JP6640994B2 - 安定した可溶性ヘテロ二量体tcr - Google Patents
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Description
本発明の第一の側面では、α鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフ
ィド結合を含有する、αβヘテロ二量体TCRを提供する。
もう一つの好適な例において、前記TCRの人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、TRAVの46または47番目のアミノ酸残基に取って代わったものである。
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、あるいは
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
に取って代わったものである。
もう一つの好適な例において、前記TCRはα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の可変ドメインならびに膜貫通ドメイン以外のβ鎖の定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、前記TCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖はヘテロ二量体を形成する。
もう一つの好適な例において、前記TCRは(i)その膜貫通ドメイン以外のTCRのα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメイン以外のTCRのβ鎖の全部または一部を含み、ここで、(i)および(ii)はいずれもTCR鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含む。
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常領域のC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去された。
もう一つの好適な例において、前記TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有しない。
TRAC*01エクソン1の48TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の57S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の77S、
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の17S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の59D、
TRAC*01エクソン1の15SおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の15E、
TRAC*01エクソン1の53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20E、
に取って代わったものである。
もう一つの好適な例において、前記TCRと結合している抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの組み合わせである。
もう一つの好適な例において、前記TCRのTm値は≧45℃、好ましくは≧50℃、より好ましくは≧52℃、最も好ましくは≧55℃である。
本発明の第三の側面では、本発明の第二の側面に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のT細胞受容体を製造する方法であって、
(i)本発明の第四の側面に記載の宿主細胞を培養することによって、本発明の第一の側面に記載のT細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖を発現させる工程と、
(ii)前記のα鎖および/またはβ鎖を分離または精製する工程と、
(iii)前記のα鎖および/またはβ鎖をリフォールディングさせ、前記T細胞受容体を得る工程と、
を含む方法を提供する。
本発明の第八の側面では、本発明の第一の側面に記載のTCRの使用であって、腫瘍、ウイルス感染または自己免疫疾患を治療する薬物の製造あるいはMHC-ペプチド複合体を検出する試薬の製造における使用を提供する。
に記載のTCR、本発明の第五の側面に記載の細胞または本発明の第七の側面に記載のT細胞受容体複合体を含む薬物組成物を提供する。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記(たとえば実施例)の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
本発明者は幅広く深く研究したところ、意外に安定した可溶性T細胞受容体を得た。具体的に、本発明のTCRはαβヘテロ二量体で、かつ本発明のTCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に共役の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する。より具体的に、本発明のTCRの人工的鎖間ジスルフィド結合は、α鎖のFR2とβ鎖の定常領域の間に位置する。また、本発明は前記TCRの使用、およびその製造方法を提供する。
本発明の実施またはテストにおいて本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料を使用することができるが、本明細書で好適な方法と材料が挙げられた。
T細胞受容体
天然のαβヘテロ二量体TCRはα鎖およびβ鎖を有し、α鎖およびβ鎖はαβヘテロ二量体TCRの二つのサブユニットを構成する。TCRのα鎖およびβ鎖は一般的にそれぞれ二つの「ドメイン」を有するとされ、すなわち、TCRα鎖の可変ドメイン(Vα)およびTCRα鎖の定常ドメイン(Cα)、TCRβ鎖の可変ドメイン(Vβ)およびTCRβ鎖の定常ドメイン(Cβ)である。天然TCRの膜近位領域のCα鎖とCβ鎖の間に1組のジスルフィド結合が存在し、本発明で「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、人工的に導入される、位置が天然の鎖間ジスルフィド結合の位置と異なる鎖間共役ジスルフィド結合を「人工的鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、用語「本発明のポリペプチド」、「本発明のTCR」、「本発明のT細胞受容体」は、入れ替えて使用することができ、いずれもα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含
有するヘテロ二量体TCRをいう。
で、TRBC1*01はそのエクソン1に4N、5Kおよび37Fを有するが、TRBC2*01はそのエクソン1に4K、5Nおよび37Yを有する。そのため、TCR分子のβ鎖の定常領域はTRBC1*01でもTRBC2*01でも基本的に違いがない。本発明の実施例で使用されたβ鎖の定常領域はTRBC2*01である。
用語「安定性」とは、タンパク質の安定性の任意の面である。再生能力、発現能力、タンパク質再生収率、熱安定性、凝集耐性、アンフォールディング耐性などの面を含み、好ましくはタンパク質再生収率および熱安定性の面をいう。
用語「3ドメインTCR」とは、前記TCRがα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の可変ドメインならびに膜貫通ドメイン以外のβ鎖の定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、α鎖の可変ドメインとβ鎖がヘテロ二量体を形成し、人工的鎖間ジスルフィド結合が前記TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域を連結する。
用語「4ドメインTCR」とは、前記TCRが(i)その膜貫通ドメイン以外のTCRのα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメイン以外のTCRのβ鎖の全部または一部を含み、ここで、(i)および(ii)はいずれもTCR鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖とβ鎖がヘテロ二量体を形成し、人工的鎖間ジスルフィド結合が前記TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域を連結する。
本発明は、TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に共役の人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性ヘテロ二量体のT細胞受容体を得た。具体的に、本発明のTCRの人工的鎖間ジスルフィド結合は、α鎖の可変領域(TRAV)のFR2とβ鎖の定常領域の間に位置する。より具体的に、人工的鎖間ジスルフィド結合が形成する位置は、TRAVの46番目または47番目のアミノ酸残基とβ鎖の定常領域の適切な位置の間に位置してもよい。同様に、人工的鎖間ジスルフィド結合が形成する位置は、TRBC1*01またはTRBC2*01のエクソン1の60番目または61番目のアミノ酸残基とα鎖の定常領域の適切な位置の間に位置してもよい。
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、あるいは
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
に取って代わったものである。
本発明の一つの好適な実施形態において、本発明のTCRは3ドメインTCRで、すなわち、前記TCRがα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の可変ドメインならびに膜貫通ドメイン以外の
β鎖の定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、α鎖の可変ドメインとβ鎖がヘテロ二量体を形成し、人工的鎖間ジスルフィド結合が前記TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域を連結する。
TRAC*01エクソン1の48TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の57S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の77S、
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の17S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の59D、
TRAC*01エクソン1の15SおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の15E、
TRAC*01エクソン1の53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20E、
に取って代わったものでもよい。
(I)、Leu (L)、Lys (K)、Met (M)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V)である。
げられた代表的なポリペプチドに限定されない。
コード配列
また、本発明は、本発明のTCRをコードするポリヌクレオチドに関し、本発明に係るT細胞受容体のα鎖および/またはβ鎖をコードするポリヌクレオチドも含む。
ター)や細胞に導入してもよい。
製造方法
人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の導入は、任意の適切な方法を使用してもよく、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるもの、制限酵素によるクローンまたはライゲーション非依存的なクローン化(LIC)方法を含むが、これらに限定されない。多くの標準の分子生物学教材ではこれらの方法が詳記されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の誘導および制限酵素によるクローンの詳細は、SambrookおよびRussell, (2001) 「モレキュラー・クローニング:研究室マニュアル」(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)CSHL出版社を参照する。LIC方法の詳細な情報はRashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6を参照する。
