての利用のほかにカプセル等の基材として止血剤等の医療分野でも利用されている。また、ゼラチンに臭化カリウムと硝酸銀を加えた乳化コロイドは感光物質の保護コロイドとして用いられている。また、ゼラチンが水溶性であるという性質を利用し、有機溶媒に滴下することでマイクロカプセルを作製する技術も知られている。

更に、近年ゼラチンをナノ粒子化することにより、医薬品成分を目的の臓器や組織に提供するためのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に利用する技術開発が進んでいる。ゼラチンのような食品由来の成分を用いたナノ粒子は安全性の観点から優位性が高いと考えられる。例として、キトサンと併用したナノ粒子の製造方法が挙げられる（特許文献１，２，３）。

本発明者らも、製造の簡便性および原料コストでの優位性を見出したゼラチンとガレート型カテキンを組み合わせたナノ粒子の製造方法を提案してきた（特許文献４）。本発明者らの方法はガレート型カテキンをゼラチン等の動物性タンパク質に対するコアセルベーターとして働かせる方法である。これはそれ自体が生理活性を有する物質をナノ粒子形成物質として用いた初めての方法である。即ち、機能性で最も幅広く研究されているエピガロカテキンガレートに代表されるガレート型カテキンは、抗肥満作用や循環器系疾患予防作用、抗癌作用等幅広い生理機能を有していることが知られている。また、ガレート型カテキンには脂肪分解酵素であるリパーゼを阻害する作用を有する為、植物性油脂の効率的な抽出に用いる技術が報告されている（特許文献５）。また、本発明者らはガレート型カテキンとゼラチンの複合化によりリパーゼ阻害剤を報告しており（特許文献６）、ナノ粒子形成物質としてのガレート型カテキンの用途のみならず、タンパク質との組み合わせによる生理活性の向上という優位性も見出されている。

さて、本発明者は、前記のように特許文献４において生理活性物質を担持させたナノ粒子を報告している。しかし、後述の本実施例でも示すように、一度はナノ粒子に担持された生理活性物質が、原因は不明であるが、ナノ粒子から脱離する現象が見出された。この脱離する生理活性物質の量が大きくなると、ナノ粒子中に担持される生理活性物質の量が低減するため、ナノ粒子に生理活性物質を担持されることの効果を大きく減少させる可能性がある。

ナノ粒子は生体利用性の向上が望めることからその有意性は大きい。したがって、生理活性物質の担持力をより向上したナノ粒子を作製する新たな技術の開発が求められている。

特許第５５６４２００号公報 特開２００９−０９０１６０号公報 米国特許第８，６４２，０８８号明細書 特願２０１４−１６０７４５号 特開２０１４−０６２１９２号公報 特開２０１３−０８２６７３号公報

これまで本発明者らはガレート型カテキンとゼラチン、コラーゲンまたはこれらの分解物の動物性タンパク質を用いて製造されるナノ粒子を報告してきた（特許文献４）。しかし、報告したナノ粒子の製造方法では、ナノ粒子は生体利用性の向上が見込まれる所望の粒子径を達成するものの、生理活性物質を担持させる場合、粒子径が増大したり、担持する生理活性物質の量が２０％程度であるなど、その利用においてまだ十分とはいえなかった。そこで本発明は、生理活性物質の担時力を向上させたナノ粒子の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ナノ粒子が担時している生理活性物質が脱離してくる現象に着目し、この現象を抑える技術について鋭意検討した結果、前記生理活性物質とガレート型カテキンとゼラチン、コラーゲン、およびこれらの分解物の動物性タンパク質と酸とを適切な条件下で混合して得られる溶液をまず作製し、これに生理活性物質を添加することによって作製されるナノ粒子を乾燥させるという非常に簡便な方法で、平均粒子径が１０〜２００ｎｍのナノ粒子であり、且つ担時される生理活性物質量を増加させることに成功し、本発明を完成するに至った。

