JP6337905B2 - 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置 - Google Patents

表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置 Download PDF

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Description

本発明は、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance:SPR)を利用して試料液中に含まれる被検出物質を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置に関する。
タンパク質やDNAなどの生体物質を検出する測定において、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できれば、即時に患者の状態を把握し治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質に起因する微弱な光を、高感度かつ定量的に検出する分析方法および分析装置が求められている。被検出物質を高感度で検出する1つの方法としては、表面プラズモン共鳴蛍光分析法(表面プラズモン励起増強蛍光分光法(Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy):SPFS)が知られている。
SPFSでは、金属膜が所定の面上に配置されたプリズムを用いる。そして、プリズムを介して、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光を金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光(増強された電場)を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が励起されるため、蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。
SPFSでは、高感度かつ高精度な検出を行うためには、分析チップの位置を高い精度で合わせる必要がある。被検出物質の量(濃度)を正確に検出するためには、励起光の入射角を高精度に調整することが必要であるが、分析チップの位置がずれていると、励起光の入射角を高精度に調整することができない。また、被検出物質を高感度に検出するためには、励起光の照射スポットの形状および位置と金属膜上の反応場の形状および位置とが一致することが好ましいが、分析チップの位置がずれていると、励起光の照射スポットの形状および位置を高精度に調整することができない。一方で、ユーザーに分析チップの位置を高い精度で合わせることを要求することは、ユーザビリティ(使いやすさ)の観点から好ましくない。
SPFSではないが、分析チップに光を照射して被検出物質を検出する方法において、分析チップの位置合わせを行う方法がいくつか提案されている。たとえば、特許文献1には、SPR法を利用した検出において、分析チップ(フローセル)に2つの位置確認孔を形成することが開示されている。ユーザーは、この位置確認孔を利用することで分析チップの位置を調整することができる。また、特許文献2には、蛍光物質を利用した検出において、励起光とは別波長の照明光を分析チップ(バイオチップ)に照射し、照明光の反射光または透過光を検出して、分析チップの位置を特定することが開示されている。励起光とは別波長の照明光を利用することで、蛍光物質の退色を防ぎつつ分析チップの位置を特定することができる。
特開2009−288103号公報 特開2007−093250号公報
特許文献1に記載の位置合わせ方法には、2つの位置確認孔を形成しなければならないため、分析チップの製造コストが増大するという問題がある。また、ユーザーが位置合わせをしなければならないため、ユーザビリティが悪いという問題もある。
また、特許文献2に記載の位置合わせ方法には、励起光源とは異なる光源や波長制限フィルターなどを追加しなければならないため、分析装置の製造コストが増大するという問題がある。
本発明の目的は、分析チップおよび分析装置の製造コストの増大を防ぎつつ、分析チップの位置を高い精度で合わせることができる表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置を提供することである。
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを、搬送ステージに固定されたチップホルダーに設置する工程と、前記チップホルダーに設置された前記分析チップに励起光を照射するとともに、励起光の反射光または透過光を検出して、前記分析チップの位置情報を得る工程と、前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる工程と、前記測定位置に配置された前記分析チップに励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む。
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを着脱可能に保持するためのチップホルダーと、前記チップホルダーを移動させる搬送ステージと、前記チップホルダーに保持された前記分析チップに励起光を照射する励起光照射部と、前記分析チップで反射された励起光または前記分析チップを透過した励起光を検出する励起光検出部と、前記励起光検出部の検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの位置を特定するとともに、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる位置調整部と、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、を有する。
本発明によれば、安価な受光センサーを追加するのみで、ユーザーの手を煩わせることなく分析チップの高精度な位置合わせを実現することができる。したがって、本発明によれば、製造コストの増大およびユーザビリティの低下を防ぎつつ、被検出物質の高感度かつ高精度な検出を実現することができる。
図1は、本発明の一実施の形態に係るSPFS装置の構成を模式的に示す図である。 図2は、図1に示されるSPFS装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図3は、図2に示される位置調整工程(S140)内の工程を示すフローチャートである。 図4A〜Cは、分析チップの位置情報を得る工程(S141)を説明するための模式図である。 図5A,Bは、受光センサーによる反射光の検出結果の例を示すグラフである。 図6A〜Cは、分析チップの位置情報を得る工程(S141)を説明するための模式図である。 図7は、分析チップの別の例を示す断面図である。 図8は、分析チップの位置情報を得る工程(S141)を説明するための模式図である。 図9は、分析チップを測定位置に配置する工程(S142)を説明するための模式図である。 図10は、分析チップを測定位置に配置する工程(S142)を説明するための模式図である。 図11は、図1に示されるSPFS装置の動作手順の別の例を示すフローチャートである。
