JP6383216B2 - 血液分析方法、血液分析装置およびプログラム - Google Patents

Description

本発明は、血液検体の血球を計数する血液分析方法、血液分析装置およびプログラムに関する。

マラリアの種類として、熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵形マラリアおよび四日熱マラリアが知られている。このうち、熱帯熱マラリアは、人が罹患すると重症化しやすく、罹患者には早急に治療を施す必要がある。マラリアの罹患を判定する手法としては、たとえば、特許文献１に記載の手法が知られている。この手法では、赤血球を溶血する試薬を血液試料に添加し測定試料が調製される。そして、調製された測定試料に光が照射されて光学情報が取得され、取得された光学情報に基づいて血液試料中にマラリア原虫が存在するか否かが判定される。ここでは、白血球検出用のスキャッタグラムを用いて、マラリア原虫と、白血球とが区別される。

特開２００７−２４８４４号公報

上記４種類のマラリアのうち熱帯熱マラリアのマラリア原虫は、赤血球内でリング形態をとることが多い。リング形態のマラリア原虫は、白血球に比べてサイズが小さいため、特許文献１に記載の手法では、検出することができなかった。

本発明の第１の態様に係る血液分析方法は、血液試料中の成熟赤血球と網赤血球との間に蛍光強度の差を生じさせる蛍光色素を前記血液試料に混和して調製された測定試料に光を照射し、測定試料中の血球から生じる散乱光と蛍光とを検出して、血球毎に、散乱光に関する散乱光データおよび蛍光に関する蛍光データを取得し、散乱光データと蛍光データに基づく網赤血球の分布範囲中の血球の分布状況に基づいて、血液試料中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する。

本発明の第２の態様に係る血液分析装置は、血液試料中の成熟赤血球と網赤血球との間に蛍光強度の差を生じさせる蛍光色素を前記血液試料に混和して測定試料を調製する試料調製部と、測定試料中の血球に光を照射することにより生じる散乱光と蛍光とを検出して、血球毎に、散乱光に関する散乱光データおよび蛍光に関する蛍光データを検出する検出部と、散乱光データと蛍光データに基づく網赤血球の分布範囲中の血球の分布状況に基づいて、血液試料中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する制御部と、を備える。

本発明の第３の態様に係る血液分析装置は、血液試料から調製された測定試料中の血球に光を照射することにより生じる散乱光と蛍光とを検出して、血球毎に、散乱光に関する散乱光データおよび蛍光に関する蛍光データを検出する検出部と、熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定可能な第１の測定と、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫のうち少なくとも１つの存在の可能性を決定可能な第２の測定と、を実行する制御部と、を備える。

本発明の第４の態様に係るプログラムは、コンピュータに、血液試料中の成熟赤血球と網赤血球との間に蛍光強度の差を生じさせる蛍光色素を前記血液試料に混和して調製された測定試料に光を照射することにより得られた、血球毎の散乱光に関する散乱光データおよび蛍光に関する蛍光データを取得するステップと、散乱光データと蛍光データに基づく網赤血球の分布範囲中の血球の分布状況に基づいて、血液試料中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定するステップと、を実行させる。

本発明により、血液試料中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を知ることができる。

実施形態に係る血液分析装置の構成を示すブロック図である。 実施形態に係る検出部の構成を示す模式図である。 実施形態に係る第１測定と第２測定とに関する処理を示すフローチャートである。 図４（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る第１測定に基づくスキャッタグラムと範囲とを示す図である。 図５（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る第２測定に基づくスキャッタグラムと範囲とを示す図である。 実施形態に係る第３測定に関する処理を示すフローチャートである。 図７（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る第３測定に基づくスキャッタグラムと範囲とを示す図である。 図８（ａ）は、実施形態に係る表示処理を示すフローチャートであり、図８（ｂ）、（ｃ）は、実施形態に係る画面の構成を示す模式図である。 図９（ａ）は、第１測定と第２測定とに関する処理によって熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定した場合の結果を示す図であり、図９（ｂ）は、第３測定に関する処理によって熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定した場合の結果を示す図である。

図１に示すように、血液分析装置１０は、試料調製部２０と、検出部３０と、制御部４０と、記憶部５０と、入力部６０と、出力部７０と、通信部８０と、読出部９０と、を備える。

血液分析装置１０は、第１測定と、第２測定と、第３測定を行う。第１測定では、血球等が、好塩基球と、好塩基球を除く白血球と、有核赤血球とに分類される。第２測定では、血球等が、リンパ球と、単球と、好酸球と、好中球および好塩基球を合わせた血球とに分類される。第３測定では、血球等が、成熟赤血球と、網赤血球と、血小板とに分類される。以下では、網赤血球と成熟赤血球の両方を含む概念として、「赤血球」が用いられる。

試料調製部２０は、患者から採取された末梢血である血液試料１１を受け付ける。試料調製部２０には、試薬２１〜２６を収容する容器が接続されている。試料調製部２０は、試薬２１、２２と血液試料１１とを混和して測定試料３１を調製し、試薬２３、２４と血液試料１１とを混和して測定試料３２を調製し、試薬２５、２６と血液試料１１とを混和して測定試料３３を調製する。測定試料３１〜３３は、流路を介して検出部３０に送られる。

