JP6415716B2 - 可溶性のヘテロ二量体t細胞受容体およびその製法と使用 - Google Patents
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Description
もう一つの好適な例において、前記TCRのβ鎖の定常領域に導入されたシステイン残基の置き換え位置は、TRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、19Aおよび20Eから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖の定常領域に導入されたシステイン残基の置き換え位置は、TRAC*01エクソン1の53R、89Pおよび10Yから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記TCRは可溶性のものである。
もう一つの好適な例において、前記TCRに天然の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。
もう一つの好適な例において、前記TCRでは、天然TCRのC末端を短く切断することによって前記天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を除去した。
もう一つの好適な例において、前記TCRのβ鎖の定常領域に未対合のシステイン残基は存在しない。
もう一つの好適な例において、前記TCRのβ鎖の定常領域では、未対合のシステイン残基はセリンまたはアラニンに置き換えられた。
もう一つの好適な例において、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1の 53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20E、
に置き換えられた。
配列番号2で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号4で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号6で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号8で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号10で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号12で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号14で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号16で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号18で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号20で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号22で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号24で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号26で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号28で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号30で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号32で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号34で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号36で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号38で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号40で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号42で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号44で示される細胞外β鎖アミノ酸配列、
配列番号46で示される細胞外α鎖アミノ酸配列および配列番号48で示される細胞外β鎖アミノ酸配列。
もう一つの好適な例において、前記TCRと結合している抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの組み合わせである。
好ましくは、前記検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、MRI(磁気共鳴画像)またはCT(コンピューターX線断層撮影技術)造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含む。
好ましくは、前記治療剤は、放射性核種、生物毒素、サイトカイン(たとえばIL-2など)、抗体、抗体Fc断片、抗体scFv断片、金ナノ粒子/ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素(たとえば、DT-ジアホラーゼ(DTD)またはビフェニル ヒドロラーゼ様蛋白質(BPHL))、化学治療剤(たとえば、シスプラチン)または任意の様態のナノ粒子などを含む。
もう一つの好適な例において、前記T細胞受容体と結合している治療剤は、前記TCRのα鎖またはβ鎖のC末端またはN末端に連結した抗CD3抗体あるいは任意のCD3と特異的に結合するタンパク質、小分子化合物または有機大分子化合物である。
本発明の第三の側面では、本発明の第二に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の第四の側面では、宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞であった、本発明の第三に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の本発明の第二に記載の核酸分子が組み込まれた細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞は、原核細胞および真核細胞、例えば大腸菌、酵母細胞、CHO細胞などから選ばれる。