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
図1は、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置(SPFS装置)100の構成を示す模式図である。図1に示されるように、SPFS装置100は、励起光照射ユニット110、励起光検出ユニット120、蛍光検出ユニット130、送液ユニット140、搬送ユニット150および制御部160を有する。SPFS装置100は、搬送ユニット150のチップホルダー154に分析チップ10を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ10について先に説明し、その後にSPFS装置100の各構成要素について説明する。
分析チップ10は、入射面21、成膜面22および出射面23を有するプリズム20と、成膜面22に形成された金属膜30と、成膜面22または金属膜30上に配置された流路蓋40とを有する。通常、分析チップ10は、分析のたびに交換される。分析チップ10は、好ましくは各片の長さが数mm〜数cmの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
プリズム20は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム20は、入射面21、成膜面22および出射面23を有する。入射面21は、励起光照射ユニット110からの励起光αをプリズム20の内部に入射させる。成膜面22上には、金属膜30が配置されている。プリズム20の内部に入射した励起光αは、金属膜30の裏面で反射する。より具体的には、励起光αは、プリズム20と金属膜30との界面(成膜面22)で反射する。出射面23は、金属膜30で反射した励起光αをプリズム20の外部に出射させる。
プリズム20の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム20の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面22であり、一方の脚に対応する面が入射面21であり、他方の脚に対応する面が出射面23である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面21と出射面23とが対称になり、励起光αのS波成分がプリズム20内に滞留しにくくなる。
入射面21は、励起光αが励起光照射ユニット110に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード(以下「LD」ともいう)である場合、励起光αがLDに戻ると、LDの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面21に垂直に入射しないように、入射面21の角度が設定される。本実施の形態では、入射面21と成膜面22との角度および成膜面22と出射面23との角度は、いずれも約80°である。
なお、分析チップ10の設計により、共鳴角(およびその極近傍にある増強角)が概ね決まる。設計要素は、プリズム20の屈折率、金属膜30の屈折率、金属膜30の膜厚、金属膜30の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜30に固定化された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
プリズム20は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム20の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム20の材料は、好ましくは、屈折率が1.4〜1.6であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
金属膜30は、プリズム20の成膜面22上に配置されている。これにより、成膜面22に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜30中の自由電子との間で相互作用(表面プラズモン共鳴)が生じ、金属膜30の表面上に局在場光を生じさせることができる。
金属膜30の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜30の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜30は、金薄膜である。金属膜30の形成方法は、特に限定されない。金属膜30の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜30の厚みは、特に限定されないが、30〜70nmの範囲内が好ましい。
また、図1では図示しないが、金属膜30のプリズム20と対向しない面(金属膜30の表面)には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜30上の所定の領域(反応場)に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。
流路蓋40は、金属膜30上に配置されている。金属膜30がプリズム20の成膜面22の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋40は、成膜面22上に配置されていてもよい。流路蓋40の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋40は、金属膜30(およびプリズム20)と共に、液体が流れる流路41を形成する。液体の例には、被検出物質を含む試料液や、蛍光物質で標識された抗体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。金属膜30に固定化されている捕捉体は、流路41内に露出している。流路41の両端は、流路蓋40の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路41内へ液体が注入されると、液体は捕捉体に接触する。
流路蓋40は、金属膜30上から放出される蛍光γに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋40の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γを外部に取り出す部分が蛍光γに対して透明であれば、流路蓋40の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋40は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜30またはプリズム20に接合されている。