本発明の要旨は、
（１）ガレート型カテキンを固形分として５〜２０重量％、ゼラチン、コラーゲンまたはこれらの分解物の動物性タンパク質を固形分として合計５〜２０重量％、酸を固形分として５〜２０重量％となるように水、含水有機溶媒もしくは有機溶媒に前記３成分を混合して、ガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液を得る工程（Ａ）、
生理活性物質を水、含水有機溶媒または有機溶媒に溶解させて、生理活性物質含有液を得る工程（Ｂ）、
前記工程（Ａ）で得られたガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液と、工程(Ｂ)で得られた生理活性物質含有液とを混合する工程（Ｃ）、
工程（Ｃ）で得られた混合液を乾燥して、ナノ粒子を得る工程（Ｄ）
を有するナノ粒子の製造方法であり、
前記ナノ粒子を水溶媒に分散させたときに生理活性物質が５０％以上担持されていることを特徴とする生理活性物質の担持されたナノ粒子の製造方法、
（２）前記工程（Ｃ）で得られた混合液を水、含水有機溶媒または有機溶媒を用いてさらに希釈する前記（１）記載の生理活性物質が担持されたナノ粒子の製造方法、
（３）前記乾燥が、加熱減圧乾燥、凍結乾燥または噴霧乾燥である前記（１）または（２）記載の生理活性物質が担持されたナノ粒子の製造方法、
（４）前記生理活性物質がユビキノール、スチルベン類、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミンまたはカロテノイドである前記（１）〜（３）いずれか記載の生理活性物質が担持されたナノ粒子の製造方法、
（５）前記ナノ粒子の平均粒子径が１０〜２００ｎｍである前記（１）〜（４）いずれか記載の生理活性物質が担持されたナノ粒子の製造方法
に関する。

本発明で得られるナノ粒子は、ガレート型カテキンおよび動物性タンパク質という天然物由来の原料からなり、しかもガレート型カテキンおよび動物性タンパク質に由来する優れた健康機能性が期待されるものである。例えば、本発明者らは、これまでに前記特許文献６でコラーゲンとガレート型カテキンを用いたリパーゼ阻害組成物を報告しているが、本発明によって得られたナノ粒子もその機能を保持していることが期待される。

本発明において、「担持」とは、ナノ粒子中に生理活性物質が含まれている状態をいう。
また、本発明において、「担持力」とは、ナノ粒子中に生理活性物質を担持した状態を維持する力をいう。
ナノ粒子に担持されている生理活性物質の量は、後述の実施例２に記載の透析法で判別することができる。
本発明で作製するナノ粒子の平均粒子径は、１０〜２００ｎｍであり、機能性成分の分散安定性の観点から、好ましくは１０〜１００ｎｍであり、より好ましくは２０〜６０ｎｍである。
前記ナノ粒子の平均粒子径は、後述の実施例に記載のように、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）にて測定することができる。

本発明でいう吸収性とは、摂取もしくは塗布したときに機能性成分が体内に入ることを言う。

以下、工程（Ａ）〜工程（Ｄ）を説明する。

（工程（Ａ））
本工程では、ガレート型カテキンを固形分として５〜２０重量％、ゼラチン、コラーゲンまたはこれらの分解物の動物性タンパク質を固形分として合計５〜２０重量％、酸を固形分として５〜２０重量％となるように水、含水有機溶媒もしくは有機溶媒に前記３成分を混合してガレート型カテキン・動物性タンパク質含有液を得る。

具体的には、ガレート型カテキンと前記動物性タンパク質と酸とを、水または含水有機溶媒または有機溶媒に溶解または分散させて、ガレート型カテキンおよび動物性タンパク質を含有する溶液または分散液を作製する。

本発明で用いるガレート型カテキンとしては、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、カテキンガレート（Ｃｇ）が挙げられる。前記ガレート型カテキンは、非重合体でも重合体でもよく、それらを混合しても、単独で使用してもよい。効率的な粒子形成の観点よりＥＧＣｇおよび／またはＥＣｇを含有することが好ましい。また、ガレート型カテキンを含む組成物も使用することができ、例えば、前記ガレート型カテキンを含む茶抽出物やコーヒー抽出物等が挙げられる。また、ナノ粒子の作製を効率よく行う面から、ガレート型カテキンを含む組成物中のガレート型カテキン量が２０重量％以上のものが好ましく、３０重量％以上のものがより好ましく、６０重量％以上のものがさらに好ましい。