本発明の第六の側面では、本発明の第一に記載のT細胞受容体を製造する方法であって、
(i)本発明の第四に記載の宿主細胞を培養することによって、本発明の第一に記載のT細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖を発現させる工程と、
(ii)前記のα鎖および/またはβ鎖を分離または精製する工程と、
(iii)前記のα鎖および/またはβ鎖をリフォールディングさせ、前記T細胞受容体を得る工程と、
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の複合体は、本発明のT細胞受容体と治療剤の結合で形成された複合体、または本発明のT細胞受容体と検出可能なマーカーの結合で形成された複合体を含む。
もう一つの好適な例において、前記の複合体は、2つまたは3つ以上のT細胞受容体分子を含む。
本発明の第九の側面では、薬学的に許容される担体と安全有効量の本発明の第一に記載のTCR、本発明の第四に記載の細胞または本発明の第七に記載のT細胞受容体複合体を含む薬物組成物を提供する。
本発明の第十の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に本発明の第一に記載のTCR、本発明の第五に記載の細胞、本発明の第七に記載のT細胞受容体複合体または本発明の第九に記載の薬物組成物を施用することを含む方法を提供する。
好ましくは、前記の疾患は、腫瘍、自己免疫疾患およびウイルス感染性疾患を含む。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記(例えば実施例)の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
天然のTCRは2本のポリペプチドからなるが、それぞれαβ型またはγδ型である。各ポリペプチドはそれぞれ一つの膜近位の定常ドメインおよび一つの膜遠位の可変ドメインを有する。各定常ドメインおよび可変ドメインにそれぞれ一つの鎖内ジスルフィド結合が含まれる。TCRの細胞外定常ドメインは一つの膜近位の領域および一つの免疫グロブリン領域を有する。天然TCRの膜近位領域の2本の鎖の間に1組のジスルフィド結合が存在し、本発明で「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、人工的に導入される、位置が天然の鎖間ジスルフィド結合の位置と異なる鎖間共役ジスルフィド結合を「人工的鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、用語「本発明のポリペプチド」、「本発明のTCR」、「本発明のT細胞受容体」は、入れ替えて使用することができ、いずれも本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRをいう。
TCRの各鎖における非システイン残基をシステインに突然変異させて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。当該ジスルフィド結合はTCRの各鎖の定常領域に位置することが好ましい。
本発明の好ましい実施形態において、システインを導入して人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成する位置は、
TRAC*01エクソン1の 53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20Eである。
本発明のもう一つの好ましい実施形態において、本発明のTCRは膜貫通ドメイン以外の一部の定常ドメインを含んでもよいが、このような場合、天然のTCR鎖間ジスルフィド結合を形成する一つまたは複数のシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与しないほかのアミノ酸残基に突然変異するか、あるいはこれらの残基の一つまたは複数を欠失させる。
本発明の一つの好適な例において、本発明の高安定性のTCRはC末端が短く切断された天然のTCRのα鎖とβ鎖の定常領域を含み、好ましくは天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基から1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個またはそれ以上のアミノ酸の位置で短く切断し、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を除去し、このようなTCRが天然の鎖間ジスルフィド結合を含まない。 しかし、もちろん、本発明のTCRに天然の鎖間ジスルフィド結合が含まれてもよい。注意すべき点は、TCR鎖の1本だけが天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を有し、当該システインが本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有するTCR分子とほかの分子との連結に使用される場合もあることである。TCRのβ鎖に一つの遊離の未対合のシステイン残基が含まれる場合、本発明では、当該システインを別のアミノ酸、たとえばセリンまたはアラニンに突然変異させることが好ましい。本発明のTCRの各鎖は、その鎖間ジスルフィド結合を含んでもよい。
TCR鎖におけるアミノ酸残基がすべてその抗原特異性および機能性に重要であるわけではないため、本発明のTCR鎖に適量の突然変異を導入してもその抗原特異性および機能性に影響しない場合もある。ほかの突然変異の様態は、1〜6個(通常は1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、最も好ましくは1個)のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換、ならびにC末端および/またはN末端への1個または2個以上(通常は5個以内、好ましくは3個以内、より好ましくは2個以内)のアミノ酸の付加を含むが、これらに限定されない。たとえば、本分野において、機能が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。C末端および/またはN末端への1つまたは2つ以上のアミノ酸の付加も、通常、蛋白質の構造と機能を変えることはない。
