TW201920654A - 用來治療視網膜疾病的組合物及其製造與使用方法 - Google Patents

用來治療視網膜疾病的組合物及其製造與使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明係揭露用於治療、改善或預防視網膜疾病或狀態之組合物以及藉由將其給予視網膜前驅細胞來改善明視(日光)視力；改善矯正視力敏銳度；改善黃斑功能；改善視野；或改善暗視(夜間)視力之方法。

Description

用來治療視網膜疾病的組合物及其製造與使用方法
相關申請案之交互參照
本申請案主張於2017年06月05日向美國智慧財產局提出之美國臨時申請案No. 62/515,216之優先權，其全部內容於此併入作為參考。
本文中所描述之標的概括而言係有關於幹細胞生物學及再生醫學的領域。
視網膜變性係指由視網膜的感光細胞持續地及不可逆地衰退及死亡所造成的惡化或退化。感光細胞的死亡可導致失明。
於是，領域中存在有對於有效治療修復創傷及失去的感光細胞與修復視覺功能之需求。
本文提供供用於個體(例如人類)中作為有用於視網膜疾病或狀態的治療的藥物的製劑、製造的產物以及/或組合物，其中製劑、製造的產物以及/或組合物包括含有非不凋亡的人類視網膜前驅細胞(non-immortal human retinal progenitor cells)的細胞群體，其中製劑、製造的產物以及/或組合物之製造藉由機械地以及/或酵素地消化從介於約12週至約28週之間的孕齡的人類取得之人類視網膜組織樣本以產生細胞及細胞簇的解離懸浮液，在標準氧氣濃度之下，在培養瓶或塗佈有無異源纖連蛋白(fibronectin)、鳥氨酸、聚賴氨酸或層黏連蛋白(laminin)之培養皿中的無血清培養基培養懸浮液介於約4至6次之間的傳代並且在低氧氣濃度之下，在無血清培養基接續培養懸浮液另外介於約3至6次之間的傳代，其中細胞以40％至90％之間的匯合傳代，並在每次傳代時用酵素處理以解離細胞並加入新鮮培養基，從而製造非不凋亡的人類視網膜前驅細胞，其中不凋亡的人類視網膜前驅細胞表現選自由巢蛋白、Sox2、Ki-67、MHC Class I、MHC Class II、骨橋蛋白(OPN)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)及Fas/CD95所組成之群組中之一或多個標記，其中巢蛋白被群體中大於90%的細胞表現，其中Sox2被群體中大於80%的細胞表現，其中Ki-67被群體中大於30%的細胞表現，其中MHC Class I被群體中大於70%的細胞表現，其中Fas/CD95被群體中大於30%的細胞表現，其中MHC Class II被群體中小於2%的細胞表現，其中骨橋蛋白(OPN)以大於20 ng/106 cells/24 hours的量被群體中的細胞表現，以及其中當以細胞存在於不包含鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之載體內為基線時，bFGF以介於50至300 pg/106 cells/ hour之間的量被群體中的細胞表現。群體中的細胞可另外表現中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)(例如以介於約0.5至約2.5 ng/106 cells/24 hours之間的量)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived growth factor，PEDF)(例如以高達30 ng/106 cells/24 hours之量)、多效蛋白(pleiotrophin，PTN)(例如以介於約50至約600 pg/106 cells/24 hours之間的量)以及/或中期因子(midkine，MDK)(例如以高達約12 ng/106 cells/24 hours之量)。
在本文中所揭露的任何製劑、製造的產物或組合物中，懸浮液在低氧氣濃度之下的接續培養後，細胞被允許在標準氧氣濃度之下不傳代地成長一時間期間(例如介於約1小時至5天之間)。
舉例而言，適合的低氧氣濃度可包含0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣。
在一些實施例中，介於0.01 mg/ml至0.5 mg/ml之間的維他命C被包含在每1至2天更換的培養基中。
這些供使用的製劑、製造的產物或組合物可配製以用於注射於個體之玻璃體腔(vitreous cavity)或視網膜下空間(subretinal space)。
舉例而言，視網膜疾病與狀態可為色素病變(retinitis pigmentosa，RP)、萊伯氏先天性黑矇症(Leber’s congenital amaurosis，LCA)、斯特格氏病(Stargardt disease)、Usher's綜合症(Usher’s syndrome)、脈絡膜缺失症(choroideremia)、視桿-視錐或視錐-視桿失養症(rod-cone or cone-rod dystrophy)、纖毛病變(ciliopathy)、粒線體疾病(mitochondrial disorder)、漸進式視網膜萎縮症(progressive retinal atrophy)、視網膜退化病變(degenerative retinal disease)、老年性黃斑部病變(age related macular degeneration，AMD)、濕式AMD(wet AMD)、乾式AMD(dry AMD)、地圖狀萎縮(geographic atrophy)、家族性黃斑病變或後天性黃斑病變(familial or acquired maculopathy)、視網光感受器疾病( retinal photoreceptor disease)、視網膜色素上皮層疾病( retinal pigment epithelial-based disease)、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、黃斑囊樣水腫(cystoid macular edema)、葡萄膜炎(uveitis)、視網膜剝離(retinal detachment)、創傷性視網膜損傷(traumatic retinal injury)、醫源性視網膜損傷(iatrogenic retinal injury)、黃斑裂孔(macular holes)、黃斑毛細血管擴張症(macular telangiectasia)、神經節細胞疾病( ganglion cell disease)、視神經細胞疾病(optic nerve cell disease)、青光眼(glaucoma)、視神經病變(optic neuropathy)、缺血性視網膜疾病( ischemic retinal disease)、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity)、視網膜血管阻塞(retinal vascular occlusion)、家族性巨動脈瘤(familial macroaneurysm)、視網膜血管疾病(retinal vascular disease)、眼血管疾病(ocular vascular diseases)、血管疾病(vascular disease)或缺血性視神經病變(ischemic optic neuropathy)。
在一些實施例中，在製劑、製造的產物或組合物中的細胞更表現選自由波形蛋白(vimentin)、CD9、CD81、AQP4、CXCR4、CD15/LeX/SSEA1、GD2神經節苷脂(GD2 ganglioside)、CD133、β3-微管蛋白(β3-tubulin)、MAP2、GFAP、OPN/SPP1、PTN、KDR以及TEK所組成之群組中之一或多個標記。
亦提供藉由(a)機械地以及/或酵素地解離從介於12週至約28週之間的孕齡的人類取得之人類視網膜組織細胞樣本以產生細胞及細胞簇的解離懸浮液，其中細胞以及/或小細胞簇的收集樣本係使用胰蛋白酵素或均等物酵素地解離；(b) 在標準氧氣濃度之下，在培養瓶或塗佈有無異源纖連蛋白、鳥氨酸、聚賴氨酸或層黏連蛋白之培養皿中的無血清培養基培養該解離懸浮液介於約4至6次之間的傳代；以及(c)在低氧氣濃度之下，在無血清培養基接續培養該解離懸浮液另外介於約3至6次之間的傳代；其中細胞以40％至90％之間的匯合傳代，並在每次傳代時用酵素處理以解離細胞，且培養基約每1至2天更換；來製造含有非不凋亡的人類胎兒神經視網膜細胞(non-immortal human fetal neural retinal cells)的異質混合物之製劑、製造的產物或組合物的方法。
在一些實施例中，懸浮液在低氧氣濃度之下的接續培養後，細胞被允許在標準氧氣濃度之下不傳代地成長一時間期間(例如介於約1小時至5天之間)。
舉例而言，適合的低氧氣濃度可包含0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣。
在任何的這些方法中，介於0.01 mg/ml至0.5 mg/ml之間的維他命C被包含在每1至2天更換的培養基中。
細胞以及/或細胞簇被培養在基本培養基，選擇性地與幫助細胞存活或成長的補充物或添加劑一起培養。藉由非限制實例的方式，幫助細胞存活或成長的補充物或添加劑係選自由左旋麩醯胺酸(L-glutamine)、由EGF及bFGF(Invitrogen)組成的人工重組生長因子(human recombinant growth factors)與其他生長因子所組成之群組。在一些實施例中，培養基補充有具有約1.0 mg/ml的起始濃度之量的白蛋白或重組白蛋白。
細胞的樣本以病原體、細菌、內毒素、真菌、黴漿菌、病毒、肝炎病毒或HIV病毒的存在；正常核型(normal karyotype)的存在；生存能力(viability)；以及/或致腫瘤性(tumorigenicity)篩選。在一些實施例中，細胞的樣本額外地或替代性地不顯示升高的端粒酶活性(elevated telomerase activity)。
這些方法亦可包含步驟(a)依據細胞表面或基因標記選擇人類胎兒神經視網細胞(human fetal neural retinal cells)；以及/或步驟(b)依據人類胎兒神經視網膜細胞轉錄組譜(human fetal neural retinal cell transcriptome profile)、蛋白質體組譜(proteome profile)或基因組譜(genomic profile)選擇人類胎兒神經視網細胞。舉例而言，步驟(a)可額外地涉及在培養前(預期的)或在培養後之一或者兩者選擇細胞；細胞表面或基因標記包括CD15/LeX/SSEA1以及/或GD2神經節苷脂(GD2 ganglioside)；以及/或細胞表面或基因標記包括CD9、CD81、CD133或AQP4以及/或CXCR4。
額外地提供用來分離非不凋亡的人類視網膜前驅細胞的群體之方法，其涉及機械地以及/或酵素地解離來自在視網膜形成之後但在光感受器外段貫穿視網膜完全地形成之前並且在視網膜血管形成實質上完成或完成之前的階段之人類視網膜組織的樣本以產生細胞及細胞簇的解離懸浮液；在標準氧氣濃度之下，在培養瓶或塗佈有無異源纖連蛋白、鳥氨酸、聚賴氨酸或層黏連蛋白之培養皿中的無血清培養基培養該解離懸浮液介於約4至6次之間的傳代；以及在低氧氣濃度之下，在無血清培養基接續培養該解離懸浮液另外介於約3至6次之間的傳代，其中細胞以40％至90％之間的匯合傳代，並在每次傳代時用酵素處理以解離細胞，其中人類視網膜前驅細胞表現選自由巢蛋白、Sox2、Ki-67、MHC Class I、MHC Class II、骨橋蛋白(OPN)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)及Fas/CD95所組成之群組中之一或多個標記，其中巢蛋白被群體中大於90%的細胞表現，其中Sox2被群體中大於80%的細胞表現，其中Ki-67被群體中大於30%的細胞表現，其中MHC Class I被群體中大於70%的細胞表現，其中Fas/CD95被群體中大於30%的細胞表現，其中MHC Class II被群體中小於2%的細胞表現，其中骨橋蛋白(OPN)以大於20 ng/106 cells/24 hours的量被群體中的細胞表現，以及其中當以細胞存在於不包含鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之載體內為基線時，bFGF以介於50至300 pg/106 cells/ hour之間的量被群體中的細胞表現。群體中的細胞可另外表現中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)(例如以介於約0.5至約2.5 ng/106 cells/24 hours之間的量)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived growth factor，PEDF)(例如以高達30 ng/106 cells/24 hours之量)、多效蛋白(pleiotrophin，PTN)(例如以介於約50至約600 pg/106 cells/24 hours之間的量)以及/或中期因子(midkine，MDK)(例如以高達約12 ng/106 cells/24 hours之量)。
在一些實施例中，懸浮液在低氧氣濃度之下的接續培養後，細胞被允許在標準氧氣濃度之下不傳代地成長一時間期間(例如介於約1小時至5天之間)。
舉例而言，適合的低氧氣濃度可包含0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣。
在任何的這些方法中，培養基每1至2天更換。
在任何的這些方法中，介於0.01 mg/ml至0.5 mg/ml之間的維他命C被包含在每1至2天更換的培養基中。
人類視網膜組織可從介於約12週至約28週之間的孕齡的人類胎兒視網膜取得。
在這些方法的一些實施例中，細胞被培養在無血清或減少血清細胞培養基。這培養基可額外地含有白蛋白。
群體內的細胞更表現選自由波形蛋白、CD9、CD81、AQP4、CXCR4、CD15/LeX/SSEA1、GD2神經節苷脂、CD133、β3-微管蛋白、MAP2、GFAP、OPN/SPP1、PTN、KDR以及TEK所組成之群組中之一或多個標記。
亦提供藉由給予有效劑量的供使用的製劑、製造的產物或組合物來治療、改善、預防或減緩病患(例如人類)的視網膜疾病或狀態的進程之方法，其中製劑、製造的產物或組合物包括含有非不凋亡的人類視網膜前驅細胞的細胞群體，其中製劑、製造的產物或組合物係由機械地以及/或酵素地消化從介於約12週至約28週之間的孕齡的人類取得之人類視網膜組織樣本以產生細胞及細胞簇的解離懸浮液；以及在標準氧氣濃度之下，在培養瓶或塗佈有無異源纖連蛋白、鳥氨酸、聚賴氨酸或層黏連蛋白之培養皿中的無血清培養基培養該解離懸浮液介於約4至6次之間的傳代；以及在低氧氣濃度之下，在無血清培養基接續培養該解離懸浮液另外介於約3至6次之間的傳代，其中細胞以40％至90％之間的匯合傳代，並在每次傳代時用酵素處理以解離細胞並加入新鮮培養基，因此製造非不凋亡的人類視網膜前驅細胞，其中非不凋亡的人類視網膜前驅細胞表現選自由巢蛋白、Sox2、Ki-67、MHC Class I、MHC Class II、骨橋蛋白(OPN)及Fas/CD95所組成之群組中之一或多個標記，其中巢蛋白被群體中大於90%的細胞表現，其中Sox2被群體中大於80%的細胞表現，其中Ki-67被群體中大於30%的細胞表現，其中MHC Class I被群體中大於70%的細胞表現，其中Fas/CD95被群體中大於30%的細胞表現，其中MHC Class II被群體中小於2%的細胞表現，其中骨橋蛋白(OPN)以大於20 ng/106 cells/24 hours的量被群體中的細胞表現，以及其中當以細胞存在於不包含鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之載體內為基線時，bFGF以介於50至300 pg/106 cells/ hour之間的量被群體中的細胞表現。群體中的細胞可另外表現中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)(例如以介於約0.5至約2.5 ng/106 cells/24 hours之間的量)、色素上皮衍生因子(PEDF)(例如以高達30 ng/106 cells/24 hours之量)、多效蛋白(PTN)(例如以介於約50至約600 pg/106 cells/24 hours之間的量)以及/或中期因子(MDK)(例如以高達約12 ng/106 cells/24 hours之量)。
在一些實施例中，懸浮液在低氧氣濃度之下的接續培養後，細胞被允許在標準氧氣濃度之下不傳代地成長一時間期間(例如介於約1小時至5天之間)。
舉例而言，適合的低氧氣濃度可包含0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣。
在任何的這些方法中，介於0.01 mg/ml至0.5 mg/ml之間的維他命C被包含在每1至2天更換的培養基中。
製劑、製造的產物或組合物被注射於病患的玻璃體腔或視網膜下空間。在一些實施例中，製劑、製造的產物或組合物被注射於玻璃體腔的前區(anterior region)以及/或玻璃體腔的後區(posterior region)。
視網膜疾病或狀態可包含視網膜色素病變(RP)、萊伯氏先天性黑矇症(LCA)、斯特格氏病、Usher's 病、脈絡膜缺失症、視桿-視錐或視錐-視桿失養症、纖毛病變、粒線體疾病、漸進式視網膜萎縮症、視網膜退化病變、老年性黃斑部病變(AMD)、濕式AMD、乾式AMD、地圖狀萎縮、家族性黃斑病變或後天性黃斑病變、視網光感受器疾病、視網膜色素上皮層疾病、糖尿病視網膜病變、黃斑囊樣水腫、葡萄膜炎、視網膜剝離、創傷性視網膜損傷、醫源性視網膜損傷、黃斑裂孔、黃斑毛細血管擴張症、神經節細胞疾病、視神經細胞疾病、青光眼、視神經病變、缺血性視網膜疾病、早產兒視網膜病變、視網膜血管阻塞、家族性巨動脈瘤、視網膜血管疾病、眼血管疾病、血管疾病或缺血性視神經病變。
藉由非限制實例的方式，有效量為介於0.3至0.5x106 cells之間或介於0.5至3x106 cells之間。
這些方法亦可涉及玻璃體切除手術(surgical vitrectomy)、核心玻璃體切除術(core vitrectomy)、玻璃體溶解物質(vitreolytic agent) 或其結合的使用與有效劑量的供使用的製劑、製造的產物或組合物給予一起之組合。
在任何的這些方法中，病患可受到供使用的製劑、製造的產物或組合物的至少一個後續劑量施予於病人的同一隻眼睛或另一隻眼睛。
憑藉在此描述的任何方法，明視(日光)視力、視力敏銳度、黃斑功能、視野、暗視(夜間)視力或其任意結合在給予病患供使用的製劑、製造的產物或組合物之後改善。
供使用的製劑、製造的產物或組合物的給予亦可導致一或多個下列結果：(i)增強米勒細胞的活化；(ii)增加麩醯胺酸合成酶的局部表現；(iii) 減少血管通透性；(iv)減少缺血的發生；(v)增強視網膜退化中之巨噬細胞的募集；(vi)增加視網膜退化中之bFGF的局部表現；(vii)降低半胱天冬酶33的表現。
本文中所述之任何態樣及實施例可如同在本發明的總結圖式以及/或說明書，包括本發明的以下具體的、非限制的實例/實施例中揭露般地與任何其他態樣或實施例作結合。
除另有定義，本文中所使用之所有技術的及科學的用語具有與被本申請案所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解之相同意義。在說明書中，除非內文另有清楚指示，否則單數形式亦包含複數。
雖然相似於或均等於本文中所描述之方法及材料可被用於實現及測試本申請案，但是以下描述適合的方法及材料。為了所有的目的，所有公開物、專利申請案、專利以及本文所提及之其他參考物因此明確地藉由參照併入。
