JP6348183B2 - 細胞サイズにより間葉系幹細胞を培養する方法 - Google Patents

Description

発明の分野

本発明は、細胞サイズにより間葉系幹細胞を培養する方法に関する。より具体的には、８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離し、特定の条件下でそれらを培養する方法に関する。

発明の背景

「幹細胞」は、胚、胎児および成体の組織に見いだされる体細胞の未分化型の一般名であり、様々な特殊化した細胞型に分化する潜在性を有する。

幹細胞は、その潜在能力によって分類することができる：多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、多分化能性幹細胞(multipotent stem cell)および単能性幹細胞。多能性幹細胞は、任意の型の細胞に分化する多能性を有する。胚性幹細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、多能性幹細胞の代表である。成体幹細胞は、多分化能(multipotency)および／または単分化能を示す。それらの中には、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞などがある。

多能性ヒト胚性幹細胞を細胞治療剤に利用しようとする様々な試みにもかかわらず、腫瘍形成および免疫拒否反応の可能性はいまだ高いままであり、克服するには困難な障壁である。

リプログラミングにより、完全に分化した成体細胞からその胚性幹細胞段階の初期段階へ意図的に退行させた幹細胞の一種であるｉＰＳ細胞の場合、その細胞は自家組織の細胞なので、免疫拒否反応の危険性は排除される可能性があるが、腫瘍形成の危険性は依然として解決されるべき問題である。

間葉系幹細胞は免疫モジュレーション効果を呈し、腫瘍形成の危険性が存在しないので、これらの問題を解決する代案としてその細胞が示唆されてきた。間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、神経芽細胞、心筋芽細胞、肝細胞、膵島β細胞、脈管細胞などを含めた様々な細胞型に分化することができる多分化能性幹細胞であり、免疫応答をモジュレートする機能を有することが公知である。

間葉系幹細胞は、様々な組織、たとえば骨髄、臍帯血、脂肪組織などから単離されてもよいが、間葉系幹細胞が由来する起源により細胞表面マーカーが互いにやや異なるので、十分に定義されなくてもよい。一般に、それらが骨芽細胞、軟骨細胞および筋芽細胞に分化することができ、紡錘状の形態を有し、表面マーカーＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ３４（−）およびＣＤ４５（−）を発現することができる場合、そのような幹細胞は間葉系幹細胞と定義される。この文脈において、異なる遺伝的起源および／または背景の間葉系幹細胞は、標準的な定義の下で互いに有意に異ならないが、ｉｎ ｖｉｖｏ活性の点で互いに有意に異なる。さらに、間葉系幹細胞が外来性の細胞治療剤として使用される場合、ｉｎ ｖｉｖｏ活性が低くてもなお、限られたプールの間葉系幹細胞は、利用可能な他の選択肢を認めない。

加えて、臨床診療に間葉系幹細胞を適用するには、組織から得ることができる間葉系幹細胞の量が限られていることを考慮して、初期段階にある細胞を大量に得て、それらを継代で培養することが必須である。しかしながら、間葉系幹細胞は、継代中に極めて不均一な群を形成し、その不均一さが細胞の増殖、分化および加齢に影響を及ぼし、間葉系幹細胞を治療剤として開発しようとすることを困難にしている。

これらの問題を克服する取り組みにおいて、Ｌｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８；Ｍａｊｏｒｅ Ｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２００９；Ｒａｔａｉｃｚａｋ ＭＺ ｅｔ ａｌ．、Ａｇｉｎｇ、２０１２などは、間葉系幹細胞を培養する様々な方法を開示している。しかしながら、これらの方法は、いくつかの短所を有する：その方法によって不均一な細胞が得られて、大量生産に必要な細胞数を得ることが困難になり、細胞の増殖能(proliferative capacity)が各継代後に減少し、細胞の加齢が急速に進行する。さらに、上記の論文において使用される器材は、望ましい製造過程（ＧＭＰ）に適しておらず、実際の製造過程に適用することが困難になった。したがって、均一な群の細胞を抽出し、効率的かつ低費用でそれらを大量に増殖させる方法の必要性がある。

したがって、間葉系幹細胞を効率的に培養する方法を提供することが本発明の目的である。

上記の方法を使用して調製され、増殖能および分化潜在能(differentiation potential)が改善された間葉系幹細胞を提供することが本発明の別の目的である。

間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を提供することが本発明のさらなる目的である。

本発明の一側面によると、（１）８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離する工程；と（２）２〜５％酸素の条件下で、２．１〜３．８ｍＭカルシウムおよび１．０〜３．０ｍＭマグネシウムを含有する培地中で間葉系幹細胞を培養する工程とを含む、間葉系幹細胞を培養する方法が提供される。

本発明の別の側面によると、上記の方法によって調製され、増殖能および分化潜在能が改善された間葉系幹細胞が提供される。

本発明のさらなる側面によると、間葉系幹細胞を含む細胞治療剤が提供される。

本発明の方法は、８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離し、カルシウム、マグネシウムの存在下で、低酸素（低い酸素）条件下でそれを培養することによって間葉系幹細胞の増殖能および分化潜在能を有意に改善することができ、得られる間葉系幹細胞を細胞治療剤として利用可能にする。