α鎖の定常領域10Y: IQNPDPAVYQLRDSKSSDKS
α鎖の定常領域53R: ITDKTVLDMRSMDFKSNSAV
α鎖の定常領域89P: SIIPEDTFFCSPESSSAAAL
β鎖の定常領域20E: EVAVFEPSEAEISHTQKATL
β鎖の定常領域54S: WWVNGKEVHSGVSTDPQPLKおよび
β鎖の定常領域19A: EVAVFEPSEAEISHTQKATL。
本発明は人工的鎖間ジスルフィド結合で連結されるヒトの安定性αβTCR、およびほかの哺乳動物の人工的鎖間ジスルフィド結合で連結されるαβTCRを含み、前記哺乳動物はヤギ、ヒツジ、ブタ、マウスやラットを含むが、これらに限定されない。たとえば、本発明によれば、同定できたマウスににおけるシステインを導入して人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成する位置は以下の通りである(太字で下線のアルファベットで示す)。
ヒトのα鎖の10Yのネズミの同等物:IQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLF
ヒトのα鎖の53Rのネズミの同等物: GTFITDKTVLDMKAMDSKSNGA
ヒトのα鎖の89Pのネズミの同等物: QDIFKETNATYPSS
ヒトのβ鎖の20Eのネズミの同等物:FPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLAT
ヒトのβ鎖の54Sのネズミの同等: LSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESN
ヒトのβ鎖の19Aのネズミの同等: FPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLAT。
また、本発明は、本発明のTCRをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のヌクレオチド全長配列或いはの断片は、通常、PCR増幅法、組換え法又は人工合成の方法で得られるが、これらに限定されない。現在、本発明のポリペプチド(又はその断片、或いはその誘導体)をコードするDNA配列を全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子(たとえばベクター)や細胞に導入してもよい。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまはたコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞にも関する。
また、本発明は、本発明のTCRをコードするポリヌクレオチドに関し、本発明に係るT細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA形態でもRNA形態でもよい。DNAは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。たとえば、成熟ポリペプチドをコードするコード領域の配列は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47で示されるコード領域の配列と同様でもよく、あるいは縮重変異体でもよい。ここで用いられるよに、「縮重変異体」とは本発明において配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするが、上記に対応するコード領域の配列と違う核酸配列である。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまはたコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞にも関する。
一方、本発明は、さらに、本発明のTCRポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、特にモノクローナル抗体も含む。
新しい人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の導入は、任意の適切な方法を使用してもよく、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるもの、制限酵素によるクローンまたはライゲーション非依存的なクローン化(LIC)方法を含むが、これらに限定されない。多くの標準の分子生物学教材ではこれらの方法が詳記されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の誘導および制限酵素によるクローンの詳細は、SambrookおよびRussell, (2001) 「モレキュラー・クローニング:研究室マニュアル」(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)CSHL出版社を参照する。LIC方法の詳細な情報はRashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6を参照する。
通常の組み換えDNA技術によって、本発明のポリヌクレオチドで組み換えの本発明のポリペプチドを発現または生産することができる。一般的に、以下の工程を含む。
(1)本発明のTCRポリペプチドをコードするポロヌクレオチド(または変異体)を使用し、あるいはこのポロヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する。
(2)適切な培地において宿主細胞を培養する。
(3)培地または細胞から本発明のTCRポリペプチドを分離し、精製する。
好ましくは、細菌、たとえば大腸菌において封入体の様態で発現させて体外でリフォールディングさせて本発明の可溶性の高安定性TCRを得ることができる。
本発明のTCRおよび本発明のTCRを移入したT細胞は、薬学的に許容される担体といっしょに薬物組成物で提供することができる。本発明のTCR、多価TCR複合体および細胞は、通常、無菌薬物組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。この薬物組成物は、任意の適切な様態でもよい(患者への投与に必要な方法によって決まる)。単位剤形で提供してもよいが、通常、密封の容器に入って提供され、キットの一部として提供してもよい。このようなキットは、取り扱い説明書を含むが、必ず必要なものではない。複数の前記単位剤形を含んでもよい。