本文所引用的參考物不被承認其對於所請求的申請案而言為先前技術。在不一致的情況之下，以包含定義的本說明書為準。此外，材料、方法與實例僅為例示性並非意指為限制。
說明書全文中所描述之特徵、結構或特色可以任何適合的方式結合於一或多個實施例中。舉例而言，本說明書全文中片語「例示性實施例(exemplary embodiments)」、「實例實施例(example embodiments)」、「一些實施例(some embodiments)」或其他相同語言的使用意指結合實施例描述之特定的特徵、結構或特色可被包含在本文中所述的至少一個實施例中的事實。於是，本說明書全文中片語「例示性實施例(exemplary embodiments)」、「實例實施例(example embodiments)」、「在一些實施例(in some embodiments)」、「在其他實施例(in other embodiments)」或其他相同語言的出現不必然全部意指相同的實施例群組，並且所描述之特徵、結構或特色可以任何適合的方式結合於一或多個實施例中。
本申請案之其他特徵與優點將從結合實例的下列詳細的描述變得顯而易見。
定義
為了有助於本揭露之理解，以下定義一些術語。本文中的術語被用來描述本文中所描述之標的之具體實施例。但是除了在申請專利範圍中列出的之外，他們的用法不限定標的。
本揭露中，「包括(comprises)」、「包括(comprising)」、「含有(containing)」、「具有(having)」以及其類似物可具有美國專利法賦予它們的意義並且可意謂「包含(includes)」、「包含(包含)」以及其類似物。用語「實質上由...組成(consisting essentially of)」或「實質上組成(consists essentially)」同樣的具有美國專利法賦予它們的意義，並且這些術語為開放式，只要所載之基本的或新穎的特徵不被超出所載的部分之存在所改變，則允許超出所載的部分的存在，但是排除先前技術的實施例。
除非具體陳述或從內文明顯得知，當用於本文中時，用語「一(a)」、「一(an)」以及「該(the)」被理解為單數或複數。
除非具體陳述或從內文明顯得知，當用於本文中時，用語「或(或)」被理解為包含的(inclusive)。
當用於本文其他上下文中時，除非另有指示，用語「約(about)」意指所載數值，例如量、劑量、溫度、時間、百分比等的+/- 10%、+/- 9%、+/- 8%、+/- 7%、+/- 6%、+/- 5%、+/- 4%、+/- 3%、+/- 2%或+/- 1%。
在替代性實施例中，當用於本文中時，用語「病人(patient)」或「個體(subject)」以及類似物在本文中被互換地使用以指代任何哺乳類動物，包含人類、馴養的及農場動物與動物園、運動及寵物動物，例如狗、馬、貓與農業使用的動物，包含牛、綿羊、豬及山羊。較佳的哺乳類動物為人類，包含成人、孩童及年長者。個體亦可為寵物動物，包含狗、貓及馬。較佳的農業動物為牛及山羊。
在替代性實施例中，用語「治療(treat)」、「治療(treating)」、「治療(treatment)」以及類似物當用於本文中時，除非另有指示，意指治癒、反轉、減弱、緩和、使減至最小、抑制其過程、壓抑、暫停以及/或預防該用語應用的疾病、異常或狀態或者此些疾病、異常或狀態的一或多個(例如不必然為全部)症狀，且包括給予本文中所描述之任何組合物、藥物組合物或劑量形式以避免疾病、狀態或異常的病症或併發症的發病時間、緩和病症或併發症、減弱疾病、狀態或異常的進程以及/或消除疾病、狀態或異常。較佳地，治療為有療效的或改良的。
在替代性實施例中，當用於本文中時，「預防(preventing)」或「防止(prophylaxis)」意謂整體或部分地預防或改良或控制或減少或暫停例如疾病、異常或狀態的待預防之物或事件的發生。
在替代性實施例中，片語「治療有效量(therapeutically effective amount)」、「有效量(effective amount)」以及類似物，當用於本文中時，指給予病人或病人的細胞、組織或器官以達到治療效果，例如改善或替代性的療效的必需量。有效量係足以引出研究員、獸醫、醫生或臨床醫師所尋求之細胞、組織、系統、動物或人類之生物的或醫療反應。適當的有效量或治療有效量之判定係所屬技術領域中具有通常知識者的常規水平。
在替代性實施例中，用語「給予(administering)」、「給予(administer)」、「給予(administration)」以及類似物，當用於本文中時，意指將治療劑給予有以此種試劑來治療之需要的個體之任何模式的轉移、釋放、導入或輸送。該模式包括，但不限於，眼內的(intraocular)、口服(oral)、外用的(topical)、靜脈內的(intravenous)、動脈內的(intraarterial)、腹腔內的(intraperitoneal)、肌肉內的(intramuscular)、真皮內的(intradermal)、鼻內的(intranasal)、皮下的(subcutaneous)給予。
在替代性實施例中，當用於本文中時，用語「純化的(purified)」、「濃縮的(enriched)」或類似物指示細胞或細胞群體從其正常組織環境中被移除並以相較於正常組織環境更高的濃度存在。於是，「純化的(purified)」或「濃縮的(enriched)」細胞群體可更包含除了視網膜前驅細胞之外的細胞類型並且可包含其他組織組分，且用語「純化的(purified)」或「濃縮的(enriched)」不必然指示僅前驅細胞存在或者排除其他類型的細胞存在。
在替代性實施例中，視網膜前驅細胞群體當用於本文中時可為至少5%的純度、至少10%的純度、至少15%的純度、至少20%的純度、至少25%的純度、至少30%的純度、至少35%的純度、至少40%的純度、至少45%的純度、至少50%的純度、至少55%的純度、至少60%的純度、至少65%的純度、至少70%的純度、至少75%的純度、至少80%的純度、至少85%的純度、至少90%的純度、至少95%的純度、至少96%的純度、至少97%的純度、至少98%的純度、至少99%的純度或在介於5%至99%的純度之間的任何增量(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)。
在替代性實施例中，「標記(marker)」意指可被觀察的或可被感測的任何分子。舉例而言，標記可包含，但不受限於，例如特定基因的轉錄之核酸、基因的多胜肽產物、非基因產物的多胜肽(non-gene product polypeptide)、醣蛋白、糖脂、醣脂類、脂類、脂蛋白或小分子(舉例而言，具有小於10,000 Daltons的分子量之分子)。在替代性實施例中，視網膜前驅細胞可通過可在細胞群體內的細胞表面(「細胞表面標記(cell surface marker)」)、在細胞群體內的細胞內部(即在細胞的細胞核或細胞質中)表現以及/或在RNA或蛋白質程度作為「基因(genetic)」標記表現的一或多個標記的存在而表徵。
在替代性實施例中，用語「表現(express)」以及「表現(expression)」當用於本文中時意指在宿主細胞內的核酸序列的轉錄以及/或轉譯。在宿主細胞中感興趣的所需產物/蛋白質之表達程度可依據存在於細胞內的對應的mRNA的量或如本實施例中選擇的序列編碼之感興趣的所需多胜肽/蛋白質的量來判定或「篩選(screened)」。舉例而言，從選擇的序列轉錄的mRNA可藉由北方點墨雜交法(Northern blot hybridization)、核糖核酸酶RNA保護法(ribonuclease RNA protection)、細胞RNA的原位雜交法(in situ hybridization to cellular RNA)、微陣列分析(microarray analysis)或反轉錄的聚合酶連鎖反應(reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)來定量或感測。選擇的序列編碼的蛋白質可藉由各種抗體檢測方法，例如利用ELISA、西方點墨法(Western blotting)、放射免疫分析(radioimmunoassays)、免疫沉澱法(immunoprecipitation)、對蛋白質的生物活性之分析、蛋白質的免疫染色(包含例如免疫組織化學染色法以及免疫細胞化學)、流式細胞儀或螢光激發細胞分選(FACS)分析或均相時差性螢光(HTRF)分析來感測或定量。
視網膜前驅細胞(RPCs)
在替代性實施例中，哺乳動物的視網膜前驅細胞的分離、表徵以及使用如在其全部內容於此併入作為參考之WO 2012/158910中所詳細描述的。
在脊椎動物的胚胎發展中，視網膜與視神經源自發展的腦部的延伸物，所以視網膜被視為是中樞神經系統(CNS)的一部分且為真正的腦部組織。視網膜係具有藉由突觸相互連接之神經的數個層之層狀結構。離玻璃體最接近至最遠的，即從最接近頭的前側外部朝向頭部的內部與後側，視網膜層包含包括米勒細胞足板之內限制膜、包含神經節細胞核軸突之神經纖維層、包含其軸突變成視神經纖維的神經節細胞核之神經節細胞層、含有在雙極細胞軸突與神經節及無長突神經細胞之樹突之間的突觸之內叢層、含有雙極細胞的核及周圍細胞體(核周體)之內核層、含有分別以桿狀小球和錐形椎弓根結束之桿狀和錐狀突起之外叢狀層、含有桿狀及錐狀細胞體之外核層、自其細胞核分離光感受器的內節部分的外限制膜、光感受器層、以及為單層立方細胞的視網膜色素上皮層(RPE)。直接感光的神經元為光感受器細胞，其主要包括兩種類型：桿狀及錐狀。桿狀主要在昏暗光線下作用並提供黑-白視力，而錐狀供應白天視力與對顏色的感知。第三種類型的光感受器為光敏感的前驅細胞，其對於明亮的日光之反射反應為重要的。
供體胎兒視網膜細胞(Donor fetal retinal cells)(例如本文中所述之視網膜前驅細胞)可對宿主視網膜，特別是包含宿主錐狀細胞提供營養影響。這種營養作用不僅具有神經保護作用，而且通過改善的視覺功能判定其對殘留的宿主視網膜細胞還具有快速的再生作用。經由細胞分化，供體細胞能够整合於視網膜內並取代光感受器(其可为有限的數量)。整体的影響為以臨床上顯著的程度快速及持續地修復並保留視網膜的視覺功能，而若不快速及持續地修復並保留則視網膜的視覺功能將注定完全失敗而讓病人完全失明。於是，本文中所描述之任何的組合物及方法可被用來以臨床上顯著的程度快速及持續地修復並保留例如人類的哺乳類動物之視網膜的視覺功能。舉例而言，本文中所描述之任何的組成物及方法可提供臨床上顯著的營養影響給患病的視網膜或者提供再生影響給黃斑以及/或暗視視覺功能。
本文中所描述之組合物與群組的細胞是密切相關的細胞群，而不是孤立的單細胞類型。
雖然這些細胞本身不是幹細胞(因為它們不符合真正幹細胞的定義)，它們是不成熟的以及/或可塑的(plastic)。然而，這些細胞不能(在缺少額外的操縱下)產生胚層以及/或不能(在缺少額外的操縱下)產生所有的三個胚層。
此外，這些細胞被預先指定來製造視網膜組織或者細胞。因而，這些細胞可表現前驅細胞標記與視網膜標記。
視網膜前驅細胞不是分化多能的(pluripotent)並可顯出為多能的(multipotent)。然而，因為細胞從未以分化多能的狀態培養，所以它們是較安全的。然而，在一些實施例中，哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞可從分化多能細胞株人工分化。它們選擇性地不含有其餘的分化多能細胞類型之群體。
本文中所描述之細胞為有別於神經前驅細胞以及/或神經幹細胞(NSCs)之視網膜前驅細胞(RPCs)。具體而言，此種哺乳動物胎兒視網膜或RPC細胞是多能的但並不等同於NSCs。舉例而言，哺乳動物胎兒視網膜或RPC細胞不是來自腦部，而是來自視網膜。此外，哺乳動物胎兒視網膜或RPC細胞產生光感受器而自腦衍生的前驅細胞劣於產生光感受器。同樣地，不像NSCs，哺乳動物胎兒視網膜或RPC細胞是多能的(在缺少額外的操縱下)但不產生少突膠質細胞(oligodendrocytes)。舉例而言，哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞產生(分化成)包含光感受器的視網膜細胞而不是少突膠質細胞。
哺乳動物胎兒視網膜或RPC細胞係取得(或可取得)自哺乳動物胎兒神經視網膜，而非取得(或可取得)自睫狀緣、睫狀體上皮或REP。此外，哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞不是源自分化的米勒膠質、不是有絲***後前驅物本身、不是幹細胞本身以及/或不是經單一的分離細胞類型本身。
哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞未在早期胚胎(例如囊胚)中發現。此外，未在正常成熟的哺乳動物(例如人類)中發現任何有用豐度的(Useful abundance)哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞。
此外，於微生物的生命中視網膜前驅細胞不會持續存留。然而，這些哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞以其自然豐度(native abundance)於發展的(胎兒)哺乳動物(例如人類)視網膜中發現。
雖然，當在细胞增殖情形下生長時，哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC大部分是有絲***的，少數有絲***後細胞的混合物亦可被包含在本文中所述之任何的組合物與群體中。
哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞在例如人類的不相關之哺乳動物中作為眼同種異體移植物(ocular allografts)而免疫耐受。因而，當放置在眼睛時，RPCs具有低免疫活性。藉由非限制性實例之方式，這些哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞可被移植至玻璃體腔或在視網膜下空間，以用於哺乳動物的或人類的視覺或視網膜疾病治療以及/或預防性治療。
較佳地，哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞不伴隨腫瘤形成或其它不想要的細胞增生的任何風險(或無實質上的風險)。
在替代性實施例中，哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞以球狀或貼附的單層、或者以球狀然後單層以及/或以球狀與單層的結合物來被培養。然而，球狀不是必需的，而且在一些實施例中，細胞以解離的細胞而非球狀或以解離的細胞與球狀之混合物移植。哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞含有在玻璃體內聚結並選擇性可變成球狀之移植細胞。
在替代性實施例中，視網膜前驅細胞與含有其之細胞群體不是不凋亡的且也不允許它們不凋亡或者被迫不凋亡。雖然細胞不無限地增生，本文中所述之示例性細胞培養方法可改善增生速率與期間以及/或可顯著地改善供體細胞產量以用於給定組織的捐贈(given tissue donation)。
RPCs可為非基因改造的細胞或它們可使用所屬技術領域中任何方法基因改造 (例如穩定地、瞬間地或誘導的轉型)。舉例而言，視網膜前驅細胞可被基因改造以表現一或多個感興趣的異源或外源核酸序列。核酸序列可為「外源的(exogenous)」意指對導入載體的細胞而言它是外來的，或者序列對細胞內的序列而言為同源的，但在該序列所在之宿主細胞核酸內的位置通常沒被發現。在替代性實施例中，核酸序列包含質體、擴增子、cDNA、mRNA、反義RNA、siRNA，但不受限於這些實例。用語「基因(gene)」意指功能性蛋白質、多胜肽或胜肽編碼核酸單位。如將被所屬技術領域中具有通常知識者所理解的，此功能性用語包括表現或可被改編以表現蛋白質、多胜肽、域、胜肽、融和蛋白與突變體之基因序列、cDNA序列與較小的工程基因序列。
可用所屬技術領域中所習知的任何方法學基因地改變細胞。一個示例性的方法為以重組病毒載體將基因***至組織的細胞中。可使用所屬技術領域中所知之很多不同的載體中之任一種，諸如病毒載體、質體載體、線型DNA等，來導入編碼治療試劑之外源的核酸片段至標靶細胞以及/或組織。舉例而言，這些載體可使用任何的感染、轉導、轉染、磷酸鈣介導轉染、DEAE-葡聚糖介導轉染、電穿孔、脂質體介導轉染、生物粒子基因遞送(biolistic gene delivery)、使用融合且陰離子脂質體之脂質體基因傳送(此為使用陽離子脂質體的替代方案)、直接注射、受體介導攝取、磁穿孔、超音波以及如所屬技術領域中所知之其他方法被***。
在替代性實施例中，如本文所使用的，「載體(vector)」意指核酸序列可被***其中以用來導入其可被複製的細胞中之載體(carrier) 核酸分子。載體包含質體、黏接質體、 病毒(噬菌體、動物性病毒以及植物性病毒)與人工染色體(例如YACs)。所屬技術領域中具有通常知識者將很好地通過描述在Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences之標準重組技術構建載體。除了編碼修改多胜肽以外，載體可編碼諸如標籤或標靶分子之非修改的多胜肽。編碼該融合蛋白質的有用的載體包含pIN載體、編碼組胺酸的一股之載體以及pGEX載體，以用於產生用於後續的純化與分開或切割之谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase，GST)可溶融合蛋白質。
載體可被主要設計為用來導入異源核酸分子進入細胞，諸如「可操作地連接的(operably linked)」或者在一或多個控制序列的控制之下之基因。在替代性實施例中，「啟動子(promoter)」意指聚集在RNA聚合酶II以及其他轉錄活化蛋白質的起始位點周圍的一或多個轉錄控制模組。任何啟動子/促進子結合(按照真核啟動子資料庫EPDB)可用來驅動感興趣的核酸分子(即構成的、誘導的、可抑制的與組織特異性)之表現。再者，載體可含有可選擇的標記以幫助其在體外或離體的操作。載體亦可含有可從人類生長激素(hGH)基因、牛生長激素(BGH)基因或者SV40取得之多腺苷酸化訊號。此外，載體亦可含有用於生產多基因(multigene)或多順反子(polycistronic)信息之內部核糖體接合位點(internal ribosome binding sites，IRES)元件。IRES元件能夠繞過5-甲基化帽依賴型轉譯 (5-methylated cap-dependent translation)的核糖體掃描模型並且在內部位點開始轉譯(Pelletier, J. 與Sonenberg, N. (1988) Nature 334(6180): 320-325)。IRES元件可被連接於異源開放閱讀框。各被IRES元件分開之多個開放閱讀框可被一起轉錄，產生多順反子信息。藉由IRES元件的病毒，核糖體可讀取每一個開放閱讀框以有效的轉譯。多重基因可使用單一啟動子/促進子來轉錄單一訊息以有效地表現。
在一些實施例中，載體為病毒的載體。所屬技術領域中習知之病毒載體包含，但不限於腺病毒載體(adenoviral vectors)、反轉錄病毒載體(retroviral vectors)、牛痘病毒載體(vaccinia viral vectors)、腺相關病毒載體(adeno-associated viral vectors)、多瘤性病毒載體(polyoma viral vectors)、甲病毒載體(alphaviral vectors)、彈狀病毒載體(rhabdoviral vectors)、慢病毒載體(lentiviral vectors)、艾伯斯坦-巴爾病毒載體(Epstein-Barr viral vectors)、細小核糖核酸病毒載體(picornaviral vectors)或皰疹病毒載體(herpesviral vectors)。