(1)本発明のTCRポリペプチドをコードするポロヌクレオチド(または変異体)を使用し、あるいはこのポロヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する。
(3)培地または細胞から本発明のTCRポリペプチドを分離し、精製する。
好ましくは、細菌、たとえば大腸菌において封入体の様態で発現させて体外でリフォールディングさせて本発明の安定した可溶性TCRを得ることができる。
本発明のTCRおよび本発明のTCRを移入したT細胞は、薬学的に許容される担体といっしょに薬物組成物で提供することができる。本発明のTCR、多価TCR複合体および細胞は、通常、無菌薬物組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。この薬物組成物は、任意の適切な様態でもよい(患者への投与に必要な方法によって決まる)。単位剤形で提供してもよいが、通常、密封の容器に入って提供され、キットの一部として提供してもよい。このようなキットは、取り扱い説明書を含むが、必ず必要なものではない。複数の前記単位剤形を含んでもよい。
ology and Immunotherapy,51,565)、3.サイトカイン(Gilliesら,1992,美国国家科学院院刊(PNAS)89,1428;Cardら,2004,Cancer Immunology and Immunotherapy, 53,345;Halinら,2003,Cancer Research,63,3202)、4.抗体Fc断片(Mosqueraら,2005,The Journal Of Immunology,174,4381)、5.抗体scFv断片 (Zhuら,1995,International
Journal of Cancer, 62, 319)、6.金ナノ粒子/ナノロッド(Lapotkoら,2005,Cancer letters,239,36;Huangら,2006,Journal of the American Chemical Society,128,2115)、7.ウイルス粒子(Pengら,2004,Gene therapy,11,1234)、8.リポソーム(Mamotら,2005,Cancer research,65,11631)、9.磁性ナノ粒子、10.プロドラッグ活性化酵素(たとえば、DT-ジアホラーゼ(DTD)またはビフェニル ヒドロラーゼ様蛋白質(BPHL))、化学治療剤(たとえば、シスプラチン)など。
これらの薬物組成物は、通常の方法によって混合、希釈または溶解で配合することができ、かつ適切な薬物添加剤、たとえば賦形剤、崩壊剤、バインダー、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤(isotonicities)、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤や溶解助剤などを添加することもあり、またこの配合過程は剤形に合わせて通常の方法で行うことができる。
、乳酸重合体、乳酸-グリコール酸共重合体などが挙げられ、好ましくは生分解可能な重合体、たとえば乳酸重合体および乳酸-グリコール酸共重合体が挙げられる。
本発明のTCRは、薬物または診断試薬として有用である。修飾またはほかの改良によって薬物または診断試薬として使用されることに適する特徴を持たせることができる。この薬物または診断試薬は、多くの異なる疾患の治療または診断に使用することができ、前記疾患は、癌(たとえば腎臓癌、卵巣癌、頭部および頚部癌、睾丸癌、肺癌、胃癌、子宮頚癌、膀胱癌、前立腺癌やメラノーマなど)、自己免疫疾患、ウイルス感染性疾患、移植拒絶や移植片対宿主病を含むが、これらに限定されない。
癌に対し、腫瘍または転移癌の周囲を標的とすると、毒素または免疫刺激物の効果を向上させることができる。自己免疫疾患において、特異的に正常の細胞または組織に対する免疫反応を抑制し、または免疫抑制薬を徐々に放出させ、より長時間でより多い局部の効果を果たさせることで、被試者の全体の免疫力に対する影響を最小限にする。移植拒絶の防止において、同様の方法で免疫抑制の作用を最適化することができる。薬物が既存のウイルス性疾患、たとえばHIV、SIV、EBV、CMV、HCV、HBVに対し、薬物が感染細胞の周辺で放出され、または活性化機能を発揮することも有益である。
本発明の安定した可溶性T細胞受容体は、TCRとpMHC(ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体)の間の相互作用の研究および疾患の診断と治療などの目的に使用することができる。
本発明の主な利点は以下の通りである。
(1)本発明は、安定した可溶性T細胞受容体を得、本発明のTCRは、好適に再生・リフ
ォールディング・精製され、かつその元のリガンドと特異的に結合できる。
(3)本発明のT細胞受容体はタンパク質再生収率が高く、大規模製造が容易で、かつ生産コストの低下に有利である。
TCR分子1G4(抗原短鎖ペプチドHLA-A2/SLLMWITQC(配列番号25)、NY-ESO-1腫瘍特異的抗原に対するもの)のTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに、かつそのTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させることによって、人工的鎖間ジスルフィド結合を形成させた。
5’-3’
GTGGTTTCGTCAAGATTGCGGTAAAGGTCTGACC (配列番号26)
GGTCAGACCTTTACCGCAATCTTGACGAAACCAC (配列番号27)
上記TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC (配列番号28)
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC (配列番号29)
PCRの手順は以下の通りである。
メインおよびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図1aおよび1bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図2aおよび2bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。
TCRタンパク質の発現