図１は、トリプシン処理前の付着している形態（図１ａ）、およびトリプシン処理後の単一細胞形態の間葉系幹細胞の写真を示す。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒによって測定した細胞のサイズ分布を例示するグラフも示す（図１ｃ）。 図２Ａは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ＃１〜＃４）を培養した後に、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒによって測定した細胞のサイズ分布を示すグラフである。 図２Ｂは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ＃１〜＃４）を培養した後に、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒによって測定した細胞のサイズ分布を示すグラフである。 図３は、細胞を継代で培養した後に、小さいサイズを有する細胞群Ｉ（ＭＳＣ＃１および＃２）、および大きい細胞サイズを有する細胞群ＩＩ（ＭＳＣ＃３および＃４）の累積集団倍加数（cumulative population doubling, ＣＰＤ）を示すグラフである。 図４は、本発明の方法により得られる８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞（小さい）の顕微鏡写真である。 図５ａは、非単離細胞群（元の、左）、８μｍを超える細胞サイズを持つ細胞群（大きい、中央）、および８μｍ以下の細胞サイズを持つ細胞群（小さい、右）の顕微鏡写真を提供する。図５ｂおよび５ｃは、３つの群の増殖能および累積集団倍加数（ＣＰＤ）をそれぞれ示すグラフである。 図６は、８μｍ以下のサイズを有する間葉系細胞の比による増殖能を示すグラフである。グラフ中で群１〜５は、それぞれ：８μｍを超えるＭＳＣ（１００％）；８μｍを超えるＭＳＣ（７５％）＋８μｍ以下のＭＳＣ（２５％）；８μｍを超えるＭＳＣ（５０％）＋８μｍ以下のＭＳＣ（５０％）；８μｍを超えるＭＳＣ（２５％）＋８μｍ以下のＭＳＣ（７５％）；８μｍ以下のＭＳＣ（１００％）から構成される間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のことを指す。各群の増殖能は、群１と比較した増加倍数として表される。 図７は、８μｍ以下のサイズを持つ細胞群（小さい）および非単離細胞群（元の）を、従来の培養条件（対照）、追加のカルシウム（マグネシウムを含む）条件（Ｃａ²⁺（Ｍｇ²⁺））、低酸素条件（低酸素）ならびに追加のカルシウム（マグネシウムを含む）条件／低酸素条件（ＣＭＨ）下で培養した後の、細胞形態（ａ、ｂ）および細胞の増殖能（ｃ）の試験の結果を示す。 図８Ａは、従来の培養条件ならびにＣＭＨ条件下で、臍帯血から得た４つの型の間葉系幹細胞（ＭＳＣ＃１〜＃４）の非単離細胞群（元の）および小さい細胞群を継代で培養した後の、増殖能（８Ａ）を測定した結果を示すグラフを提供する。 図８は、従来の培養条件ならびにＣＭＨ条件下で、臍帯血から得た４つの型の間葉系幹細胞（ＭＳＣ＃１〜＃４）の非単離細胞群（元の）および小さい細胞群を継代で培養した後の、累積集団倍加数（８Ｂ）を測定した結果を示すグラフを提供する。 図９は、臍帯血由来間葉系幹細胞の１つの型（ＭＳＣ＃１）を１．８〜４．４ｍＭの濃度でカルシウムを含有する培地中で６日間培養した後の細胞数の結果である。 図１０は、臍帯血由来間葉系幹細胞の１つの型（ＭＳＣ＃１）を正常酸素（酸素正常状態）ならびに３％および５％酸素の条件下で培養した後の細胞数の結果である。 図１１は、元の細胞群および小さい細胞群を従来の培養条件ならびにＣＭＨ条件下で培養した後の、ｐ５３およびｐ２１（増殖阻害マーカー）の発現レベルを示すウェスタンブロットの結果および定量グラフを提供する。 図１２Ａは、元の細胞群および小さい細胞群を従来の培養条件ならびにＣＭＨ培養条件下で数回の継代で培養し、細胞の老化を誘導した後の、染色した老齢細胞の写真および染色された細胞数対全細胞数の比を示すグラフを提供する。 図１２Ｂは、元の細胞群および小さい細胞群を従来の培養条件ならびにＣＭＨ培養条件下で数回の継代で培養し、細胞の老化を誘導した後の、染色した老齢細胞の写真および染色された細胞数対全細胞数の比を示すグラフを提供する。 図１３は、元の細胞群および小さい細胞群を従来の培養条件ならびにＣＭＨ培養条件下で培養した後の骨形成誘導（ａ）および脂肪生成誘導（ｂ）を示す写真を提供する。

発明の詳細な説明

本発明は、（１）８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離する工程；と（２）２〜５％酸素の条件下で、２．１〜３．８ｍＭカルシウムおよび１．０〜３．０ｍＭマグネシウムを含有する培地中で単離された間葉系幹細胞を培養する工程とを含む間葉系幹細胞を培養する方法を提供する。

本発明は、８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞が、他のサイズの細胞より大きな増殖能を有し、間葉系幹細胞の増殖能および分化潜在能が、低酸素条件下で特定の濃度のカルシウムおよびマグネシウムを含有する培地中で培養することによりさらに改善され得るという発見に基づく。

本発明の間葉系幹細胞を培養する方法において、工程（１）は、８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離する工程である。

本発明の培養方法は、様々な起源の間葉系幹細胞に適用されてもよい。本発明において有用な間葉系幹細胞の例には、臍帯血、骨髄、脂質、筋肉、皮膚、羊水、臍帯または歯に由来するものがあるが、それらに限らない。本発明の好ましい一態様において、本発明の培養方法は、臍帯血由来間葉系幹細胞に適用される。

加えて、本発明の培養方法を適用できる間葉系幹細胞は、様々な対象から得られてもよい。たとえば、本発明において有用な間葉系幹細胞は、ヒトを含めた哺乳動物から得られてもよいが、それに限らない。本発明の好ましい一態様において、ヒト起源の間葉系幹細胞が使用される。

従来の間葉系幹細胞が、３．５〜２４μｍのサイズを有する一方で、本発明において使用される間葉系幹細胞は、８μｍ以下のサイズ（小さい）を有することによって特徴づけられる。８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞は、非単離間葉系幹細胞（以下「元の細胞」と記載する）または８μｍを超えるサイズを持つ間葉系幹細胞より優れた増殖能を有する。

本発明の方法において、８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞の単離は、特定の制限はないが、好ましくはフィルターを使用して実行することができる。フィルターは、間葉系幹細胞を傷める危険性および使用法の安全性を考慮して選択されてもよく、たとえばＸｉａｏｇａｎ ｙａｇｕａｎｇの濾過膜チューブなどがある。フィルターを使用する単離の方法は、小さい細胞を得るのに最適な条件下で行われてもよい。たとえば、２×１０⁵個細胞の集団において間葉系幹細胞を８μｍの細孔径を有する濾過膜チューブにロードし、１２００ｒｐｍで５分間、１回遠心分離して、８μｍ以下のサイズを有する均一な間葉系幹細胞を得てもよい。

８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を、以下「小さい細胞」と呼ぶ。

本発明の間葉系幹細胞を培養する方法の工程（２）は、２〜５％酸素の低酸素条件下で２．１〜３．８ｍＭカルシウムおよび１．０〜３．０ｍＭマグネシウムを含有する培地中で８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を培養する工程である。

培養方法は、カルシウムおよびマグネシウムを含有する培地中で間葉系幹細胞を培養することによって主に特徴づけられる。

培地は、カルシウムおよびマグネシウムの濃度を調節することにより幹細胞用の従来の培地から調製されてもよい。従来の培地の例には、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、マッコイ５Ａ培地、イーグル基礎培地、コンノートメディカルリサーチラボラトリーズ（Connaught Medical Research Laboratory）（ＣＭＲＬ）培地、グラスゴー最小必須培地、ハムＦ−１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ライボビッツＬ−１５培地、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、１９９培地およびハンクス培地１９９があるが、それらに限らない。