在其他實施例中，核酸序列可被包埋在脂質體或脂質製劑內。脂質體是具有磷脂雙層膜與內部水介質之特徵的囊泡結構。多層脂質體具有被水介質分開的多個脂質層。當磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們自發性地形成。脂質組分在形成包埋水分與溶解的溶質的封閉結構之前在脂質雙層之間(Ghosh, P. C. 與Bachhawat, B. K. (1991) Targeted Diagn. Ther. 4: 87-103) 進行自我重排。商品上可獲得之脂質體或脂質製劑中之一個實例為Lipofectamine (Invitrogen)。其他包含FuGENE (Promega)、PromoFectin (PromoKine)、Affectene (Qiagen)、Polyfect (Qiagen)、Superfect (Qiagen)與TransMessenger (Qiagen)。
RPCs的分離與培養
亦提供用來製造、分離以及/使用例如人類視網膜前驅細胞(hRPCs)之胎兒視網膜細胞的解離懸浮液之方法。在各種實施例中，胎兒視網膜細胞的懸浮液不包含組織或支架。
細胞群體可從健康的個體(即，未含有視網膜疾病之單個個體)、從生病的個體收集並且不僅可包含新鮮的視網膜細胞群體還可包含冷凍的視網膜細胞群體。來源包含，但不限於，自胚胎、胎兒、兒童或成人的組織取得之全眼或視網膜組織或其他來源。本文中所描述之方法可更包含藉由對其他視網膜前驅細胞專一性標記的正相選擇來細胞分離之濃縮或純化程序或步驟。視網膜前驅細胞與細胞群體可從任何哺乳動物物種或個體，例如人類、靈長類動物、馬、牛、豬、犬科、貓科、雪貂、兔、嚙齒動物，例如大鼠、小鼠及倉鼠等取得或收集。
在一些實施例中，細胞在視網膜形成之後，但在光感受器外段(photoreceptor outer segments)貫穿視網膜完全地形成之前並且在視網膜血管形成完成或實質上完成之前的階段從哺乳動物胎兒視網膜收集。在人類的胎兒中，該階段通常介於約12週至約18週的胎兒孕齡之間(例如約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28週)。對於來自較大的哺乳動物之非人類細胞，諸如貓科或豬的視網膜前驅細胞，該階段通常介於約3週至約11週的胎兒孕齡之間(例如約3、4、5、6、7、8、9、10或11週)。舉例而言，參見Anand-Apte, B.與Hollyfield, J. G. "Developmental Anatomy of the Retinal and Choroidal Vasculature." In The Retina and Its Disorders, Besharse, J.與 Bok, D., Academic Press, (2001)。然而，細胞亦可從產後或新生兒的哺乳動物組織收集。
在組織樣本的處理之後或同時，視網膜前驅細胞可從其他組織組分純化。舉例而言，前驅細胞可在組織樣本已在適合細胞生長的條件下培養一段足夠讓細胞去貼附培養皿的時間之後，從其他細胞與組織組分純化。在一些實施例中，細胞的純化涉及在培養期間取得從組織樣本遷移且出現在培養基或者鬆散地貼附在纖連蛋白或其他基材或者滋養層細胞層(feeder cell layer)之細胞。這些細胞可藉由常規方法取得，諸如：移除與離心培養基以沉澱其中的細胞，以及以諸如磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)或亨克斯平衡鹽溶液(Hanks Balanced Salt Solution)之溶液清洗殘留在培養皿的細胞以移除如貼壁細胞層鬆散地黏貼之該些細胞。這個清洗溶液也可接著離心以取得細胞。視網膜前驅細胞與細胞群體的純化可進一步涉及從一些不溶之組織組分，包含諸如脂質的殘留組織物質分離細胞。細胞可藉由所屬技術領域中習知與可獲得之任何方法，從其他組織組分中分離，前述之方法包含例如使用密度梯度、離心、藉由流式細胞儀或磁性細胞分離(magnetic cell separation，MACS)分揀以及過濾或其結合。純化細胞的特定方法之實例在領域中為習知且載於，例如：在美國專利案No. 6,777,231。 也可用負分離方法(Negative separation methods)來移除一或多個特定類型的細胞。
組織液可被處理或「解離 (dissociated)」。解離可藉由物理解離以及/或藉由曝露於有助使細胞從其他組織組分釋出以產生細胞以及/或細胞簇之「解離的懸浮液(dissociated suspension)」之酵素製品中來進行。該酵素的實例包含，但不限於，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases)、梭菌蛋白酶(clostripain)、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、類胰蛋白酶、胃蛋白酶、類胃蛋白酶、中性蛋白酶以及膠原酶(collagenases)。適合的蛋白水解酶描述在美國專利案No. 5,079,160、6,589,728、5,422,261、5,424,208以及5,322,790中。舉例而言，酶製品可僅包含胰蛋白酶或者結合一或多個其它的酶。酶促解離可與藉由例如切碎(mincing)、吸液(pipetting)、剁碎(chopping)、均質化(homogenizing)、磨碎(grinding)、凍融(freeze-thawing)、滲透性震盪(osmotically shocking)之物理解離結合執行以移除不想要的細胞或連接的組織而最終造就單一細胞簇或可包含可藉由尺寸例如「小(small)」、「中(medium)」以及「大(large)」來定義的之細胞簇。細胞簇尺寸是主觀的且在實施本文所揭露之標的中可所有變動。
亦提供用來分離與表徵(characterization of)從供體組織收集、在培養中生長、且配製以用於給予個體或病人的哺乳動物視網膜前驅細胞及包含此種細胞之組合物的方法。
例如本文中所描述的，哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞定量地表現不同的基因譜(gene profiles)；或者它們定量地表現不同的可溶性因子譜(soluble factor profiles)；或者它們定量地表現不同的表面標記譜(surface marker profiles)。而且哺乳動物胎兒視網膜細胞或RPC細胞具有之不固定的、不變的或不可變的基因譜。相反地，他們具有在培養中隨著時間定量地動態改變的基因譜。
本文所揭露之標的係有關於含有根據定義的細胞培養方法所分離的並且表現特徵標記之哺乳動物視網膜前驅細胞之細胞群體。細胞群體可為從哺乳動物分離並且在體外生長之細胞培養。舉例而言，培養可包括培養在培養盤、培養皿、培養瓶或生物反應器中的細胞懸浮液或者貼壁細胞。樣本可為均質的或異質的，其可藉由如本文所定義之一或多個標記的表現來判定。本文所揭露之細胞群體為混合的細胞群體並且可含有未分化以及分化的細胞之混合物。本文所定義之視網膜前驅細胞的標記特徵之相對表現量(Relative expression levels)可在群體中的細胞之間變動。
視網膜前驅細胞可藉由它們分子標記的表現而表徵，包含細胞表面的標記與非表面的(基因的(genetic))標記。然而，在先前技術中常見的是，對於特定的標記將細胞稱為「陽性(positive)」或「陰性(negative)」，真正的表現量係定量地判定的。在細胞表面(或位在其他地方)上的分子數目可相差幾個對數地變動，仍被表徵為「陽性(positive)」。亦被所屬技術領域中具有通常知識者所理解的是，對染色為陰性，即標記專一性試劑的結合量與例如同型匹配控制組(isotype matched control)之控制組無可測得之差異之細胞可表現微量的標記。標識的「染色(staining)」量之表徵容許在細胞群體之間的細微差異。細胞的染色強度可藉由流式細胞儀來監控，其雷射感測螢光染料(正比於被例如抗體的專一性試劑所結合的細胞表面的標記之量)的量化濃度。流式細胞儀或FACS亦可用以依照結合於專一試劑的強度以及諸如細胞尺寸與光線散射之其他參數，來分開細胞群體。雖然染色的絕對量可隨特定的螢光染色劑與試劑製品而不同，但數據可以控制組來標準化。
為了以控制組來標準化分佈，每一個細胞被記錄成具有特定的染色強度之數據點(data point)。這些數據點可根據對數規模顯示，測量的單位為任意的染色強度。藉由實例的方式，樣本中最亮的染色細胞的強度可較未染色的細胞強不下於4個對數。當以此方式表示時，落在染色強度的最高對數的細胞為明亮的，而那些在最低強度的細胞為陰性的。低的(low)陽性的染色細胞具有高於同型匹配控制組的亮度之染色量但是不如正常在群體中發現的最明亮的染色的細胞一樣強。低陽性的細胞可具有異於樣本中陰性與明亮的染色陽性細胞的獨特特性。替代性控制組可利用具有定義的標記密度在其表面之基質，舉例而言，建造的珠或細胞株，提供強度的陽性的控制組。
在從其中衍生出視網膜前驅細胞與細胞群體的視網膜組織之培養的期間，標記的表現可受到改變。舉例而言，標記表現之差異可受諸如氧氣濃度(即，大氣的氧氣條件或含氧量正常的(normoxic)條件或者低氧氣條件，也就是所知的缺氧(hypoxic)條件)的培養的條件之影響。藉由非限制實例之方式，低氧氣條件可包含0.5%-10%氧氣(即，0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10%)。所屬技術領域中具有通常知識者將知道的是，視網膜前驅細胞與細胞群體的標記表現不是靜態的並可隨著一或多個培養條件(即培養基、氧氣濃度、傳代次數(number of passages)及培養時間等)的作用而改變。
視網膜前驅細胞與細胞群體可表現一或多個、二或多個、三或多個、四或多個、五或多個、六或多個、七或多個、八或多個、九或多個、十或多個、十一或多個、十二或多個、十三或多個、十五或多個、十六或多個、十七或多個、十八或多個、十九或多個、二十或多個、二十五或多個、三十或多個本文中所定義的標記或者介於高達五十或多個標記之間的任何增量。
藉由非限制的實例之方式，視網膜前驅細胞與含有視網膜前驅細胞之細胞群體可藉由諸如巢蛋白(nestin)、波形蛋白(vimentin)、Sox2、Ki-67、MHC Class I、Fas/CD95、MAP2、CD9、CD81、AQP4、CXCR4、CD15/LeX/SSEA1、GD2神經節苷脂、CD133、b3-微管蛋白、GFAP、OPN/SPP1、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、PTN、KDR以及/或TEK之一或多個標記的表現來表徵(characterized)或篩選。在一些實施例中，視網膜前驅細胞與細胞群體表現選自由巢蛋白、Sox2、Ki-67、MHC Class I及Fas/CD95所組成之群組中之一或多個標記，其中巢蛋白被群體中大於90%或者95-99%(即95、96、97、98或99%)的細胞表現，其中Sox2被群體中大於80%或者90-99%(即90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%)的細胞表現，其中Ki-67被群體中大於30%或者40-60%(即40、41、42、43、44、45、46、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60%)的細胞表現((即60-85%)即60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85%的細胞在含氧量正常的/大氣的氧氣條件之下生長，80-90%(即80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90%)的細胞在缺氧條件之下生長，其中MHC Class I被群體中大於70%或者90%的細胞表現，其中骨橋蛋白(osteopontin, OPN)以大於20 ng/106 cells/24 hours的量被群體中的細胞表現，其中當以細胞存在於不包含bFGF之載體內為基線時，鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)以約50至300 pg/106 cells/ hour(即50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295或300 pg/106 cells/ hour)的量被群體中的細胞表現，以及/或其中Fas/CD95被群體中大於30%或者40-70%(即40、41、42、43、44、45、46、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%)的細胞表現。群體中細胞可另外地表現中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)(例如介於約0.5至約2.5 ng/106 cells/24 hours之間的量(即0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5 ng/106 cells/24 hours)、色素上皮衍生因子(PEDF) (例如高達30 ng/106 cells/24 hours之量)(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30 ng/106 cells/24 hours)、多效蛋白(pleiotrophin, PTN)(例如介於50至600 pg/106 cells/24 hours之間的量)(例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595或600 pg/106 cells/24 hours)以及/或中期因子(MDK)(例如高達12 ng/106 cells/24 hours之量)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12 ng/106 cells/24 hours)。
視網膜前驅細胞與細胞群體可另外地(或替代性地)更表現選自由波形蛋白、CD9、CD81、AQP4、CXCR4、CD15/LeX/SSEA1、GD2神經節苷脂、CD133、b3-微管蛋白、MAP2、GFAP、OPN/SPP1、PTN、KDR以及/或TEK所組成之群組中之一或多個標記。GFAP可由5-10%群體中的細胞表現。在一些實施例中，有關於同種異體產物(allogenic product)之免疫耐受性的MHC Class II可被群體中1-3%(即1、2或3%)或者小於2%的細胞表現。CXCR4可由在大氣的氧氣條件之下生長的5-30%(即5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30%)的細胞表現，但是由在缺氧條件之下生長的 90%的細胞表現。CD15可由4-35%(即4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35%)群體中的細胞表現，即在大氣的氧氣條件之下生長的4-8%(即4、5、6、7或8%)的細胞表現，在缺氧條件之下生長的由15-35% (即15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35%)的細胞表現。GD2可由2-15%(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15%)群體中的細胞表現，即在大氣的氧氣條件之下生長的2-4%(即2、3或4%)的細胞表現，在缺氧條件之下生長的15%的細胞表現。
骨橋蛋白(OPN)為本文中所描述之細胞與細胞群體的候選潛力標記(candidate potency marker)。ELISA結果已證實OPN以＞20ng/106 cells/24 hours的量被本文中所描述之細胞與細胞群體所表現。
在替代性實施例中，視網膜前驅細胞與細胞群體以ABCA4、AIPL1、AKT3、APC2、BSN、CCNG2CDHR1、CRX、CD24、密連蛋白11、CNTF、CNTFR、DACH1、DAPL1、DCX、DLG2與4、DLL4、EPHA7、EYS、FLT1、FSTL5、FZD5、FGF9、10與14、GADD45G、GRIA2、HES5與6、HEY2、HEYL、HGF、HIF3A、IMPG1與2、JAK2與3、KLF4、MAP6、髓鞘鹼性蛋白(myelin basic protein, MBP)、MYCN、Nanog、NBL1、NEFL、NEFM、NEUROD1、NEUROD4、NEUROG1、NEUROG2、NOTCH 1、2與3、NRL、NRCAM、NRSN、NRXN1、2與3、OCT4、OLIG2、OPN1MW1與2、OPN1SW、OTX2、PAR4、PAX6、PRPH2、RAX1與2、RBP3、RCVRN、RELN、RGR、視紫紅質(rhodopsin)、RICTOR、RP1、RRH、RXRG、SIX3與6、SOX 8、SLC25A27、STAT1、STAT3、SYP、SYT4、WIF1、VSX2以及/或VSX1與2中之一或多個的低、微量、陰性或降低的表現進行表徵或篩選。這些標記的表現圖案可被用來區別例如新鮮的分離的視網膜組織之來源組織與視網膜前驅細胞或細胞群體。
表現可相對於來源組織增加之其他標記包含，但不限於，ADM、ANGPT1、ANGPTL2與4、ATP5D、BHLHE40、CCL2、CCNB1、CCND2與CCNDE1、CD44、CDKN2A、密連蛋白1、4與6、CPA4、CTGF、CXCL12、DKK2、EMP1、FOXC2、FZD6、GADD45B、HES1、HIF1A、HOXB4、IGF1、IGFBP3、5與7、IL1A、IL1R、IL1RAP、IL4R、IL7R、IL11、IL18、JAG1、LIF、LOX、BDNF、EGF、EGFR、FGF1、2、5與9、KLF4、5與12、MITF、MMP1、MYC、NCAN、NEFH、NOG、NTF3、NTRK2、NRP1與2、OSMR(IL31RA)、OTX1、PAX8、PDGFA、B與C、PLAU、PRRX1、RPE65、SDF-1、SFRP1與4、SIX1與4、SLC25A1、19與20、TEK/TIE1、THBS1與2、TLR4、VEGFA、VEGFC WNT5A以及/或WNT7B。
視網膜前驅細胞與細胞群體與其他像腦部前驅細胞與神經幹細胞之中樞神經系統前驅細胞類型以及可自例如腦部及脊髓之胎兒CNS組織衍生的其他細胞不同。可相對於其他CNS前驅細胞增加之標記包含，但不限於ARR3 (arrestin C)、CDF10、CDKN2A、CTGF、CXCL12/SDF1、BHLHE41、BMP2、DKK1、EGFR、EPHB2、FN1、FOSL1與2、FOXD1、GABBR1、GAS1與6、GBX2、HHEX、HOXB2、IGFBPS與7、INHBA、JAG1、KDR、KLF10LHX9、LHX2、LIF、MET、NEUROD1、NTF3、NTRK2、OPTN (optineurin)、RCVRN、SAG (S-arrestin)、SERPINF1(PEDF)、SFRP1、SOX3、TBX3、TGFB、WIF、WNT5A以及/或WNT5B。可相對於其他CNS前驅細胞減少之標記包含，但不限於AQP4、ASLL1、CLDN11、CDKN1B、CCL2、CCNG2、CXCR4 (SDF1 受體)、DCX、DLX2與5、EMX2、EPHA3、4與7、FABP7、FOXG1、GRIA1、2與3、HGF、IL2、KLF4、LIFR、MNX1、NGF、NKX2-2、NOTCH1、NPY、NPY2R、OLIG2、OMG、PBX1、PDGFRA、RTN1、SCGN、SOX11、TFAP2B、TNFRSF21以及/或WNT7A。
