JP6410855B2 - ムチンの製造方法 - Google Patents
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Description
(1)破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程と、前記液体成分からムチンを抽出する工程と、を備える、ムチンの製造方法であって、前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたクラゲである、ムチンの製造方法。
(2)前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させ、更にpHを6〜8に調整したクラゲである、(1)に記載のムチンの製造方法。
(3)前記コラーゲン分解酵素阻害剤がエチレンジアミン四酢酸塩である、(1)又は(2)に記載の製造方法。
(4)糖鎖が硫酸基を有するムチン。
(5)糖鎖を構成する単糖単位の30モル%以上が1つ以上の硫酸基を有する、(4)に記載のムチン。
(6)(4)又は(5)に記載のムチンを有効成分として含有する界面活性剤。
(7)(4)又は(5)に記載のムチンを有効成分として含有するイオン交換樹脂。
(8)(4)又は(5)に記載のムチンを有効成分として含有する潤滑剤。
1実施形態において、本発明は、破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程と、前記液体成分からムチンを抽出する工程と、を備える、ムチンの製造方法であって、前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたクラゲである、ムチンの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により、クラゲから純度の高いムチンを容易に製造することができる。
クラゲとしては特に制限されず、例えば、ミズクラゲ、エチゼンクラゲ、アカクラゲ、スナイロクラゲ、ハブクラゲ、カミクラゲ等の、ヒドロ虫綱、鉢虫綱、箱虫綱に属する刺胞動物のいずれも用いることができる。また、クラゲは、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたものであれば、採取直後のものであってもよく、冷凍保存を経たものであってもよい。
コラーゲン分解酵素阻害剤としては、キレート剤、コラーゲン分解酵素の阻害効果が高い化合物(キレート剤を除く。)等が挙げられる。
発明者は、コラーゲン分解酵素阻害剤としてキレート剤が有効であることを見出した。これは、クラゲの体内に存在するコラーゲン分解酵素が、主にマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)であるためであると推測している。
コラーゲン分解酵素の阻害効果が高い化合物(キレート剤を除く。)としては、例えば、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+、青酸化合物、β1−アンチコラゲナーゼ、DFP(ジイソプロピルフルオロリン酸)、PMSF(フェニルメタンスルホニルフルオリド)、SBTI(ダイズトリプシンインヒビター)、TLCK(Tos−Lys−クロロメチルケトン)、TPCK(Tos−Phe−クロロメチルケトン)、N−[1(R,S)−カルボキシ−n−ブチル]−Leu−Phe−AlaNH2、[N−1(r)−カルボキシエチル−α(s)(フェニルエチル)Gly−(S)−Leu−N−フェニルアミド、[N−1(R)−カルボキシエチル−α(s)(2−フェニルエチル)Gly−Leu−N−フェニルアミド、Nα−(nデシルホスホニル)Gly−Pro−Ala、nデシルPO2Gly−Pro−Ala、2,3−ジメルカプトプロパノール、Nα(エチルホスホニル)Gly−Pro−Ala、N(2R)2[2’ヒドロキシアミノ2’オキソエチル]6フェノキシヘキサノイル−LフェニルアラニルNメチルアミド、N2−(2(5)−[(ヒドロキシカルバモイル)メチル−4−メチルバレリル]−N−1,3一ジメチルバリンアミド、Nα−(イソアミルホスホニル)−Gly−Pro−Ala、(S,S)−3−メルカプト−6−メチル−4−[[[1(S)−[(メチルアミノ)カルボニル]2(3−インドリル)エチル]アミノ]カルボニル]ヘプタン酸メチルエステル、ミノサイクリン、NN((R)−1−ホスホノプロピル)(S)Leu−(S)−3インドイルアラニン−N−メチルアミド、ホスホラミドン、Nαホスホリル−Gly−Pro−Ala−アミド、Nαホスホリル−Gly−Pro−Ala、Nαホスホリル−Gly−Pro−アミド、Z−Phe−psi−(PO2CH2)Gly−Pro−AHX、Z−Phe−psi−(PO2CH2)Gly−Pro−NLE、N−Z−Pro−Leu−Glyヒドロキマート、5−シアナミド−4−オキソ−6−フェニルヘキサノイル−Pro−Pro、ジイソプロピルフロロリン酸、N−(エトキシヒドロキシホスフィニル)−L−Ile−N−メチル−L−トリプトファンアミド、還元型グルタチオン、HS−C2H4−CO−Pro−ホモアルギニン、HS−C2H4−CO−Pro−NH−(4ニトロベンジル)、HS−C2H4−CO−Pro−4ニトロベンジルアミド、8−ヒドロキソキノリン、イソプロピルアルコール、2−メルカプトエタノール、メルカプトトリペプチド、N−(4−ニトロフェニルエチルホスホニル)Gly−L−Pro−L−2−アミノ−ヘキサン酸、N−(3フェニルプロピルホスホニル)Gly−Pro−L−2−アミノ−ヘキサン酸、トリグリコール酸、N−(4−トリフルオロメチルフェニルエチルホスホニル)−Gly−Pro−L−2−アミノヘキサン酸、Z−Gly−Leu−OH、Z−Gly−Pro−Leu−NHOH、Z−Gly−Pro−Leu−OH、Z−Gly−Pro−NHOH、シナモイル(5R,S)−5−アミノ−7−メチル−4−オキソオクタノイル−Pro−Pro、N−ベンジルオキシカルボニル−システイントリプトアミド、4−デジメチルアミノテトラサイクリン、(2R,S)−HONH−Mal(iBu)NH(CH2)7CH3、3−(N−ヒドロキシカルバモイル)−2−(R)−イソブチルプロピオニル−L−トリプトファン−N[2−(4−ヒドロキシフェニル)エチル]アミド、HSCH(CH2CH(CH3)2)CO−Ala−Gly−D−Arg−NH2、2−アミノベンジル−Gln−Gly−Pro−2−ナフチルアミド、ドキシサイクリン、ロイペプチン、キモスタチン、マトリルスタチン(Matlystatins)、マリマスタット(Marimastat)、バチマスタット(Batimastat)、セアフラビン(Theaflavin)、アクチノニン(Actinonin)、クロドロネート(Clodronate)、リファンピシン(rifampicin)、カプトプリル(Captopril)、シラシタチン(Cilastatin)、コプチシン(Coptisine)、グリチルレチン酸(Glycyrrhetinic acid)、ベツリン酸、TIMP−2、TIMP−4、AG3340、BB1101、BB1909、BB2014、CGS27023A、CT1166、FN439、FOY305、FUT175、FUT187、GM6001、RO31−4724、RO31−7467、RO31−9790、RO32−3555、RS39066、RS130830、SC40827、SE205、WS79089A、WS79089B、WS79089C等が挙げられる。これらの化合物は1種を単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
クラゲに共存する微生物による低分子コラーゲンの生成を抑制するためには、採取後のクラゲに殺菌剤を添加することも有効である。
本実施形態のムチンの製造方法において、材料に用いるクラゲは、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させ、更にpHを6〜8に調整したクラゲであることが好ましい。すなわち、本実施形態のムチンの製造方法は、採取直後のクラゲにコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させる工程と、コラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたクラゲのpHを6〜8に調整する工程と、破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程と、前記液体成分からムチンを抽出する工程と、を備える、製造方法であってもよい。
まず、破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する。クラゲの破砕方法は特に制限されず、裁断機、ミキサー等を用いて破砕されたクラゲであってもよい。破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する方法は特に制限されず、例えば、遠心分離によって行ってもよいし、圧搾によって行ってもよいし、ろ過によって行ってもよい。
続いて、任意選択で本工程を実施してもよい。すなわち、破砕されたクラゲから得られた上記の液体成分は、そのまま、後述する金属塩を添加する工程に用いてもよい。あるいは、本工程を実施して高分子コラーゲンを除去した後に、金属塩を添加する工程に用いてもよい。本工程を実施することにより、より純度が高いムチンを製造することが容易になる。また、破砕されたクラゲには浮遊成分が発生する場合があり、この浮遊成分に高分子コラーゲンが多く含まれる場合がある。したがって、浮遊成分が発生した場合には浮遊成分も除去することが好ましい。
続いて、上述した液体成分からムチンを抽出する。ムチンの抽出方法は特に制限されず、例えば、上述した液体成分に、アルコールを添加し、アルコール濃度を75容量%程度以上に調整することによりムチンを沈殿させることができる。
1実施形態において、本発明は、糖鎖が硫酸基を有するムチンを提供する。発明者は、クラゲから製造したムチンが、糖鎖に硫酸基を有することを見出した。
1実施形態において、本発明は、上述したムチンを有効成分として含有する界面活性剤を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述したムチンを有効成分として含有するイオン交換樹脂を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述したムチンを有効成分として含有する潤滑剤を提供する。
(クラゲの自己分解の検討1)
採取したクラゲを、そのまま−20℃、−50℃又は−80℃で凍結保存した。凍結から図1の横軸に示す日数後に解凍し、網目2mmのザルに入れて固体成分及び液体成分に分離し、固体成分の割合(質量%)を測定した。
(クラゲの自己分解の検討2)