任意に、培地は血清を含有してもよく、含有しなくてもよい。加えて、培地中で、血清の代わりに、血清代替物が使用されてもよい。

本発明の一態様において、培地は５〜３０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する。別の態様において、培地は血清代替物を含有する。市販の製品に加えて、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＩＧＦおよびそれに類似するサイトカインを含めたヒト血清またはヒト血小板溶解物中の様々な増殖因子が、血清代替物として使用されてもよい。

本発明の培養方法において、カルシウムは、免疫原性の抑制およびサイトカイン分泌の刺激により、間葉系幹細胞の増殖を促進するように機能する。この点で、カルシウムは、培地中に２．１〜３．８ｍＭの濃度、好ましくは３．３〜３．８ｍＭの濃度で、より好ましくは約３．６ｍＭの濃度で使用されてもよい。たとえば、α−ＭＥＭを培地に採用する場合、培地が１．８ｍＭのカルシウムをすでに含有しているので、カルシウムは０．３〜２．０ｍＭの濃度、好ましくは１．５〜２．０ｍＭの濃度、より好ましくは約１．８ｍＭの濃度で添加されてもよい。同様に、別の培地を採用する場合、本発明の培養方法に必要な所望の濃度を達成するために添加すべきカルシウム濃度は、培地自体のカルシウム濃度を考慮して直ちに算出することができる。

本発明の培地において、マグネシウムは、カルシウムの沈殿を防ぐために利用される。マグネシウムは、培地中に１．０〜３．０ｍＭの濃度で、好ましくはおよそ１．８ｍＭの濃度で使用されてもよい。マグネシウムが培地中に１．０ｍＭ未満の濃度で存在する場合、カルシウムの沈殿を防ぐことは困難である。他方で、培地中で３．０ｍＭより高いマグネシウム濃度は、細胞外基質（ＥＣＭ）の形成を遮断し、培養皿の底に細胞が付着することを妨げ、したがって剪断応力の影響を受けやすくし、細胞内石灰化を増加させる可能性がある。たとえば、α−ＭＥＭを培地に採用する場合、培地が０．８ｍＭのマグネシウムをすでに含有しているので、マグネシウムは０．２〜２．２ｍＭの濃度、好ましくは１．０ｍＭの濃度で添加されてもよい。同様に、別の培地を採用する場合、本発明の培養方法に必要な所望の濃度を達成するために添加すべきマグネシウム濃度は、培地自体のマグネシウム濃度を考慮して直ちに算出することができる。

したがって、本発明の好ましい態様による培地は、５〜３０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．３〜２．０ｍＭカルシウム、ならびに０．２〜２．２ｍＭマグネシウムが補充されたα−ＭＥＭに基づいてもよく、それによりカルシウムおよびマグネシウムの終濃度がそれぞれ２．１〜３．８ｍＭおよび１．０〜３．０ｍＭになるように作製される。

さらに、本発明の培養方法の別の特徴は、間葉系幹細胞の低酸素培養条件である。正常酸素条件（酸素正常状態）と比較して、低酸素条件は、免疫原性の抑制およびサイトカイン分泌の刺激により、間葉系幹細胞の増殖を促進する。この文脈において、低酸素条件は、２〜５％の酸素含有量を示す。２％以下または５％以上の酸素濃度に付随する問題は、間葉系幹細胞の増殖の有意な低下である。本発明の好ましい一態様において、間葉系幹細胞は約３％レベルの酸素で培養される。低酸素条件は、細胞インキュベーター内の酸素濃度を調節することによって達成されてもよい。たとえば、インキュベーターは、正常酸素圧の雰囲気を低酸素雰囲気に変えるために、窒素ガス（１００％）または窒素／二酸化炭素混合物ガス（９５％／５％）と一緒に供給されてもよい。インキュベーター内の酸素濃度は、インキュベーターに備えられた酸素センサーによって監視されてもよい。

本発明の上述した条件を除いて、間葉系幹細胞は従来の様式で培養されてもよい。たとえば、間葉系幹細胞は、３次元バイオリアクタもしくはスピナーまたは従来の付着培養容器内で培養されてもよい。

カルシウムおよびマグネシウムの濃度制御に関する第１の特徴を、低酸素条件に関する第２の特徴と組み合わせると、相乗効果を得ることができる。すなわち、特定の濃度のカルシウムならびにマグネシウムと低酸素条件との組合せにより、免疫原性の抑制およびサイトカイン分泌の刺激のさらに高い改善に伴って、個々の条件と比較して間葉系幹細胞をより効率的に増殖させることが可能になる。本発明の培養方法の複合条件を、「ＣＭＨ条件」（カルシウム＋マグネシウム＋低酸素性条件）と称する。

本発明の培養方法は、間葉系幹細胞の継代に適用されてもよい。換言すれば、本発明の培養方法を使用して培養される間葉系幹細胞は、同じ様式で継代培養することができる。間葉系幹細胞をより効率的に増殖させることが可能になることにより、本発明の培養方法は、より少ない回数の継代が実施される場合でも、より多くの間葉系幹細胞を産生するという長所を有する。たとえば、各継代で同数の細胞が接種され、一様な期間培養された５回の継代の後に、本発明の培養方法は、従来の方法より１００〜１０００倍多い数の間葉系幹細胞を産生することが見いだされている。

したがって、本発明は、上記の方法によって調製され、増殖能および分化潜在能が改善された間葉系幹細胞を提供する。

加えて、本発明は、上記の培養方法によって得られる間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を提供する。本発明の細胞治療剤は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島β細胞、脈管細胞または肺細胞の再生もしくは保護に適用することができる。加えて、本発明の細胞治療剤は、肺疾患の治療；肺疾患誘導性炎症の抑制または治療；肺組織の再生；および肺線維症の抑制からなる群から選択される１つに有用である。特に、肺疾患誘導性炎症および線維症の抑制または改善に使用することができる。さらに、本発明の細胞治療剤は、心血管疾患の療法または軟骨の再生に適用することができる。さらに、本発明の細胞治療剤は、免疫モジュレーション機能を改善し；免疫応答、免疫細胞侵入または免疫原性のうち１つを減少させ；炎症性反応を抑制することができる。

以下に、本発明を、例を伴って詳細に述べることになるが、例は本発明の範囲を制限しない。

例１：臍帯血由来間葉系幹細胞の細胞サイズの分析
非単離臍帯血由来間葉系幹細胞の細胞サイズを、以下の通りに測定した。

具体的には、臍帯血由来間葉系幹細胞を４人のドナーから得て冷凍保存した。間葉系幹細胞の各収集物を解凍し、１０％ ＦＢＳが補充されたα−ＭＥＭ培地を有するインキュベーター内で３７℃、５％ ＣＯ₂の条件下で５日間培養した。