試薬２１は、赤血球を溶血させるための界面活性剤を含んでおり、試薬２２は、血液試料１１中の有核赤血球と白血球との間に蛍光強度の差を生じさせるための蛍光色素を含んでいる。試薬２１として、たとえば、シスメックス株式会社製の、ライザセル（登録商標） ＷＮＲ（登録商標）が用いられ、試薬２２として、たとえば、シスメックス株式会社製の、フルオロセル（登録商標） ＷＮＲが用いられる。試薬２３は、赤血球を溶血させるための界面活性剤を含んでおり、試薬２４は、血液試料１１中の白血球のサブクラスの間に蛍光強度の差を生じさせるための蛍光色素を含んでいる。試薬２３として、たとえば、シスメックス株式会社製の、ライザセル ＷＤＦ（登録商標）が用いられ、試薬２４として、たとえば、シスメックス株式会社製の、フルオロセル ＷＤＦが用いられる。試薬２５は希釈液であり、試薬２６は、血液試料１１中の成熟赤血球と網赤血球との間に蛍光強度の差を生じさせるための蛍光色素を含んでいる。試薬２５として、たとえば、シスメックス株式会社製の、セルパック（登録商標） ＤＦＬ（登録商標）が用いられ、試薬２６として、たとえば、シスメックス株式会社製の、フルオロセル ＲＥＴ（登録商標）が用いられる。

なお、試薬２５、２６は、いずれも赤血球を溶血させない。試薬２５、２６は、赤血球を溶血させず、且つ、成熟赤血球と網赤血球を測定できる範囲において、適宜、変更が可能である。ここで、「赤血球を溶血させない」とは、少量の界面活性剤により染色を促進させるよう赤血球にダメージを与えることを含んでいる。なお、本実施形態において、測定試料３１〜３３の調製を複数の試薬を用いて行った。しかし、これに限らず、血液試料１１に対して１つの試薬を混合し測定試料３１〜３３の調製を行ってもよい。

検出部３０は、測定試料３１〜３３に光を照射し、測定試料３１〜３３中の血球等から生じる前方散乱光と、側方散乱光と、蛍光と、を検出する。検出部３０は、各光に基づいて、前方散乱光に関する前方散乱光データと、側方散乱光に関する側方散乱光データと、蛍光に関する蛍光データと、を取得する。検出部３０は、これらデータを制御部４０に出力する。検出部３０については、追って図２を参照して説明する。

制御部４０は、前方散乱光データと、側方散乱光データと、蛍光データとを、記憶部５０に記憶する。記憶部５０は、血球の分析で用いるプログラム５１を予め記憶している。制御部４０は、プログラム５１を実行して、以下に示す血球の分析を行う。

制御部４０は、第１測定と第２測定とで得られたデータに基づいて、それぞれ上述した分類を行う。さらに、制御部４０は、第１測定と第２測定とで得られたデータに基づいて、血液試料１１中における熱帯熱マラリア原虫以外の種類のマラリア原虫の存在の可能性を判定する。熱帯熱マラリア原虫以外の種類のマラリア原虫とは、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫である。以下、熱帯熱マラリア原虫以外の種類のマラリア原虫を、「他のマラリア原虫」と称する。他のマラリア原虫の存在の可能性を判定する処理については、追って図３を参照して説明する。

制御部４０は、第３測定で得られたデータに基づいて、上述した分類を行う。さらに、制御部４０は、第３測定で得られたデータに基づいて、血液試料１１中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定する。熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定する処理については、追って図６を参照して説明する。

制御部４０は、入力部６０を介してオペレータからの指示を受け付け、血球の分析結果を出力部７０に表示させる。入力部６０は、マウスやキーボードであり、出力部７０は、ディスプレイである。制御部４０は、通信部８０を介して外部のコンピュータ等と通信を行い、読出部９０を介して外部のプログラムを読み込む。読出部９０は、光学ドライブである。血球の分析で用いるプログラム５１は、記憶部５０に予め記憶されることに限らず、血球の分析前に、通信部８０と読出部９０を介して、外部から記憶部５０に記憶されても良い。

図２に示すように、検出部３０は、シースフロー系３１０と、ビームスポット形成系３２０と、前方散乱光受光系３３０と、側方散乱光受光系３４０と、蛍光受光系３５０と、信号処理回路３６０と、を備える。

シースフロー系３１０は、フローセル３１１を備える。フローセル３１１は、透光性を有する材料によって管状に構成されている。測定試料３１〜３３は、シース液に包まれた状態で、フローセル３１１内に流される。測定試料３１〜３３に含まれる粒子は、一列に整列した状態でフローセル３１１内を通る。

ビームスポット形成系３２０は、光源３２１から出射された光が、コリメータレンズ３２２とコンデンサレンズ３２３を通って、フローセル３１１内を流れる測定試料３１〜３３に照射されるよう構成される。光源３２１は、半導体レーザであり、光源３２１から出射される光は、赤色波長帯域のレーザ光である。なお、光源３２１から出射される光の波長は、上述した血球の分類が可能な範囲において、適宜、変更が可能である。

測定試料３１〜３３に含まれる粒子に光が照射されることにより、測定試料３１〜３３中の粒子から、前方散乱光と、側方散乱光と、蛍光が生じる。前方散乱光は、粒子の大きさに関する情報を反映し、側方散乱光は、粒子の内部情報を反映し、蛍光は、粒子の染色度合いを反映する。フローセル３１１に照射された光のうち、粒子に照射されずにフローセル３１１を透過した光は、ビームストッパ３２４により遮断される。

前方散乱光受光系３３０は、前方散乱光を光検出器３３１で受光するように構成されている。光検出器３３１は、フォトダイオードであり、受光した前方散乱光の強度に応じた電気信号を出力する。側方散乱光受光系３４０は、側方散乱光を、側方集光レンズ３４１により集光し、ダイクロイックミラー３４２で反射させ、光検出器３４３で受光するよう構成されている。光検出器３４３は、フォトダイオードであり、受光した側方散乱光の強度に応じた電気信号を出力する。蛍光受光系３５０は、側方集光レンズ３４１により集光され、ダイクロイックミラー３４２を透過した蛍光を、分光フィルタ３５１を通して、光検出器３５２で受光するよう構成されている。光検出器３５２は、アバランシェフォトダイオードであり、受光した蛍光の強度に応じた電気信号を出力する。