図1に示されるように、励起光αは、入射面21からプリズム20内に入射する。このとき、励起光αの一部は、入射面21で反射して反射光βとなる。プリズム20内に入射した励起光αは、金属膜30に全反射角度(表面プラズモン共鳴が生じる角度)で入射する。このように金属膜30に対して励起光αを表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射することで、金属膜30上に局在場光(一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる)を発生させることができる。この局在場光により、金属膜30上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが出射される。SPFS装置100は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を検出することで、被検出物質の存在または量を検出する。
次に、SPFS装置100の各構成要素について説明する。前述のとおり、SPFS装置100は、励起光照射ユニット110、励起光検出ユニット120、蛍光検出ユニット130、送液ユニット140、搬送ユニット150および制御部160を有する。
励起光照射ユニット110は、チップホルダー154に保持された分析チップ10に励起光αを出射する。蛍光γの測定時には、励起光照射ユニット110は、金属膜30に対する入射角が表面プラズモン共鳴を生じさせる角度となるように、金属膜30に対するP波のみを入射面21に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム20を介して金属膜30に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜30の表面上に生じさせる光である。本実施の形態に係るSPFS装置100では、励起光αは、分析チップ10の位置決めにも使用される。
励起光照射ユニット110は、励起光αをプリズム20に向けて出射するための構成と、金属膜30の裏面に対する励起光αの入射角度を走査するための構成とを含む。本実施の形態では、励起光照射ユニット110は、光源ユニット111、角度調整機構112および光源制御部113を含む。
光源ユニット111は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜30裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット111は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、APC機構および温度調整機構(いずれも不図示)を含む。
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード(LD)である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜30にP波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜30裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
APC機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、APC機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、APC機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
角度調整機構112は、金属膜30(プリズム20と金属膜30との界面(成膜面22))への励起光αの入射角を調整する。角度調整機構112は、プリズム20を介して金属膜30の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー154とを相対的に回転させる。
たとえば、角度調整機構112は、光源ユニット111を励起光αの光軸と直交する軸(図1の紙面に対して垂直な軸)を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜30上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における2つの励起光αの光軸の交点近傍(成膜面22上の照射位置と入射面21との間)に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
金属膜30に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光の最大光量を得られる角度が増強角である。増強角またはその近傍の角度に励起光αの入射角を設定することで、高強度の蛍光γを測定することが可能となる。なお、分析チップ10のプリズム20の材料および形状、金属膜30の膜厚、流路内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路内の蛍光物質の種類および量、プリズム20の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。本実施の形態では、金属膜30の法線(図1におけるz軸方向の直線)に対する励起光αの好適な出射角は、約70°である。
光源制御部113は、光源ユニット111に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット111の出射光(励起光α)の出射を制御する。光源制御部113は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
励起光検出ユニット120は、光学測定(例えば、増強角の検出や光学ブランク値の測定、蛍光γの検出など)を行う際の分析チップ10の位置決めのために、分析チップ10への励起光αの照射によって生じた反射光βまたは透過光β’を検出する。好ましくは、励起光検出ユニット120は、最初の光学測定を行う前に、分析チップ10の位置決めのために反射光βまたは透過光β’を検出する。多くの場合、最初の光学測定は、増強角の検出であることから、増強角の検出の前に反射光βまたは透過光β’を検出することが好ましい。増強角の検出を実施しない場合は、光学ブランクの測定前に反射光βまたは透過光β’を検出する。増強角の検出および光学ブランクの測定の両方を実施しない場合は、蛍光γの検出前に反射光βまたは透過光β’を検出する。本実施の形態では、励起光検出ユニット120は、励起光αの反射光βを検出する。励起光検出ユニット120は、受光センサー121およびセンサー制御部122を含む。
受光センサー121は、励起光αの反射光βを検出する。受光センサー121の種類は、励起光αの反射光または透過光を検出可能であれば特に限定されない。たとえば、受光センサー121は、フォトダイオード(PD)である。受光センサー121の受光面の大きさは、励起光αのビーム径よりも大きいことが好ましい。たとえば、励起光αのビーム径が1〜1.5mm程度の場合、受光センサー121の受光面の1辺の長さは3mm以上であることが好ましい。