TCRのα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の発現プラスミドでそれぞれ大腸菌株BL21(DE3)を形質転換し、LBプレート(カナマイシン50 μg/ml)に塗布して37℃で一晩培養した。翌日、クローンを取って10 mlのLB液体培地(カナマイシン50 μg/ml)に接種して2〜3 h培養し、体積比1:100で1LのLB培地(カナマイシン50 μg/ml)に接種し、続いてOD600が0.5〜0.8になるまで培養した後、最終濃度が1mMのIPTGで目的タンパク質の発現を誘導した。4時間誘導した後、6000 rpmで10 min遠心して細胞を収集した。PBS緩衝液で菌体を1回洗浄し、そして菌体を分けて保存し、200 mlの細菌培養物に相当する菌体を取って5mlのBugBuster Master Mix (Novagen)で細菌を分解させ、6000gで15min遠心して封入体を収集した。その後、洗浄剤で4回洗浄することによって細胞破片および膜成分を除去した。その後、緩衝液、たとえばPBSで封入体を洗浄することによって洗浄剤および塩を除去した。最後に、封入体を6M塩化グアニジニウム緩衝溶液で溶解させ、そして封入体の濃度を測定し、それを-80℃で冷凍保存した。
-80℃超低温冷蔵庫から封入体を取り出して解凍し、最終濃度が10 mMになるようにジチオトレイトール(DTT)を入れ、ジスルフィド結合が完全に断裂するように37℃で30 minから1時間インキュベートした。その後、封入体サンプル溶液(9.2mgα鎖と10mgβ鎖)を200 mlの4℃に冷やしておいたリフォールディング緩衝液(100 mM Tris pH 8.1、400 mM L-アルギニン、2 mM EDTA、5 M 尿素、6.5mMシステアミン塩酸塩および1.87mMシスタミン二塩酸塩)に滴下し、4℃でゆっくり約30分間撹拌した。再生溶液を8倍体積の冷やしておいたH2Oで16〜20時間透析した。さらに8倍体積の20 mM Tris pH 8.0で2回透析し、4℃で約8時間透析を続け、透析後サンプルをろ過して以下の精製を行った。
透析されたリフォールディング物(20 mM Tris pH 8.0において)は、GE Hitrap Qアニオン交換クロマトグラフィー充填カラム(GE Healthcare)を使用し、AKTA精製装置(GE Healthcare)において0〜600 mM NaClで勾配溶離を行った。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによって各成分を分析し、そして合併した。
第一段階の精製で合併されたサンプル溶液を濃縮してこの段階の精製に供し、PBS緩衝液で平衡化しておいたSuperdex 100 160/300 GLゲルろ過クロマトグラフィー充填カラム(GE Healthcare)によってタンパク質を精製し、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を導入した3ドメインTCR分子の溶離曲線を図3に示す。クマシーブリリアントブルー染色のSDS-PAGEによってピークの成分を分析し、その還元と非還元ゲル画像を図65のレーン1とレーン6に示す。溶離ピークおよびゲル画像から、単一溶離ピークは人工的鎖間ジスルフィド結合で連結する可溶性TCR分子で、当該分子はSDSゲルにおいて単一バンドとして安定して存在し、還元された後別
々のα鎖の可変ドメインとβ鎖になったことがわかる。
TCRタンパク質は二段階の精製を経て合併した後、溶離画分の純度をHPLCによって検出した。条件は、 Agilent 1260、クロマトグラフィカラムBio SEC-3(300 A、φ7.8×300 mm)で、移動相が150 mMリン酸塩緩衝液で、流速0.5 mL/min、カラム温度25℃、紫外検出波長214 nmであった。TCR分子のSEC(サイズ排除クロマトグラフィー)スペクトルは図4に示す。本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する3ドメインTCR分子のHPLC溶離ピークは単一で対称的で、当該タンパク質の構造が安定して、凝集やアンフォールディングなどの現象がなく、純度が非常に高いことが示された。
本発明におけるTCRタンパク質再生収率の計算方法は、
タンパク質再生収率(%)=100×精製完成後得られたタンパク質の量(mg)/再生に使用された封入体の量(mg)である。上記計算方法に基づき、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目の間に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成した1G4 TCR分子のタンパク質再生収率は49%であった。収率は高く、TCRのα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域の間に本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を有する3ドメインTCR分子は安定した可溶性のものであることが示された。
実施例2で得られた1G4 TCRタンパク質(濃度0.5 mg/ml)1 mlをPBSに透析し、米国TA(waters)社の示差走査熱量計(Nano DSC)によってTCRタンパク質に対して熱安定性を測定した。検出の温度範囲は10〜90℃で、昇温速度は1℃/minであった。透析外液PBSをコントロールとし、基準線を3回測定し、基準線が安定したら、タンパク質のサンプルを検出した。データを収集した後、分析ソフトTA_DSC_NanoAnalyzeによってTCRのTm値を測定し、そのDSCサーモグラムを得た。本発明のα鎖の可変領域とβ鎖の定常領域に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRのDSCサーモグラムは、図5に示すように、そのTm値は53℃に達した。当該サーモグラムは、室温で、ひいては温度43〜44℃で、本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子がいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を持ったことを反映し、その安定性が高いことが示された。
forteBIO Okeリアルタイム分析システムによってTCRタンパク質とそれに相応する抗原pMHC複合体の結合活性を検出した。
a.精製