信号処理回路３６０は、光検出器３３１、３４３、３５２から出力された電気信号に対して所定の信号処理を施すことにより、それぞれ、前方散乱光と、側方散乱光と、蛍光とに対応する信号波形を取得する。信号処理回路３６０は、取得したそれぞれの信号波形について、信号波形のピーク値を取得し、取得したピーク値をＡ／Ｄ変換する。これにより、信号処理回路３６０は、測定試料３１〜３３に含まれる粒子ごとに、各信号波形のピーク値のデジタルデータ、すなわち、前方散乱光に関する前方散乱光データと、側方散乱光に関する側方散乱光データと、蛍光に関する蛍光データとを取得する。信号処理回路３６０は、こうして取得した各光のデータを、図１に示す制御部４０に出力する。

なお、検出部３０の光学系は、図２に示す構成以外にも適宜変更可能である。

次に、血液分析装置１０が行う処理についてフローチャートを参照して説明する。オペレータにより開始指示が行われると、血液分析装置１０は、血液試料１１を吸引して試料調製部２０に供給し、図３に示す第１測定と第２測定とに関する処理と、図６に示す第３測定に関する処理とを、順に行う。

図３に示すように、ステップＳ１０１において、試料調製部２０は、血液試料１１と試薬２１、２２とを混和して、測定試料３１を調製する。測定試料３１の調製において、試薬２１の作用によって血液試料１１内の赤血球が溶血される。このとき、赤血球内にマラリア原虫が存在すると、このマラリア原虫は液中に遊離する。検出部３０は、測定試料３１をフローセル３１１に流す。ステップＳ１０２において、検出部３０は、測定試料３１に光を照射して、前方散乱光と、側方散乱光と、蛍光とを、それぞれ、光検出器３３１、３４３、３５２により検出し、粒子ごとに、前方散乱光データと、側方散乱光データと、蛍光データと、を取得する。

ステップＳ１０３において、制御部４０は、ステップＳ１０２で取得したデータに基づいて、図４（ａ）に示すスキャッタグラム１１０を作成し、スキャッタグラム１１０上に範囲１１１〜１１３を設定する。スキャッタグラム１１０の横軸と縦軸は、それぞれ、蛍光データと前方散乱光データを示す。図４（ａ）は、マラリアに罹患していない患者から採取した血液試料１１に基づく場合のスキャッタグラム１１０を示している。範囲１１１〜１１３は、それぞれ、好塩基球と、好塩基球を除く白血球と、有核赤血球とが含まれると見なされる範囲である。制御部４０は、各範囲に含まれる点を、それぞれ、各範囲に対応する血球と見なして分類する。ステップＳ１０４において、制御部４０は、範囲１１１〜１１３に含まれる粒子数を計数して、それぞれ、好塩基球数と、好塩基球を除く白血球数と、有核赤血球数とを取得する。

なお、ここでは、説明の便宜上、範囲１１１〜１１３内の粒子数を取得するために、スキャッタグラム１１０を作成し、スキャッタグラム１１０上に範囲１１１〜１１３を設定している。しかしながら、範囲１１１〜１１３に対応する粒子数の取得は、必ずしも実際に図形やグラフを用いて行われる必要はない。すなわち、ステップＳ１０３、Ｓ１０４の処理に替えて、所定の数値範囲に属する粒子をフィルタリングによって抽出し、抽出した粒子数を計数するデータ処理を行うことにより、範囲１１１〜１１３内の粒子数を取得しても良い。同様に、ステップＳ１０５、Ｓ１０６と、ステップＳ１０９、Ｓ１１０と、ステップＳ１１１、Ｓ１１２と、図６のステップＳ２０３、Ｓ２０４においても、粒子数および血球数の取得は、必ずしも実際に図形やグラフを用いて行われる必要はない。

ステップＳ１０５において、制御部４０は、ステップＳ１０２で取得したデータに基づいて、図４（ｂ）に示すスキャッタグラム１２０を作成し、スキャッタグラム１２０上に範囲１２１を設定する。スキャッタグラム１２０の横軸と縦軸は、それぞれ、側方散乱光データと前方散乱光データを示す。図４（ｂ）は、三日熱マラリアに罹患している患者から採取した血液試料１１に基づく場合のスキャッタグラム１２０を示している。

ここで、マラリア原虫は、赤血球内で、輪状体、成熟栄養体、***体などの形態をとる。熱帯熱マラリア原虫以外の他のマラリア原虫は、末梢血の赤血球内で輪状体以外の形態をとる場合が多いため、他のマラリア原虫の大きさは、白血球の大きさと同程度となる場合が多い。したがって、他のマラリア原虫を、白血球の分類を行う第１測定で得られたデータに基づいて分類できる。範囲１２１は、他のマラリア原虫が含まれると見なされる範囲である。ステップＳ１０６において、制御部４０は、範囲１２１に含まれる粒子数を計数して、他のマラリア原虫数を取得する。

一方、熱帯熱マラリア原虫は、末梢血の赤血球内で輪状体の形態をとる場合が多いため、熱帯熱マラリア原虫の大きさは、白血球の大きさよりも数段小さい場合が多い。熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球が溶血されたとしても、熱帯熱マラリア原虫は、輪状体の形態を維持する。したがって、熱帯熱マラリア原虫を、白血球の分類を行う第１測定で得られたデータに基づいて分類しようとしても、熱帯熱マラリア原虫は、大部分がスキャッタグラム１１０中のデブリスの範囲に重なるため、熱帯熱マラリア原虫を分類することは困難である。そこで、本実施形態では、網赤血球の分類を行う第３測定で獲られたデータに基づいて、血液試料１１中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定する。この判定については、追って図６を参照して説明する。