診断の目的に使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、MRI(磁気共鳴画像)またはCT(コンピューターX線断層撮影技術)造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明のTCRと結合または抱合することができる治療剤は、以下のものを含むが、これらに限定されない。 1.放射性核種(Koppeら,2005,Cancer metastasis reviews,24,539)、2.生物毒素(Chaudharyら,1989,Nature,339,394;Epelら,2002,Cancer Immunology and Immunotherapy,51,565)、3.サイトカイン(Gilliesら,1992,美国国家科学院院刊(PNAS)89,1428;Cardら,2004,Cancer Immunology and Immunotherapy, 53,345;Halinら,2003,Cancer Research,63,3202)、4.抗体Fc断片(Mosqueraら,2005,The Journal Of Immunology,174,4381)、5.抗体scFv断片 (Zhuら,1995,International Journal of Cancer, 62, 319)、6.金ナノ粒子/ナノロッド(Lapotkoら,2005,Cancer letters,239,36;Huangら,2006,Journal of the American Chemical Society,128,2115)、7.ウイルス粒子(Pengら,2004,Gene therapy, 11,1234)、8.リポソーム(Mamotら,2005,Cancer research,65,11631)、9.磁性ナノ粒子、10.プロドラッグ活性化酵素(たとえば、DT-ジアホラーゼ(DTD)またはビフェニル ヒドロラーゼ様蛋白質(BPHL))、化学治療剤(たとえば、シスプラチン)など。
薬物組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含有してもよい。用語の「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投与のために使用される担体である。当該用語は、自身がその組成物を受ける個体に有害な抗体を誘導せず、且つ投与後過剰な毒性がないという条件を満足するような薬剤担体を指す。これらの担体は、本分野の技術者に熟知である。「レミントンの医薬科学」(Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.,N.J. 1991年))において、薬学的に允許される賦形剤に関する十分な検討が見つけられる。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、佐剤、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。
通常、治療性組成物は注射剤、例えば液体溶液または懸濁液に調製してもよく、注射直前に溶液または懸濁液に配合することに適する液体ビヒクルの固体形態に調製してもよい。
本発明の組成物にすれば、通常の経路で給与することができ、眼内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、或いは局部給与を含むが、これらに限られない。予防・治療する対象は、動物、特にヒトでよい。
これらの薬物組成物は、通常の方法によって混合、希釈または溶解で配合することができ、かつ適切な薬物添加剤、たとえば賦形剤、崩壊剤、バインダー、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤(isotonicities)、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤や溶解助剤などを添加することもあり、またこの配合過程は剤形に合わせて通常の方法で行うことができる。
本発明の薬物組成物が実際に治療に使用される場合、活性成分としての本発明のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の投与量は、治療される患者それぞれの体重、年齢、性別、症状の程度によって合理的に決定することができる。
本発明のTCRは、薬物または診断試薬として有用である。修飾またはほかの改良によって薬物または診断試薬として使用されることに適する特徴を持たせることができる。この薬物または診断試薬は、多くの異なる疾患の治療または診断に使用することができ、前記疾患は、癌(たとえば腎臓癌、卵巣癌、頭部および頚部癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、子宮頚癌、膀胱癌、前立腺癌やメラノーマなど)、自己免疫疾患、ウイルス感染性疾患、移植拒絶や移植片対宿主病を含むが、これらに限定されない。
本発明のTCRの特異性によって、薬物の部位特定または標的化投与を実現することで、多くの疾患の治療または診断の効果を向上させる。
本発明のTCRは、T細胞の活性化の調整に有用で、本発明のTCRは特異的なpMHCと結合することによってT細胞の活性化を抑制する。T細胞が仲介する炎症および/または組織損傷に関する自己免疫疾患、たとえば1型糖尿病にこの方法が適用できる。
本発明のTCRは、診断試薬としても有用である。検出可能なマーカーで本発明のTCRを標識し、たとえば診断目的に適するマーカーで標識し、MHC-ペプチドとMHC-ペプチドに特異的な本発明のTCRの間の結合を検出することができる。蛍光標識されたTCR多量体はFACS分析に適し、TCRに特異的なペプチドを持つ抗原提示細胞の検出に使用することができる。
本発明の高安定性T細胞受容体は、TCRとpMHC(ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体)の間の相互作用の研究および疾患の診断と治療などの目的に使用することができる。
(1)本発明のT細胞受容体は、高安定性を有し、好適に再生・リフォールディング・精製され、かつその元のリガンドと特異的に結合できる。
(2)本発明のT細胞受容体は高いTm値を有し、Tm値は45℃超である。
(3)本発明のT細胞受容体はタンパク質再生収率が高く、大規模製造が容易で、かつ生産コストの低下に有利である。