受光センサー121は、励起光αの反射光βが入射する位置に配置される。本実施の形態では、受光センサー121は、入射面21からの反射光βが入射する位置に配置される。好ましくは、受光センサー121は、蛍光γの検出時と同じかまたはそれに近い角度で出射された励起光αの反射光βが入射する位置に配置される。励起光αの照射位置は、入射角の変化によりわずかに変化するため、分析チップ10の位置決め時と蛍光γの測定時とで励起光αの入射角を同じかまたはそれに近い角度にすることで、蛍光γの検出時の位置決め精度をより高くすることが可能となる。本実施の形態では、金属膜30の法線(図1におけるz軸方向の直線)に対する励起光αの出射角が約70°である場合、入射面21からの反射光βは、搬送ステージの進行方向(図1におけるx軸方向)にほぼ水平に進む。したがって、受光センサー121は、この水平方向に進む反射光βが入射する位置に配置される(図4C参照)。
センサー制御部122は、受光センサー121の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー121の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー121の感度の変更、などを制御する。センサー制御部122は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
蛍光検出ユニット130は、金属膜30への励起光αの照射によって生じた蛍光γを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット130は、金属膜30への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光も検出する。蛍光検出ユニット130は、例えば、受光ユニット131、位置切り替え機構132およびセンサー制御部133を含む。
受光ユニット131は、分析チップ10の金属膜30の法線方向(図1におけるz軸方向)に配置される。受光ユニット131は、第1レンズ134、光学フィルター135、第2レンズ136および受光センサー137を含む。
第1レンズ134は、例えば、集光レンズであり、金属膜30上から出射される光を集光する。第2レンズ136は、例えば、結像レンズであり、第1レンズ134で集光された光を受光センサー137の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター135は、両レンズの間に配置されている。
光学フィルター135は、蛍光成分のみを受光センサー137に導き、高いS/N比で蛍光γを検出するために、励起光成分(プラズモン散乱光)を除去する。光学フィルター135の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター135は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターであるが、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターであってもよい。
受光センサー137は、蛍光γを検出する。受光センサー137は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー137は、例えば、光電子増倍管(PMT)やアバランシェフォトダイオード(APD)などである。
位置切り替え機構132は、光学フィルター135の位置を、受光ユニット131における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー137が蛍光γを検出する時には、光学フィルター135を受光ユニット131の光路上に配置し、受光センサー137がプラズモン散乱光を検出する時には、光学フィルター135を受光ユニット131の光路外に配置する。位置切り替え機構132は、例えば、回転駆動部と、回転運動を利用して光学フィルター135を水平方向に移動させる公知の機構(ターンテーブルやラックアンドピニオンなど)とによって構成される。
センサー制御部133は、受光センサー137の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー137の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー137の感度の変更、などを制御する。センサー制御部133は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
送液ユニット140は、チップホルダー154に保持された分析チップ10の流路41内に、試料液や標識液、洗浄液などを供給する。送液ユニット140は、薬液チップ141、シリンジポンプ142および送液ポンプ駆動機構143を含む。
薬液チップ141は、試料液や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。薬液チップ141としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
シリンジポンプ142は、シリンジ144と、シリンジ144内を往復動作可能なプランジャー145とによって構成される。プランジャー145の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ144が交換可能であると、シリンジ144の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ144が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ144内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ144を交換せずに使用することが可能となる。
送液ポンプ駆動機構143は、プランジャー145の駆動装置、およびシリンジポンプ142の移動装置を含む。シリンジポンプ142の駆動装置は、プランジャー145を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ142の送液量や送液速度を管理できるため、分析チップ10の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ142の移動装置は、例えば、シリンジポンプ142を、シリンジ144の軸方向(例えば垂直方向)と、軸方向を横断する方向(例えば水平方向)との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ142の移動装置は、例えば、ロボットアーム、2軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
シリンジ144と分析チップ10との相対的な高さを一定に調整し、分析チップ10内での残液量を一定に管理する観点からは、送液ユニット140は、シリンジ144の先端の位置を検出する装置をさらに有することが好ましい。