続いて、ステップＳ１０７において、試料調製部２０は、血液試料１１と試薬２３、２４とを混和して、測定試料３２を調製する。測定試料３２の調製においても、試薬２３の作用によって血液試料１１内の赤血球が溶血される。このとき、赤血球内にマラリア原虫が存在すると、このマラリア原虫は液中に遊離する。検出部３０は、測定試料３２をフローセル３１１に流す。ステップＳ１０８においても、ステップＳ１０２と同様にして、検出部３０は、各光のデータを取得する。

ステップＳ１０９において、制御部４０は、ステップＳ１０８で取得したデータに基づいて、図５（ａ）に示すスキャッタグラム１３０を作成し、スキャッタグラム１３０上に範囲１３１〜１３４を設定する。スキャッタグラム１１０の横軸と縦軸は、それぞれ、側方散乱光データと蛍光データを示す。図５（ａ）は、マラリアに罹患していない患者から採取した血液試料１１に基づく場合のスキャッタグラム１３０を示している。範囲１３１〜１３４は、それぞれ、リンパ球と、単球と、好酸球と、好中球および好塩基球を合わせた血球とが含まれると見なされる範囲である。制御部４０は、各範囲に含まれる点を、それぞれ、各範囲に対応する血球と見なして分類する。ステップＳ１１０において、制御部４０は範囲１３１〜１３４に含まれる粒子数を計数して、それぞれ、リンパ球数と、単球数と、好酸球数と、好中球および好塩基球を合わせた血球数とを取得する。

次に、ステップＳ１１１において、制御部４０は、ステップＳ１０８で取得したデータに基づいて、図５（ｂ）に示すスキャッタグラム１４０を作成し、スキャッタグラム１４０上に範囲１４１を設定する。スキャッタグラム１４０の横軸と縦軸は、それぞれ、側方散乱光データと前方散乱光データとを示す。図５（ｂ）は、三日熱マラリアに罹患している患者から採取した血液試料１１に基づく場合のスキャッタグラム１２０を示している。

この場合も、熱帯熱マラリア原虫を分類できないものの、他のマラリア原虫を、白血球の分類を行う第２測定で得られたデータに基づいて分類できる。範囲１４１は、他のマラリア原虫が含まれると見なされる範囲である。ステップＳ１１２において、制御部４０は、範囲１２１に含まれる粒子数を計数して、他のマラリア原虫数を取得する。

続いて、ステップＳ１１３において、制御部４０は、ステップＳ１０６で取得したマラリア原虫数が所定数以上、または、ステップＳ１１２で取得したマラリア原虫数が所定数以上であるかを判定する。制御部４０は、ステップＳ１１３でＹＥＳと判定すると、ステップＳ１１４において、血液試料１１中に他のマラリア原虫が存在する可能性ありとして、他のマラリアについて陽性と判定する。一方、制御部４０は、ステップＳ１１３でＮＯと判定すると、ステップＳ１１５において、血液試料１１中に他のマラリア原虫が存在する可能性なしとして、他のマラリアについて陰性と判定する。こうして、第１測定と第２測定とに関する処理が終了する。

なお、ステップＳ１１３における他のマラリアの判定は、第１測定に基づいて取得されるマラリア原虫数のみに基づいて行われても良く、または、第２測定に基づいて取得されるマラリア原虫数のみに基づいて行われても良い。

図６に示すように、ステップＳ２０１において、試料調製部２０は、血液試料１１と試薬２５、２６とを混和して、測定試料３３を調製する。測定試料３３の調製では、赤血球は溶血されない。赤血球にマラリア原虫が含まれていると、このマラリア原虫は、試薬２６により染色される。検出部３０は、測定試料３３をフローセル３１１に流す。ステップＳ２０２においても、ステップＳ１０２と同様にして、検出部３０は、各光のデータを取得する。

ステップＳ２０３において、制御部４０は、ステップＳ２０２で取得したデータに基づいて、図７（ａ）に示すスキャッタグラム１５０を作成し、スキャッタグラム１５０上に範囲１５１、１５２、１５２ａ、１５２ｂ、１５２ｃ、１５３を設定する。スキャッタグラム１５０の横軸と縦軸は、それぞれ、蛍光データと前方散乱光データとを示す。図７（ａ）は、マラリアに罹患していない患者から採取した血液試料１１に基づく場合のスキャッタグラム１５０を示している。

範囲１５１、１５２、１５３は、それぞれ、成熟赤血球と、網赤血球と、血小板とが含まれると見なされる範囲である。範囲１５２ａ、１５２ｂ、１５２ｃは、範囲１５２のうち、それぞれ、蛍光強度が低い範囲と、蛍光強度が中程度の範囲と、蛍光強度が高い範囲である。範囲１５２ａは、低蛍光網赤血球、すなわち、蛍光強度が低い網赤血球が含まれると見なされる範囲である。範囲１５２ｂは、中蛍光網赤血球、すなわち、蛍光強度が中程度である網赤血球が含まれると見なされる範囲である。範囲１５２ｃは、高蛍光網赤血球、すなわち、蛍光強度が高い網赤血球が含まれると見なされる範囲である。制御部４０は、各範囲に含まれる点を、それぞれ、各範囲に対応する血球と見なして分類する。

ステップＳ２０４において、制御部４０は、範囲１５１、１５２、１５２ａ、１５２ｂ、１５２ｃ、１５３に含まれる粒子数を計数して、それぞれ、成熟赤血球数と、網赤血球数と、低蛍光網赤血球数と、中蛍光網赤血球数と、高蛍光網赤血球数と、血小板数と、を取得する。