TCR分子LC13(抗原短鎖ペプチドHLA-B4405:EEYLKAWTF(配列番号49)に対するもの)のTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
上記TCRのTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
GATAAATGCGTGCTGGATATGTGCAGCATGGATTTCAAAAG(配列番号50)
CTTTTGAAATCCATGCTGCACATATCCAGCACGCATTTATC(配列番号51)
5’-3’
GGCAAAGAAGTGCATTGCGGTGTTTGTACCGATC(配列番号52)
GATCGGTACAAACACCGCAATGCACTTCTTTGCC(配列番号53)
LC13 TCRαおよびβ鎖の遺伝子を含む発現プラスミドはそれぞれ上記αおよびβ鎖のプライマーで以下のような突然変異を行った。各PCR点突然変異反応において、10〜30ngのプラスミドDNAを5μL 10×KOD plus緩衝液、5μL 2.5mM dNTP Mix、 3μL 2mM MgSO4 、1単位のKOD plusポリメラーゼ(東洋紡上海生物科技有限公司)、10μMの上・下流プライマー1μLずつと混合し、最後にH2Oで50μLまで補充した。均一に混合した後、Bio-Rad PCR装置にセットして反応させた。94℃で2min初期変性させた後、18サイクルの増幅を行った(94℃で15sec変性、55℃で30secアニールおよび68℃で6min伸長)。その後、10単位のDpnI制限酵素(New England Biolabs)で37℃で1時間消化させた。10μLの消化産物を感受性E.coli DH5α細菌に形質転換して37℃で16時間生長させた。単一クローンを取って5mLのLB+カナマイシンで一晩培養した。メーカーの使用説明書に従ってZyppyプラスミドミニプレップキット(ZYMO RESEARCH)でプラスミドDNAを精製し、かつInvitrogen社に送ってシークエンシングによって同定され、正確に突然変異したら下流発現に使用した。
TCRタンパク質の発現
鋳型鎖を持つ目的遺伝子をNcoIおよびNotIで二重酵素切断し、NcoIおよびNotIで二重酵素切断されたpET28a(Novagen)ベクターと連結させた。連結産物をE.coli DH5α(Tiangen)に形質転換し、カナマイシン含有LBプレートを塗布し、37℃で逆さで一晩培養し、クローンを取ってPCR選別を行い、陽性組換え体に対してシークエンシングを行った。
-80℃超低温冷蔵庫から封入体を取り出して解凍し、最終濃度が10mMになるようにジチオトレイトール(DTT)を入れ、ジスルフィド結合が完全に断裂するように37 ℃で30 min〜1時間インキュベートした。その後、封入体サンプル溶液(15mg α鎖と10mgβ鎖)を順に200mlの4℃に事前に冷やしたリフォールディング緩衝液(100mM Tris pH 8.1、400mM L-アルギニン、2mM EDTA、5M 尿素、6.5mMシステアミン塩酸塩および1.87mMシスタミン二塩酸塩)に滴下し、4℃でゆっくり約30分間撹拌した。再生溶液として8倍体積の事前に冷やしたH2Oを使用して16〜20時間透析した。さらに8倍体積の20mM Tris pH 8.0で2回透析し、4℃で約8時間透析を続け、透析後サンプルをろ過した後以下の精製を行った。
透析を経たリフォールディング物(20 mM Tris pH 8.0中)はGE Hitrap Qアニオン交換クロマトグラフィー用充填カラム(GE Healthcare)を使用し、AKTA精製装置(GE Healthcare)によって0〜600 mM NaClで勾配溶離を行った。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによって各画分を分析した後、合併した。
第一段階の精製で合併したサンプル溶液を濃縮してこの段階の精製に使用し、PBS緩衝液で事前に平衡化させたSuperdex 100 160/300 GLゲルろ過クロマトグラフィー用充填カラム(GE Healthcare)によってタンパク質を精製し、TCR分子LC13の溶離曲線はそれぞれ図3に示す。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによってピークの画分を分析し、その還元・非還元ゲル画像は図73のレーン2およびレーン6に示す。溶離ピークおよびゲル画像から、単一ピークは人工的鎖間ジスルフィド結合で連結された可溶性TCR分子で、当該分子はSDSゲルで安定して存在し、還元後離れたα鎖とβ鎖になったことがわかる。
TCRタンパク質は2段階の精製を経て合併した後、溶離画分の純度をHPLCによって測定した。条件は、 Agilent 1260、クロマトグラフィカラムBio SEC-3(300 A、φ7.8×300 mm)で、移動相が150 mMリン酸塩緩衝液で、流速0.5 mL/min、カラム温度25℃、紫外検出波長214 nmであった。TCR分子LC13のSEC(サイズ排除クロマトグラフィー)スペクトルは図4に示す。本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称のものである。
本発明において、TCRタンパク質の再生収率の計算式は、
タンパク質再生収率(%)=100×精製後得られたタンパク質量(mg)/再生に使用された封入体の量(mg)である。上記計算式では、TRAC*01エクソン1の53番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させたLC13 TCRのタンパク質再生収率は43.30%であった。収率が高かったというのは、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有する可溶性TCR分子が安定していることを説明した。
実施例2で得られたLC13 TCRタンパク質(濃度0.5 mg/ml)1 mlをPBSに透析し、米国TA(waters)社の示差走査熱量計(Nano DSC)によってTCRタンパク質に対して熱安定性の測定を行った。検出の温度範囲は10〜90℃で、昇温速度は1℃/minであった。透析外液のPBSをコントロールとし、基線を3回測定し、基線が安定したら、さらにタンパク質のサンプルを検出した。データを採取した後、分析ソフトTA_DSC_NanoAnalyzeでTCRのTm値を測定し、かつそのDSCサーモグラムを得た。体外可溶発現で得られた人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明のLC13 TCRのDSCサーモグラムは図5に示すように、そのTm値は55.82℃に達した。当該DSCサーモグラムから、室温で、ひいては41〜43℃の温度でも、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が正確なフォールディングを維持し、かつ持つべき活性を保つことがわかるが、これはその安定性が高いことを示す。