為了避免改變細胞，可在沒有抗生素的情況下培養供體細胞。而且，在沒有抗生素的情況下，因為可排除隱藏的微生物污染而可能使用非常低傳代(passage)的細胞。較佳地，使用低傳代的細胞對轉型(transformation)以及/或形成腫瘤具有低風險。此外，使用低傳代的細胞最接近存在於成長中的視網膜之自然細胞。
任何適合的基本培養基可用於RPCs的生長與培養。細胞培養描述細胞生長在控制的條件下之過程，一般在其自然環境之外。細胞群體可在領域中習知之任何細胞培養基中生長或培養。在替代性實施例中，用語「基本培養基(basal medium)」意指可支持細胞生長的任何培養基。基本培養基提供標準的無機鹽類，諸如鋅、鐵、鎂、鈣與鉀、維他命、葡萄糖、緩衝系統以及主要胺基酸。可用於本發明之基本培養基包含，但不限於，Minimum Essential Medium Eagle、ADC-1、LPM(無牛血清白蛋白)、F10 (Ham)、F12 (Ham)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ Medium(有與沒有Fitton-Jackson的修飾)、Basal Medium Eagle (BME—有添加Earle's salt base)、Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM—沒有血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow Modification Eagle Medium (GMEM)、Leibovitz L-15 Medium、McCoy's 5A Medium、Medium M199 (M199E—有Earle's sale base)、Medium M199 (M199H—有Hank's salt base)、Minimum Essential Medium Eagle (MEM-E—有Earle's salt base)、Minimum Essential Medium Eagle (MEM-H—有Hank's salt base)以及Minimum Essential Medium Eagle (MEM-NAA有非必要胺基酸)，許多其他培養基，包含medium 199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams' G、Neuman & Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153與Ultraculture。用於培養本文中所描述之視網膜前驅細胞的較佳培養基為Advanced DMEM/F12與Ultraculture。這些培養基中的一些被總結在Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture," pp. 62-72。
在替代性實施例中，「條件培養基(conditioned medium)」意指相較於基礎或基本培養基為有改變的培養基。舉例而言，培養基的條件可導致諸如營養物以及/或生長因子之分子相較於在基本培養基所發現的原本濃度增加或減小。培養基可藉由允許特定類型的細胞在特定條件下在培養基生長或維持持續一特定期間來調節。舉例而言，培養基可藉由允許視網膜前驅細胞擴增(expanded)、分化或維持在被定義組成的培養基在被定義的溫度下持續被定義的時數來被調節。如將被領域中具有通常知識者所領會的是，細胞、培養基類型、期間與環境的條件之數種結合可被用於產生幾乎無限陣列的條件培養基。
細胞培養補充物或添加劑之實例包含，但不限於，組成成分(ingredients)以部分或全部取代在支持細胞存活或生長中之血清的角色。舉例而言，補充物可包含胰島素、過度金屬蛋白質(transmetalloproteins)、微量元素、維他命或其他因子。這些因子一般未包含在基本培養基中但被一般用於培養細胞的血清所提供。補充物或添加劑可包含支持細胞生長的下列組分中之至少一或多個：一或多個胰島素或其取代物、一或多個過度金屬蛋白質或其取代物、一或多個微量元素(例如：硒、鐵、鋅、銅、鈷、鉻、碘、氟化物、鎂、鉬、釩、鎳、錫)、一或多個維他命(例如：維他命C、維他命E、維他命A、維他命B群)、一或多個鹽類(例如：鈉鹽、鎂鹽、鈣鹽或磷酸鹽)、一或多個緩衝液(例如：磷酸鹽緩衝生理鹽水、HEPES緩衝液)、一或多個胺基酸(例如：左旋麩醯胺酸)、一或多個激素(hormones)、類激素化合物或生長因子(諸如，例如：運鐵蛋白(transferrin)、EGF、NGF、ECGF、PDGF、FGF、IGF、LIF、白血球介素(interleukins)、干擾素(interferons)、TGF以及/或VEGF、升糖素(glucagon)、皮質類固醇(corticosteroids)、血管加壓素(vasopressin)或***素(prostaglandins))、血清白蛋白或其取代物、一或多個糖類(葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、核糖、糖酵解代謝物(glycolytic metabolites))、一或多個抗生素以及/或抗黴劑(例如盤尼西林、鏈黴素(streptomycin)、Fungizone)以及一或多個脂質(游離及結合蛋白質的脂肪酸(free and protein-bound fatty acids)、三酸甘油酯、磷脂質、膽固醇或乙醇胺)。諸如剔除血清替代物(KnockOut Serum Replacement, KOSR)、N2、B27、StemPro™、胰島素-運鐵蛋白-硒補充物(Insulin-Transferrin-Selenium Supplement, ITS)與G5之許多商品化血清取代添加劑對所屬技術領域中具有通常知識者而言為習知且容易獲得的。這些添加劑藉由被定義好的成分表徵，所以其組分濃度可依照其在培養基中的比例來判定。
藉由非限制實例之方式，細胞以及/或小細胞簇被培養在不含血清的培養基或含有血清的培養與抗生素及真菌劑(antifungals)或者無抗生素或真菌劑之無菌環境不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或者更多的傳代。細胞以及/或小細胞簇被培養在基本培養基中(例如Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12TM (DMEM/F12TM )培養基或ADVANCED DMEM/F12TM 培養基(Gibco-Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad Calif.))或者ULTRACULTURETM 培養基(BioWhittaker-Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, Md.)，選擇性地搭配N2補充物(Invitrogen)或B27或無異源(Xeno Free)B27 (Invitrogen)、左旋麩醯胺酸或GlutaMax™ (Invitrogen)以及包含例如EGF與bFGF (Invitrogen)之人類重組生長因子，或其他生長因子。舉例而言，用於人類細胞之DMEM/F12TM 培養基以及用於貓科或犬科細胞的ULTRACULTURETM 培養基。
在替代性實施例中，維他命C可被額外地(或替代地)包含在培養基中。舉例而言，可以介於約0.1 mg/ml至0.05 mg/ml之間、或介於約0.01 mg/ml至約0.5 mg/ml之間(例如：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、039、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5 mg/ml)被包含在培養基中，每1或2天更換。
培養基亦可選擇性地補充白蛋白或者人類或貓科或犬科的白蛋白、或者重組的白蛋白或白蛋白。藉由非限制實例之方式，白蛋白可以具有約1.0 mg/ml之起始濃度的量加入。
可在含有減少的或沒有血清之培養基中產生哺乳動物的視網膜前驅細胞的培養。血清的實例包含胎牛血清(fetal bovine serum)、小牛血清(calf serum)、新生牛血清(newborn calf serum)、山羊血清(goat serum)、馬血清(horse serum)、人類血清(human serum)、兔血清(rabbit serum)、大鼠血清(rat serum)、小鼠血清(mouse serum)等等。在特定培養條件下，血清濃度可在約0.05% v/v至約20% v/v的範圍內(例如：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、1、1.5、2、2.5、3、3.5、5、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20%)。舉例而言，在一些分化的過程中，培養基的血清濃度可小於約0.05% (v/v)、小於約0.1% (v/v)、小於約0.2% (v/v)、小於約0.3% (v/v)、小於約0.4% (v/v)、小於約0.5% (v/v)、小於約0.6% (v/v)、小於約0.7% (v/v)、小於約0.8% (v/v)、小於約0.9% (v/v)、小於約1% (v/v)、小於約2% (v/v)、小於約3% (v/v)、小於約4% (v/v)、小於約5% (v/v)、小於約6% (v/v)、小於約7% (v/v)、小於約8% (v/v)、小於約9% (v/v)、小於約10% (v/v)、小於約15% (v/v)或小於約20% (v/v)。在一些實施例中，視網膜前驅細胞與包含視網膜前驅細胞之細胞群體沒有血清(無血清，serum-free)、沒有血清取代物以及/或沒有任何補充物地生長。
在替代性實施例中，視網膜前驅細胞或包含視網膜前驅細胞之細胞群體在無異源(xeno-free)條件之下培養。「無異源(Xeno-free)」或「無精諾真(xenogen-free)」意指其中特定物種的細胞(例如：人類細胞)在僅有人類產物補充物(例如：人類血清白蛋白、人類血清)而無其他物種之產物的存在下生長或培養之條件。此對於用來移植(transplantation)到人類的細胞尤其重要。已經曝露於各種未被定義的動物衍生產物之細胞因為移植排斥、免疫反應、與病毒或細菌的感染、傳染性蛋白顆粒(prions)以及尚未被定義的人畜共通傳染病之風險增加而使得其在臨床應用上為不可取的。而且，為了包含人類的使用或非人類的哺乳動物(例如獸醫的使用)的使用之所有哺乳動物的使用，對細胞篩選正常核型或者透過例如黴漿菌、革蘭氏陰性菌(例如內毒素試驗)、菌類及其類似物之感染或污染的存在。亦可藉由端粒酶活性分析(telomerase activity assay)、hTERT基因表現篩選致腫瘤性或轉形為癌症表現型(cancerous phenotype)的細胞，並生長在軟瓊脂或在裸鼠的腫瘤形成處。該分析為先前技術中所習知的並且為所屬技術領域中具有通常知識者所熟練的。
視網膜前驅細胞或包含視網膜前驅細胞之細胞群體可被培養在滋養層細胞層(例如：胚胎的或成人的纖維母細胞)或者在細胞外基質支架或基質，諸如膠原蛋白、巢蛋白、硫肝蛋白糖(heparin sulfate proteoglycans)、纖維結合蛋白、層黏連蛋白、明膠(gelatin)或基底膜基質(Matrigel) 之存在下。舉例而言，PURECOL® 膠原蛋白以為所有膠原蛋白的純度(＞99.9%的膠原蛋白含量)、功能、並且可得的最像天然的膠原蛋白的標準聞名。PURECOL® 膠原蛋白為接近97% 的第一型膠原蛋白(Type I collagen)且其餘部分由第三型膠原蛋白組成，並且適合用來表面塗佈、提供用來培養細胞的薄膜之製備或用作為固體膠。先前技術所習知之支架或基質的另一實例為CELLstart™ (Invitrogen)。
在一些實施例中，細胞培養條件可涉及細胞在設定於37 °C與5% CO2 之培養箱中的生長。視網膜前驅細胞或包含視網膜前驅細胞之細胞群體可被培養在含氧量正常的或大氣的(20%)氧氣下，並且可生長在接近懷孕期間發育中的胎兒視網膜之氧氣濃度之條件下，即「低的(low)」或「缺氧的(hypoxic)」條件，例如：0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣或者介於其間的任何增量。
在替代性實施例中，植入密度(plating density)意指每單位體積的培養基中的細胞數目或者在貼壁培養(adherent culture)中每cm2 的細胞數目。文中相似的用語為「匯合(confluence)」，其通常用作為細胞培養皿或瓶中細胞數目的量測並且意指培養皿或瓶被細胞覆蓋的覆蓋率。舉例而言，100%匯合意謂培養皿被細胞完全地覆蓋，且因此沒有多的空間給細胞生長；而50%匯合意謂大約一半的培養皿被覆蓋並且還有空間給細胞生長。
傳代(亦以繼代培養(subculture)或分盤細胞(splitting cells)為習知的)涉及移動少數的細胞到新的器皿。如果定期地分盤細胞，細胞可被培養較長的時間，由於其避免由長期的高細胞密度所引起的衰老。懸浮液培養易於通過以大體積的新鮮培養基稀釋含有少許的細胞之小量的培養傳代。就貼壁培養而言，細胞第一次需要去貼壁。此通常以諸如胰蛋白酶-EDTA的酶或如細胞解離緩衝液(Cell Dissociation Buffer)的非酵素溶液之混合物來完成，然而，可獲得各種用於此目的之酵素或非酵素混合或配製。小量的去貼壁的細胞可接著被用來植入新的培養中。
大部分初代細胞培養(primary cell cultures)具有有限的生命周期並不無限期地增生。在一定次數群體倍增之後(所謂的海佛烈克極限，Hayflick limit)，細胞經過衰老的過程而停止***，同時一般保留生存能力。在一些實施例中，視網膜前驅細胞或細胞群體可被培養不超過10次傳代。舉例而言，被傳代一次、二次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次傳代。在一些實施例中，在標準氧氣條件下，RPCs被傳代約4-6(例如4、5或6)次，選擇性地，在低氧氣條件下，繼續地培養約1-10次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)傳代。
在替代性實施例中，細胞可被傳代(在標準氧氣條件下、在低氧氣條件以及/或在其任何結合)超過5次，諸如，例如六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、或更多傳代。在特定的實施例中，視網膜前驅細胞與細胞群體被培養約5-32次(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32)傳代。所屬技術領域中具有通常知識者將知悉可使用先前技術所習知的其他方法培養細胞超過32次傳代(即33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多傳代)。
在各種實施例中，以病原體、細菌、內毒素、真菌、黴漿菌、病毒、肝炎病毒或HIV病毒的存在篩選細胞的樣本。亦以正常核型、生存能力以及/或致腫瘤性的存在篩選細胞的樣本。選擇性地，細胞的樣本不顯示升高的端粒酶活性。
在如本文所提供之這些方法中之任何方法中，視網膜細胞以及/或視網膜組織可在分離、選擇以及/或培養之前或之後被冷凍。可使用在先前技術中普遍使用之任何冷凍保存劑(cryopreservation agents)以及/或技術完成細胞冷凍。在使用之前，被冷凍的細胞可使用任何在先前技術中習知之規程解凍。
細胞的生存能力可在他們用於本文所述之任何方法之前檢測。藉由非限制實例之方式，在冷凍保存之前，較佳地，至少70%(即70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)的細胞是具生存能力的。在解凍後，較佳地，至少70%(即71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)的細胞是具生存能力的。同樣地，一旦細胞培養恢復，較佳地，至少70%(即70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%)的細胞是具生存能力的。在任何階段具生存能力的細胞的數目之判定是在所屬技術領域中具有通常知識者的常規水平之中。
在特定的實施例中，最終產物製劑已展現保存在冰凍(即在0-4 °C)時維持最佳的生存能力(即至少85%)長達4小時或更久(即4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更久)。此將反過來允許細胞製備品的地方性地運輸至區域性診所據點。
在低氧氣條件之下細胞的進一步擴增可用來大幅地增加每次捐贈的細胞產率(cell yield per donation)。舉例而言，在一些實施例中，細胞總共可被傳代5-12(即5、6、7、8、9、10、11或12)或更多次。藉由非限制實例之方式，在一實施例中，此可包含發生在標準氧氣條件下的4-6次(即4、5或6)傳代之後的3-6次(即3、4、5或6)傳代的二次低氧氣擴增(secondary low oxygen expansion)。然而，將被所屬技術領域中具有通常知識者認知的是，傳代的總數目可為約1-32或更多次傳代(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或更多)。此可包含1-20或更多次傳代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)之二次低氧氣擴增。全部傳代的適當的數目與低氧氣傳代的數目之判定是在所屬技術領域中具有通常知識者的常規水平之中。該二次低氧氣培養傳代的使用大幅擴張來自GMP hRPCs(諸如藉由在標準氧氣條件下培養衍生的那些)的工作庫(working bank)的產率。舉例而言，從標準正常氧氣庫來的細胞可被解凍並在低氧氣條件下進一步擴增額外的1-20次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)傳代。
當可能使用較少的低氧氣細胞傳代時，所致之產率可能較低。而且，當亦是可能使用較多的低氧氣細胞傳代時，此將潛在地具有增加所得產品由於伴有功效喪失之潛在的表型漂變(phenotypic drift)以及/或不想要的遺傳變異的累積導致為有缺陷的風險。
在一些實施例中，二次低氧氣培養傳代之後，視網膜前驅細胞經過，其中他們被允許在標準氧氣條件下生長介於1小時至高達5天的短暫期間(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、24、36、48、60、72、84、96、108或120小時)的「回復期間(recovery period)」。在替代性實施例中，在此回復期間內，細胞被允許在沒有經過進一步的傳代下生長。
於是，在一非限制實例中，用於本文中所描述之任何的組合物與方法之視網膜前驅細胞可使用涉及 (a)在標準氧氣條件下培養數次傳代，接著(b)在低氧氣條件下培養數次傳代，選擇性地接著(c)在標準氧氣條件下培養一設定的期間而沒有任何更進一步的傳代之「雜交(hybrid)」途徑產生。在標準氧氣條件下以及/或低氧氣條件下之適當的傳代次數與回復期間之適當的期間之判定是在所屬技術領域中具有通常知識者的常規水平之中。
使用此新的培養方法學產生的所得細胞產物已在體外與動物中檢測。其結果類似於在以那些沒有經過二次低氧氣培養的細胞產物觀察到的。
將被所屬技術領域中具有通常知識者認知的是，此二次低氧氣成分加入於整個過程中是有益於其中不需要諸如初始分解與移植之複雜的程序並且傳代進行將以強烈地增生的細胞完全標準化之自動化製造方法。