本発明で用いる一方の動物性タンパク質としては、ガレート型カテキンとコアセルベートを形成可能なゼラチン、コラーゲンまたはこれらの分解物が挙げられる。
ゼラチンの由来は、牛、豚、魚、ニワトリ等、および遺伝子組み換え体のいずれかを用いることができる。なお、牛骨または豚骨由来の動物性タンパク質は、５００ｎｍ以下の粒子が一部形成されるものの、凝集および沈殿が起こりやすいため、本発明では使用することが難しい。ただし、牛骨または豚骨由来のタンパク質が含まれている動物性タンパク質であっても、平均粒子径１０〜２００ｎｍのナノ粒子が作製できれば、特に限定はなく使用することができる。
コラーゲンとしては、前記ゼラチンを酵素などで分解したものが挙げられ、コラーゲンペプチドも含まれる。
前記ゼラチンまたはコラーゲンの分解物としては、コラーゲンやコラーゲンペプチド以外の分解物が含まれる。
本発明では、前記ゼラチン、コラーゲンまたはこれらの分解物のいずれかを単独で使用してもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。

本発明に用いる酸は、ナノ粒子の使用用途に応じて、使用可能な酸を選択すればよい。例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸、トリフルオロ酢酸のような有機酸、塩酸、過塩素酸、炭酸のような無機酸、または緩衝液などで調整することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記３成分を溶解または分散させる溶媒として使用する水としては、純水、蒸留水、水道水、市販の飲料水などが挙げられるが特に限定はない。
前記溶媒として使用する有機溶媒としては、水と混和するものであればよく、特に限定はない。また、得られたナノ粒子の使用用途に適した溶媒を選択することが好ましく、例えば、食品用途に適した溶媒としては、グリセリン、プロピレングリコール、エタノール等が挙げられ、医薬品用途に適した溶媒としては、上記に加えてメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
また、前記溶媒として使用する含水有機溶媒とは、前記有機溶媒と水との混合溶媒をいう。

前記溶媒に前記ガレート型カテキンと動物性タンパク質と酸とを混合する手段としては、例えば、前記ガレート型カテキンと、前記動物性タンパク質と、酸とを、前記溶媒に溶解または分散させることが挙げられる。

前記のようにガレート型カテキン・動物性タンパク質含有液を作製する際は、前記の原料を粉末状態で混合してから溶解もしくは分散させてもよいし、各原料の溶液もしくは分散液を作製してから混合してもよい。また、前記溶解または分散させる際には、ガレート型カテキンと動物性タンパク質と酸との溶解性の観点から、前記溶媒の温度を２０〜９０℃に調整しておくことが好ましいが、溶解もしくは分散すれば特に限定はない。

前記ガレート型カテキン・動物性タンパク質含有液中のガレート型カテキンの固形分値は、平均粒子径１０〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、５〜２０重量％であり、１０〜２０重量％であることがより好ましい。

前記ガレート型カテキン・動物性タンパク質含有液中の動物性タンパク質の固形分値は、平均粒子径１０〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、合計５〜２０重量％であることが好ましく、合計１０〜２０重量％であることがより好ましいが、所望のナノ粒子が作製できれば、特に限定されることはない。

前記ガレート型カテキン・動物性タンパク質含有液中の酸の固形分値は平均粒子径１０〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、５〜２０重量％であり、１０〜２０重量％であることが好ましい。

また、本工程では、平均粒子径１０〜２００ｎｍのナノ粒子を効率よく得る観点から、前記ガレート型カテキン・動物性タンパク質含有液中のガレート型カテキンの固形分と動物性タンパク質の固形分の重量比（動物性タンパク質／ガレート型カテキン）が０．０７〜８．０となるように調整することが好ましい。
ガレート型カテキンと動物性タンパク質の重量比（動物性タンパク質／ガレート型カテキン）が８．０を超える場合、２００ｎｍ以下のナノ粒子が一部生成されるが、平均粒子径としては２００ｎｍを超える。また、前記ガレート型カテキンと動物性タンパク質の重量比が０．０７未満でも同様である。

また、前記ガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液のｐＨは、１．０〜８．０に調整することが好ましい。ｐＨが１．０より低すぎるとナノ粒子が溶解してしまったり、粒子径が大きくなったりする。このように低いｐＨでナノ粒子の粒子径を調整した報告はほとんどない。一方、ｐＨが８．０より高いと、一時的に粒子を形成するが、凝集、沈殿が生じやすい。また、ｐＨ８．０を超えるとガレート型カテキンの安定性が減少するため効率的なナノ粒子を形成させることができない。前記混合液のｐＨは１．５〜６．０がより好ましく、１．５〜４．０がより好ましい。