ここで、熱帯熱マラリア原虫を内部に輪状体の形態で含む赤血球は、成熟赤血球が分布すると見なされる範囲１５１と、網赤血球が分布すると見なされる範囲１５２との境界を跨ぐように分布する。範囲１５２に熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球が分布すると、図７（ｂ）に示すように、範囲１５２における血球の分布状況が正常時の分布状況から変化する。図７（ｂ）は、熱帯熱マラリアに罹患している患者から採取した血液試料１１に基づく場合のスキャッタグラム１５０を示している。そこで、制御部４０は、範囲１５２における血球の分布状況を、後述する条件１、２により判定することにより、血液試料１１中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定する。

ステップＳ２０５において、制御部４０は、網赤血球幼若指数と、Ｄｅｌｔａ−Ｈｅと、ＲＥＴ ｒａｔｉｏを、以下の算出式により算出する。

・網赤血球幼若指数 ＝ ｛（中蛍光網赤血球数＋高蛍光網赤血球数）／網赤血球数｝×１００
・Ｄｅｌｔａ−Ｈｅ ＝ （ＲＥＴ−Ｈｅ）−（ＲＢＣ−Ｈｅ）
・ＲＥＴ ｒａｔｉｏ ＝ 網赤血球数／（網赤血球幼若指数×１０００）

ＲＥＴ−Ｈｅは、網赤血球に含まれるヘモグロビン量であり、ＲＢＣ−Ｈｅは、成熟赤血球に含まれるヘモグロビン量である。ＲＥＴ−Ｈｅは、範囲１５２に含まれ網赤血球と見なされた粒子の前方散乱光データの平均値をＲＥＴ−Ｙとすると、定数Ｃ１１、Ｃ１２を用いて、以下の算出式により算出される。

・ＲＥＴ−Ｈｅ ＝ Ｃ１１×ｅｘｐ（Ｃ１２×ＲＥＴ−Ｙ）

ＲＢＣ−Ｈｅは、範囲１５１に含まれ成熟赤血球と見なされた粒子の前方散乱光データの平均値をＲＢＣ−Ｙとすると、定数Ｃ１３、Ｃ１４を用いて、以下の算出式により算出される。

・ＲＢＣ−Ｈｅ ＝ Ｃ１３×ｅｘｐ（Ｃ１４×ＲＢＣ−Ｙ）

ステップＳ２０６において、制御部４０は、条件１が満たされるかを判定する。以下に示す条件（１）〜（４）が全て満たされると、条件１が満たされる。Ｓｈ１〜Ｓｈ４は、予め設定された閾値である。

＜条件１＞
（１）網赤血球数がＳｈ１以上
（２）網赤血球幼若指数がＳｈ２以下
（３）Ｄｅｌｔａ−ＨｅがＳｈ３以下
（４）ＲＥＴ ｒａｔｉｏがＳｈ４以上

熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球は、上述したように、範囲１５１、１５２の境界を跨ぐように分布する。したがって、熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球が増えると、範囲１５２に含まれる血球数が増えるため、条件（１）が満たされ易くなる。また、熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球が増えると、範囲１５２に含まれる血球は、範囲１５２ａ側に偏って分布するようになるため、条件（２）、（４）が満たされ易くなる。言い換えれば、条件（２）、（４）では、網赤血球に対応する範囲１５２のうち、蛍光強度が低い範囲に含まれる血球の割合が高いか否かが判定される。

ここで、範囲１５２に含まれ網赤血球と見なされた粒子の前方散乱光データに基づく重心位置を、第１の重心位置とし、範囲１５１に含まれ成熟赤血球と見なされた粒子の前方散乱光データに基づく重心位置を、第２の重心位置とする。第１の重心位置は、範囲１５２に含まれる粒子の前方散乱光データの平均値、すなわちＲＥＴ−Ｙであり、第２の重心位置は、範囲１５１に含まれる粒子の前方散乱光データの平均値、すなわちＲＢＣ−Ｙである。上記のように、ＲＥＴ−ＨｅとＲＢＣ−Ｈｅは、それぞれ、ＲＥＴ−ＹとＲＢＣ−Ｙを用いて算出される。よって、ＲＥＴ−ＨｅとＲＢＣ−Ｈｅは、それぞれ、第１の重心位置と第２の重心位置を反映する値である。

したがって、第１の重心位置と第２の重心位置を反映する値は以下のようにして取得できる。すなわち、ＲＥＴ−Ｙを、範囲１５２に含まれ網赤血球と見なされた粒子の前方散乱光データの平均値により取得し、ＲＢＣ−Ｙを、範囲１５１に含まれ成熟赤血球と見なされた粒子の前方散乱光データの平均値により取得する。そして、第１の重心位置を反映する値を、Ｃ１１×ｅｘｐ（Ｃ１２×ＲＥＴ−Ｙ）により取得し、第２の重心位置を反映する値を、Ｃ１３×ｅｘｐ（Ｃ１４×ＲＢＣ−Ｙ）により取得する。

熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球は、スキャッタグラム１５０上において、網赤血球よりもやや下側に現れる。すなわち、熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球の前方散乱光データは、マラリア原虫を含まない正常な網赤血球の前方散乱光データに比べて小さい。血液試料１１に熱帯熱マラリア原虫が存在すると、第１の重心位置は低くなる。第１の重心位置が低くなることは、第１の重心位置と第２の重心位置との差分が小さくなることにより判断できる。上記のように、ＲＥＴ−ＨｅとＲＢＣ−Ｈｅは、それぞれ、第１の重心位置と第２の重心位置を反映する値である。したがって、第１の重心位置と第２の重心位置との差分が小さくなることは、ＲＥＴ−ＨｅとＲＢＣ−Ｈｅとの差分、すなわち、Ｄｅｌｔａ−Ｈｅによっても判断できる。よって、熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球が増えると、Ｄｅｌｔａ−Ｈｅが小さくなり、条件（３）が満たされ易くなる。