細胞の形態を顕微鏡で観察し、単一細胞をトリプシンでの処理によって得た。単一細胞をトリパンブルーで処理し、生存率を試験した。細胞を、１００×の倍率でＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｕ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて観察し、細胞集団の複数の領域を撮影した。撮影した領域において、生細胞のサイズを、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ ｖｉｓｉｏｎ ５×（ｎｅｘｃｅｌｏｍ ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ）を使用して分析した。

図１は、顕微鏡で撮影した写真を示す。図１ａは、臍帯血から単離した、培養された間葉系幹細胞を示す写真であり、図１ｂは、トリプシン処理後の単一細胞の形態である間葉系幹細胞を示す写真である。図１ｃは、細胞サイズの測定結果を示すグラフである。

図１から分かるように、細胞がお互いに付着していた場合（図１ａ）、細胞サイズに関する情報は全く得られなかったが、細胞が単一細胞の形態であった場合（図１ｂ）、細胞サイズを試験することができた。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒでの分析により、間葉系幹細胞は、４．８４〜１８．５２μｍの様々なサイズを持つ細胞の不均一な集団を構成することが確認された（図１ｃ）。

例２：サイズによる臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能に関する分析
臍帯血由来間葉系幹細胞の細胞サイズと増殖能の間の相関を分析するために、４人のドナーから得た間葉系幹細胞（ＭＳＣ＃１〜＃４）を、例１に記述される方法によって培養し、次いで、細胞サイズを、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して分析した。分析の結果を、図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａから分かるようにＭＳＣ＃１および＃２の細胞サイズが比較的小さく、一方で図２Ｂから分かるようにＭＳＣ＃３および＃４の細胞サイズが比較的大きいことが確認された。

小さい細胞サイズを有する群Ｉ（ＭＳＣ＃１および＃２）および大きい細胞サイズを有する群ＩＩ（ＭＳＣ＃３および＃４）を継代で培養し、累積増殖曲線を作成した。累積増殖曲線は、集団倍化数（ＰＤ）の累積値である累積集団倍加数（ＣＰＤ）として表される。

ＰＤは、各継代の細胞の総数に基づいて算出され、それはｌｏｇ（特定の継代の増殖率）／ｌｏｇ２である。特定の継代の細胞が、５０〜６０％のコンフルエンスに達するとき、それをトリプシン処理し、分離して単一細胞を回収する。特定の継代の増殖率を、回収した単一細胞の数を培養容器に最初に提供した細胞の数で割ることによって算出した。これらの手順を、細胞の増殖が止まる継代まで繰り返した。細胞は、第１および第２の継代から開始して細胞の増殖が止まる最後の継代まで増殖させておいた。継代当たりの培養の期間は７日間であった。グラフにおけるＰ１〜Ｐ１０は継代数のことを指す。実験結果を図３に示す。

図３から分かるように、小さい細胞サイズを有する群Ｉにおける増殖能が、大きい細胞サイズを有する群ＩＩより大きく、群Ｉにおける細胞の増殖が、群ＩＩより長く続いたことが確認された。

例３：細胞サイズの決定および小さい細胞の単離
＜３−１＞単離に適した細胞サイズの決定
サイズにより細胞を分析するためのフィルターとして、Ｘｉａｏｇａｎ ｙａｇｕａｎｇの濾過膜チューブを選択した。フィルターは、５０ｍＬチューブの内部に組み込まれるため、遠心分離の間外部からの汚染から保護することができる。一方、細胞を単離するための機器、たとえばソート機器、Ｂｅｃｋｍａｎの高速遠心分離機、ＢＤのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）は公知である。しかし、ソート機器は、細胞の分離過程の間に細胞を傷める可能性があるため治療剤を製造する手順に適さない。Ｂｅｃｋｍａｎの高速遠心分離機器は消耗部品に使い捨て製品を利用しないので、ＧＭＰ製造過程における使用に適さない。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）に関しては、密封されたシステムでなく、遠心分離の間に細胞の無菌条件を保証しない。本発明の間葉系幹細胞が治療剤として使用されるべきことを考慮して、実際のＧＭＰ製造施設に適しているＸｉａｏｇａｎ ｙａｇｕａｎｇの濾過膜チューブが最も適当であると決定した。

濾過膜チューブを使用して、３μｍ以下（≦３μｍ）、５μｍ以下（≦５μｍ）および８μｍ以下（≦８μｍ）のサイズを有する臍帯血由来間葉系幹細胞を単離した。単離した細胞のそれぞれの量を測定した。その結果、フィルターによって単離した≦３μｍまたは≦５μｍのサイズを有する細胞の量および間葉系幹細胞集団の中の前記細胞のパーセンテージは、非常に低かった。それに対し、８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞は充分な量得られた。したがって、適切な細胞サイズを８μｍ以下に決定し、このサイズ範囲の細胞を「小さい細胞」または「小さい間葉系幹細胞」と称する。

＜３−２＞小さい細胞を取得するための最適条件を確立する
８μｍ以下のサイズを有する細胞を取得するための最適条件を確立するために、遠心分離条件（速度および遠心分離の継続時間）、ロードする細胞数および遠心分離の反復回数による細胞取得率を調査した。

（１）遠心分離速度による細胞取得率
例１において培養された間葉系幹細胞（２×１０⁵個細胞／２ｍＬ）を、遠心分離機（Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ、ｃｏｍｂｉ５１４Ｒ）を使用して８００ｒｐｍ、１２００ｒｐｍ、１５００ｒｐｍおよび２０００ｒｐｍでそれぞれ５分間遠心分離した。遠心分離後にフィルターを通過した細胞の比（％）を、フィルターにロードした細胞数（２×１０⁵個細胞）を１００％と設定して測定した。結果を表１に示す。

表１に示すように、１２００ｒｐｍの速度での遠心分離により、他の速度より高い取得率を得られることが判明した。上記の結果に基づいて、下の実験において遠心分離は１２００ｒｐｍの速度で行った。

（２）遠心分離の継続時間による細胞取得率
例１において培養された間葉系幹細胞（２×１０⁵個細胞／２ｍＬ）を、遠心分離機（Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ、ｃｏｍｂｉ５１４Ｒ）を使用して１２００ｒｐｍで２分間、５分間および１０分間それぞれ遠心分離し、次いで、フィルターを通過した細胞の比を上記と同じ様式で測定した。結果を表２に示す。