送液ユニット140は、薬液チップ141より各種液体を吸引し、分析チップ10の流路41内に供給する。このとき、プランジャー145を動かすことで、分析チップ10中の流路41内を液体が往復し、流路41内の液体が攪拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路41内における反応(例えば抗原抗体反応)の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、分析チップ10の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ144がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、分析チップ10およびシリンジ144が構成されていることが好ましい。
流路41内の液体は、再びシリンジポンプ142で吸引され、薬液チップ141などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路41内の反応場に、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。
搬送ユニット150は、分析チップ10を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット110が分析チップ10に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光γを蛍光検出ユニット130が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット140が分析チップ10の流路41内に液体を供給するか、または分析チップ10の流路41内の液体を除去する位置である。搬送ユニット150は、搬送ステージ152およびチップホルダー154を含む。チップホルダー154は、搬送ステージ152に固定されており、分析チップ10を着脱可能に保持する。チップホルダー154の形状は、分析チップ10を保持することが可能であり、かつ励起光α、反射光βおよび蛍光γの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー154には、励起光α、反射光βおよび蛍光γが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ152は、チップホルダー154を一方向(図1におけるx軸方向)およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ152は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
制御部160は、角度調整機構112、光源制御部113、位置切り替え機構132、センサー制御部133、送液ポンプ駆動機構143および搬送ステージ152を制御する。また、制御部160は、励起光検出ユニット120の検出結果に基づいて、チップホルダー154に保持された分析チップ10の位置を特定するとともに、搬送ステージ152によりチップホルダー154を移動させて、分析チップ10を適切な測定位置に移動させる位置調整部としても機能する。制御部160は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
次に、SPFS装置100の検出動作(本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法)について説明する。図2は、SPFS装置100の動作手順の一例を示すフローチャートである。図3は、図2に示される位置調整工程(S140)内の工程を示すフローチャートである。
まず、SPFS装置100のチップホルダー154に分析チップ10が設置される(工程S100)。
次いで、制御部160は、搬送ステージ152を操作して、分析チップ10を送液位置に移動させる(工程S110)。
次いで、制御部160は、送液ユニット140を操作して、薬液チップ141内の試料液を分析チップ10の流路41内に導入する(工程S120)。流路41内では、抗原抗体反応(1次反応)によって、金属膜30上に被検出物質が捕捉される。この後、流路41内の試料液は除去され、流路41内は洗浄液で洗浄される。なお、分析チップ10の流路41内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、試料液を導入する前に流路41内を洗浄して保湿剤を除去する。
次いで、制御部160は、搬送ステージ152を操作して、分析チップ10を測定位置の近くまで移動させる(工程S130)。
次いで、制御部160は、励起光照射ユニット110、励起光検出ユニット120および搬送ステージ152を操作して、分析チップ10の位置情報を得るとともに、得られた位置情報に基づいて分析チップ10の位置を調整する(工程S140)。図3に示されるように、この工程では、まず、チップホルダー154に保持された分析チップ10に励起光αを照射するとともに、励起光αの反射光βを検出して、分析チップ10の位置情報を得る(工程S141)。これにより、測定位置からの分析チップ10の位置ずれの程度を特定することができる。次いで、得られた位置情報に基づいて、搬送ステージ152によりチップホルダー154を移動させて、分析チップ10を適切な測定位置に配置する(工程S142)。
図4は、分析チップ10の位置情報を得る工程(S141)を説明するための模式図である。まず、図4Aに示されるように、分析チップ10が光源ユニット111から離れた位置にある場合、光源ユニット111が励起光αを出射すると、励起光αは流路蓋40で反射して、下側(搬送ステージ152側)に向かう。したがって、励起光検出ユニット120の受光センサー121には、分析チップ10からの反射光βは入射しない。
この状態で分析チップ10を光源ユニット111に近づけていくと、光源ユニット111からの励起光αは、プリズム20と流路蓋40との境界部(以下「エッジ部」という)に到達する。この場合、図4Bに示されるように、流路蓋40で反射した励起光α(反射光β)は受光センサー121に入射しないが、入射面21で反射した励起光α(反射光β)は受光センサー121に入射する。したがって、受光センサー121には、分析チップ10からの反射光βの一部が入射する。
さらに分析チップ10を光源ユニット111に近づけていくと、光源ユニット111からの励起光αは、すべてプリズム20の入射面21に到達する。したがって、図4Cに示されるように、受光センサー121には、分析チップ10からの反射光βのすべてが入射する。
図5は、受光センサー121による反射光βの検出結果の例を示すグラフである。この例では、搬送ステージ152により分析チップ10を一方向(x軸方向)に100μmずつ移動させながら、受光センサー121により反射光βの強度を測定した。励起光αのビーム径は1〜1.5mm程度である。図5Aでは、検出結果のみを示しており、図5Bでは、3本の近似直線も示している。