100 mlの重鎖または軽鎖を誘導発現するE. coli菌液を収集し、4℃で8000 gで10 min遠心した後10 mlのPBSで菌体を1回洗浄し、さらに5 mlのBugBuster Master Mix Extraction
Reagents(Merck)で激しく振とうして菌体を再懸濁させ、そして室温で回転させて20 min
インキュベートした後、4℃で6000 gで15 min遠心し、上清を捨て、封入体を収集した。
所要の短鎖ペプチド(北京賽百盛遺伝子技術有限公司)を合成して濃度が20 mg/mlになるようにDMSOに溶解させた。軽鎖および重鎖の封入体を8 M尿素、20 mM Tris pH 8.0、10
mM DTTで溶解させ、再生前に3 M塩化グアニジニウム、10 mM酢酸ナトリウム、10 mM EDTAを入れてさらに変性させた。短鎖ペプチドに25 mg/L(最終濃度)になるように再生緩衝液(0.4 M L-アルギニン、100 mM Tris pH 8.3、2 mM EDTA、0.5 mM 酸化型グルタチオン、5 mM 還元型グルタチオン、0.2 mM PMSF、4℃に冷却)を入れた後、順に20 mg/Lの軽鎖および90 mg/Lの重鎖(最終濃度、重鎖は3回に分けて8 h/回入れた)を入れ、再生は4℃で完成するまで少なくとも3日行われ、SDS-PAGEによって再生が成功したか検出した。
10体積の20 mM Tris pH 8.0で透析することによって再生緩衝液を置き換え、緩衝液を少なくとも2回置き換えることによって溶液のイオン強度を十分に低下させた。透析後0.45 μmの酢酸セルロースろ膜でタンパク質溶液をろ過した後、HiTrap Q HP(GE社)アニオン交換カラムにかけた(5 mlベッド体積)。Akta精製装置(GE社)を使用し、20 mM Tris pH 8.0で調製した0〜400 mM NaClの直線勾配液でタンパク質を溶離させ、pMHCが約250 mM NaClにおいて溶離し、各ピークの成分を収集し、SDS-PAGEによって純度を検出した。
Millipore限外ろ過チューブで精製されたpMHC分子を濃縮し、同時に緩衝液を20 mM Tris pH 8.0に置き換えた後、ビオチン化試薬として0.05 M Bicine pH 8.3、10 mM ATP、10 mM MgOAc、50 μM D-Biotin、100 μg/ml BirA酵素(GST-BirA)を入れ、室温で混合物を一晩インキュベートし、SDS-PAGEによって完全にビオチン化したか検出した。
Millipore限外ろ過チューブでビオチン化標識されたpMHC分子を1 mlに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーによってビオチン化されたpMHCを精製し、Akta精製装置(GE社)を使用し、ろ過されたPBSでHiPrepTM 16/60 S200 HRカラム(GE社)を予め平衡化し、1 mlの濃縮されたビオチン化pMHC分子をかけた後、PBSで1 ml/minの流速で溶離させた。ビオチン化されたpMHC分子は約55 mlにおいて単峰として溶離して現れた。タンパク質を含有する成分を合併し、Millipore限外ろ過チューブで濃縮し、BCA法(Thermo)によってタンパク質濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤cocktail(Roche)を入れてビオチン化されたpMHC分子を分けて-80℃で保存した。
forteBIO Okeリアルタイム分析システムによってTCRタンパク質のそれに相応する抗原pMHC複合体に対する特異性を検出した。本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCRタンパク質の特異性の検出方法は、TCRに相応する抗原pMHC複合体(既にビオチン化されたもの)および選ばれたいくつかのほかの無関連の抗原pMHC複合体(既にビオチン化されたもの)をそれぞれSAセンサーの表面に載せた後、測定される各TCRタンパク質と相互作用させ、最後に、その相互作用による信号を分析した。
本実施例では、さらにTCR分子のTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の3ドメインTCR分子が得られることが検証された。
5’-3’
GTGGTATCGTCAAGAATGCGGTGAAGGTCCGGTC (配列番号32)
GACCGGACCTTCACCGCATTCTTGACGATACCAC (配列番号33)
上記JM22 TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC (配列番号34)
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC (配列番号35)
上記LC13 TCRのTRAVの46番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
CATTGGTACCGTCAGCTGTGCAGCCAAGGTCCGG (配列番号36)
CCGGACCTTGGCTGCACAGCTGACGGTACCAATG (配列番号37)
上記LC13 TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
GGTGTTTCTACCGATTGCCAGCCGCTGAAAGAAC (配列番号38)
GTTCTTTCAGCGGCTGGCAATCGGTAGAAACACC (配列番号39)
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
メインおよびβ鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図7aおよび7bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図8aおよび8bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図9および図66のレーン2(還元ゲル)およびレーン5(非還元ゲル)に示す。HPLC溶離ピークは、図10に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は25%に達した。そのTm値は54℃で、相応するDSCチャートは図11に示す。JM22分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図12に示す。