表２に示すように、１２００ｒｐｍで５分間の遠心分離により、他の継続時間より高い細胞取得率を得られることが判明した。上記の結果に基づいて、下の実験において遠心分離は１２００ｒｐｍで５分間行った。

（３）ロードされる細胞数による細胞取得率
例１において培養された間葉系幹細胞を、５×１０⁴、１×１０⁵、２×１０⁵または３×１０⁵個細胞／２ｍＬの集団でフィルターにロードし、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、フィルターを通過した細胞の比を、上記と同じ様式で測定した。結果を表３に示す。

表３に示すように、２×１０⁵個細胞の集団で間葉系幹細胞をロードすることにより、他の集団より高い取得率を得られることが判明した。下の実験において、遠心分離は、２×１０⁵個の集団で間葉系幹細胞をロードし、１２００ｒｐｍで５分間行った。

（４）遠心分離の回数を決定する
遠心分離の回数による細胞取得率を試験するために、細胞を２つの群に分割し、それぞれ１回および２回遠心分離した。２回遠心分離する群を、２つのサブグループにさらに分割した。この後者の２回目の遠心分離において、第１のサブグループではどのフィルターも交換せずに遠心分離チューブに新たな培地を添加し、一方で第２のサブグループではフィルターを交換した後に細胞を培地に懸濁した。

具体的には、第１のサブグループ（２回（培地添加））では、上記の通り間葉系幹細胞を１回遠心分離した後に、使用したフィルターに新しい培地２ｍＬを添加し、細胞を遠心分離した。次いで、フィルターを通過した細胞の数を、上記と同じ様式で測定した。そして、第２のサブグループ（２回（フィルター交換））では、上記の通り間葉系幹細胞を１回遠心分離した後に、フィルターに残っていた細胞を懸濁することによって細胞を回収した。次いで、新たなフィルターを置き、細胞を遠心分離して、フィルターを通過した細胞数を測定した。結果を表４に示す。

表４に示すように、２回遠心分離した２つのサブグループは、１回遠心分離した群と有意な差を示さなかった。したがって、遠心分離の回数は、最終的に１回に決定した。

最適条件下で得た間葉系幹細胞を顕微鏡で観察すると、図４に示すように８μｍ以下の細胞サイズを有する一様な細胞群を得られたことが確認された。

例４：８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞（小さい細胞）の増殖能についての比較
本発明により得られる小さい細胞の増殖能を試験するために、間葉系幹細胞を、非単離細胞群（元の）、８μｍ以下の細胞サイズを持つ細胞群（小さい）および８μｍを超える細胞サイズを持つ細胞群（大きい）に分け、継代で培養して増殖能を比較した。上述した細胞群の３つの型を１０％ ＦＢＳが補充されたα−ＭＥＭ培地中で、各継代が累積増殖を測定するまで平均５日間で培養した。

測定の結果を図５に示す。図５ａは、３つの型の細胞群の顕微鏡写真を示し、８μｍ以下の細胞サイズを有する群（右の写真）が、元の細胞群（左の写真）および８μｍを超える細胞サイズを有する群（中央の写真）と比較してより均一であったことを示す。図５ｂおよび５ｃは、増殖能およびＣＰＤを示し、８μｍ以下の細胞サイズを有する群における増殖能が他の細胞群より一層大きかった。特に、８μｍ以下の細胞サイズを有する群におけるＣＰＤは、他の２つの群より少なくとも２倍大きかった。

例５：８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞（小さい細胞）のパーセンテージによる増殖能についての分析
８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞（小さい細胞）の増殖能の優位性を実証するために、異なるパーセンテージの小さい細胞を含む５種類の細胞群を、以下の通りに調製した。

群１：８μｍを超えるＭＳＣ（１００％）
群２：８μｍを超えるＭＳＣ（７５％）＋８μｍ以下のＭＳＣ（２５％）
群３：８μｍを超えるＭＳＣ（５０％）＋８μｍ以下のＭＳＣ（５０％）
群４：８μｍを超えるＭＳＣ（２５％）＋８μｍ以下のＭＳＣ（７５％）
群５：８μｍ以下のＭＳＣ（１００％）
各細胞群の増殖能を例２と同じ方法によって測定し、増殖能の量を群１と比較した増加倍数として図６に表す。

図６に示すように、８μｍ以下のサイズを有する細胞のパーセンテージが増加すると、細胞の増殖能が高くなることが観察された。これらの結果は、８μｍ以下のサイズを有する細胞が非常に高い増殖能を有することを示す。

例６：ＣＭＨ条件による小さい細胞の増殖能についての分析
従来の培養条件（すなわち、３７℃および５％ ＣＯ₂）下で、継代で培養した場合、細胞サイズの増加により、臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能が低下することが公知である。したがって、優れた増殖能を有する８μｍ以下の臍帯血由来間葉系幹細胞が、その細胞サイズおよび増殖能を維持できる培養条件を確立することが必要である。

したがって、この例において、８μｍ以下のサイズを有する臍帯血由来間葉系幹細胞を様々な条件下で培養し、次いで、その条件下での細胞サイズおよび増殖能を比較した。

具体的には、元の細胞群および８μｍ以下の細胞サイズを有する細胞群（小さい細胞群）の細胞を解凍し、１０％ ＦＢＳが補充されたα−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を含有するインキュベーター（低酸素／ＣＯ₂インキュベーター、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３１３１）内で３７℃、５％ ＣＯ₂の条件下で５日間培養した。細胞が８０〜９０％コンフルエンスに到達したとき、単一細胞をトリプシンでの処理により得た。次いで、細胞を５０００個細胞／ｃｍ²の濃度でα−ＭＥＭ培地に接種し、典型的な培養条件（対照群）、追加のカルシウム（マグネシウムを含む）条件、低酸素条件、および追加のカルシウム（マグネシウムを含む）／低酸素条件（以下「ＣＭＨ」と呼ぶ）下で培養した。典型的な培養条件の場合、細胞を、α−ＭＥＭ培地（１０％ ＦＢＳを含有する；１．８ｍＭカルシウムおよび０．８ｍＭマグネシウムを含有する）中で３７℃、５％ ＣＯ₂、および酸素正常状態（大気酸素濃度２１％（体積／体積））の条件下で培養した。追加のカルシウム（マグネシウムを含む）条件の場合、細胞を、１．８ｍＭカルシウムならびに１ｍＭマグネシウムを添加することによりカルシウムおよびマグネシウムの全濃度をそれぞれ３．６ｍＭおよび１．８ｍＭに調節したα−ＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ₂および酸素正常状態の条件下で培養した。さらに、低酸素条件の場合、細胞をα−ＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ₂および低酸素（３％（体積／体積）の酸素濃度）の条件下で培養した。ＣＭＨ条件の場合、細胞を、１．８ｍＭカルシウムならびに１ｍＭマグネシウムを添加することによりカルシウムおよびマグネシウムの全濃度をそれぞれ３．６ｍＭおよび１．８ｍＭに調節したα−ＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ₂および３％（体積／体積）酸素の条件下で培養した。各群の細胞の形状および増殖能を、４回の培養継代の間観察した。