なお、前記ガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液のｐＨを調整するには、例えば、ガレート型カテキン含有溶液または分散液と、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液のｐＨを、酸を用いて予め調整してもよい。このように予めｐＨを調整することで、ガレート型カテキン含有溶液または分散液と、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液を混合するだけでも、混合液のｐＨを１．０〜８．０の範囲に調整することができる。また、ガレート型カテキン、動物性タンパク質を粉体混合する場合、この粉体混合物中に前記ｐＨ調整用の酸等を混合し、その後に溶媒を混合してもよい。

前記のようにｐＨを１．０〜８．０の範囲に調整したガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液中において、ガレート型カテキンと動物性タンパク質とがコアセルベートを形成される。

（工程（Ｂ））
本工程では、生理活性物質を、水または含水有機溶媒または有機溶媒に溶解させて、生理活性物質含有液を作製する。

前記生理活性物質としては、ユビキノール、スチルベン類、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、カロテノイドなどが挙げられる。

本発明に用いられるユビキノールは、還元型コエンザイムＱ１０とも言われる機能性成分であり、油溶性の固体状物質である。ユビキノールとしては、市販品を用いればよく、株式会社カネカ製のものが挙げられる。例えば、株式会社カネカ製の精製品である「カネカＱＨ」や調製品である「カネカＱＨ安定化粉末（Ｐ３０）」などが挙げられるが、コスト面や物性面で「カネカＱＨ」が望ましい。

本発明に用いられるスチルベン類は、レスベラトロール、プテロスチルベン、ピセアタンノールなどが挙げられる。またこれらを含有する組成物であってもよい。スチルベン類は市販品を用いればよく、例えば、ピセアタンノールを含有する丸善製薬社製のノブドウエキスやレスベラトロールを含有するビーエイチエヌ社製のビネアトロールなどが挙げられる。

本発明に用いられる水溶性ビタミンとしては、ビタミンＢ群が挙げられる。ビタミンＢ群にはビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２がある。これらは市販品を用いればよい。

脂溶性ビタミンとしては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫなどが挙げられる。これらは市販品を用いればよい。

カロテノイドとしては、ルテイン、アスタキサンチン、リコピン、カロテンなどが挙げられる。これらは市販品を用いればよい。

前記溶媒として使用する水としては、純水、蒸留水、水道水、市販の飲料水などが挙げられるが特に限定はない。
前記溶媒として使用する有機溶媒としては、水と混和するものであればよく、特に限定はない。また、得られたナノ粒子の使用用途に適した溶媒を選択することが好ましく、例えば、食品用途に適した溶媒としては、グリセリン、プロピレングリコール、エタノール等が挙げられ、医薬品用途に適した溶媒としては、上記に加えてメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
また、前記溶媒として使用する含水有機溶媒とは、前記有機溶媒と水との混合溶媒をいう。

前記溶媒に前記生理活性物質を溶解させる手段としては、公知の手段であれば特に限定はない。例えば、前記生理活性物質を、前記溶媒に添加・混合することで、溶解させることができる。また、温度条件などの混合条件については、常温であればよく、特に限定はない。

また、前記生理活性物質の凝集や沈殿などを防ぐ目的で、安定剤、乳化剤などを加えてもよい。安定剤としては、アラビアガム、ペクチン、大豆多糖類、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、カゼインナトリウムなどが挙げられる。また、乳化剤としては、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。

前記生理活性物質含有液中の生理活性物質の固形分値は、平均粒子径１０〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、０．００１〜５０重量％であることが好ましいが、所望のナノ粒子が作製できれば、特に限定されることはない。

（工程（Ｃ））
本工程では、前記工程（Ａ）で作製した前記ガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液と、前記工程（Ｂ）で作製した前記生理活性物質含有液とを混合し、得られる混合液中でナノ粒子を形成させる。

本工程における前記ガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液と、前記生理活性物質含有液との混合方法は、均一に混合可能であればよく、前記混合方法としては攪拌しながら添加する方法、ホモジナイズしながら添加する方法等が使用可能であるが、特に限定はない。
また、必要に応じて、混合液を作製する際に、水等の溶媒を添加してもよい。