經由存在的RPCs的誘導多能幹細胞(induced pluripotent stem cell，iPS)轉化後在更原始的、增生的狀態的擴增，RPCs可被額外地產生。使用先前技術中習知之任何方法iPS可接著再分化回去RPCs。在此情形中，被稱為RPCs的先前的表觀遺傳學印記(epigenetic imprinting)有助於將細胞重新定向回它們的原始狀態，從而增加RPCs產率以及/或促進高產率同種異體產物(allogeneic product)(即藉由避免多能細胞的汙染)的安全性。此擴增方法學可提供非常大的及潛在地無限的「非衰老的(non-senescing)」RPCs的來源，前述之RPCs從臨床上已證實的RPCs樣本所衍生，而不需要重複胎兒組織的採購。
RPCs可從多能細胞株或如或非上述RPCs所衍生之此種細胞株之一額外地製造。此種衍生可包含部分分化成含有從其中可收集、純化並進一步擴增RPCs之原始的視網膜結構之「胚胎體(embryoid bodies)」，即眼杯衍生物(eye cup derivatives)。
在替代性實施例中，可使用其中用於iPS的供體細胞從睫狀體上皮(ciliary body epithelium)或從虹膜取得之自體細胞(autologous cells)來進行類似的方法，當此些組織均可被外科醫師獲得並具有重疊於(雖然不真正相同於)視網膜之發展的印記。
RPCs的給予與治療方法
本文亦提供被配製成細胞懸浮液的並作為用來治療具有視網膜疾病的病人之同種異體移植之被培養的視網膜前驅細胞的使用與方法。舉例而言，本文所提供的是包括或其組成是由來自未成熟的例如人類之哺乳動物的視網膜之被培養的異質細胞群體的使用之以細胞為基礎的療法。
藉由各種不同的方式，本文中所描述之細胞群體與相關的組合物可被提供予個體或病人。藉由非限制實例之方式，它們可局部地提供，例如提供於真正的或潛在的創傷或疾病之位點。在一些實施例中，他們在可能的或真正的創傷或疾病的位點使用注射筒或注射針注射組合物來提供。在其他實施例中，他們被系統性地提供，即靜脈注射地或動脈注射地被給予於血液中。特定的給予途徑，大部分，將依據將被治療或預防之疾病或創傷的位置與本質來決定。於是，在替代性實施例中，本文所描述之方法包含透過任何已知與可獲得的方法或途徑來提供細胞群體或組合物，包含但不受限於眼內的、口服、胃腸外的(parenteral)、靜脈內的、動脈內的、鼻內的與肌肉內的給予。
依照先前技術中習知並被內科醫師獲得之資訊，可輕易地完成適合的劑量與治療方案之判定。
藉由非限制實例之方式，在替代性實施例中，細胞的劑量可介於約0.3至約0.5百萬個細胞之間(例如：0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、或0.5百萬個細胞)或介於0.5-3百萬個細胞之間(例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或3百萬個細胞)。
介於兩個劑量範圍之間觀察到的功效結果是約略相似。然而，如果病人的眼睛具有弱的懸韌帶，則隨著更大的劑量(例如：2-3百萬個細胞)的細胞有可能增加存留在視軸、黏在水晶體後囊以及/或進入眼前房(假性眼前房積膿，pseudo-hypopyon)之風險。而且，將被所屬技術領域中具有通常知識者認知的是，移植物存活的持續期間可能可與劑量成正比，因而，可與原本移植物的尺寸成正比。
在玻璃體腔中同種異體hRPCs的給藥頻率將是重要的。在各種實施例中，後續的劑量(即再劑量(redoses))可被施予於病人的同一個眼睛或另一個眼睛。在動物模式與數個病人中，已進行再劑量於另一個眼睛而沒有後續的免疫後遺症(immune sequelae)。因此，提出再劑量將是雙側良好耐受的(並假設在同一個眼睛為已在動物上進行高達3次)。
移植物可在RP病人身上存活一年或更久。然而，它們傾向於在接近1-1.5年之後從玻璃體消失，此表明在接近1至2年的時間範圍之內的再劑量可能不會太過激進並且事實上可能在多數案例中成為未來的常態。
在本文所揭露之任何方法中，治療可涉及單次治療或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或9或更多)治療。為了預防目的，在某些實施方案中，預期在可能潛在地引起視網膜損傷的應激之後給予純化的細胞群。
在一實施例中，細胞群體及組合物可作為對個體之玻璃體腔或視網膜下空間的單一注射而局部地給予。
雖然本文中所描述之組合物及方法不受限於動作的任何特定機制，動作的例示性機構是擴散性的以及/或與營養有關的。證據與垂死的宿主錐細胞之營養重編程(trophic reprogramming)之概念一致，導致從細胞凋零軌跡到光處理能力的再生之轉換。此可為直接的或間接的。不排除其他眼組織的參與。此機制允許將胎兒神經視網膜細胞的異質混合物的移植物放置在玻璃體或視網膜下空間中。
在替代性實施例中，玻璃體放置(placement)增強以擴散為基礎的治療效果。此機制可允許胎兒神經視網膜細胞的異質混合物之移植物取代視軸，但仍治療病人的黃斑。而且，玻璃體放置被用來大幅地簡化治療，因為此例示性治療對世界各地有需求的病人可增加可用性。此外，玻璃體放置可藉由遠離脈管系統而有助於免疫耐受。將被所屬技術領域中具有通常知識者認知的是，玻璃體放置避免視網膜下手術的潛在併發症、避免全身麻醉的風險、不需要在視網膜上進行穿孔(視網膜切開術，retinotomy)(這會增加視網膜脫離、出血的風險)以及/或不需對病人的視網膜進行局灶性脫離(focal detachment) (局灶性脫離可導致光感受器損傷或丟失、視網膜撕裂、出血、全面性視網膜剝離，並且在RP中，薄的、萎縮的和粘附的視網膜的脫離將是困難/危險的程序)。
在一些實施例中，使用適合的注射針尺寸與長度，放置細胞在玻璃體腔。在替代性實施例中，為了增強傳送效率與避免由於留滯在注射筒所致之產品損失，注射筒具有最小的(即1微升)殘留空間(dead space)。短注射針(例如具有5/16吋長的31G(gauge)或具有½吋長的30G)的使用允許最大的便利性(即適用於臨床上或診療室設定)。然而，長注射針(例如具有5/8吋長的27G或25G)的使用允許在玻璃體中更後部(後區)，更靠近黃斑，之最佳化的放置(在操作範圍內使用)。適當的注射針尺寸與長度之判定是在所屬技術領域中具有通常知識者的常規水平之中。當挑選適當的注射針尺寸與長度時，重要的是，在細胞通過針頭後，細胞的生存能力保持在所需的閾值之上。
在替代性實施例中，細胞放置是在前玻璃體之內，其是簡單且允許最大的安全性與便利性。相反地，在替代性實施例中，放置是在後玻璃體(接近晶狀體後極)，這需要直接觀察針尖以避免視網膜的穿透性損傷。然而，此可增強整體治療效果與可代表最佳化放置與功效。
雖視網膜細胞取代是可能的，但它不是臨床療效所必需的。同樣地，供體細胞遷移到視網膜是可能的，但它不是臨床療效所必需的；供體細胞供體細胞整合到視網膜迴路中是可能的，但它不是臨床療效所必需的；供體細胞整合到宿主視網膜的外核層/黃斑是可能的，但它不是臨床療效所必需的；以及/或供體細胞整合到視網膜是可能的，但它不是移植物持續存活所必需的。
在一些實施例中，RPC細胞可被注入其中選擇性地不需要玻璃體切除術(vitrectomy)或視網膜下手術之玻璃體腔。然而，一些實施例可涉及選擇性的使用玻璃體切除術、核心玻璃體切除術以及/或玻璃體溶解物質中之一或多個，以移除玻璃體凝膠以及最佳化注射細胞向後玻璃體(例如，靠近眼後極的最佳位置)的移動性和穿透性。在一些案例中，使用玻璃體切除手術可增強在眼睛的細胞放置。
細胞亦可被植入(例如注射入)視網膜下空間，或者它們可使用任何標準的眼內的注射程序，例如使用皮下注射的或角度***通路，被植入(例如注射入)眼睛。在一些案例中，無視網膜切開術或無眼內氣體或不需要矽油。
替代性地，依據如在所屬技術領域中具有通常知識者所判定的情況可選擇性地進行前房穿刺術(anterior chamber paracentesis)。在一些實施例中，在手術之間以及/或之後不需要眼球的縫合。
本文所揭露之任何方法可包含將組合物在表面麻醉(topical anesthesia)下直接給予玻璃體腔，不需要對個體進行全身免疫抑制的步驟。此外，雖然移植物的組織分型與對病人或個體之匹配不是必需的，但若需要的話其可進行，例如使用所屬技術領域中具有通常知識者所習知之任何組織分型與匹配技術。
如所提出的，在本文所述之任何方法中，在替代性實施例中，僅使用表面麻醉，例如未使用局部、區域或全身麻醉。然而，在一些案例中，給藥期間可額外的或替代性使用局部、區域或全身麻醉。適合用來使用在本文中所揭露之方法中適合的表面麻醉之實例包含，但不限於mepricaine、丙美卡因(proparacaine)、丙胺卡因(prilocaine)、羅哌卡因(ropivacaine)、苯佐卡因(benzocaine)、普寧卡因(bupivacaine)、苦味酸胺苯丁酯(butamben picrate)、 氯普魯卡因(chlorprocaine)、***(***e)、袋布卡因(dibucaine)、奎尼卡因(dimethisoquin)、達可隆(dyclonine)、 依鐵卡因(etidocaine)、己卡因(hexylcaine)、***(ketamine)、利多卡因(lidocaine)、甲派卡因(mepivacaine)、丙嗎卡因(pramoxine)、丙卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、水楊酸(salicylates)及其衍生物、酯、鹽以及其混合物。
在特定實施例中，不需要消炎(anti-inflammatory)以及/或免疫抑制(即全身免疫抑制)。而且，臨床經驗支持不需要，因為在一些案例中，可看到移植物的存活超過數個月，舉例而言，包含且超過1年。
然而，如果需要的話，可包含為術後滴眼液(post-operative drops)之消炎以及/或免疫抑制治療。舉例而言，如果在臨床上指出治療後炎症持續的證據，則病人可在注射後以一周或者選擇性地，高達兩周後逐漸減量地用局部類固醇滴眼液治療。
在替代性實施例中，沒有強制臥床休息、臉朝下(face-down)的姿勢之開刀後囑咐以及/或需要。這些方法可在門診手術中進行並且可能不要求任何過夜住院。
在一些實施例中，在給藥期間，病人的頭部盡可能接近水平地從傾斜的坐姿向後傾斜，以最大化地將在玻璃體凝膠內的注射細胞朝向對於視覺而言是視網膜最重要的部分眼睛的後極安頓。當病人能忍受時，病人應該維持此姿勢持續大約30分鐘或更久。此外，給藥後病人亦應該花時間在家以背躺下臉朝上。
在替代性實施例中，本文中所述之任何涉及或使用胎兒神經視網膜細胞(例如視網膜前驅細胞)之異質混合物之組合物與方法被用來治療、改善、減少症狀、減緩進程或者預防視網膜疾病或狀態，例如：Usher's 病、視網膜色素病變 (RP)、視網膜退化性病變、老年性黃斑部病變(AMD)、濕式AMD或乾式AMD、地圖狀萎縮、視網光感受器疾病、糖尿病視網膜病變、黃斑囊樣水腫、葡萄膜炎、視網膜剝離、視網膜損傷、黃斑裂孔、黃斑毛細血管擴張症、創傷性或醫源性視網膜損傷、神經節細胞或視神經細胞疾病、青光眼或視神經病變、血性視網膜疾病，例如早產兒視網膜病變、視網膜血管阻塞或 缺血性視神經病變；或者改善明視(日光)視力；或改善矯正視力敏銳度；或改善黃斑功能；或改善視野；或改善暗視(夜間)視力。
同樣地，在替代性實施例中，本文中所述之任何組合物與方法可可用來提供快速效果、增加最佳矯正視力敏銳度、改善黃斑功能以及/或保留或恢復中心注視的可能。
在替代性實施例中，使用或實現本文中所揭露之任何之組合物與方法導致各種系統性的好處，例如：可能因為有關於在光對晝夜節律、垂體功能、激素的釋放、血管緊張度等之影響之身體改善而對治療中個體外觀上的改變；提高視覺能力；改善走動獨立性；改善幸福感；和/或改善日常生活活動。
較佳地，使用或實現本文中所揭露之任何之組合物與方法不導致例如腫瘤之不想要的細胞生長；感染，例如無眼内炎- 眼內手術的風險；疾病的散佈(然而，普利昂病或狂牛病難以排除)；葡萄膜炎；以及/或急性移植物排斥之發展；升高的眼壓；隅角閉鎖；低眼壓；視網膜剝離；以及/或新血管形成。
在替代性實施例中，在本文中所述之使用與方法可快速地與持續地修復以及/或保留哺乳動物(例如人類)個體的視網膜視覺功能的臨床上顯著的程度，包含，但不受限於，改善明視(日光)視力；增加最佳矯正視力敏銳度；改善黃斑功能；保留或恢復中心注視、改善視野、改善暗視(夜間)視力、聲音靈敏度的增加或改善與異側眼的視力之改善。其他的改變可包含各種系統性的好處，例如：可能因為有關於在光對晝夜節律、垂體功能、激素的釋放、血管緊張度之影響之身體改善而對治療中個體外觀上的改變；提高視覺能力；改善走動獨立性；改善幸福感；和/或改善日常生活活動。此些視覺的改變可藉由先前技術習知之方法量測。
視覺利益可快速地並可在治療後的第一週之內發生，但也可能在較長時間周期內作為增量收益發生。可發生視網膜細胞取代以及/或供體細胞遷移到視網膜、視網膜迴路或外核層或黃斑，但是它不是臨床療效所必需的。供體細胞可能遷移到視網膜，但是它不是臨床療效所必需的。
包含以本文中所揭露之視網膜前驅細胞組合物的治療所致之視力改善之視覺改變的量測可使用標準的眼科檢查技術來達成，其包含，但不受限於，眼底檢查(fundus examination)、最佳矯正視力(best corrected visual acuity, BCVA)、IOP、裂隙燈檢查(slit lamp examination)、螢光眼底攝影(fluorescein angiography, FA)、網膜斷層攝影(Optical Coherence Tomography, OCT)、立體聲眼底(stereo-fundus photography)、視網膜電描記法(electroretinography, ERG)、錐狀頻閃細胞視網膜電描記法(cone flicker electroretinography)、視野檢查(視野)、微視野檢查(microperimetry)、黑暗適應性(dark adaptation)、迷宮通過能力(maze negotiating skill)、視動/視動反應(optokinetic/optomotor responses)、瞳孔反應(pupillary responses)、視覺誘發電位(visual evoked potentials, VIP)以及適應的光學掃描雷射眼底檢查法(adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy, AOSLO)。
體內動物數據亦已表明玻璃體內RPCs是影響患病視網膜中多種細胞類型的一種手段，包含，但不受限於，米勒細胞(增強視網膜退化的活化以及/或增加麩胺醯胺合成酶(glutamine synthetase，GS)的局部表現)、糖尿病視網膜病變的血管腔隙(血管通透性(洩露)較低以及/或基於視網膜內的VEGF濃度降低的缺血較少)、增強視網膜退化中之巨噬細胞的募集、增加視網膜退化中之bFGF(神經營養因子)的局部表現、降低半胱天冬酶3(caspase)的表現(表示較少的視網膜細胞死亡)。因而，RPCs的給予在其他視網膜疾病、病變與狀態的範圍內亦可有效。
此外，已觀察到在未注射的對側眼中的功效指標方面的交叉治療效果的初步證據。明確地，此在RCS大鼠(光感受器的組織學拯救與ERG紀錄)可看到出且亦可在病人的子集(視力敏銳度測驗)中看到，且其似乎是可超越被注射眼睛的局限之體液的(humoral)治療的效果之證據。這種作用可能是細胞激素(cytokines)以及/或胞外體(exosomes)經過血液循環、免疫調節或者兩者的擴散之結果。
同樣地，動物中的體內數據表明，骨橋蛋白(OPN)的單一玻璃體內注射重複一些，但並非全部，由hRPCs所提供的治療效果。然而，就視網膜細胞群體的時間與專一性反應而言，單一劑量的多效蛋白(PTN)以及/或中期因子之效果異於使用OPN所觀察的效果。
動物中的體內數據亦表明，RPC衍生的胞外體之單一玻璃體內注射重複，就一些範圍，由hRPCs所提供的治療效果。
組合物與製劑
在替代性實施例中，本文中所述之視網膜前驅細胞與細胞群體可被配製為藉由任何或各種方式來給予的組合物，包含口服(orally)、胃腸外的(parenterally)、霧化吸入(inhalation spray)、鼻腔粘膜(nasally)、局部給藥(topically)、鞘內(intrathecally)、腦內的(intracerebrally)、硬脊膜外腔(epidurally)、顱內的(intracranially)或肛門(rectally)。本文中所述之組合物與製劑可含有醫藥上或獸醫學上可接受的液體、載體(carriers)、助劑以及載體(vehicles)並且可為液體、錠劑、膠囊、植體、噴霧、凝膠、脂質體、奈米粒子以及相似物之型式。
視網膜前驅細胞與細胞群體可以醫藥上或獸醫學上的型式來給予個體。在替代性實施例中，片語「醫藥上可接受的(pharmaceutically acceptable)」意指當給予動物或人類時，不產生有害的、過敏的或其他不良的反應之分子實體(molecular entities)與組合物。在替代性實施例中，當用於本文中時，「醫藥上可接受的載體(pharmaceutically acceptable carrier)」包含任何與所有水溶液與非水溶液的載體，其包含水、乙醇、多元醇類(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇以及類似物)以及其適合的混合物、諸如橄欖油之植物油與諸如油酸乙酯之可注射的有機酯類。
醫藥上可接受的載體可選擇性地包含白蛋白(例如人類白蛋白)，其為在製備中能改善細胞存活之蛋白質。
同樣地，本文中所揭露之任何之組合物與製備亦可包含賦形劑HypoThermosol®-FRS (HTS-FRS) (BioLife Solutions, Inc.)，其為商業上可得到之低溫儲存溶液/製劑設計以調解長期低溫(2°C-10°C)保存的細胞儲存後壞死和細胞凋亡的水平 (參見，例如美國專利案No. 6,921,633、美國專利案No. 6,632,666以及WO 2005/009766)。
在替代性實施例中，白蛋白以及/或HTS的添加被用來延長視網膜前驅細胞在本文中所揭露之任何的製備中的存活時間，高達約24小時(例如：約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時)。
舉例而言，適宜的流動性可藉由諸如卵磷脂的塗佈物質之使用、在分散液的情況下維持要求的粒徑以及界面活性劑之使用來維持。這些組合物亦含有諸如防腐劑、潤濕劑、 乳化劑以及分散劑之助劑。藉由滅菌程序以及藉由包含例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸及其類似物之各種抗菌劑及抗真菌劑可確定避免微生物的存在。亦可視需求而包含諸如糖、氯化鈉及其類似物等滲透劑於組合物中。此外，可藉由包含諸如單硬脂酸鋁及明膠之延緩吸收的試劑來造成可注射的醫藥上型態的延長吸收。在製造與儲存條件下，其必需為安定的，並且必需抗如細菌及真菌之微生物的汙染地保存。用於醫藥上活性的物質之此種媒介與試劑的使用為先前技術中已習知的。
必需給予個體有效量的視網膜前驅細胞或細胞群體。在替代性實施例中，「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」意指產生想要的效果之組合物的量。舉例而言，有效量將依據，部分經由被傳送的分子或試劑(在此指視網膜前驅細胞或細胞群體)、待使用治療試劑之適應症、給予的途徑以及個體或病人的尺寸(身體重量、身體表面或器官尺寸)以及狀態(年齡以及一般健康)。於是，臨床醫師或內科醫生可滴定(titer)劑量並修改給予途徑以獲得最佳化療效。用於具體目的之特定的試劑之有效量可使用所屬技術領域中具有通常知識者已習知之方法來判定。就本文中所定義之任何的組合物而言，有效量可在細胞培養分析或諸如小鼠、大鼠、兔、狗、豬或猴之動物模式初步估算。動物模式亦可用來判定適當的濃度範圍與給予途徑。該資料接著可用於判定對人類有用的劑量與給予途徑。