forteBIO Okeリアルタイム分析システムによってTCRタンパク質とその対応する抗原pMHC複合体の結合活性を検出した。
SAセンサーの表面に約2 nmのビオチン化pMHC複合体を固定化し、さらに0.05 mMのビオチンを10 μL/minの流速でチップを120 s通らせ、ストレプトアビジンの残りの結合位置をブロッキングした。動態学の分析方法によってその親和力を測定し、PBST緩衝液(PBS+0.005% ツイン20、pH 7.4)でTCRタンパク質を5つの異なる濃度(通常は64、32、16、8、4、0 μM)に希釈し、その対応するpMHCの親和力を測定した。Evaluationソフトで1:1で結合するモデルでフィッティングして動態学のパラメーターを算出した。
a.精製
100 mlの重鎖または軽鎖を誘導発現するE. coli菌液を収集し、4 ℃で8000 gで10 min遠心した後10 ml PBSで菌体を1回洗浄した後、5 mlのBugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)で激しく振とうして菌体を再懸濁させ、室温で回転させながら20 minインキュベートした後、4 ℃で6000 gで15 min遠心し、上清を捨て、封入体を収集した。
上記封入体を5 mlのBugBuster Master Mixに再懸濁させ、室温で回転させながら5 minインキュベートした。30 mlの10倍に希釈したBugBusterを入れ、均一に混合し、4 ℃で6000 gで15 min延伸した。上清を捨て、30 mlの10倍に希釈したBugBusterを入れて封入体を再懸濁させ、均一に混合し、4 ℃で6000 gで15 min遠心し、2回繰り返し、30 mlの20 mM Tris-HCl pH 8.0を入れて封入体を再懸濁させ、均一に混合し、4 ℃で6000 gで15 min遠心し、最後に20 mM Tris-HCl 8M尿素で封入体を溶解させ、SDS-PAGEによって封入体の純度を測定し、BCAキットによって濃度を測定した。
所要の短鎖ペプチド(北京賽百盛遺伝子技術有限公司)を合成して濃度が20 mg/mlになるようにDMSOに溶解させた。軽鎖および重鎖の封入体を8 M尿素、20 mM Tris pH 8.0、10 mM DTTで溶解させ、再生前に3 M塩化グアニジニウム、10 mM酢酸ナトリウム、10 mM EDTAを入れてさらに変性させた。短鎖ペプチドを25 mg/L(最終濃度)で再生緩衝液(0.4 M L-アルギニン、100 mM Tris pH 8.3、2 mM EDTA、0.5 mM 酸化型グルタチオン、5 mM 還元型グルタチオン、0.2 mM PMSF、4 ℃に冷却)を入れた後、順に20 mg/Lの軽鎖および90 mg/Lの重鎖(最終濃度、重鎖は3回に分けて添加、8 h/回)を入れ、再生は完成まで4 ℃で少なくとも3日行われ、SDS-PAGEによって再生に成功したか検出した。
10倍体積の20 mM Tris pH 8.0で透析して再生緩衝液を交換し、溶液のイオン強度が十分に低下するように緩衝液を少なくとも2回交換した。透析後、0.45 μm 酢酸セルロースろ膜でタンパク質溶液をろ過した後、HiTrap Q HP(GE社)アニオン交換カラムにかけた(5 ml床体積)。Akta精製装置(GE社)を使用し、20 mM Tris pH 8.0で調製された0〜400 mM NaCl直線勾配液でタンパク質を溶出させ、pMHCは約250 mM NaClで溶出し、各ピークの画分を収集し、SDS-PAGEによって純度を検出した。
Millipore限外濾過管で精製されたpMHC分子を濃縮させ、同時に緩衝液を20 mM Tris pH 8.0に交換した後、ビオチン化試薬として0.05 M Bicine pH 8.3、10 mM ATP、10 mM MgOAc、50 μM D-Biotin、100 μg/ml BirA酵素(GST-BirA)を入れ、室温で混合物を一晩インキュベートし、SDS-PAGEによってビオチン化が完全か検出した。
Millipore限外濾過管でビオチンで標識されたpMHC分子を1 mlに濃縮させ、ゲルろ過クロマトグラフィーによってビオチン化されたpMHCを精製し、Akta精製装置(GE社)を使用し、ろ過されたPBSで事前に平衡化したHiPrepTM 16/60 S200 HRカラム(GE社)を使用し、1 mlの濃縮されたビオチン化pMHC分子をかけた後、PBSで1 ml/min流速で溶出させた。ビオチン化pMHC分子は約55 mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含有する画分を合併し、Millipore限外濾過管で濃縮させ、BCA法(Thermo)によってタンパク質濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤cocktail(Roche)を入れてビオチン化pMHC分子を小分けして-80℃で保存した。
異なる濃度のLC13分子とその対応する抗原の結合曲線は図6に示すように、KD値は10.5μMであった。当該結合曲線から、濃度の低下は本発明のTCR分子とその対応する抗原の結合に影響せず、低濃度のTCR分子は高濃度TCR分子と同様の結合活性を示したことがわかるが、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有するTCRは安定していることが説明された。
forteBIO Okeリアルタイム分析システムによってTCRタンパク質とその対応する抗原pMHC複合体の特異性を検出した。6種類の異なるビオチン化抗原(濃度0.5μM)をそれぞれ6本のSAセンサーの表面に載せた。その後、測定される各TCRタンパク質(濃度2〜20μM)と互いに作用させた。最後に、その相互作用によるシグナルを分析した。結果から、人工的鎖間ジスルフィド結合を導入したLC13TCRはその対応する抗原であるpMHC複合体だけと結合し、A0201:KLVALGINAV(配列番号54)、A0201:KLVALGINAV(配列番号54)、A0201: SLLMWITQC(配列番号55)、 A0201: GILGFVFTL(配列番号56)、 A0101: EVDPIGHLY(配列番号57)、 A1101: SSCSSCPLSK(配列番号58)およびA2402: KYKDYFPVI(配列番号59)を含むほかの無関連の抗体と結合しなかったことがわかる。