本工程において、混合する際の温度等の条件については、成分の大幅な変化等が生じず、均一に混合可能な条件であればよく、使用する成分に適した温度であればよい。例えば、ゼラチンであれば低温であると溶液の粘度が上昇し、濃度が数％以上等と高い場合、均一に混合することが困難となることから、５０℃以上であることが好ましい。さらに、高温の場合、成分の変化が起こりやすくなるため、５０〜１００℃がより好ましく、さらに好ましくは、５０〜９０℃がよい。

前記のようにして得られるナノ粒子を含有する混合液（以下、ナノ粒子含有溶液ともいう）は、ナノ粒子を濃縮したり、精製したりするために、限外濾過、透析等を施してもよい。透析をすれば、粒子化していない成分を分離しやすい。限外濾過膜としては例えばペンシル型ＵＦ膜（旭化成社製）、透析膜としてはＳｎａｋｅＳｋｉｎ（ピアス社製）が挙げられる。これ以外にもナノ粒子を失わずに限外ろ過および透析ができれば特に限定はない。

また、前記工程（Ｃ）で得られたナノ粒子含有溶液を、水、含水有機溶媒または有機溶媒にて希釈してもよい。このように前記ナノ粒子含有溶液をさらに希釈することで、得られたナノ粒子の凝集が抑制され、また、後述の乾燥時にも所望の平均粒子径を保ったまま乾燥しやすいという利点がある。

希釈の程度としては、例えば、得られたナノ粒子含有溶液の５〜１００倍量の溶媒を混合すればよい。

また、前記希釈した溶液には、安定剤として、アラビアガム、ペクチン、大豆多糖類、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、カゼインナトリウムなどを混合してもよい。また、乳化剤として、ショ糖脂肪酸エステル等を混合してもよい。また、ナノ粒子の形成安定剤として、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウムなどのリン酸塩、トランスグルタミナーゼなどの酵素系タンパク質結合剤を混合することができる。前記安定剤、乳化剤、形成安定剤などの含有量には、特に限定はなく、希釈した溶液中のナノ粒子が１０〜２００ｎｍとなればよい。

本工程において、希釈する際の温度等の条件については、成分の大幅な変化等が生じず、均一に混合可能な条件であればよく、例えば、常温であればよい。

（工程（Ｄ））
本工程では前記工程（Ｃ）で得られた混合液を乾燥させてナノ粒子を得る。本工程において、前記工程（Ｃ）で得られた混合液中に形成されているナノ粒子に乾燥処理をさらに施すことで、前記ナノ粒子における生理活性物質の担持力を顕著に向上させることができる。

前記乾燥方法としては、加熱減圧乾燥、凍結乾燥または噴霧乾燥などが挙げられる。
前記加熱減圧乾燥とは、加熱装置内を減圧させて沸点を下げることで、乾燥の促進を図り、少ないエネルギーで蒸発・乾燥させる方法をいう。凍結乾燥とは、まず凍結を行い、次いで真空中で、凍結した乾燥物の沸点を下げて、乾燥物の水分を昇華させて乾燥させる方法をいう。また、噴霧乾燥とは、液体を気体中に噴霧して急速に乾燥させ、乾燥粉体を製造する方法をいう。
前記乾燥方法は、いずれも、公知の乾燥装置を用いて行えばよい。

前記乾燥時における温度条件としては、各乾燥方法に準じて適当な温度範囲に設定すればよいが、例えば、加熱減圧乾燥では２０〜１００℃、凍結乾燥では２０〜６０℃、噴霧乾燥では出口温度を５０〜１００℃に調整することが挙げられるが、特に限定はない。

（ナノ粒子）
前記の工程（Ａ）〜工程（Ｄ）を経て得られるナノ粒子中の生理活性物質の含有量としては、０．１〜２０重量％が好ましい。

また、前記ナノ粒子は、生理活性物質の担時力が向上していることから、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などに配合することで、ガレート型カテキン、動物性タンパク質に加えて前記生理活性物質などの複数の生理活性物質の生体利用性を向上させることができる。