図5Aに示されるように、分析チップ10の移動距離が0〜約1000μmの間は、受光センサー121には、分析チップ10からの反射光βは入射しない。これは、励起光αが、流路蓋40で反射して、下側(搬送ステージ152側)に向かうためである(図4A参照)。一方、分析チップ10の移動距離が約1000〜約2000μmの間は、受光センサー121に入射する反射光βの光量が徐々に増大する。これは、励起光αの一部が、入射面21で反射して、受光センサー121に入射するためである(図4B参照)。分析チップ10の移動距離が約2000μmを超えると、受光センサー121に入射する反射光βの光量が一定となる。これは、反射光βのすべてが、受光センサー121に入射するためである(図4C参照)。したがって、グラフ中の傾斜部(移動距離:約1000〜約2000μm)が、エッジ部に対応する。なお、傾斜部の幅は、励起光αのx軸方向のビーム径(1〜1.5mm程度)に対応している。
図5Bでは、前半の水平部(移動距離:0〜約1000μm)と、傾斜部(移動距離:約1000〜約2000μm)と、後半の水平部(移動距離:約2000μm超)のそれぞれを直線近似している。グラフ中の点Aは、前半の水平部の近似直線と傾斜部の近似直線との交点である。点Bは、傾斜部の近似直線と後半の水平部の近似直線との交点である。点Cは、点Aと点Bとの中点である。点Aは、反射光βの光量の最小値に対応する。点Bは、反射光βの光量の最大値に対応する。点Cは、反射光βの光量の中間値に対応する。
図5Bのグラフにおいて、分析チップ10の位置を特定するには、点A〜Cのいずれかを使用すればよい。点Aおよび点Bは、励起光αのビームの縁がエッジ部に到達した地点を示している。したがって、励起光αのビーム径を考慮すれば、エッジ部の位置を特定することができ、結果として分析チップ10の位置を特定することができる。一方、点Cは、励起光αのビームの中心がエッジ部に到達した地点を示している。点Cを利用する場合は、励起光αのビーム径を考慮することなく、エッジ部の位置を特定することができ、結果として分析チップ10の位置を特定することができる。したがって、励起光αのビーム径の影響を抑制する観点からは、励起光αの反射光β(または透過光β’)の光量の中間値を用いて、分析チップ10の位置を特定することが好ましい。
このように、分析チップ10に励起光αを照射するとともに、励起光αの反射光βを検出することで、分析チップ10の位置を特定することができる。このとき、図6Aに示されるように、分析チップ10の1つの面(図6Aでは入射面21)に励起光αを照射することで、分析チップ10の位置を特定してもよい。図6Aに示される例では、受光センサー121の受光面が小さくなっており、受光センサー121に反射光βが入射するかどうかで、入射面21の位置を特定することができる。しかしながら、分析チップ10の位置を水平方向(x軸方向)だけでなく高さ方向(z軸方向)についても高精度に特定する観点からは、図4に示されるように、分析チップ10の互いに隣接する2つの面に励起光αを照射することで、分析チップ10の位置を特定することが好ましい。この場合、搬送ステージ152によるチップホルダー154の移動方向に対して平行および垂直ではない方向に励起光αを照射することが好ましい。なお、図6Bに示されるように、流路蓋40からの反射光βが入射し、入射面21からの反射光βが入射しない位置に受光センサー121を配置しても、図4に示される例と同様の効果を得られる(反射光βの強度は、移動距離が短いときに高くなり、移動距離が長いときに低くなる)。
また、入射面21の位置が特に重要であることから、分析チップ10の互いに隣接する2つの面に励起光αを照射する場合は、分析チップ10の入射面21と入射面21に隣接する面(本実施の形態では流路蓋40の裏面)とに励起光αを照射することが好ましい。この場合、図6Cに示されるように、プリズム20の入射面21とプリズム20の下面とに励起光αを照射してもよい。しかしながら、図6Cに示される例では、分析チップ10の位置を特定するときに(工程S141)、分析チップ10が測定位置よりも光源ユニット111に近づいてしまう。したがって、分析チップ10を測定位置に移動させるときに(工程S142)、搬送ステージ152によりチップホルダー154を逆方向に移動させなければならない。このように搬送ステージ152を2方向に動作させることは、搬送ステージ152を1方向にのみ動作させる場合に比べて、動作精度の低下に繋がるおそれがある。これに対し、図4および図6A,Bに示される例では、搬送ステージ152によりチップホルダー154を逆方向に移動させる必要はない。したがって、分析チップ10の位置を高精度に調整する観点からは、分析チップ10の位置情報を得る工程(S141)および分析チップを測定位置に移動させる工程(S142)では、搬送ステージ152によりチップホルダー154を励起光αの光源(光源ユニット111)に近づく方向(x軸方向)にのみ移動させることが好ましい。
なお、上記「分析チップ10の互いに隣接する2つの面」には、実質的に隣接する2つの面が含まれる。たとえば、図7に示されるように、プリズム20と、プリズムの成膜面22上に配置された金属膜30と、金属膜30の上に配置されたスペーサー42と、スペーサー42の上に配置された流路蓋40とを有する分析チップ10’を使用するとする。流路41の形状は、スペーサー42により形作られている。一方、流路蓋40は、透明の平板である。この場合、厳密には、プリズム20の入射面21と流路蓋40の下面との間にスペーサー42の側面が存在するため、入射面21と流路蓋40の下面とは隣接していない。しかしながら、励起光αのビーム径(例えば1〜1.5mm)に比べてスペーサー42の厚みが非常に薄い(例えば100μm)場合、入射面21と流路蓋40の下面とが実質的に隣接していると考えられる。したがって、この場合は、実質的に隣接する入射面21および流路蓋40の下面からの反射光βを検出してエッジ部を検出する。接着剤や両面テープなどの接合部材や金属膜30などについても同様に無視することができる。
このように反射光βを検出する際に無視できる部材(例えばスペーサー42)の厚さは、励起光αのビーム径の1/5以下であり、好ましくは1/10以下である。たとえば、励起光αが、励起光αのビーム径の1/5以下または1/10以下の厚みのスペーサー42を含む領域に照射された場合、分析チップ10からの反射光βは、その大半(4/5以上または9/10以上)が入射面21または流路蓋40の下面からの反射光βであり、位置検出に利用されうる。したがって、スペーサー42の影響を受けることなく、分析チップ10の位置を特定することができる。このように、励起光αのビーム径の1/5以下の厚みの部材(スペーサー42や、接合部材、金属膜30など)は、反射光βを検出する際に無視することができる。すなわち、分析チップ10の入射面21と流路蓋40の下面は実質的に隣接する2面として考えることができる。