本実施例では、TCR分子のTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の4ドメインTCR分子が得られることが検証された。
鎖の細胞外のアミノ酸配列はそれぞれ図19および1bに、それに相応するヌクレオチド配列はそれぞれ図20および2bに示し、導入したシステイン残基は太字で下線のアルファベットで表す。その溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図21および図67のレーン1(還元ゲル)およびレーン6(非還元ゲル)に示す。HPLC溶離ピークは、図22に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は35%に達した。そのTm値は56℃で、相応するDSCチャートは図23に示す。LC13分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図24に示す。
本実施例では、TCR分子のTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCR分子が得られることが検証された。
5’-3’
GTTTCGTCAAGATCCGTGCAAAGGTCTGACCAGC (配列番号40)
GCTGGTCAGACCTTTGCACGGATCTTGACGAAAC (配列番号41)
上記TCRのTRBC*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸をシステインに突然変異させる場合、設計されたプライマーは以下の通りである。
GTTTCTACCGATCCGtgcCCGCTGAAAGAACAG (配列番号42)
CTGTTCTTTCAGCGGgcaCGGATCGGTAGAAAC (配列番号43)
実施例1〜実施例4に記載の方法でTCRに対してPCR、再生および機能テストを行った。
本実施例では、TCR分子のTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCR分子が得られることが検証された。
本実施例では、TCR分子のTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCR分子が得られることが検証された。
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の3ドメインTCR分子の溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図49および図65のレーン2(還元ゲル)およびレーン7(非還元ゲル)に示す。HPLC溶離ピークは、図50に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は37%に達した。そのTm値は48℃で、相応するDSCチャートは図51に示す。TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図52に示す。
R分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
本実施例では、TCR分子のTRAVの46番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCR分子が得られることが検証された。
本実施例では、TCR分子のTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の3ドメインTCR分子が得られることが検証された。
鎖間ジスルフィド結合を形成させた。突然変異に使用されたプライマーおよび工程は上記実施例を参照した。
人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する本発明の3ドメインTCR分子の溶離曲線およびゲル画像はそれぞれ図57および図65のレーン3(還元ゲル)およびレーン8(非還元ゲル)に示す。HPLC溶離ピークは、図58に示すように、単一で対称的なものである。タンパク質再生収率は22%に達した。そのTm値は48℃で、相応するDSCチャートは図59に示す。TCR分子とそれに相応する抗原の結合曲線は図60に示す。
本実施例では、TCR分子のTRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合が形成すると、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCR分子が得られることが検証された。
が高く、高い温度でいずれも正確なフォールディングを維持し、かつあるべき活性を保ち、その安定性が高いことが示された。同時に、TCR分子とその元のリガンドの結合曲線は、TCR濃度の低下がそのリガンドとの結合に影響しないことを示し、側面から本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するTCR分子が安定していることが示された。特異性テストでは、これらの本発明の人工的鎖間ジスルフィド結合が導入されたTCR分子はそれに相応する抗原だけと結合し、ほかの数種の無関連の抗原のいずれとも相互作用がなく、優れた特異性を示した。そのため、上記実験データによって、TRAVの47番目とTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目に人工的鎖間ジスルフィド結合を導入することによって、安定した可溶性の本発明の4ドメインTCRタンパク質を得ることができることが証明された。
Claims (23)
- α鎖の可変領域とβ鎖の定常領域との間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有するαβヘテロ二量体T細胞受容体(TCR)であって、
前記TCRの人工的鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸
、あるいは
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
に取って代わったものである、ことを特徴とするαβヘテロ二量体TCR。 - 前記TCRは、可溶性のものであることを特徴とする請求項1に記載のTCR。
- 前記TCRはα鎖の可変ドメインおよびβ鎖の可変ドメインならびに膜貫通ドメイン以外のβ鎖の定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖の定常ドメインを含まず、前記TCRのα鎖の可変ドメインとβ鎖とがヘテロ二量体を形成することを特徴とする請求項1又は2に記載のTCR。