TCR分子1G4(抗原短鎖ペプチドHLA-A2/SLLMWITQC(配列番号55)に対するもの、NY-ESO-1腫瘍特異的抗原)のTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
実施例1に記載のプライマーおよびPCR手順を使用して突然変異を行った後、TCR分子1G4のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図7aと7bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図8aと8bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
実施例2に記載の方法によって1G4TCRタンパク質の純度を測定し、そしてその収率を算出した。得られたそのSECスペクトルは図10に示すように、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する1G4TCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称のものである。その収率は40%に達した。
同時に、本発明のTCR分子は強い特異性も持ち、その対応する抗原であるpMHC複合体だけと結合し、B4405: EEYLKAWTF(配列番号49)、 A0201: GILGFVFTL(配列番号56)、 A0101: EVDPIGHLY(配列番号57)、 A1101: SSCSSCPLSK(配列番号58)およびA2402: KYKDYFPVI(配列番号59)を含むほかの無関連の抗体と結合しなかった。
TCR分子JM22(抗原短鎖ペプチドHLA-A2/GILGFVFTL(配列番号56)に対するもの、インフルエンザウイルス基質タンパク質由来)のTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
実施例1に記載のプライマーおよびPCR手順を使用して突然変異を行った後、TCR分子JM22のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図13aと13bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図14aと14bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
実施例2に記載の方法によってJM22TCRタンパク質の純度を測定し、そしてその収率を算出した。得られたそのSECスペクトルは図16に示すように、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するJM22TCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称のものである。その収率は31.65%に達した。
同時に、本発明のTCR分子は強い特異性も持ち、その対応する抗原であるpMHC複合体だけと結合し、B4405: EEYLKAWTF(配列番号49)、 A0201: SLLMWITQC(配列番号55)、 A0101: EVDPIGHLY(配列番号57)、 A1101: SSCSSCPLSK(配列番号58)およびA2402: KYKDYFPVI(配列番号59)を含むほかの無関連の抗体と結合しなかった。
TCR分子MGA3(抗原短鎖ペプチドHLA-A1:EVDPIGHLY(配列番号57)に対するもの、MageA3腫瘍特異的抗原)のTRAC*01エクソン1の53番目のアルギニンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54番目のセリンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
実施例1に記載のプライマーおよびPCR手順を使用して突然変異を行った後、TCR分子MGA3のα鎖とβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はぞれぞれ図19aと19bに、その対応するヌクレオチド配列はぞれぞれ図20aと20bに示し、導入されたシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
実施例2に記載の方法によってMGA3TCRタンパク質の純度を測定し、そしてその収率を算出した。得られたそのSECスペクトルは図22に示すように、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するMGA3TCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称のものである。その収率は30.14%に達した。
本発明のTCR分子は強い特異性も持ち、その対応する抗原であるpMHC複合体だけと結合し、B4405: EEYLKAWTF(配列番号49)、 A0201: SLLMWITQC(配列番号55)、 A0101: GILGFVFTL(配列番号56)、 A1101: SSCSSCPLSK(配列番号58)およびA2402: KYKDYFPVI(配列番号59)を含むほかの無関連の抗体と結合しなかった。
それぞれTCR分子LC13、1G4、JM22およびMGA3のTRAC*01エクソン1の89番目のプロリンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19番目のアラニンをシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
上記数種類のTCRのTRAC*01エクソン1の89番目のプロリンをシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
CGGAAGATACGTTCTTCTGCAGCCCAGAAAGTTCC(配列番号60)
GGAACTTTCTGGGCTGCAGAAGAACGTATCTTCCG(配列番号61)
5’-3’
GTTTTTGAACCGAGCGAATGCGAAATTAGCCATACC(配列番号62)
GGTATGGCTAATTTCGCATTCGCTCGGTTCAAAAAC(配列番号63)