細胞の形状（ａ、ｂ）および増殖能（ｃ）を、図７に示す。図７ａならびに７ｂで示すように、ＣＭＨ条件下で培養した元の細胞群および小さい細胞群の細胞密度が、他の条件下で培養した群より有意に高いことが示された。さらに、元の細胞群と小さい細胞群の細胞の形状を比較した場合、小さい細胞群は、同一の形態の細胞付着を有し、より多量の付着細胞を有した。

他方、図７ｃから分かるように、対照細胞群と小さい細胞群の両方において、増殖能はＣＭＨ条件下で最も大きいことが示された。特に、小さい細胞群の継代当たりの増殖能は、何もしていない細胞群のそれより少なくとも２倍大きかった。さらに、継代当たりの小さい細胞群の増殖能に対する結果は、ＣＭＨ条件下で培養した細胞が、正常条件下で培養したそれより少なくとも２倍大きい増殖能を有することを示した。

上記の結果は、小さい細胞群が元の細胞群より大きい増殖能を有し、細胞サイズを維持することができ、ＣＭＨ条件下で小さい細胞を培養することにより細胞の増殖能を向上させ得ることを示している。

例７：ＣＭＨ条件下で培養した小さい細胞群の細胞サイズおよび増殖能についての分析
ＣＭＨ条件下で培養した、小さい細胞群の臍帯血由来間葉系幹細胞のサイズおよび増殖能を分析するために、元の細胞群および８μｍ以下の細胞サイズを有する小さい細胞群を、典型的な培養条件ならびにＣＭＨ条件下で培養した。そのような間葉系幹細胞を、典型的な培養条件下で２回の継代で培養し（ｐ２）、その後各条件下に継代で培養した。これらの細胞を、各継代後に７日間培養した。次いで、細胞の増殖能および累積的増殖能を測定した。結果を図８に示す。

図８に示すように、小さい細胞群をＣＭＨ条件下で培養した場合、細胞サイズおよび増殖能の維持は大きく向上し、その効果は連続する継代を通して維持された。実際の細胞療法に使用される初期の継代（ｐ３〜ｐ６）の間に、増殖能が著しく高くなることを観察した。特に、小さい細胞群とＣＭＨ条件との組合せは、継代当たりの増殖能において少なくとも２倍の差異を示した（図８Ａ）。累積集団倍加数（ＣＰＤ）の場合、ＭＳＣの間でいくらかの変動はあったが細胞の増殖能が複数の継代を通じて維持されることが判明した（図８Ｂ）。

これらの結果は、小さい細胞群と本発明のＣＭＨ培養条件との組合せが、臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖を改善するのに効果的であることを示す。

例８：カルシウム濃度による間葉系幹細胞の増殖能
カルシウム濃度による臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能を試験するために、細胞を様々な濃度のカルシウムを含む培地中で培養した。

具体的には、分娩後に母親から採集され、凍結状態で貯蔵された臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ＃１）を解凍し、１０％ ＦＢＳが補充されたα−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を含有するインキュベーター（低酸素／ＣＯ₂インキュベーター、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３１３１）内で３７℃、５％ ＣＯ₂条件下で培養した。細胞が５０〜９６％コンフルエンスに到達したとき、それらをトリプシンでの処理により単一細胞に分離した。α−ＭＥＭ（１０％ ＦＢＳが補充された；１．８ｍＭカルシウムおよび０．８ｍＭマグネシウムを含有する）に、培地のカルシウム終濃度が１．８ｍＭ、３．４ｍＭ、３．６ｍＭ、３．８ｍＭ、４．０ｍＭ、４．２ｍＭおよび４．４ｍＭに調節されるように様々な濃度のカルシウム（０ｍＭ、１．６ｍＭ、１．８ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭおよび２．６ｍＭ）を添加した。細胞を培地中で６日間培養し、次いで計数した。カルシウムに起因する沈殿を防ぐために、各培地にマグネシウムを１ｍＭの濃度で添加した（全マグネシウム濃度は、１．８ｍＭであった）。細胞を、２１％（体積／体積）正常酸素圧の条件下で培養した。細胞が５０〜６０％の程度まで増殖したとき、それらを同じ方法で、継代で培養した。試験結果を図９に示す。

図９から分かるように、０〜１．８ｍＭの追加のカルシウム濃度に対して増殖能は増加した（培地中に１．８または３．６ｍＭの全カルシウム濃度）。これらの結果から、細胞の最大の増殖を達成するための最適カルシウム濃度は培地中に３．６ｍＭであった。したがって、典型的な培養条件と比較してより大きい増殖能を達成するには、１．８〜３．６ｍＭのカルシウム濃度を持つ培地中で細胞を培養することが有利であると考えられる。

例９：酸素濃度による臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能
酸素濃度による臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能を試験するために、細胞を様々な濃度の酸素を含む条件下で培養した。

具体的には、臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ＃１）を、例８と同じ様式で１０％ ＦＢＳが補充されたα−ＭＥＭ中で培養したが、カルシウムおよびマグネシウムは追加で添加せず、細胞を３％もしくは５％酸素下で、または正常酸素圧条件（空気中酸素レベル２１％）下で培養し、計数した。結果を図１０に示す。

結果に示すように、細胞の増殖能は、正常酸素圧条件より低酸素条件下で大きかった。特に、増殖能は３％の酸素濃度下で最も大きく、その結果は長期間の連続する継代を通して維持された。

例１０：培養条件による臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖阻害タンパク質および老化についての分析
例６における臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖の改善の原因を同定するために、幹細胞中の増殖阻害タンパク質の発現レベルおよび老化におけるその変化を試験した。