本文所描述之組合物的有效量之實例包含細胞懸浮液，其體積為5 ml、10 ml、15 ml、20 ml、25 ml、50 ml、100 ml、150 ml、200 ml、250 ml、300 ml、350 ml、400 ml、450 ml、500 ml 或在高達5000 ml (5 ml)之間的任何增量(例如：500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950或 5000 ml)。
在替代性實施例中，體積的上限及下限被傳送系統及/或方法所限制。參見，例如Kayikcuiglu, O. R. et al, (2006) Retina 26(9): 1089-90。舉例而言，當在沒有玻璃體切除術的情況下，由於增加的眼壓，給藥的體積上限為大約200ml。當在有玻璃體切除術的情況下給藥予玻璃體腔時，體積的上限由璃體腔的體積所限制並且可以含有高達5ml或更多。由於視網膜剝離，視網膜下注射的上限可高達200ml。在替代性實施例中，這些體積包含每劑量介於1000至10百萬之間個細胞或每劑量1000至2000個細胞、每劑量2000至3000個細胞、每劑量3000至4000個細胞、每劑量400至5000個細胞、每劑量5000至6000個細胞、每劑量6000至7000個細胞、每劑量7000至8000個細胞、每劑量8000至9000個細胞、每劑量9000至10,000個細胞、每劑量10,000至15,000個細胞、每劑量15,000至20,000個細胞、每劑量20,000至25,000個細胞、每劑量25,000至30,000個細胞、每劑量30,000至35,000個細胞、每劑量35,000至40,000個細胞、每劑量40,000至45,000個細胞、每劑量45,000至50,000個細胞、每劑量50,000至55,000個細胞、每劑量55,000至60,000個細胞、每劑量60,000至65,000個細胞、每劑量65,000至70,000個細胞、每劑量70,000至75,000個細胞、每劑量75,000至80,000個細胞、每劑量80,000至85,000個細胞、每劑量85,000至90,000個細胞、每劑量90,000至95,000個細胞、每劑量95,000至100,000個細胞、每劑量100,000至125,000個細胞、每劑量125,000至150,000個細胞、每劑量150,000至200,000個細胞、每劑量200,000至250,000個細胞、每劑量250,000至300,000個細胞、每劑量300,000至350,000個細胞、每劑量350,000至400,000個細胞、每劑量400,000至450,000個細胞、每劑量450,000至500,000個細胞、每劑量500,000至550,000個細胞、每劑量550,000至600,000個細胞、每劑量600,000至650,000個細胞、每劑量650,000至700,000個細胞、每劑量700,000至750,000個細胞、每劑量750,000至800,000個細胞、每劑量800,000至850,000個細胞、每劑量850,000至900,000個細胞、每劑量900,000至950,000個細胞、每劑量950,000至1,000,000個細胞或者每劑量介於1000 個細胞至高達10百萬個細胞之間的任何增量。當然，劑量可根據給藥頻率與期間而變動。在替代性實施例中，本文所描述之組合物的細胞劑量含有在小體積中高數目的細胞；舉例而言，諸如每100 ml 0.5百萬個細胞。細胞數目可藉由在先前技術中所習知之任何方法來計算，諸如藉由血細胞計數器(hemacytometer)、分光光度法(spectrophotometry)、庫氏計數器(Coulter counter)、流式細胞術(flow cytometry)等。劑量可一次性地給予或可經過數個治療的療程給予。
組合物亦可被配製成用於胃腸外的給予眼睛(尤其是玻璃體腔或視網膜下空間)、玻璃體腔或者視網膜下空間或藉由鞏膜或藉由在先前技術中所習知之任何方法或規程，例如：包含如在美國專利案No.7,585,517所述之鞏膜傳送、如在美國專利案No.7,883,717所述之用來傳送至病人眼睛內部之持續性釋放傳送裝置、如在美國專利案No.5,378,475或5,466,233所述之用來***眼睛的玻璃體區的裝置或者藉由例如如在美國專利申請公開案No.20110112470或20100256597(描述用於對病人的眼睛的標靶給藥之微針尖)所述之皮下注射的注射筒或角度***途徑之使用、或者經由例如如在美國專利申請公開案No.20100209478所述之經由具有穿過淚點(puncta lacrimali)尺寸之親水性高分子水凝膠或例如如在美國專利申請公開案No.20100191176所述之提供在人類眼睛的視網膜下空間接近機會之裝置傳送至視網膜、腦部、神經或CNS。前房穿刺術亦可在經由所屬技術領域中具有通常知識者所決定時進行。方法在尤其是對於玻璃體內的放置之程序之間、及/或之後，不需要縫合眼球。然而，對於利用玻璃體切除術之方法而言，此可能為必需的，舉例而言，當在視網膜下空間放置細胞時。
本文所揭露之組合物亦可配製為用於鞘內、腦內硬膜外(intracerebral epidural)、皮下的、靜脈內的、肌肉內的以及/或動脈內的給藥；例如美國專利申請公開案No.200500480021所述的；藉由注射途徑但亦包含各種注入技術。給藥可透過例如鞘內幫浦之導管或幫浦之使用或者植入式醫療裝置來實現。在替代性實施例中，方法亦可涉及含有本文所揭露之視網膜前驅細胞、細胞群體或組合物之植體與人工器官、生物反應器系統、細胞培養系統、培養盤、培養皿、試管、瓶與燒瓶及其類似物之給予或移植，諸如那些在美國專利案No.7,388,042、7,381,418、7,379,765、7,361,332、7,351,423、 6,886,568、5,270,192與美國專利申請公開案No.20040127987、20080119909、20080118549、20080020015、20070254005、20070059335、20060128015所述的。
在替代性實施例中，含有視網膜前驅細胞或細胞群體之組合物選擇性地與一或多個藥物共同給藥(co-administered)。藥物的非限制實例可包含諸如血管抑素(angiostatin)、醋酸阿奈可他(anecortave acetate)、血小板反應蛋白(thrombospondin)、血管內皮生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑(VEGF receptor tyrosine kinase inhibitors)之抗血管生成劑(anti-angiogenesis agents)；以及諸如樂舒晴(ranibizumab)以及貝伐單抗(bevacizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、舒尼替尼(sunitinib)以及索拉菲尼(sorafenib)之抗血管內皮生長因子(anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF)藥物與具有抗血管生成效果之任何各種習知之小分子與轉錄抑制劑；習知之眼科藥物的種類包含：諸如交感神經阻斷劑(adrenergic antagonists)的青光眼治療劑(glaucoma agents)，其包含，舉例而言，諸如醋丁洛爾(acetbutolol)、阿替洛爾(atenolol)、畢索洛爾(bisoprolol)、卡維地洛(carvedilol)、艾司洛爾(asmolol)、拉貝洛爾(labetalol)、納多洛爾(nadolol)、噴布洛爾(penbutolol)、吲哚洛爾(pindolol)普萘洛爾(propranolol)、美托洛爾(metipranolol)、倍他洛爾(betaxolol)、卡替洛爾(carteolol)、左倍他洛爾(levobetaxolol)、左布諾洛爾(levobunolol)以及第莫洛(timolol)之β阻斷劑(beta-blocker agents)；諸如：腎上腺素(epinephrine)、地匹福林(dipivefrin)、可樂定(clonidine)、亞泊可尼丁(aparclonidine)以及溴莫尼定(brimonidine)之腎上腺素促效劑(adrenergic agonists)或擬交感神經作用劑(sympathomimetic agents)；諸如：毛果芸香(pilocarpine)、卡巴可(carbachol)、碘化磷(phospholine iodine)、以及毒扁豆鹼(physostigmine)、水楊酸(salicylate)、氯化乙醯膽鹼(acetylcholine chloride)、依色林(eserine)、二異丙基磷酸氟(diisopropyl fluorophosphate)、地美溴銨(demecarium bromide)之擬交感神經作用劑(parasympathomimetics)或膽鹼性致效劑(cholingeric agonists)；毒蕈鹼(muscarinics)；包含表面(topical)及/或全身的藥劑，舉例而言，乙醯偶氮胺(acetozolamide)、布林左胺(brinzolamide)、多佐胺(dorzolamide)及甲氮醯胺(methazolamide)、乙氧苯噻唑胺(ethoxzolamide)、丹木斯(diamox)以及雙氯非那胺(dichlorphenamide)之碳酸酐酶抑制劑(carbonic anhydrase inhibitor agents)；諸如：阿托品(atropine)、環噴托酯(cyclopentolate)、琥珀膽鹼(succinylcholine)、後馬托品(homatropine)、去氧腎上腺素(phenylephrine)、東莨菪鹼(scopolamine)以及托平卡胺(tropicamide)之睫狀肌麻痹擴瞳試藥(mydriatic-cycloplegic agents)；諸如：***素 F2α(prostaglandin F2 alpha)、抗***素(antiprostaglandins)、***素前軀物(prostaglandin precursors)之***素；或者諸如：百馬前列素(bimatoprost)、拉坦***素(latanoprost)、曲伏***素(travoprost)及/或烏諾***酮(unoprostone)之類***素劑(prostaglandin analog agents)。
藥物的其他實施例亦可包含，但不限於，包含例如醣類皮質激素(glucocorticoids)之抗炎劑(anti-inflammatory agents)以及皮質類固醇激素(corticosteroids)， 諸如：貝他每松(betamethasone)、皮質酮(cortisone)、***(dexamethasone)、特塞隆21-磷酸(dexamethasone 21-phosphate)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、培尼皮質醇 21-磷酸(prednisolone 21-phosphate)、乙酸培尼皮質醇(prednisolone acetate)、培尼皮質醇(prednisolone)、氟美皮質醇(fluroometholone)、氯替潑諾(loteprednol)、甲羥松(medrysone)、丙酮氟洛皮質醇(fluocinolone acetonide)、丙酮特安皮質醇(triamcinolone acetonide)、特安皮質醇(triamcinolone)、丙酮特安皮質醇(triamcinolone acetonide)、倍氯米松(beclomethasone)、亞丁皮質醇(budesonide)、氟尼縮松(flunisolide)、氟美皮質醇(fluorometholone)、氟替卡松(fluticasone)、氟氫可地松(fludrocortisone)、氫化皮質酮(hydrocortisone)、乙酸氫化可體松(hydrocortisone acetate)、氯替潑諾(loteprednol)、利美索龍(rimexolone)以及非類固醇抗炎藥包含，舉例而言，阿斯匹靈(aspirin)、待克菲奈(diclofenac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、溴芬酸(bromfenac)、奈帕芬胺(nepafenac)以及酮咯酸(ketorolac)、水楊酸(salicylate)、美西辛(indomethacin)、萘克洛芬(naxopren)、吡羅昔康(piroxicam)以及那別敏二氟尼柳(nabumetone diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacine)、酮基布洛芬(ketoprofen)、甲氯芬那(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奧沙普嗪(oxaprozin)、吡羅昔康、雙水楊酯(salsalate)、舒林達酸(sulindac)以及托美丁(tolmetin)；COX-2抑制劑(COX-2 inhibitors)，像是：來考昔(celecoxib)、羅非考昔(rofecoxib)以及伐地考昔(Valdecoxib)；抗感染劑(anti-infective)或抗微生物劑(antimicrobial agents)諸如：抗生素(antibiotics)包含，舉例而言，四環黴素(tetracycline)、氯四環素(chlortetracycline)、桿菌肽(bacitracin)、新黴素(neomycin)、多黏菌素(polymyxin)、短桿菌肽(gramicidin)、頭孢胺苄(cephalexin)、土黴素(oxytetracycline)、氯黴素(chloramphenicol)、利福平(rifampicin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、托普黴素(tobramycin)、健他黴素(gentamycin)、 紅黴素(erythromycin)、青黴素(penicillin)、磺醯胺(sulfonamides)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺醋醯(sulfacetamide)、磺胺甲基噻唑(sulfamethizole)、磺胺異噁唑(sulfisoxazole)、硝糠(nitrofurazone)、丙酸鈉(sodium propionate)、胺基糖苷類(aminoglycosides)，諸如：慶大黴素(gentamicin)、妥布黴素(tobramycin)、丁胺卡那黴素(amikacin)以及鏈黴素(streptomycin)；氟喹諾酮類(fluoroquinolones)，諸如：塞普沙辛(ciprofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左旋氧氟沙星(levofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、枯草桿菌素(bacitracin)、紅黴素(erythromycin)、夫西地酸(fusidic acid)、新黴素、多黏菌素B、短桿菌肽、三甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)以及磺胺醋醯(sulfacetamide)；真菌劑，諸如：抗黴菌劑 B(amphotericin B)、抗卡泊芬凈(caspofungin)、克黴唑(clotrimazole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、伏立康唑(voriconazole)、特比萘芬(terbinafine)、 制黴菌素(nystatin)以及咪康唑(miconazole)； 抗瘧疾藥(anti-malarial agents)，諸如：氯奎(chloroquine)、阿托奎酮(atovaquone)、鹽酸甲氟喹(mefloquine)、普來馬昆(primaquine)、奎尼丁(quinidine)以及奎寧(quinine)；抗分枝桿菌劑(anti-mycobacterium agents)，諸如：孟表多(ethambutol)、異菸鹼醯胺(isoniazid)、吡嗪醯胺(pyrazinamide)、雷發平(rifampin)以及利福布丁(rifabutin)及/或殺寄生蟲劑(anti-parasitic agents)，諸如：阿苯達唑(albendazole)、甲苯達唑(mebendazole)、噻苯達唑(thiobendazole)、甲硝唑(metronidazole)、吡喃泰(pyrantel)、阿托奎酮、雙碘喹啉(iodoquinaol)、伊維菌素(ivermectin)、嘌呤黴素(paromycin)、帕芝奎(praziquantel)以及三甲曲沙(trimatrexate)。
藥物的其他實施例亦可包含，但不限於，諸如：碘苷三氟胸苷(idoxuridine trifluorothymidine)、阿昔洛韋(acyclovir)、西多福韋(cidofovir)、法昔洛韋(famciclovir)、更昔洛韋(gancyclovir)、伐昔洛韋(valacyclovir)、纈更昔洛韋(valganciclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)、曲氟尿苷(trifluridine)以及膦甲酸(foscarnet)之抗病毒劑(antiviral agents)；諸如：利托那韋(ritonavir)、沙奎那韋(saquinavir)、洛匹那韋(lopinavir)、茚地那韋(indinavir)、阿紮那韋(atazanavir)、安普那韋(amprenavir)以及奈非那韋(nelfinavir)之蛋白酶抑制劑(protease inhibitors)；諸如：阿巴卡韋(abacavir)、ddl、3TC、d4T、ddC、替諾福(tenofovir)以及恩曲他濱(emtricitabine)、地拉韋啶(delavirdine)、依發韋侖(efavirenz)以及奈韋拉平(nevirapine)之核苷酸/核苷/非核苷酸反轉錄酶抑制劑(nucleotide/nucleoside/non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors)；諸如：干擾素(interferons)、雷巴威林(ribavirin)以及曲氟尿苷(trifluridiene)之其他抗病毒劑；包含碳青黴烯(cabapenems)，像是厄他培南(ertapenem)、亞胺培南(imipenem)以及美羅培南(meropenem)之抗細菌劑；諸如：安泛黴素(cefadroxil)、西華樂林(cefazolin)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢托倫(cefditoren)、頭孢氨芣(cephalexin)、西華克樂(cefaclor)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢酮(cefoperazone)、西弗士林(cefotaxime)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢甲氧黴素(cefoxitin)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢齊定(ceftaxidime)、頭孢布烯(ceftibuten)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢呋辛(cefuroxime)以及氯碳頭孢(loracarbef)之頭孢菌素抗生素(cephalosporins)；諸如：阿奇黴 素(azithromycin)、克拉黴素(clarithromycin)、地紅黴素(dirithromycin)以及替利黴素(telithromycin)之其他的巨環內酯(macrolides)以及酮內酯類(ketolides)；包含阿莫西林(amoxicillin)、 安比西林(ampicillin)、匹氨青黴素(pivampicillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、哌拉西林(piperacillin)以及替卡西林(ticarcillin)之青黴素(具有以及沒有拉维酸(clavulanate))；諸如：多西環素(doxycycline)、米諾環素(minocycline)以及四環黴素之四環黴素；及/或諸如氨曲南(aztreonam)、氯黴素、克林黴素(clindamycin)、利奈唑胺(linezolid)、呋喃妥因(nitrofurantoin)以及萬古黴素(vancomycin)之其他抗細菌劑。