また、図8に示されるように、励起光αの反射光βの代わりに、励起光αの透過光β’を検出しても、分析チップ10の位置を特定することができる。図8に示される例では、励起光αが流路蓋40に入射した場合は、透過光β’が生じる。一方、励起光αが入射面21に入射した場合は、プリズム20の成膜面22で全反射が生じるため、透過光β’は生じない。したがって、受光センサー121が透過光β’を検出することで、エッジ部の位置を特定することができ、結果として分析チップ10の位置を特定することができる。
図9は、分析チップ10を適切な測定位置に配置する工程(工程S142)を説明するための模式図である。まず、図9Aに示されるように、エッジ部の位置を特定したとする。この場合、エッジ部の位置と金属膜30裏面の励起光αを照射すべき領域(反応場の裏側の領域)との距離は決まっているため、図9Bに示されるように、搬送ステージ152にチップホルダー154を所定の距離移動させることで、分析チップ10を適切な測定位置に配置することができる。
また、図10に示されるように、分析チップ10が高さ方向(z軸方向)にずれて配置されていた場合(例えば、分析チップ10とチップホルダー154との間にごみが挟まっていた場合)も、分析チップ10を適切な測定位置に配置することができる。すなわち、図10Aに示されるように、エッジ部の位置を特定したとする。この場合、分析チップ10がz軸方向にずれていない場合(図中破線で示す)に比べて、x軸方向における分析チップ10の位置はずれている。しかしながら、この場合であっても、図10Bに示されるように、エッジ部の位置に基づいて、搬送ステージ152にチップホルダー154を所定の距離移動させることで、分析チップ10を適切な測定位置に配置することができる。
SPFS装置100の動作手順の説明に戻る(図2参照)。次いで、制御部160は、励起光照射ユニット110および蛍光検出ユニット130を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ10に励起光αを照射するとともに、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光を検出して、増強角を検出する(工程S150)。具体的には、制御部160は、励起光照射ユニット110を操作して金属膜30に対する励起光αの入射角を走査しつつ、蛍光検出ユニット130を操作してプラズモン散乱光を検出する。このとき、制御部160は、位置切り替え機構132を操作して、光学フィルター135を受光ユニット131の光路外に配置する。そして、制御部160は、プラズモン散乱光の光量が最大の時の励起光αの入射角を増強角として決定する。
次いで、制御部160は、励起光照射ユニット110および蛍光検出ユニット130を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ10に励起光αを照射するとともに、受光センサー137の出力値(光学ブランク値)を記録する(工程S160)。このとき、制御部160は、角度調整機構112を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部160は、位置切り替え機構132を制御して、光学フィルター135を受光ユニット131の光路内に配置する。
次いで、制御部160は、搬送ステージ152を操作して、分析チップ10を送液位置に移動させる(工程S170)。
次いで、制御部160は、送液ユニット140を操作して、蛍光物質で標識された2次抗体を含む液体(標識液)を分析チップ10の流路41内に導入する(工程S180)。流路41内では、抗原抗体反応(2次反応)によって、金属膜30上に捕捉されている被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路41内の標識液は除去され、流路内は洗浄液で洗浄される。
次いで、制御部160は、搬送ステージ152を操作して、分析チップ10を工程S140で決定された適切な測定位置に移動させる(工程S190)。
次いで、制御部160は、励起光照射ユニット110および蛍光検出ユニット130を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ10に励起光αを照射するとともに、捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光γを検出する(工程S200)。制御部160は、検出値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する。検出された蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
以上の手順により、試料液中の被検出物質の存在またはその量を検出することができる。
なお、図11に示されるように、増強角の検出(工程S150)は、1次反応(工程S120)の前に行ってもよい。この場合は、分析チップ10の測定位置の決定(工程S130および工程S140)も、1次反応(工程S110および工程S120)の前に実施される。このようにすることで、図2に示されるフローチャートにおいて1次反応(工程S120)と2次反応(工程S180)の間に行っていた分析チップ10を送液位置に移動させる工程(工程S170)を省略することができる。また、1次反応(工程S120)を行う前の分析チップ10を送液位置に移動させる工程(工程S110)における位置精度が高まり、1次反応(工程S120)および2次反応(工程S180)において、送液ユニット140のシリンジ144の先端を分析チップ10内により確実に挿入できるようになる。このため、ユーザーがチップホルダー154に分析チップ10を設置する工程(工程S100)において要求される分析チップ10の位置精度が緩くなり、ユーザビリティが向上する。
また、励起光αの入射角があらかじめ決まっている場合は、増強角の検出(工程S150)を省略してもよい。この場合も、分析チップ10の測定位置の決定(工程S130および工程S140)は、光学ブランク値の測定(工程S160)の前に実施される。このように、分析チップ10の測定位置の決定(工程S130および工程S140)は、光学測定(増強角の検出、光学ブランク値の測定または蛍光の検出)を初めて実施する前に実施されることが好ましい。
また、上記の説明では、被検出物質と捕捉体とを反応させる工程(1次反応、工程S120)の後に、被検出物質を蛍光物質で標識する工程(2次反応、工程S180)を行った(2工程方式)。しかしながら、被検出物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、分析チップ10の流路内に試料液を導入する前に、試料液に標識液を添加して被検出物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、分析チップ10の流路内に試料液と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、分析チップ10の流路内に試料液を注入することで、蛍光物質で標識されている被検出物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被検出物質が蛍光物質で標識されるとともに、被検出物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、分析チップ10の流路内に試料液を導入することで、1次反応および2次反応の両方を完了することができる(1工程方式)。このように1工程方式を採用する場合は、抗原抗体反応の前に増強角の検出(工程S150)が実施され、さらにその前に、分析チップ10の測定位置の決定(工程S130および工程S140)が実施される。