なお、条件（３）において、第１の重心位置と第２の重心位置を反映する他の値を用いて、第１の重心位置と第２の重心位置との差分が所定の閾値以下であるか否かが判定されても良い。たとえば、第１の重心位置を反映する値を、ＲＥＴ−Ｙにより取得し、第２の重心位置を反映する値を、ＲＢＣ−Ｙにより取得する。そして、条件（３）において、ＲＥＴ−ＹとＲＢＣ−Ｙとの差分が所定の閾値以下であるか否かを判定しても良い。

このように、血液試料１１に熱帯熱マラリア原虫が存在し、熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球が増えると、条件（１）〜（４）がそれぞれ満たされ易くなる。したがって、条件（１）〜（４）が全て満たされる場合、すなわち、条件１が満たされる場合は、血液試料１１に熱帯熱マラリア原虫が存在する可能性が高くなる。制御部４０は、ステップＳ２０６においてＹＥＳと判定すると、処理をステップＳ２０７に進め、ステップＳ２０６においてＮＯと判定すると、処理をステップＳ２１０に進める。

ステップＳ２０７において、制御部４０は、熱帯熱マラリアのスコアを算出する。熱帯熱マラリアのスコアは、定数Ｃ２１〜Ｃ２４を用いて、以下の算出式により算出される。

・スコア＝（ＲＥＴ ｒａｔｉｏ）×Ｃ２１−血小板数×Ｃ２２−（Ｄｅｌｔａ−Ｈｅ）×Ｃ２３＋Ｃ２４

定数Ｃ２１〜Ｃ２４は、後述する条件（５）において熱帯熱マラリアのスコアを所定の基準値と比較することにより、血液試料１１における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定できるよう、予め設定される。ここでは、基準値が１００に設定される。

ステップＳ２０８において、制御部４０は、条件２が満たされるかを判定する。以下に示す条件（５）が満たされると、条件２が満たされる。

＜条件２＞
（５）熱帯熱マラリアのスコアが、１００より大きい

熱帯熱マラリア原虫を含む赤血球が増えると、上述したように、ＲＥＴ ｒａｔｉｏは大きくなり、Ｄｅｌｔａ−Ｈｅは小さくなる。また、患者が熱帯熱マラリアに罹患すると、血液試料１１中における血小板数が減る。したがって、患者が熱帯熱マラリアに罹患し、血液試料１１に熱帯熱マラリア原虫が存在すると、条件（５）が成立し易くなり、条件２が成立し易くなる。よって、条件２が満たされる場合、血液試料１１に熱帯熱マラリア原虫が存在する可能性が高くなる。制御部４０は、ステップＳ２０８においてＹＥＳと判定すると、処理をステップＳ２０９に進め、ステップＳ２０８においてＮＯと判定すると、処理をステップＳ２１０に進める。

制御部４０は、ステップＳ２０６、Ｓ２０８においてＹＥＳと判定した場合、すなわち、条件１、２がいずれも満たされる場合、ステップＳ２０９において、血液試料１１中に熱帯熱マラリア原虫が存在する可能性ありとして、熱帯熱マラリアについて陽性と判定する。一方、制御部４０は、ステップＳ２０６、Ｓ２０８の何れかにおいてＮＯと判定した場合、すなわち、条件１、２の何れかが満たされない場合、ステップＳ２１０において、血液試料１１中に熱帯熱マラリア原虫が存在する可能性なしとして、熱帯熱マラリアについて陰性と判定する。こうして、第３測定に関する処理が終了する。

条件１、２は、いずれも、範囲１５２における血球の分布状況に基づいて、範囲１５２における血球の分布状況が正常時の分布状況から変化していることを判定するものである。したがって、第３測定に関する処理において、ステップＳ２０６、Ｓ２０８の何れか一方が省略されても良い。すなわち、条件１を満たす場合に、熱帯熱マラリアについて陽性と判定しても良く、条件２を満たす場合に、熱帯熱マラリアについて陽性と判定しても良い。

第３測定によれば、検出した粒子の散乱光データと蛍光データに基づいて、粒子を成熟赤血球と、網赤血球と、血小板に分類する。そして、網赤血球が分布すると見なされる範囲１５２における血球の分布状況を、条件１、２によって判定することにより、血液試料１１中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定する。よって、赤血球の分類と、熱帯熱マラリアの判定とを同時に行うことができる。

第３測定によれば、図６のステップＳ２０５〜Ｓ２１０の処理を行うだけで、熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定できる。したがって、第３測定を行う装置において熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定していない場合でも、ステップＳ２０５〜Ｓ２１０の処理を行うプログラムが、この装置のプログラム５１に含められるだけで、熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定できるようになる。この場合、ステップＳ２０５〜Ｓ２１０の処理を行うプログラムは、たとえば、通信部８０と読出部９０を介して外部から記憶部５０に記憶される。

なお、血液試料１１に他のマラリア原虫が存在する場合、他のマラリア原虫を含む赤血球は、スキャッタグラム１５０の上端近傍または右端近傍に位置する。このため、第３測定に関する処理によって、血液試料１１中における他のマラリア原虫の存在の可能性を正確に判定することは困難である。しかしながら、図３に示した第１測定と第２測定とに関する処理によって、血液試料１１中における他のマラリア原虫の存在の可能性を判定できる。したがって、第１〜第３測定に関する処理によれば、血液試料１１中における全てのマラリア原虫の存在の可能性を判定できる。