藥物的其他實施例亦可包含，但不限於，舉例而言，諸如：包含色甘酸鈉(sodium chromoglycate)、安他唑啉(antazoline)、美舍吡啉(methapyriline)、氯芬尼拉明(chlorpheniramine)、西替利嗪(cetrizine)、吡拉明(pyrilamine)、苯吡丙胺(prophenpyridamine)、阿地白介素(aldesleukin)、阿達木單抗(adalimumab)、氮雜硫代嘌呤(azathioprine)、巴西利馬伯(basiliximab)、達可利諸伯(daclizumab)、恩塔臬西伯(etanercept)、羥氯奎寧(hydroxychloroquine)、英夫利昔單抗(infliximab)、來氟米特(leflunomide)、胺甲蝶呤(methotrexate)、霉酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)以及柳氮磺吡啶(sulfasalazine)的抗敏感劑(antiallergenics)之免疫調節劑(immune-modulating agents)；諸如：氮卓斯汀(azelastine)、依美斯汀(emedastine)、氯雷他定(loratadine)、地氯雷他定(desloratadine)、西替利嗪(cetirizine)、苯海拉明(diphenhydramine)、氯菲安明(chlorpheniramine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、氯馬斯汀(clemastine)、賽庚啶(cyproheptadine)、非索非那定(fexofenadine)、羥嗪(hydroxyzine)、異丙嗪(promethazine)以及左卡巴斯汀(levocabastine)之抗組織胺藥(anti-histamine agents)；免疫藥物(immunological drugs)(諸如：疫苗以及免疫增強劑(immune stimulants))；諸如：色甘酸鈉(cromolyn sodium)、可多替芬(ketotifen)、洛度沙胺(lodoxamide)、內多克麗米爾(nedocrimil)、奧洛他定(olopatadine)以及諸如：全達黴素(gentimicin)以及西多福韋(cidofovir)之吡嘧司特睫狀體消溶劑(pemirolastciliary body ablative agents)之MAST細胞安定劑(cell stabilizer agents)；以及諸如：維替波吩(verteporfin)、丙美卡因(proparacaine)、四卡因(tetracaine)、環孢黴素(cyclosporine)以及匹魯卡品(pilocarpine)之其他眼科藥劑(ophthalmic agents)；細胞表面糖蛋白接收器抑制劑(inhibitor s of cell-surface glycoprotein receptors)；諸如：脫羥腎上腺素(phenylephrine)、萘甲唑啉(naphazoline)、四胼林(tetrahydrazoline)之解充血劑(decongestants)、脂質或低血壓脂質(hypotensive lipids)；諸如：喹吡羅(quinpirole)、非諾多泮(fenoldopam)以及異波帕胺(ibopamine)之多巴胺受體促效劑(dopaminergic agonists)及/或拮抗劑；血管痙孿抑制劑(vasospasm inhibitors)；血管擴張劑(vasodilators)；抗高血壓藥物(antihypertensive agents)、血管緊縮素轉化酶(angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors)；諸如：奧美沙坦(olmesartan)之血管緊縮素-1受體拮抗劑(angiotensin-1 receptor antagonists)；微管抑制劑(microtubule inhibitors)；分子馬達(molecular motor)(動力蛋白(dynein) 以及/或驅動蛋白(kinesin))抑制劑；肌動蛋白细胞骨架調節劑(actin cytoskeleton regulatory agents)諸如：細胞鬆弛素(cyctchalasin)、拉特潤枯林(latrunculin)、海洋苔藓素A(swinholide A)、埃酒克林酸(ethacrynic acid)、H-7以及Rho-激酶抑制劑(Rho-kinase，ROCK，inhibitors)；重塑抑制劑(remodeling inhibitors)；諸如：叔-丁基氫-喹諾酮(tert-butylhydro-quinolone)以及AL-3037A之細胞外基質的調節物；諸如N-6-環己基腺苷(N-6-cylclophexyladenosine)以及(R)-苯異丙基腺苷((R)-phenylisopropyladenosine)之腺苷接收器抑制劑(adenosine receptor agonists)及/或拮抗劑；血清素拮抗(serotonin agonists)；諸如：***(estrogens)、***(estradiol)、助孕素(progestational hormones)、孕酮(progesterone)、胰島素、降鈣素(calcitonin)、副甲狀腺素(parathyroid hormone)、胜肽以及抗利尿激素下視丘釋放因子(vasopressin hypothalamus releasing factor)之荷爾蒙劑(hormonal agents)；舉例而言，包含表皮生長因子(epidermal growth factor)、纖維母細胞生長因子、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor)、轉化生長因子β(transforming growth factor beta)、生長激素(somatotrapin)、纖連蛋白、 結締組織生長因子(connective tissue growth factor)、骨型態發生蛋白(bone morphogenic proteins, BMPs)、腦源神經營養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)、神經膠質細胞株衍生神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor, IGF)及神經生長因子(nerve growth factor, NGF)之生長因子拮抗劑(growth factor antagonists)或生長因子(growth factors)；以及/或諸如：白血球介素、CD44、科格林(cochlin)、骨橋蛋白、多效生長因子(pleotrophin)、中期因子、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)以及諸如：血清澱粉樣蛋白A(serum amyloid A)的血清澱粉樣蛋白(serum amyloids)之細胞激素。
其他治療試劑可包含，但不限於，諸如：蘆貝魯唑(lubezole)、尼莫地平(nimodipine)及相關化合物之神經保護劑(neuroprotective agents)以及包含血流增強劑(blood flow enhancers)、鈉離子通道阻斷劑(sodium channels blockers)、諸如美金剛(memantine)的麩胺酸抑制劑(glutamate inhibitors)、神經營養因子、氧化氮合成酶抑制劑(nitric oxide synthase inhibitors)；自由基捕捉劑(free radical scavengers)或抗氧化劑(anti-oxidants)；螯合物(chelating compounds)；細胞凋亡相關蛋白酶抑制劑(apoptosis-related protease inhibitors)；減少新蛋白質合成之化合物；放射線治療劑(radiotherapeutic agents)；光動力治療劑(photodynamic therapy agents)；基因治療劑(gene therapy agents)；基因調節劑(genetic modulators)以及諸如：環孢黴素 A、緩和劑(delmulcents)以及玻璃酸鈉(sodium hyaluronate)之乾眼藥物(d ry eye medications)；諸如：多沙唑嗪(doxazosin)、哌唑嗪(prazosin)以及特拉唑嗪(terazosin)之α阻斷劑(alpha blocker agents)；諸如：氨氯地平(amlodipine)、苄普地爾(bepridil)、地爾硫卓(diltiazem)、非洛地(felodipine)、依拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼索地平(nisoldipine)以及維拉帕米(verapamil)之鈣離子通道阻斷劑(calcium-channel blockers)；諸如：可尼丁(clonidine)、二氮嗪(diazoxide)、非諾多泮(fenoldopan)、聯胺肼(hydralazine)、敏樂定(minoxidil)、硝普鹽(nitroprusside)、酚苄胺(phenoxybenzamine)、依前列醇(epoprostenol)、妥拉蘇林(tolazoline)、曲前列環素(treprostinil)以及亞硝酸類劑(nitrate-based agents)之其他降血壓劑(anti-hypertensive agents)；包含諸如：肝素(heparin)、達 肝素(dalteparin)、依諾肝素(enoxaparin)、亭紮肝素(tinzaparin)以及方達帕林(fondaparinux)的肝素以及類肝素(heparinoids)之抗凝血藥物(anti-coagulant agents)；諸如水蛭素(hirudin)、蛋白脢抑制劑(aprotinin)、阿加曲班(argatroban)、比伐盧定(bivalirudin)、地西盧定(desirudin)、來匹盧定(lepirudin)、苯甲香豆醇(warfarin)以及希美加群(ximelagatran)之其他抗凝血藥物；以及/或諸如：阿昔單抗(abciximab)、氯吡格雷(clopidogrel)、雙嘧達莫(dipyridamole)、依替巴肽(optifibatide)、噻氯匹定(ticlopidine)以及替羅非班(tirofiban)之抗血小板劑(anti-platelet agents)。
其他治療試劑可包含，但不限於，諸如：前列地爾(alprostadil)、卡前列素(carboprost)、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)以及伐地那非(vardenafil)之***素PDE-5抑制劑(prostaglandin PDE-5 inhibitors)以及其他***素劑(prostaglandin agents)；凝血酶抑制劑(thrombin inhibitors)；抗凝血劑(antithrombogenic agents)；抗血小板凝集劑(anti-platelet aggregating agents)；血栓溶解劑(thrombolytic agents)；及/或諸如：阿帖普酶(alteplase)、阿尼普酶(anistreplase)、瑞替普酶(reteplase)、鏈激酶(streptokinase)、替奈普酶(tenecteplase)以及尿激酶(urokinase)之纖維蛋白溶解劑(fibrinolytic agents)；諸如：西羅莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)、依維莫司(everolimus)、佐他莫司(zotarolimus)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)以及黴酚酸(mycophenolic acid)之抗增生劑(anti-proliferative agents)；包含左旋甲狀腺素(levothyroxine)、氟羥***(fluoxymestrone)、甲基睪固酮(methyltestosterone)、諾龍(norandrolone)、氧雄龍(oxandrolone)、睪固酮(testosterone)、***(estradiol)、雌酮(estrone)、雌酮硫酸酯哌嗪(estropipate)、克羅米芬(clomiphene)、性腺激素(gonadotropins)、羥孕酮(hydroxyprogesterone)、左炔諾孕酮(levonorgestrel)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、米非司酮(mifepristone)、炔諾酮(norethindrone)、縮宮素((oxytocin)、孕酮、雷洛昔芬(raloxifene)以及他莫昔芬(tamoxifen)之荷爾蒙相關劑(hormonal-related agents)；包含諸如：卡莫司汀環己亞硝(carmustine lomustine)、氮芥***酸(melphalan)、順鉑(cisplatin)、3-氟尿嘧啶(fluorouracil3)以及諸如博萊霉素(bleomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、艾達魯比辛(idarubicin)、絲裂黴素(mitomycin)以及普卡黴素(plicamycin)的甲基苄肼類抗生素劑(procarbazine antibiotic-like agents)之烷化劑(alkylating agents)之抗腫瘤藥(anti-neoplastic agents)；抗增生劑(anti proliferative agents)(諸如：1,3-順 視黃酸(1,3-cis retinoic acid)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、紫杉醇(taxol)、雷帕霉素(rapamycin)、絲裂黴素C以及順鉑)；諸如：阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、羥基脲(hydroxyurea)、巰嘌呤(mercaptopurine)以及5-氟尿嘧啶(5-flurouracil，5-FU)之抗代謝劑(antimetabolite agents)；諸如：阿地白介素(aldesleukin)、甲磺酸依麥替尼布(imatinib)、利妥昔單株抗體(rituximab)以及托西莫單株抗體(tositumomab)之免疫調節劑(immune modulating agents)；有絲***抑制劑(mitotic inhibitors)：多西他賽(docetaxel)、依託泊苷(etoposide)、長春花鹼(vinblastine)以及長春新鹼(vincristine)；諸如：鍶-89(strontium-89)之放射性劑(radioactive agents)；以及/或諸如：伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)以及米托坦(mitotan)之其他抗腫瘤劑。
套組與仿單(Instructions)
亦提供套組，其含有適合用於本文所揭露之方法(例如：治療視網膜疾病或狀態或製造或分離胎兒神經視網膜細胞的異質混合物)之任何本文所述之組合物(例如：胎兒神經視網膜細胞的異質混合物)，包含其使用說明書。亦提供套組，其含有組合物、製造的產物或細胞的混合物或培養(例如：胎兒神經視網膜細胞的異質混合物)，其中套組還選擇性地包含用來實現本文所述之任何方法之說明書。
套組亦可包含含有本文所述之哺乳動物視網膜前驅細胞之細胞群體，不管細胞以培養、新鮮或冷凍提供或者被製備為用來給藥予個體的組合物。同樣地，套組可更包含用來實現本文所述之方法的說明書。在一些實施例中，此套組可額外地含有與本文所述之視網膜前驅細胞的一或多個標記結合之試劑(例如：抗體或寡聚核苷酸引子(oligonucleotide primer))以及/或基本或條件培養基。在替代性實施例中，適合的套組可包含含有對一或多個標記具專一性的抗體之第一容器與含有基本或條件培養基之第二個容器，其中所述抗體例如通過與熒光標記物或磁珠結合(conjugated)而適用於分離或檢測。套件可更包含有利於本發明的細胞群體之製備的一或多個其他試劑，諸如：細胞培養基、細胞外基質塗佈的細胞培養皿以及/或適合用於組織處理的酵素。套件亦可包含有關其用於分離、純化、以及/或擴張從組織樣本取得之視網膜前驅細胞或細胞群體之使用說明書。同樣地，套件可更包含用來從病人或捐贈者取得組織樣本之方法以及/或用來盛裝取得的組織樣本之容器。
獸醫學上的應用
本文所描述之任何組合物與方法亦可用於獸醫學上的應用。舉例而言，貓的RPCs的生長與營養不良的貓及其他動物的視網膜之治療應用，例如任何哺乳類寵物、常見的馴養的及罕見野生哺乳動物物種、動物園動物、農場動物、運動動物(例如賽狗或賽馬)以及其類似動物。
有許多馴養動物攜帶由於大量近親繁殖導致失明的基因。這些包含貓、狗、馬，可能還有其他物種。
同樣地，在野生及馴養的動物中發生的視網膜疾病和損傷將受益於使用本文所述的組合物和方法的治療。
製造的產品、植體與人工器官
亦提供包含本文所描述含有胎兒神經視網膜細胞之異質混合物之一或多個組合物之植體、人工器官、生物反應器系統、細胞培養系統、皿、盤、試管、瓶、及燒瓶以及類似物。
在替代性實施例中，藉由非限制實施例的方式，本文額外提供含有胎兒神經視網膜細胞之異質混合物的生物反應器、植體、支架、人工器官或相似的裝置；舉例而言，植體類似或如美國專利案No.7,388,042、7,381,418、7,379,765、7,361,332、7,351,423、 6,886,568、5,270,192所描述的，以及美國專利申請案公告No.20040127987、20080119909(描述耳的植體(auricular implants))、20080118549(描述眼的植體)、20080020015(描述生物活性傷口敷料)、20070254005(描述心臟瓣膜生物假體、血管移植物、半月板植體)、20070059335、20060128015(描述肝植體)
均等物
在以上的描述中闡述了本發明的一個或多個實施例的細節。雖然於本發明的實踐或測試可用與本文描述的類似或均等於的任何方法和材料，但現在描述優選的方法和材料。
已呈現的前述描述，僅用於說明之目的並且不意欲將本發明限制在所公開的精確形式，而是將本發明以附加的申請專利範圍限制。
已描述本發明的一些實施例。雖然，可被理解的是，在沒有背離本發明的精神與範疇之下，可作各種修改。據此，其他實施例是在下列申請專利範圍之內。
無。
無。

Claims (56)