また、上記実施の形態ではSPFS装置について説明したが、本発明に係る分析チップの位置合わせ方法は、SPR装置などのSPFS装置以外の分析装置にも適用されうる。
本出願は、2013年10月31日出願の特願2013−226667に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
10,10’ 分析チップ
20 プリズム
21 入射面
22 成膜面
23 出射面
30 金属膜
40 流路蓋
41 流路
42 スペーサー
100 SPFS装置
110 励起光照射ユニット
111 光源ユニット
112 角度調整機構
113 光源制御部
120 励起光検出ユニット
121 受光センサー
122 センサー制御部
130 蛍光検出ユニット
131 受光ユニット
132 位置切り替え機構
133 センサー制御部
134 第1レンズ
135 光学フィルター
136 第2レンズ
137 受光センサー
140 送液ユニット
141 薬液チップ
142 シリンジポンプ
143 送液ポンプ駆動機構
144 シリンジ
145 プランジャー
150 搬送ユニット
152 搬送ステージ
154 チップホルダー
160 制御部
α 励起光
β 励起光の反射光
β’ 励起光の透過光
γ 蛍光

Claims (8)

  1. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
    入射面成膜面および下面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを、搬送ステージに固定されたチップホルダーに設置する工程と、
    前記チップホルダーに設置された前記分析チップに励起光を照射するとともに、励起光の反射光または透過光を検出して、前記分析チップの位置情報を得る工程と、
    前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる工程と、
    前記測定位置に配置された前記分析チップに励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、
    を含
    前記励起光の反射光は、前記プリズムの入射面で反射した励起光、前記プリズムの下面で反射した励起光、または前記成膜面もしくは前記金属膜上に構造体が配置されている場合における当該構造体で反射した励起光であり、
    前記励起光の透過光は、前記成膜面もしくは前記金属膜上に構造体が配置されている場合における当該構造体を透過した励起光である、
    表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
  2. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記分析チップの互いに隣接する2つの面に励起光を照射する、請求項1に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
  3. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記分析チップの前記入射面と前記入射面に隣接する面とに励起光を照射する、請求項2に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
  4. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記励起光の反射光または透過光が検出部に到達しない状態のときの前記励起光の反射光または透過光の光量と、前記励起光の反射光または透過光の全部が前記検出部に到達する状態のときの前記励起光の反射光または透過光の光量の中間値を用いて、前記分析チップの位置情報を特定する、請求項2または請求項3に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
  5. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記搬送ステージによる前記チップホルダーの移動方向に対して平行および垂直ではない方向に励起光を照射する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
  6. 前記分析チップの位置情報を得る工程では、前記入射面反射した励起光を検出する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
  7. 前記分析チップの位置情報を得る工程および前記分析チップを測定位置に移動させる工程では、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを励起光の光源に近づく方向にのみ移動させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
  8. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
    入射面成膜面および下面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを着脱可能に保持するためのチップホルダーと、
    前記チップホルダーを移動させる搬送ステージと、
    前記チップホルダーに保持された前記分析チップに励起光を照射する励起光照射部と、
    前記分析チップで反射された励起光または前記分析チップを透過した励起光を検出する励起光検出部と、
    前記励起光検出部の検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの位置を特定するとともに、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる位置調整部と、
    前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、
    を有
    前記分析チップで反射された励起光は、前記プリズムの入射面で反射した励起光、前記プリズムの下面で反射した励起光、または前記成膜面もしくは前記金属膜上に構造体が配置されている場合における当該構造体で反射した励起光であり、
    前記分析チップを透過した励起光は、前記成膜面もしくは前記金属膜上に構造体が配置されている場合における当該構造体を透過した励起光である、
    表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
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