第１測定と第２測定とに関する処理と、第３測定に関する処理とが終了すると、表示処理が行われる。

図８（ａ）に示すように、ステップＳ３０１において、制御部４０は、網赤血球数と熱帯熱マラリアのスコアとを含む画面２００を、出力部７０に表示させる。図８（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、他のマラリアについて陽性と判定された場合の画面例と、熱帯熱マラリアについて陽性と判定された場合の画面例である。図８（ｂ）、（ｃ）において、領域２１０には、図６のステップＳ２０４で取得した網赤血球数が、適宜単位が整えられた状態で表示される。領域２２０には、熱帯熱マラリアのスコアと、熱帯熱マラリアのスコアを視覚的に把握できるバーとが表示される。

ステップＳ３０２において、制御部４０は、第１測定と第２測定とに関する処理で行われた判定に基づいて、他のマラリアについて陽性であるかを判定する。他のマラリアについて陽性であると、ステップＳ３０３において、制御部４０は、血液試料１１中における他のマラリア原虫の存在の可能性を示唆する表示を行う。具体的には、図８（ｂ）に示すように、領域２３０に、「三日熱マラリア？卵形マラリア？四日熱マラリア？」が表示される。

ステップＳ３０４において、制御部４０は、第３測定に関する処理で行われた判定に基づいて、熱帯熱マラリアについて陽性であるかを判定する。熱帯熱マラリアについて陽性であると、ステップＳ３０５において、制御部４０は、血液試料１１中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を示唆する表示を行う。具体的には、図８（ｃ）に示すように、領域２３０に、「熱帯熱マラリア？」が表示される。

表示処理によれば、オペレータは、領域２２０、２３０の表示内容を見ることで、患者から採取した血液試料１１中に熱帯熱マラリア原虫が存在する可能性があるか否かを知ることができる。

次に、熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を、第１測定と第２測定とに関する処理によって判定する場合と、第３測定に関する処理によって判定する場合とを、実際の測定結果を示しながら比較する。いずれの場合においても、同じ血液試料群に対して判定が行われた。判定対象の血液試料数は９９であった。目視により陽性および陰性と判定された血液試料数は、それぞれ、２３および７６であった。

感度は、目視により陽性と判定された血液試料数に対する、判定結果により陽性と判定された血液試料数の比率である。特異度は、目視により陰性と判定された血液試料数に対する、判定結果により陰性と判定された血液試料数の比率である。ＰＰＶ（Positive Predictive Value）は、判定結果により陽性と判定された血液試料数に対する、目視により陽性と判定された血液試料数の比率である。ＮＰＶ（Negative Predictive Value）は、判定結果により陰性と判定された血液試料数に対する、目視により陰性と判定された血液試料数の比率である。

図９（ａ）に示すように、第１測定と第２測定とに関する処理によれば、目視により陽性と判定された２３個の血液試料と、目視により陰性と判定された７６個の血液試料とが、全て陰性と判定された。これにより、ＮＰＶは７６．８％であった。

一方、図９（ｂ）に示すように、第３測定に関する処理によれば、目視により陽性と判定された２３個の血液試料のうち、１７個の血液試料が陽性と判定され、６個の血液試料が陰性と判定された。また、目視により陰性と判定された７６個の血液試料のうち、１個の血液試料が陽性と判定され、７５個の血液試料が陰性と判定された。これにより、ＮＰＶは、７６．８％から９２．６％と改善され、ＰＰＶも９４．４％となった。

以上の測定結果から分かるとおり、第３測定による処理によれば、第１測定と第２測定とによる処理に比べて、より精度良く、血液試料１１中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を判定できる。

１０ … 血液分析装置
２０ … 試料調製部
３０ … 検出部
３１〜３３ … 測定試料
４０ … 制御部
５１ … プログラム

Claims (24)