例えば、前記ナノ粒子を食品に利用可能な条件（具体的には、食品に利用可能な溶媒等を用いた場合）で作製した場合は、飲食品に配合してもよい。飲食品としては特に限定されず、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子、機能性食品、健康食品、健康志向食品等が挙げられる。保存性、携帯性、摂取の容易さ等を考慮すると、菓子類が好ましく、菓子類の中でも、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット、チューイングガム等が好ましい。

前記ナノ粒子を飲食品に配合する場合、ナノ粒子の飲食品における含有量は、その生理活性効果が期待できる量であればよい。通常１日あたり１０〜１００００ｍｇ、より好ましくは１００〜３０００ｍｇ摂取できるように配合量を決定することが好ましい。例えば、固形状食品の場合には５〜５０重量％、飲料等の液状食品の場合には０．０１〜１０重量％が好ましい。

また、前記ナノ粒子は、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤または飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

前記ナノ粒子は医薬品に配合してもよい。前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。または胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
前記ナノ粒子を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療または予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。

前記ナノ粒子は医薬部外品に配合してもよい。前記医薬部外品としては、口腔に用いられる医薬部外品、例えば、歯磨き、マウスウオッシュ、マウスリンスや、感染症予防等を目的とした滋養強壮系ドリンク剤等が挙げられる。
前記ナノ粒子を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、通常０．００１〜３０重量％添加するのが好ましい。

前記ナノ粒子は化粧品に配合してもよい。前記化粧品としては、ローション、乳液、クリーム、パック剤、仕上げ化粧品、頭髪用化粧品、洗顔剤、浴剤、制汗剤等が挙げられる。これらの化粧品では、抗酸化効果から美容効果が期待され、抗菌効果から防菌の目的で利用することができる。
また、前記ナノ粒子を化粧品として使用する場合には、化粧品中に０．１ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍの濃度となるようにするのが好ましい。

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１：ナノ粒子粉末の作製）
ゼラチン（商品名：Ｇ微粉、新田ゼラチン社製）１ｇ、緑茶抽出物（ガレート型カテキン６４％）１．８ｇ、クエン酸２ｇを粉体で混合し、これに蒸留水５．２ｇを添加して８０℃で加温しながらホモジナイザーにて均一化させてゼラチン・ガレート型カテキン含有溶液（ｐＨ２．０）１０ｇを得た。
次いで、エタノール９ｇとレスベラトロール（関東化学社製）１ｇとを添加して混合して生理活性物質溶液１０ｇを得た。
ゼラチン・ガレート型カテキン含有溶液１０ｇと生理活性物質溶液１０ｇを均一に混合し、これを５倍量の１０％エタノール溶液にて希釈した。さらに１０倍量の０．４重量％大豆多糖類（商品名：ＳＭ−１２００、三栄源社製）溶液でこれを希釈し、等倍量の０．２重量％リン酸塩で希釈してナノ粒子含有液とした。
前記ナノ粒子含有液を、噴霧乾燥機（東京理科社製）を用いて噴霧乾燥し、ナノ粒子粉末１０ｇを得た。
なお、噴霧乾燥の条件としては、入口温度１８０℃、出口温度９０℃、乾燥空気量０．４ｍ^３／ｍｉｎ、噴霧圧力５０ｋＰａ、流速４００ｍＬ／ｈとした。
得られたナノ粒子粉末を再度水に分散させ、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）を用いて平均粒子径を測定した結果、平均粒子径は９３．６ｎｍであった。