実施例1〜実施例4に記載の方法を使用してTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
それぞれTCR分子LC13、1G4、JM22およびMGA3のTRAC*01エクソン1の10番目のチロシンをシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20番目のグルタミン酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
上記数種類のTCRのTRAC*01エクソン1の10番目のチロシンをシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
5’-3’
CCGGATCCGGCCGTTTGCCAGCTGCGTGATAGC(配列番号64)
GCTATCACGCAGCTGGCAAACGGCCGGATCCGG(配列番号65)
5’-3’
GAACCGAGCGAAGCGTGCATTAGCCATACCCAG(配列番号66)
CTGGGTATGGCTAATGCACGCTTCGCTCGGTTC(配列番号67)
実施例1〜実施例4に記載の方法を使用してTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
Claims (19)
- T細胞受容体(TCR)であって、
前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常領域にシステイン残基を導入することによって人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ前記T細胞受容体のTm値は≧45℃であること、
ここで、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1のR53CおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のS54C、あるいは
TRAC*01エクソン1のY10CおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のE20C、
に置き換えられたこと
を特徴とする受容体。 - 前記TCRは(i)その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のTCRα鎖、および(ii)その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のTCRβ鎖を含み、ここで、(i)および(ii)はいずれもTCR鎖の機能性可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項1に記載のTCR。
- 前記TCRは可溶性のものであることを特徴とする請求項1または2に記載のTCR。
- 前記TCRに天然の鎖間ジスルフィド結合は存在しないことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のTCR。
- 前記TCRでは、天然TCRのC末端を短く切断することによって前記天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を除去したことを特徴とする請求項4に記載のTCR。
- 前記TCRでは、前記天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別の残基に置き換えられたことを特徴とする請求項4に記載のTCR。
- 前記TCRのβ鎖の定常領域に未対合のシステイン残基は存在しないことを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載のTCR。
- 前記TCRのβ鎖の定常領域では、未対合のシステイン残基はセリンまたはアラニンに置き換えられたことを特徴とする請求項7に記載のTCR。
- 前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC末端またはN末端に抱合体が結合していることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載のTCR。
- 前記TCRと結合している抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項9に記載のTCR。
- 前記TCRと結合している治療剤は、前記TCRのα鎖またはβ鎖のC末端またはN末端に連結した抗CD3抗体であることを特徴とする請求項10に記載のTCR。
- 請求項1〜11のいずれかに記載のTCRのα鎖および/またはβ鎖をコードする核酸配列またはその相補配列を含むことを特徴とする核酸分子。
- 請求項12に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
- 請求項13に記載のベクターを含むか、或いは染色体に外来の請求項12に記載の核酸分子が組み込まれていることを特徴とする宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞。
- 請求項1〜11のいずれかに記載のTCRを提示することを特徴とする分離された細胞。
- 請求項1〜11のいずれかに記載のT細胞受容体を製造する方法であって、
(i)請求項14に記載の宿主細胞を培養し、請求項1〜11のいずれかに記載のTCRのα鎖および/またはβ鎖を発現する工程と、
(ii)前記の鎖および/または鎖を分離または精製する工程と、
(iii)前記の鎖および/または鎖をリフォールディングさせ、前記TCRを得る工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 一つまたは複数の請求項1〜11のいずれかに記載のTCRを含むことを特徴とするT細胞受容体複合体。
- 腫瘍、ウイルス感染または自己免疫疾患を治療する薬物の製造あるいはMHC−ペプチド複合体を検出する試薬の製造に使用されることを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載のTCRの使用。
- 薬学的に許容される担体と安全有効量の請求項1〜11のいずれかに記載のTCR、請求項15に記載の細胞または請求項17に記載のT細胞受容体複合体とを含むことを特徴とする薬物組成物。
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