1. 血液試料中の成熟赤血球と網赤血球との間に蛍光強度の差を生じさせる蛍光色素を前記血液試料に混和して調製された測定試料に光を照射し、
   前記測定試料中の血球から生じる散乱光と蛍光とを検出して、血球毎に、前記散乱光に関する散乱光データおよび前記蛍光に関する蛍光データを取得し、
   前記散乱光データと前記蛍光データに基づく網赤血球の分布範囲中の血球の分布状況に基づいて、血液試料中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、血液分析方法。
2. 赤血球を溶血させない試薬を用いて前記測定試料を調製する、請求項１に記載の血液分析方法。
3. 前記網赤血球の分布範囲のうち蛍光強度が低い範囲に含まれる血球の割合に基づいて、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１または２に記載の血液分析方法。
4. 前記散乱光データと前記蛍光データに基づいて、前記測定試料中の血球を成熟赤血球、網赤血球、および血小板に分類する、請求項１ないし３の何れか一項に記載の血液分析方法。
5. 前記網赤血球の分布範囲に含まれる複数の血球について、前記散乱光データの第１の平均値を取得し、
   前記散乱光データと前記蛍光データに基づく成熟赤血球の分布範囲に含まれる複数の血球について、前記散乱光データの第２の平均値を取得し、
   前記第１の平均値と前記第２の平均値との差分に基づいて、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１ないし４の何れか一項に記載の血液分析方法。
6. 前記散乱光データと前記蛍光データに基づく血小板の分布範囲に含まれる血球の数に基づいて、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１ないし５の何れか一項に記載の血液分析方法。
7. 前記網赤血球の分布範囲に含まれる血球の数に基づいて、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の血液分析方法。
8. 前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性に関する情報を表示する、請求項１ないし７の何れか一項に記載の血液分析方法。
9. 前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性に関する情報とともに前記網赤血球の分布範囲に含まれる血球の数を表示する、請求項８に記載の血液分析方法。
10. 前記測定試料に赤色波長帯域のレーザ光を照射して、血球毎に、前記散乱光データと前記蛍光データを取得する、請求項１ないし９の何れか一項に記載の血液分析方法。
11. さらに、赤血球を溶血させる試薬を血液試料に混合して調製された他の測定試料に光を照射し、
    さらに、前記他の測定試料中の血球から生じる前方散乱光と側方散乱光とを検出して、血球毎に、前記前方散乱光に関する前方散乱光データおよび前記側方散乱光に関する側方散乱光データを取得し、
    さらに、前記前方散乱光データと前記側方散乱光データに基づく粒子の分布状況に基づいて、血液試料中における前記熱帯熱マラリア原虫以外の種類のマラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の血液分析方法。
12. 血液試料中の成熟赤血球と網赤血球との間に蛍光強度の差を生じさせる蛍光色素を前記血液試料に混和して測定試料を調製する試料調製部と、
    前記測定試料中の血球に光を照射することにより生じる散乱光と蛍光とを検出して、血球毎に、前記散乱光に関する散乱光データおよび前記蛍光に関する蛍光データを検出する検出部と、
    前記散乱光データと前記蛍光データに基づく網赤血球の分布範囲中の血球の分布状況に基づいて、血液試料中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する制御部と、を備えた血液分析装置。
13. 前記試料調製部は、赤血球を溶血させない試薬を用いて前記測定試料を調製する、請求項１２に記載の血液分析装置。
14. 前記制御部は、前記網赤血球の分布範囲のうち蛍光強度が低い範囲に含まれる血球の割合に基づいて、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１２または１３に記載の血液分析装置。
15. 前記制御部は、前記散乱光データと前記蛍光データに基づいて、前記測定試料中の血球を成熟赤血球、網赤血球、および血小板に分類する、請求項１２ないし１４の何れか一項に記載の血液分析装置。
16. 前記制御部は、
    前記網赤血球の分布範囲に含まれる複数の血球について、前記散乱光データの第１の平均値を取得し、
    前記散乱光データと前記蛍光データに基づく成熟赤血球の分布範囲に含まれる複数の血球について、前記散乱光データの第２の平均値を取得し、
    前記第１の平均値と前記第２の平均値との差分に基づいて、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１２ないし１５の何れか一項に記載の血液分析装置。
17. 前記制御部は、前記散乱光データと前記蛍光データに基づく血小板の分布範囲に含まれる血球の数に基づいて、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１２ないし１６の何れか一項に記載の血液分析装置。
18. 前記制御部は、前記網赤血球の分布範囲に含まれる血球の数に基づいて、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１２ないし１７の何れか一項に記載の血液分析装置。
19. 出力部をさらに備え、
    前記制御部は、前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性に関する情報を前記出力部に表示する、請求項１２ないし１８の何れか一項に記載の血液分析装置。
20. 前記試料調製部は、さらに、赤血球を溶血させる試薬を血液試料に混合して他の測定試料を調製し、
    前記検出部は、さらに、前記他の測定試料中の血球に光を照射することにより生じる前方散乱光と側方散乱光とを検出して、血球毎に、前記前方散乱光に関する前方散乱光データおよび前記側方散乱光に関する側方散乱光データを検出し、
    前記制御部は、さらに、前記前方散乱光データと前記側方散乱光データに基づく粒子の分布状況に基づいて、血液試料中における前記熱帯熱マラリア原虫以外の種類のマラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項１２ないし１９の何れか一項に記載の血液分析装置。
21. 血液試料から調製された測定試料中の血球に光を照射することにより生じる散乱光と蛍光とを検出して、血球毎に、前記散乱光に関する散乱光データおよび前記蛍光に関する蛍光データを検出する検出部と、
    熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定可能な第１の測定と、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫のうち少なくとも１つの存在の可能性を決定可能な第２の測定と、を実行する制御部と、を備えた血液分析装置。
22. 試料調製部をさらに備え、
    前記第１の測定において、
    前記試料調製部は、血液試料中の成熟赤血球と網赤血球との間に蛍光強度の差を生じさせる蛍光色素を前記血液試料に混和して第１の測定試料を調製し、
    前記検出部は、前記第１の測定試料中の血球に光を照射することにより生じる散乱光と蛍光とを検出して、血球毎に、前記散乱光に関する散乱光データおよび前記蛍光に関する蛍光データを検出し、
    前記制御部は、前記散乱光データと前記蛍光データに基づく網赤血球の分布範囲中の血球の分布状況に基づいて、血液試料中における前記熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定する、請求項２１に記載の血液分析装置。
23. 試料調製部をさらに備え、
    前記第２の測定において、
    前記試料調製部は、血液試料中の白血球のサブクラスの間に蛍光強度の差を生じさせるための蛍光色素を用いて第２の測定試料を調製し、
    前記検出部は、前記第２の測定試料中の血球に光を照射することにより生じる前方散乱光と側方散乱光とを検出して、血球毎に、前記前方散乱光に関する前方散乱光データおよび前記側方散乱光に関する側方散乱光データを検出し、
    前記制御部は、前記前方散乱光データと前記側方散乱光データに基づく粒子の分布状況に基づいて、血液試料中における前記三日熱マラリア原虫、前記卵形マラリア原虫、および前記四日熱マラリア原虫のうち少なくとも１つの存在の可能性を決定する、請求項２１または２２に記載の血液分析装置。
24. コンピュータに、
    血液試料中の成熟赤血球と網赤血球との間に蛍光強度の差を生じさせる蛍光色素を前記血液試料に混和して調製された測定試料に光を照射することにより得られた、血球毎の散乱光に関する散乱光データおよび蛍光に関する蛍光データを取得するステップと、
    前記散乱光データと前記蛍光データに基づく網赤血球の分布範囲中の血球の分布状況に基づいて、血液試料中における熱帯熱マラリア原虫の存在の可能性を決定するステップと、
    を実行させるためのプログラム。