具体的には、例６に記載の通り、元の細胞群および小さい細胞群を、典型的な培養条件ならびにＣＭＨ条件下で培養した。細胞が５０〜６０％コンフルエンスに到達したとき、それらをトリプシンでの処理により解離させた。その後、細胞培養溶液を遠心分離して培地を除去し、次いでＰＢＳで洗浄して細胞を得た。次に、製造業者の手順にしたがって溶解緩衝液（ＲＩＰＡ）を使用してタンパク質を細胞から単離した。標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してタンパク質を定量化し、タンパク質１５μｇを調製してウェスタンブロットを実施した。タンパク質を１２％ポリアクリルアミドゲルにロードし、次いで１３０Ｖで２時間電気泳動した。電気泳動後にタンパク質を、ウェスタンブロッターを使用して３００ｍＡの電流で３時間、ゲルからニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）へ移し、その膜を、５％脱脂乳を含有する１×ＴＢＳＴ溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用して１時間ブロッキングした。次いで、一次抗体（ｐ２１、ｐ５３（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）およびβ−アクチン）を冷蔵温度で終夜、ブロッキングしたニトロセルロース膜に付着させた。その後、得られたニトロセルロース膜を１×ＴＢＳＴで洗浄し、二次抗体（抗ウサギまたはマウスＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を添加し、室温で１時間それに付着させておいた。次に、製造業者の手順にしたがってＥＣＬウェスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用することにより、ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ溶液を膜上に注ぎ、バンドをＣｈｅｍｉｄｏｃ機器（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）によって試験した。

ウェスタンブロットの結果を図１１に示す。図１１に示すように、ｐ５３およびｐ２１（Ａｂｃａｍ）、すなわち増殖阻害タンパク質の発現レベルは、ＣＭＨ条件下で培養した小さい細胞群において比較的低いことが判明した。この結果は、ＣＭＨ培養条件が増殖阻害タンパク質の発現を下方調節することにより間葉系幹細胞の増殖能を改善することを示す。

一方、元の細胞群および小さい細胞群の細胞を、典型的な培養条件ならびにＣＭＨ条件下で数回の継代で培養してそれらの老化を誘導した。培養溶液を各培養容器から除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次いで、１×固定溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１ｍＬをそれに添加した後、細胞を室温で１０分間培養した。固定溶液を除去した後、細胞をＰＢＳ ２ｍＬで２回洗浄した。次に、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（ＳＡ βｇａｌ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１ｍＬをそれに添加した後、細胞をインキュベーター内で２４〜４８時間培養した。次いで、染色溶液を除去した後、細胞をＰＢＳ １ｍＬで洗浄した。次いで、染色した細胞を、１００×の倍率でＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｕ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を使用して撮影した。写真を利用して全細胞数に対する染色された細胞数を試験した。

試験の結果を図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。図１２Ａおよび図１２Ｂ（左）に、典型的な培養条件ならびにＣＭＨ条件で培養した、出生させた異なる母から得たＭＳＣ（ＭＳＣ＃１〜＃４）の元の細胞群および小さい細胞群の写真を提供する。写真は染色された老齢細胞を示す。また図１２Ａおよび１２Ｂ（右）に、染色された細胞数対全細胞数の比を示すグラフを提供する。グラフにおいて、Ｏｒｉｇｉｎａｌ（Ｏ）は元の細胞群、ＯＣＭＨはＣＭＨ条件下で培養した元の細胞群、Ｓは従来の培養条件下で培養した小さい細胞群、およびＳＣＭＨはＣＭＨ条件下で培養した小さい細胞群のことを指す。

図１２Ａおよび図１２Ｂに示すように、グラフにおいて確認される通り、小さい細胞をＣＭＨ条件下で培養したときに老齢細胞の数は最少であった。これらの結果は、ＣＭＨ条件で本発明の小さい細胞を培養することにより、増殖能を高めることができ、老化を抑制できることを示している。

例１１：培養条件による臍帯血由来間葉系幹細胞の分化潜在能およびマーカーの変化の試験
本発明による小さい細胞をＣＭＨ条件下で培養した場合に、臍帯血由来間葉系幹細胞をその基本的な特徴における任意の変化について試験するために、２種類の臍帯血由来間葉系幹細胞からの元の細胞群および小さい細胞群を、従来の培養条件ならびにＣＭＨ培養条件下で培養した。分析は、骨形成および脂肪生成誘導における間葉系幹細胞の分化潜在能の任意の変化ならびにその標識マーカーの変化を確認して行った。

＜１１−１＞骨形成誘導および骨染色
骨形成分化の誘導のために、６ウェプレートの各ウェルに５００〜１０００個の細胞を入れ、２〜４日後に骨形成誘導培地（１０ｍＭグリセロリン酸、５０ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸２リン酸、１μＭデキサメタゾン／ＵＶＡＢ、ゲンタマイシンおよび１０％ ＦＢＳが補充されたα−ＭＥＭ培地）を提供した。培地を、３日毎に新たな分化培地と交換して２〜３週間細胞の分化を誘導した。分化した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで固定溶液（４０％アセトン）中で３０〜４５秒間インキュベートした。蒸留水で２〜３回細胞を洗浄した後、アルカリ性染色溶液（ファーストバイオレットＢ塩）をそれに添加し、細胞を暗所にて室温で３０分間培養した。次いで、細胞を蒸留水で２回洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液で１０〜２０秒間処理した。溶液を除去した後、細胞を水道水で洗浄し、乾燥させた。観察のために水溶性封入溶液を使用しながら染色した組織をカバースライドで覆った。細胞内アルカリホスファターゼの活性化によって、骨芽細胞に分化した細胞は暗褐色に染色されるので、細胞の骨形成誘導の程度を染色の程度に基づいて評価した。

＜１１−２＞脂肪生成誘導および脂肪染色
脂肪生成の誘導のために、６ウェルプレートの各ウェルに５００〜１０００個の細胞を入れ、２〜４日後に脂肪生成誘導培地（０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、０．２ｍＭインドメタシン、１０μＭインスリン、１μＭデキサメタゾン／ＵＶＡＢ、ならびに１０％ ＦＢＳおよびゲンタマイシンが補充されたＤＭＥＭ培地）を提供した。培地を、３日毎に新たな分化培地と交換して、３〜４週間分化を誘導した。分化した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで固定溶液（１０％ホルマリン）中で１０分間インキュベートした。蒸留水で２〜３回細胞を洗浄した後、染色溶液（オイルレッドＯ）をそれに添加し、細胞を室温に３０分間置いた。次いで、細胞を蒸留水で洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液で１０〜２０秒間処理した。溶液を除去した後、細胞を水道水で洗浄し、乾燥させた。染色した組織を観察し、水溶性封入溶液を使用しながらカバースライドで覆った。脂肪生成誘導の程度を、染色（赤色）の程度ならびに分化した脂質胞の存在および形成の程度に基づいて評価した。

実験結果を図１３に示す。図１３ａおよび図１３ｂはそれぞれ骨形成誘導ならびに脂肪生成誘導の結果を示す。図１３に示すように、小さい細胞群をＣＭＨ条件下で培養した場合、骨形成誘導および脂肪生成誘導において優れた結果が得られた。上記の結果は、小さい細胞サイズとＣＭＨ培養条件の組合せが、臍帯血由来間葉系幹細胞の分化潜在能を改善し得ることを示唆する。