  1. 一種用於一個體的製劑、製造的產物或組合物： 作為藥物， 在治療一視網膜疾病或狀態為有效的， 其中該製劑、該製造的產物或該組合物包括：包括非不凋亡的人類視網膜前驅細胞的細胞群體， 其中該製劑、該製造的產物或該組合物之製造係藉由： 機械地以及/或酵素地消化(digesting)從介於約12週至約28週之間的孕齡的人類取得之人類視網膜組織樣本以產生細胞及細胞簇的一解離懸浮液； 在標準氧氣濃度之下，在一培養瓶或塗佈有無異源纖連蛋白(xeno-free fibronectin)、鳥氨酸、聚賴氨酸或層黏連蛋白之一培養皿中的無血清培養基培養該解離懸浮液介於約4至6次之間的傳代；以及 在低氧氣濃度之下，在無血清培養基接續培養該解離懸浮液另外介於約3至6次之間的傳代； 其中細胞以40％至90％之間的匯合傳代，並在每次傳代時用酵素處理以解離細胞並加入新鮮培養基， 從而製造非不凋亡的人類視網膜前驅細胞， 其中非不凋亡的人類視網膜前驅細胞表現選自由巢蛋白、Sox2、Ki-67、MHC Class I、MHC Class II、骨橋蛋白(OPN)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)及Fas/CD95所組成之群組中之一或多個標記， 其中巢蛋白被群體中大於90%的細胞表現； 其中Sox2被群體中大於80%的細胞表現； 其中Ki-67被群體中大於30%的細胞表現； 其中MHC Class I被群體中大於70%的細胞表現； 其中Fas/CD95被群體中大於30%的細胞表現； 其中MHC Class II被群體中小於2%的細胞表現； 其中骨橋蛋白(OPN)以大於20 ng/106 cells/24 hours的量被群體中的細胞表現；以及 其中當以細胞存在於不包含鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之載體內為基線時，bFGF以介於50至300 pg/106 cells/ hour之間的量被群體中的細胞表現。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中群體中的細胞以介於0.5至2.5 ng/106 cells/24 hours之間的量表現中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)， 以高達30 ng/106 cells/24 hours之量表現色素上皮衍生因子(PEDF)， 以介於50至600 pg/106 cells/24 hours之量表現多效蛋白(PTN)；以及/或 以高達12 ng/106 cells/24 hours之量表現中期因子(MDK)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中於該解離懸浮液在低氧氣濃度之下的接續培養後，細胞會在標準氧氣濃度之下不傳代地成長一時間期間。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中該時間期間包括介於1小時至5天之間。
  5. 如申請專利範圍第1項至第3項中之任一項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中低氧氣濃度係選自由0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣所組成之群組。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中之任一項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中介於0.01 mg/ml至0.5 mg/ml之間的維他命C被包含在每1至2天更換的培養基中。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中之任一項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中該個體為人類。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中之任一項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中該製劑、該製造的產物或該組合物係配製以用於注射於該個體之玻璃體腔或視網膜下空間。
  9. 用於如申請專利範圍第1至8項中之任一項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中該視網膜疾病或狀態包括色素病變(RP)、萊伯氏先天性黑矇症(LCA)、斯特格氏病、Usher's 綜合症、脈絡膜缺失症、視桿-視錐或視錐-視桿失養症、纖毛病變、粒線體疾病、漸進式視網膜萎縮症、視網膜退化病變、老年性黃斑部病變(AMD)、濕式AMD、乾式AMD、地圖狀萎縮、家族性黃斑病變或後天性黃斑病變、視網光感受器疾病、視網膜色素上皮層疾病、糖尿病視網膜病變、黃斑囊樣水腫、葡萄膜炎、視網膜剝離、創傷性視網膜損傷、醫源性視網膜損傷、黃斑裂孔、黃斑毛細血管擴張症、神經節細胞疾病、視神經細胞疾病、青光眼、視神經病變、血性視網膜疾病、早產兒視網膜病變、視網膜血管阻塞、家族性巨動脈瘤、視網膜血管疾病、眼血管疾病、血管疾病或缺血性視神經病變。
  10. 用於如申請專利範圍第1至9項中之任一項所述之製劑、製造的產物或組合物，其中在該製劑、該製造的產物或該組合物中的細胞更表現選自由波形蛋白、CD9、CD81、AQP4、CXCR4、CD15/LeX/SSEA1、GD2神經節苷脂、CD133、β3-微管蛋白、MAP2、GFAP、OPN/SPP1、PTN、KDR以及TEK所組成之群組中之一或多個標記。
  11. 一種製造包括非不凋亡的人類胎兒神經視網細胞的一異質混合物之製劑、製造的產物或組合物的方法，其包括: (a) 機械地以及/或酵素地解離從介於12週至約28週之間的孕齡的人類取得之人類視網膜組織細胞樣本以產生細胞及細胞簇的一解離懸浮液； 其中細胞以及/或小細胞簇的採集樣本係使用胰蛋白酵素或均等物酵素地解離； (b) 在標準氧氣濃度之下，在一培養瓶或塗佈有無異源纖連蛋白、鳥氨酸、聚賴氨酸或層黏連蛋白之一培養皿中的無血清培養基培養該解離懸浮液介於約4至6次之間的傳代；以及 (c) 在低氧氣濃度之下，在無血清培養基接續培養該解離懸浮液另外介於約3至6次之間的傳代； 其中細胞以40％至90％之間的匯合傳代，並在每次傳代時用酵素處理以解離細胞，且培養基約每1至2天更換。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中於該解離懸浮液在低氧氣濃度之下的接續培養後，細胞會在標準氧氣濃度之下不傳代地成長一時間期間。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該時間期間包括介於1小時至5天之間。
  14. 如申請專利範圍第11項或第12項所述之方法，其中該低氧氣濃度係選自由0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣所組成之群組。
  15. 如申請專利範圍第10項至第13項中之任一項所述之方法，其中介於0.01 mg/ml至0.5 mg/ml之間的維他命C被包含在每1至2天更換的培養基中。
  16. 如申請專利範圍第11項至第15項中之任一項所述之方法，其中細胞以及/或細胞簇被培養於基本培養基中。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中細胞以及/或細胞簇被與幫助細胞存活或成長的一補充物或一添加劑一起培養。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中幫助細胞存活或成長的該補充物或該添加劑係選自由左旋麩醯胺酸、由EGF及bFGF(Invitrogen)組成的人工重組生長因子與其他生長因子所組成之群組。
  19. 如申請專利範圍第11項至第18項中之任一項所述之方法，其中培養基補充有具有約1.0 mg/ml的起始濃度之量的白蛋白或重組白蛋白。
  20. 如申請專利範圍第11項至第19項中之任一項所述之方法，其中細胞的樣本以病原體、細菌、內毒素、真菌、黴漿菌、病毒、肝炎病毒或HIV病毒的存在篩選。
  21. 如申請專利範圍第11項至第20項中之任一項所述之方法，其中細胞的樣本以正常核型的存在篩選。
  22. 如申請專利範圍第11項至第21項中之任一項所述之方法，其中細胞的樣本不顯示升高的端粒酶活性。
  23. 如申請專利範圍第11項至第22項中之任一項所述之方法，其中細胞的樣本以生存能力篩選。
  24. 如申請專利範圍第11項至第23項中之任一項所述之方法，其中細胞的樣本以致腫瘤性篩選。
  25. 如申請專利範圍第11項至第24項中之任一項所述之方法，其中用於製造非不凋亡的人類胎兒神經視網細胞的該異質混合物之方法，更包括: (a) 依據細胞表面或基因標記選擇人類胎兒神經視網細胞；或者 (b) 依據人類胎兒神經視網膜細胞轉錄組譜、蛋白質體組譜或基因組譜選擇人類胎兒神經視網細胞。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中 (i) 步驟(a)更包括在培養前(預期的)或在培養後之一或者兩者來選擇細胞； (ii) 細胞表面或基因標記包括CD15/LeX/SSEA1以及/或GD2神經節苷脂；或者 (iii) 細胞表面或基因標記包括CD9、CD81、CD133或AQP4以及/或CXCR4。
  27. 一種用於分離非不凋亡的人類視網膜前驅細胞的群體之方法，其包括： 機械地以及/或酵素地解離來自在視網膜形成之後但在光感受器外段貫穿視網膜完全地形成之前並且在視網膜血管形成實質上完成或完成之前的階段之人類視網膜組織的樣本以產生細胞及細胞簇的一解離懸浮液； 在標準氧氣濃度之下，在一培養瓶或塗佈有無異源纖連蛋白、鳥氨酸、聚賴氨酸或層黏連蛋白之一培養皿中的無血清培養基培養該解離懸浮液介於約4至6次之間的傳代；以及 在低氧氣濃度之下，在無血清培養基接續培養該解離懸浮液另外介於約3至6次之間的傳代； 其中細胞以40％至90％之間的匯合傳代，並在每次傳代時用酵素處理以解離細胞， 其中人類視網膜前驅細胞表現選自由巢蛋白、Sox2、Ki-67、MHC Class I、MHC Class II、骨橋蛋白(OPN)及Fas/CD95所組成之群組中之一或多個標記，其中巢蛋白被群體中大於90%的細胞表現；其中Sox2被群體中大於80%的細胞表現；其中Ki-67被群體中大於30%的細胞表現；其中MHC Class I被群體中大於70%的細胞表現；其中Fas/CD95被群體中大於30%的細胞表現；其中MHC Class II被群體中小於2%的細胞表現；其中骨橋蛋白(OPN)以大於20 ng/106 cells/24 hours的量被群體中的細胞表現；以及其中當以細胞存在於不包含鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之載體內為基線時，bFGF以介於50至300 pg/106 cells/ hour之間的量被群體中的細胞表現。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之方法，其中在群體內之細胞介於0.5至2.5 ng/106 cells/24 hours之間的量表現中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)、以高達30 ng/106 cells/24 hours之量表現色素上皮衍生因子(PEDF)、以介於50至600 pg/106 cells/24 hours之間的量表現多效蛋白(PTN)以及/或以高達12 ng/106 cells/24 hours之量表現中期因子(MDK)。
  29. 如申請專利範圍第27項所述之方法，其中於該解離懸浮液在低氧氣濃度之下的接續培養後，細胞會在標準氧氣濃度之下不傳代地成長一時間期間。
  30. 如申請專利範圍第29所述之方法，其中該時間期間包括介於1小時至5天之間。
  31. 如申請專利範圍第27項或第28項所述之方法，其中低氧氣濃度係選自由0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣所組成之群組。
  32. 如申請專利範圍第27項至第31項中之任一項所述之方法，其中培養基每1至2天更換。
  33. 如申請專利範圍第27項至第32項中之任一項所述之方法，其中介於0.01 mg/ml至0.5 mg/ml之間的維他命C被包含在每1至2天更換的培養基中。
  34. 如申請專利範圍第27項至第33項中之任一項所述之方法，其中人類視網膜組織係從介於約12週至約28週之間的孕齡的人類胎兒視網膜取得。
  35. 如申請專利範圍第27項至第33項中之任一項所述之方法，其中細胞被培養在無血清或減少血清細胞培養基。
  36. 如申請專利範圍第27項至第35項中之任一項所述之方法，其中培養基更包括白蛋白。
  37. 如申請專利範圍第27項至第36項中之任一項所述之方法，其中群體內的細胞更表現選自由波形蛋白、CD9、CD81、AQP4、CXCR4、CD15/LeX/SSEA1、GD2神經節苷脂、CD133、β3-微管蛋白、MAP2、GFAP、OPN/SPP1、PTN、KDR以及TEK所組成之群組中之一或多個標記。
  38. 一種用於治療、改善、預防或減緩一病患的一視網膜疾病或狀態的進程之方法，其包括給予有效劑量的供使用的一製劑、一製造的產物或一組合物， 其中該製劑、該製造的產物或該組合物包括：包括非不凋亡的人類視網膜前驅細胞的細胞群體， 其中該製劑、該製造的產物或該組合物之製造係： 機械地以及/或酵素地消化從介於約12週至約28週之間的孕齡的人類取得之人類視網膜組織樣本以產生細胞及細胞簇的一解離懸浮液； 在標準氧氣濃度之下，在培養瓶或塗佈有無異源纖連蛋白、鳥氨酸、聚賴氨酸或層黏連蛋白之培養皿中的無血清培養基培養該解離懸浮液介於約4至6次之間的傳代；以及 在低氧氣濃度之下，在無血清培養基接續培養該解離懸浮液另外介於約3至6次之間的傳代； 其中細胞以40％至90％之間的匯合傳代，並在每次傳代時用酵素處理以解離細胞並加入新鮮培養基，因此製造非不凋亡的人類視網膜前驅細胞， 其中非不凋亡的人類視網膜前驅細胞表現選自由巢蛋白、Sox2、Ki-67、MHC Class I、MHC Class II、骨橋蛋白(OPN)及Fas/CD95所組成之群組中之一或多個標記， 其中巢蛋白被群體中大於90%的細胞表現； 其中Sox2被群體中大於80%的細胞表現； 其中Ki-67被群體中大於30%的細胞表現； 其中MHC Class I被群體中大於70%的細胞表現； 其中Fas/CD95被群體中大於30%的細胞表現； 其中MHC Class II被群體中小於2%的細胞表現； 其中骨橋蛋白(OPN)以大於20 ng/106 cells/24 hours的量被群體中的細胞表現；以及 其中當以細胞存在於不包含鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之載體內為基線時，bFGF以介於50至300 pg/106 cells/ hour之間的量被群體中的細胞表現。
  39. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中群體中的細胞以介於0.5至2.5 ng/106 cells/24 hours之間的量表現中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)， 以高達30 ng/106 cells/24 hours之量表現色素上皮衍生因子(PEDF)， 以介於50至600 pg/106 cells/24 hours之量表現多效蛋白(PTN)；以及/或 以高達12 ng/106 cells/24 hours之量表現中期因子(MDK)。
  40. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中於該解離懸浮液在低氧氣濃度之下的接續培養後，細胞會在標準氧氣濃度之下不傳代地成長一時間期間。
  41. 如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該時間期間包括介於1小時至5天之間。
  42. 如申請專利範圍第38項至第40項中之任一項所述之方法，其中低氧氣濃度係選自由0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%氧氣所組成之群組。
  43. 如申請專利範圍第38項至第42項中之任一項所述之方法，其中介於0.01 mg/ml至0.5 mg/ml之間的維他命C被包含在每1至2天更換的培養基中。
  44. 如申請專利範圍第38項至第43項中之任一項所述之方法，其中該病患為人類。
  45. 如申請專利範圍第38項至第44項中之任一項所述之方法，其中該製劑、該製造的產物或該組合物被注射於該病患之玻璃體腔或視網膜下空間。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之方法，其中該製劑、該製造的產物或該組合物被注射於玻璃體腔的前區。
  47. 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中該製劑、該製造的產物或該組合物被注射於玻璃體腔的後區。
  48. 如申請專利範圍第38項至第47項中之任一項所述之方法，其中該視網膜疾病或狀態包括色素病變(RP)、萊伯氏先天性黑矇症(LCA)、斯特格氏病、Usher's綜合症、脈絡膜缺失症、視桿-視錐或視錐-視桿失養症、纖毛病變、粒線體疾病、漸進式視網膜萎縮症、視網膜退化病變、老年性黃斑部病變(AMD)、濕式AMD、乾式AMD、地圖狀萎縮、家族性黃斑病變或後天性黃斑病變、視網光感受器疾病、視網膜色素上皮層疾病、糖尿病視網膜病變、黃斑囊樣水腫、葡萄膜炎、視網膜剝離、創傷性視網膜損傷、醫源性視網膜損傷、黃斑裂孔、黃斑毛細血管擴張症、神經節細胞疾病、視神經細胞疾病、青光眼、視神經病變、血性視網膜疾病、早產兒視網膜病變、視網膜血管阻塞、家族性巨動脈瘤、視網膜血管疾病、眼血管疾病、血管疾病或缺血性視神經病變。
  49. 如申請專利範圍第38項至第48項中之任一項所述之方法，其中有效量為介於0.3至0.5x106 個細胞之間。
  50. 如申請專利範圍第38項至第48項中之任一項所述之方法，其中有效量為介於0.5至3x106 個細胞之間。
  51. 如申請專利範圍第38項至第50項中之任一項所述之方法，其中該方法更包括玻璃體切除手術、核心玻璃體切除術以及/或玻璃體溶解物質或其結合的使用與有效劑量的供使用的該製劑、該製造的產物或該組合物給予一起之組合。
  52. 如申請專利範圍第38項至第51項中之任一項所述之方法，其中該病患受到供使用的該製劑、該製造的產物或該組合物的至少一個後續劑量。
  53. 如申請專利範圍第52項所述之方法，其中該後續劑量被給予該病患的同一隻眼睛。
  54. 如申請專利範圍第52項所述之方法，其中該後續劑量被給予該病患的另一隻眼睛。
  55. 如申請專利範圍第38項至第54項中之任一項所述之方法，其中明視(日光)視力、視力敏銳度、黃斑功能、視野、暗視(夜間)視力或其任意結合在給予該病患供使用的該製劑、該製造的產物或該組合物之後改善。
  56. 如申請專利範圍第38項至第54項中之任一項所述之方法，其中供使用的該製劑、該製造的產物或該組合物的給予導致一或多個下列結果： (i) 增強米勒細胞的活化； (ii) 增加麩胺醯胺合成酶的局部表現； (iii) 減少血管通透性； (iv) 減少缺血的發生； (v) 增強視網膜退化中之巨噬細胞的募集； (vi) 增加視網膜退化中之bFGF的局部表現； (vii) 降低半胱天冬酶3的表現。
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