- β鎖の定常ドメインにおける天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別のアミノ酸に置き換えられたことを特徴とする請求項3に記載のTCR。
- β鎖の定常ドメインにおける天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基はアラニンまたはセリンに置き換えられたことを特徴とする請求項3に記載のTCR。
- 前記TCRのβ鎖の定常ドメインのC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されたことを特徴とする請求項3に記載のTCR。
- 前記TCRは(i)その膜貫通ドメイン以外のTCRのα鎖の全部または一部、および(ii)その膜貫通ドメイン以外のTCRのβ鎖の全部または一部を含み、
ここで、(i)および(ii)はいずれもTCR鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のTCR。 - 前記TCRのα鎖とβ鎖との定常ドメインの間に天然の鎖間ジスルフィド結合が存在しないことを特徴とする請求項7に記載のTCR。
- 前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常領域のC末端で短く切断することによって天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されたことを特徴とする請求項8に記載のTCR。
- 前記TCRのα鎖および/またはβ鎖の定常領域における天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別の残基に置き換えられたことを特徴とする請求項8に記載のTCR。
- 前記TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有することを特徴とする請求項7〜10のいずれかに記載のTCR。
- TCRのα鎖の定常領域とβ鎖の定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を形成する
システイン残基は、
TRAC*01エクソン1の48TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の57S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の77S、
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の17S、
TRAC*01エクソン1の45TおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の59D、
TRAC*01エクソン1の15SおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の15E、
TRAC*01エクソン1の53RおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の54S、
TRAC*01エクソン1の 89PおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の19A、あるいは
TRAC*01エクソン1の10YおよびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の20E、
に取って代わったものであることを特徴とする請求項11に記載のTCR。 - 前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC末端またはN末端に抱合体が結合していることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載のTCR。
- 前記TCRと結合している抱合体は、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項13に記載のTCR。
- 前記TCRと結合している治療剤は、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC末端またはN末端に連結した抗CD3抗体であることを特徴とする請求項14に記載のTCR。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のTCRのα鎖およびβ鎖をコードする核酸配列またはその相補配列を含むことを特徴とする核酸分子。
- 請求項16に記載の核酸分子を含むベクター。
- 宿主細胞または遺伝形質転換のエンジニアリング細胞であって、請求項17に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の請求項16に記載の核酸分子が組み込まれている細胞。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のTCRを発現することを特徴とする分離された細胞。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のT細胞受容体を製造する方法であって、
(i)請求項18に記載の宿主細胞を培養することによって、請求項1〜15のいずれかに記載のT細胞受容体のα鎖およびβ鎖を発現させる工程と、
(ii)前記のα鎖およびβ鎖を分離または精製する工程と、
(iii)前記のα鎖およびβ鎖をリフォールディングさせ、前記T細胞受容体を得る工程と、
を含む方法。 - 一つまたは複数の請求項1〜15のいずれかに記載のTCRを含むことを特徴とするT細胞受容体複合体。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のTCRの使用であって、腫瘍、ウイルス感染または自己免疫疾患を治療する薬物の製造あるいはMHC-ペプチド複合体を検出する試薬の製造に使用されることを特徴とする使用。
- 薬学的に許容される担体と安全有効量の請求項1〜15のいずれかに記載のTCR、請求項19に記載の細胞または請求項21に記載のT細胞受容体複合体とを含むことを特徴とする薬物組成物。
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