＜１１−３＞マーカーの分析
臍帯血由来間葉系幹細胞における細胞表面抗原の免疫表現型を分析するために、マーカータンパク質（ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＨＬＡＡＢＣおよびＨＬＡＤＲ）の発現を、以下の通りにＦＡＣＳ分析により試験した。

元の細胞群および小さい細胞群を、従来の培養条件ならびにＣＭＨ条件下で培養した。次いで、細胞をトリプシンで処理し、ＰＢＳ溶液で２回洗浄した。洗浄した細胞を、間葉系幹細胞の公知の陰性抗原であるＣＤ１４−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびＨＬＡＤＲ ＦＩＴＣ、ならびに間葉系幹細胞において強く発現される公知の陽性抗原であるＣＤ７３−ＰＥ（フィコエリトリン）、ＣＤ９０−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＰＥおよびＨＬＡＡＢＣ−ＰＥと反応させた。マーカーを発現している細胞対全細胞の比を、ＦＡＣＳ機械によって二次抗体のシグナルを検出することによって得た。反応後の分析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェアを使用して行った。

実験結果を表５に示す。

表５に示すように、細胞サイズまたは培養条件により間葉系幹細胞のマーカータンパク質の発現に差はなかった。

結果から、小さい細胞および本発明のＣＭＨ培養条件が、臍帯血由来間葉系幹細胞の基本的な特徴を有意に変化させないことが明らかになる。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
（１）８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離する工程と；
（２）２〜５％酸素の条件下で、２．１〜３．８ｍＭカルシウムおよび１．０〜３．０ｍＭマグネシウムを含有する培地中で前記間葉系幹細胞を培養する工程と
を含む、間葉系幹細胞を培養する方法。
［２］
前記間葉系幹細胞が、臍帯血、骨髄、脂質、筋肉、皮膚、羊水、臍帯または歯に由来する、［１］に記載の方法。
［３］
前記工程（１）の前記間葉系幹細胞の前記単離が、前記間葉系幹細胞を８μｍの細孔径を有する濾過膜を通過させることにより実施される、［１］記載の方法。
［４］
前記培地が、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、マッコイ５Ａ培地、イーグル基礎培地、コンノートメディカルリサーチラボラトリーズ（ＣＭＲＬ）培地、グラスゴーＭＥＭ、ハムＦ−１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ライボビッツＬ−１５培地、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、１９９培地およびハンクス培地１９９からなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［５］
前記培地が、５〜３０％ウシ胎仔血清を含む、［４］に記載の方法。
［６］
前記培地が、ウシ胎仔血清を含まないが、血清代替物を含む、［４］に記載の方法。
［７］
前記培地が、５〜３０％ウシ胎仔血清、０．３〜２．０ｍＭカルシウムおよび０．２〜２．２ｍＭマグネシウムが補充されたα−ＭＥＭに基づく、［１］に記載の方法。
［８］
培養された前記間葉系幹細胞が、［１］と同じ培養条件下で継代培養される、［１］に記載の方法。
［９］
［１］に記載の方法によって得られる間葉系幹細胞。
［１０］
［９］に記載の間葉系幹細胞を含む細胞治療剤。
［１１］
脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島β細胞、脈管細胞または肺細胞の再生もしくは保護に使用される、［１０］に記載の細胞治療剤。
［１２］
肺疾患の治療；肺疾患誘導性炎症の抑制または治療；肺組織の再生；および肺線維症の抑制からなる群から選択される１つに使用される、［１０］に記載の細胞治療剤。
［１３］
軟骨の再生に使用される、［１０］に記載の細胞治療剤。
［１４］
自己免疫疾患または移植片対宿主病の療法に使用される、［１０］に記載の細胞治療剤。
［１５］
（１）８μｍ以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離する工程と；
（２）２〜５％酸素の条件下で、２．１〜３．８ｍＭカルシウムおよび１．０〜３．０ｍＭマグネシウムを含有する培地中で、単離された前記間葉系幹細胞を培養する工程とを含む、間葉系幹細胞の増殖能および分化潜在能を改善する方法。

Claims (14)

1. ８μｍ以下のサイズを有する単離された間葉系幹細胞を、２〜５％酸素の条件下で、２．１〜３．８ｍＭカルシウムおよび１．０〜３．０ｍＭマグネシウムを含有する培地中で培養する工程を含む、間葉系幹細胞を培養する方法。
2. 前記間葉系幹細胞が、臍帯血、骨髄、脂質、筋肉、皮膚、羊水、臍帯または歯に由来する、請求項１に記載の方法。
3. 前記培地が、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、マッコイ５Ａ培地、イーグル基礎培地、コンノートメディカルリサーチラボラトリーズ（ＣＭＲＬ）培地、グラスゴーＭＥＭ、ハムＦ−１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ライボビッツＬ−１５培地、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、１９９培地およびハンクス培地１９９からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記培地が、５〜３０％ウシ胎仔血清を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記培地が、ウシ胎仔血清を含まないが、血清代替物を含む、請求項３に記載の方法。
6. 前記培地が、５〜３０％ウシ胎仔血清、０．３〜２．０ｍＭカルシウムおよび０．２〜２．２ｍＭマグネシウムが補充されたα−ＭＥＭに基づく、請求項１に記載の方法。
7. 培養された前記間葉系幹細胞が、請求項１と同じ培養条件下で継代培養される、請求項１に記載の方法。
8. 請求項１に記載の方法によって得られる間葉系幹細胞。
9. 請求項８に記載の間葉系幹細胞を含む細胞治療剤。
10. 脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島β細胞、脈管細胞または肺細胞の再生もしくは保護に使用される、請求項９に記載の細胞治療剤。
11. 肺疾患の治療；肺疾患誘導性炎症の抑制または治療；肺組織の再生；および肺線維症の抑制からなる群から選択される１つに使用される、請求項９に記載の細胞治療剤。
12. 軟骨の再生に使用される、請求項９に記載の細胞治療剤。
13. 自己免疫疾患または移植片対宿主病の療法に使用される、請求項９に記載の細胞治療剤。
14. ８μｍ以下のサイズを有する単離された間葉系幹細胞を、２〜５％酸素の条件下で、２．１〜３．８ｍＭカルシウムおよび１．０〜３．０ｍＭマグネシウムを含有する培地中で培養する工程を含む、間葉系幹細胞の増殖能および分化潜在能を改善する方法。