採取したクラゲに終濃度0.01、0.1、1及び10mMのEDTAを添加し、室温及び4℃で保存した。EDTAの添加は、採取後のクラゲに終濃度の10倍の濃度のEDTA水溶液を添加し、混和することにより行った。保存開始から図2の横軸に示す日数後に、網目2mmのザルに入れて固体成分及び液体成分に分離し、固体成分の割合(質量%)を測定した。
(クラゲの自己分解の検討3)
採取したクラゲに終濃度0、0.01、0.1、1及び10mMのEDTAを添加し、−20℃で保存した。EDTAの添加は、採取後のクラゲに終濃度の10倍の濃度のEDTA水溶液を添加し、混和することにより行った。保存開始から図3の横軸に示す日数後に、網目2mmのザルに入れて固体成分及び液体成分に分離し、固体成分の割合(質量%)を測定した。
(クラゲの自己分解の検討4)
採取したクラゲから、そのまま何も添加しなかった群(対照)、殺菌剤のみ添加した群、終濃度10mMのEDTAのみ添加した群、終濃度1mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群、終濃度10mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群を調製した。殺菌剤としては、終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを使用した。
(クラゲの自己分解の検討5)
採取したクラゲから、そのまま何も添加しなかった群(対照)、殺菌剤のみ添加した群、終濃度10mMのEDTAのみ添加した群、終濃度1mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群、終濃度10mMのEDTA及び殺菌剤を添加した群を調製した。殺菌剤としては、終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを使用した。
(ムチンの製造)
同時期に採取したミズクラゲを等量の2つのグループA及びBに分けた。グループAには、終濃度10mMのEDTA及び終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを添加した。グループBには何も添加しなかった。なお、グループAでは、pHの調整は行わなかった。続いて、各グループのクラゲをそれぞれジッパー付きビニール袋に入れ、空気を追い出してジッパーを閉じ、数回揉んだ後−20℃で凍結保存した。
(ムチンの糖鎖構造の解析)
実験例6のグループAと同様にして調製したムチンの糖鎖構造を詳細に解析した。具体的には、ムチンからヒドラジン分解及びβ脱離反応により糖鎖を切り離し、HPLCを装着したエレクトロンスプレーイオン化高分解能質量分析器(ESI−MS)で分析した。
(ムチン水溶液の表面張力の測定1)
ムチンの界面活性剤としての性質を解析した。具体的には、ムチン水溶液の界面活性能(両親媒性)を、その表面張力を測定することにより検討した。ムチンとしては、実験例6のグループAと同様にして調製したムチンを使用した。
(クラゲ由来ムチンの沈殿の調製)
湿重量2kgのクラゲをミキサーで破砕して破砕液を調製した。続いて破砕液を遠心分離して上清を回収し、ガラス製の容器に入れた。続いて、回収した上清を激しく撹拌しながら、4℃で2Lのエタノールを30分間かけて添加した。その結果、高分子コラーゲンの沈殿が形成された。約半日静置した後、遠心分離して高分子コラーゲンの沈殿を除去し、上清を回収した。回収した上清に、塩化カルシウム粉末(CaCl2・2H2O)を10g添加し、撹拌して溶解させた。その結果、ムチンの沈殿が形成され、数分で溶液が濁り始めた。30分後、遠心分離を行って、カルシウム化したムチンの沈殿を回収した。沈殿の量は700mgであった。
(ムチンの硫酸基の解析)
実験例6のグループAと同様にして調製したムチン、及び、ミズクラゲに終濃度10mMのEDTA及び終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを添加し、その直後にpHを7に調整した点以外は実験例6のグループAと同様にして調製したムチンを用意した。
(ムチン水溶液の表面張力の測定2)
実験例6のグループAと同様にして調製したムチン(pH4で抽出したムチン)、及び、ミズクラゲに終濃度10mMのEDTA及び終濃度0.1%の次亜塩素酸ナトリウムを添加し、その直後にpHを7に調整した点以外は実験例6のグループAと同様にして調製したムチン(pH7で抽出したムチン)を用意した。
(ムチン水溶液の潤滑性の検討)
表面性測定器(型式「TRIBOGEAR TYPE:38」、新東科学株式会社)を用いて、1mg/mL及び10mg/mLのムチン水溶液の存在下で、100gの荷重をかけた直径10mmのステンレス球とステンレス平面板の間の動摩擦係数を測定した。また、対照として水を用いて同様の測定を行った。
Claims (3)
- 破砕されたクラゲを液体成分及び固体成分に分離する工程と、前記液体成分からムチンを抽出する工程と、を備える、ムチンの製造方法であって、
前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させたクラゲである、ムチンの製造方法。 - 前記クラゲが、採取直後にコラーゲン分解酵素阻害剤を接触させ、更にpHを6〜8に調整したクラゲである、請求項1に記載のムチンの製造方法。
- 前記コラーゲン分解酵素阻害剤がエチレンジアミン四酢酸塩である、請求項1又は2に記載の製造方法。
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