（実施例２：生理活性物質の担持力測定）
ナノ粒子中の生理活性物質の担持力の測定は透析法を用いて測定した。

実施例１で得られるナノ粒子粉末、および工程（Ａ）で作製するゼラチン・ガレート型カテキン含有溶液中のガレート型カテキンとゼラチンの含有量を変えた以外は実施例１と同様にして製造したナノ粒子粉末を用意し、これらのナノ粒子粉末を再度水に再分散させたナノ粒子含有液とをそれぞれ透析膜（商品名：Ｓｎａｋｅ ｓｋｉｎ、ピアス社製、分画分子量：３５００Ｄａ）に２０ｍＬずつ入れ、５Ｌの水で６時間透析した。その後、水を交換し、１６時間透析した。透析膜内に残った溶液２００μＬと透析前のナノ粒子含有液２００μＬにエタノール２００μＬを添加し、さらに酢酸エチル１ｍＬを添加した。５分間混合したのち、遠心分離を行い、上澄みを回収した。得られた上澄みを真空乾燥機で完全に乾燥したのち、２００μＬのメタノールに再溶解させＨＰＬＣにてレスベラトロールを定量した。ガレート型カテキンとゼラチンとの含有量を変えた場合のナノ粒子の粒子径と、レスベラトロールの担持量の結果を表１に示す。
なお、ガレート型カテキンの含有量は、「２．５重量％（サンプル６）」、「５重量％（サンプル５）」、「１１．５重量％（サンプル１、４、７〜１１）」（実施例１と同じ）、「１９．２重量％（サンプル３）」、「２２．４重量％（サンプル２）」のいずれかに調整し、ゼラチンの含有量は、「２重量％（サンプル１１）」、「５重量％（サンプル１０）」、「１０重量％（サンプル１〜６、９）」（実施例１と同じ）、「２０重量％（サンプル８）」、「３０重量％（サンプル７）」のいずれかに調整した。また担持量の比較品として乾燥前のナノ粒子溶液（サンプル１）を用いた。

なお、表１中、「粒子径」において「凝集」とはナノ粒子が凝集したことを示す。
「レスベラトロール」の担持量について「−」とは凝集したため透析法によりレスベラトロール量を測定できなかったものを示す。

表１に示すように、ガレート型カテキンおよびゼラチンの含有量を「５〜２０重量％」の範囲内に調整して得られたナノ粒子（サンプル３〜５、８〜１０）はいずれも、粒子径が２００ｎｍ以下のナノ粒子であり、且つ透析後のナノ粒子にレスベラトロールが５０％以上担持されており、乾燥工程前のサンプル１と比べて担持力が著しく向上していることがわかる。
一方、ガレート型カテキンの含有量が２０重量％を超えたり（サンプル２）、ゼラチンの含有量が５重量％未満（サンプル１１）となったりした場合には、ナノ粒子が凝集してしまい、ナノ粒子とはならないことがわかる。また、ガレート型カテキンの含有量が５重量％未満（サンプル６）、または、ゼラチンの含有量が２０重量％を超える（サンプル７）と、平均粒子径が２００ｎｍを超えることがわかる。
以上のことから、本発明の製造方法によってナノ粒子に担持されている生理活性物質の脱離を抑えることができ、所望量の生理活性物質を含有するナノ粒子を製造することで、ガレート型カテキン、動物性タンパク質および生理活性物質等の複数の機能性成分の生体利用性をより向上させることができることがわかる。

Claims (4)

1. ガレート型カテキンを固形分として５〜２０重量％、ゼラチン、コラーゲンまたはこれらの分解物の動物性タンパク質を固形分として合計５〜２０重量％、酸を固形分として５〜２０重量％となるように水、含水有機溶媒もしくは有機溶媒に前記３成分を混合して、ガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液を得る工程（Ａ）、
   生理活性物質を水、含水有機溶媒または有機溶媒に溶解させて、生理活性物質含有液を得る工程（Ｂ）、
   前記工程（Ａ）で得られたガレート型カテキン、動物性タンパク質含有液と、工程(Ｂ)で得られた生理活性物質含有液とを混合する工程（Ｃ）、
   工程（Ｃ）で得られた混合液を乾燥して、ナノ粒子を得る工程（Ｄ）
   を有するナノ粒子の製造方法であり、
   前記ナノ粒子を水溶媒に分散させたときに生理活性物質が５０％以上担持されており、前記生理活性物質がレスベラトロール、プテロスチルベンまたはピセアタンノールであることを特徴とする生理活性物質の担持されたナノ粒子の製造方法。
2. 前記工程（Ｃ）で得られた混合液を水、含水有機溶媒または有機溶媒を用いてさらに希釈する請求項１に記載の生理活性物質が担持されたナノ粒子の製造方法。
3. 前記乾燥が、加熱減圧乾燥、凍結乾燥または噴霧乾燥である請求項１または２記載の生理活性物質が担持されたナノ粒子の製造方法。
4. 前記ナノ粒子の平均粒子径が１０〜２００ｎｍである請求項１〜３いずれか記載の生理活性物質が担持されたナノ粒子の製造方法。