JP6326287B2 - Wound healing agent - Google Patents

Description

本発明は、創傷治癒剤に関する。   The present invention relates to a wound healing agent.

熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創や、褥瘡性皮膚潰瘍及び糖尿病性皮膚潰瘍等の創傷を治癒するためには、創傷部を適度な湿潤環境に保ち、細胞増殖を促す環境を作り出す必要がある。そのために患部に適応される創傷被覆材として、従来、ガーゼ及び脱脂綿等が用いられている。これらは、滲出液の吸収が早い反面、細菌に感染しやすく、また、創面が乾燥してしまうと取り外す際に痛みや出血等を伴うという問題がある。また、創面を乾燥させないために、創傷被覆材と軟膏等を併用することも行われているが、滲出液の吸収が不充分となり、創面が過度に湿った状態になってしまう問題がある。
また、ガーゼ、脱脂綿及び軟膏等に代わり、適度な湿潤環境を維持するために、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲル（特許文献１）等の湿潤環境維持を目的とした創傷被覆材が用いられる場合がある。しかしながら、ＣＭＣゲルは滲出液等によりゲル構造を保持することが難しく、創傷部からの脱離や、菌感染の温床になる問題がある。 In order to heal wounds such as burns, skin wounds, skin exfoliation wounds, traumatic skin defect wounds, decubitus skin ulcers and diabetic skin ulcers, the wound is kept in a moderately moist environment and promotes cell proliferation. There is a need to create an environment. Therefore, conventionally, gauze, absorbent cotton, etc. are used as a wound dressing adapted to the affected area. Although these exudates are absorbed quickly, they tend to be infected with bacteria, and when the wound surface is dried, there is a problem that it is accompanied by pain, bleeding, and the like. Moreover, in order not to dry the wound surface, a wound dressing and an ointment are also used in combination, but there is a problem that the wound surface becomes excessively moistened due to insufficient absorption of exudate.
Moreover, in order to maintain a moderate moist environment instead of gauze, absorbent cotton, ointment, etc., a wound dressing material for the purpose of maintaining a moist environment such as carboxymethylcellulose (CMC) gel (Patent Document 1) may be used. . However, it is difficult for the CMC gel to maintain the gel structure due to exudate and the like, and there is a problem that it becomes a detachment from the wound part and a hotbed for bacterial infection.

一方で、湿潤環境を保つだけでなく、肉芽組織形成や上皮化を促進する創傷治癒剤として、コラーゲンスポンジ（特許文献２）が知られている。コラーゲンスポンジは生体適合性が良いなどの特徴を有するものの、湿潤環境維持に乏しく、細菌に感染しやすい、細菌が増殖しやすい、滲出液により劣化する、及び材料が入手困難である等の問題がある。
また、熱傷や褥瘡性皮膚潰瘍等では、患部から壊死組織を除去（デブリードマン）し、止血処理を実施した後に、創傷治療剤を適用する場合がある。この時、止血処理が不十分であったり、患部を動かしたりすることで、二次的に出血（二次出血）することがある。二次出血すると、患部全体に痂皮が形成され、創傷被覆材や創傷治癒剤の効果が薄れて、治癒の遅延をもたらす問題がある。二次出血の恐れがある場合、止血効果のあるアルギン酸創傷被覆材を使用する場合があるが、効果は限定的である。 On the other hand, a collagen sponge (Patent Document 2) is known as a wound healing agent that not only maintains a moist environment but also promotes granulation tissue formation and epithelialization. Collagen sponge has characteristics such as good biocompatibility, but has problems such as poor maintenance of moist environment, easy infection with bacteria, easy growth of bacteria, deterioration by exudate, and difficulty in obtaining materials. is there.
Moreover, in the case of burns, decubitus skin ulcers, etc., a wound treatment agent may be applied after removing necrotic tissue from the affected area (debridement) and performing hemostasis treatment. At this time, the hemostasis treatment may be insufficient or the affected area may be moved to cause secondary bleeding (secondary bleeding). When secondary bleeding occurs, crusts are formed throughout the affected area, and the effect of the wound dressing and wound healing agent is diminished, resulting in a delay in healing. If there is a risk of secondary bleeding, an alginate wound dressing with a hemostatic effect may be used, but the effect is limited.

特開平０６−００９３７３号公報Japanese Patent Laid-Open No. 06-009373 特開平１０−０８０４３８号公報Japanese Patent Laid-Open No. 10-080438

本発明は、菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進し、かつ二次出血を抑制する創傷治癒剤を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a wound healing agent that suppresses bacterial growth, promotes granulation tissue formation and epithelialization, and suppresses secondary bleeding.

本発明は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、
円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が４０〜８０％である創傷治癒剤。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。 The present invention is a wound healing agent comprising a protein (A) having GAGAGS sequence (1) and the following amino acid sequence (X) and / or the following amino acid sequence (X ′) and water,
The total ratio of β-turn structure and random coil structure in the protein (A) determined by the circular dichroism spectrum method is 40 to 60%, and all the amino acids with respect to the total number of amino acids in the protein (A) The ratio of the total number of amino acids in the sequence (X) to the total number of amino acids in all the amino acid sequences (X ′) is 5 to 45%, and all the GAGAGS with respect to the total number of amino acids in the protein (A) The wound healing agent whose ratio of the number of amino acids in sequence (1) is 40 to 80%.
Amino acid sequence (X): At least one amino acid sequence selected from the group consisting of VPGVG sequence (2), GVGVP sequence (3) and GAHGGPGPK sequence (4).
Amino acid sequence (X ′): an amino acid sequence in which one amino acid in the amino acid sequence (X) is substituted with lysine (K) or arginine (R), or two amino acids in the amino acid sequence (X) are lysine Amino acid sequence substituted with (K) and / or arginine (R).

本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制作用があり、肉芽組織形成や上皮化促進作用に優れ、かつ二次出血を抑制するという効果を奏する。   The wound healing agent of the present invention has a fungus growth inhibitory action, is excellent in granulation tissue formation and epithelialization promoting action, and has an effect of suppressing secondary bleeding.

本発明において、タンパク質（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。   In the present invention, the protein (A) is obtained by extraction from natural products, organic synthesis methods (enzyme method, solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method, etc.), gene recombination methods, and the like. For organic synthesis methods, see "Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV (July 1, 1981, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.)" or "Second Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry" (Lower) (May 20, 1987, edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Chemical Co., Ltd.), etc. Regarding the gene recombination method, the method described in Japanese Patent No. 3338441 can be applied. Extraction from natural products, organic synthesis methods, and gene recombination methods can both yield protein (A), but gene recombination methods are preferred from the standpoint that amino acid sequences can be easily changed and mass production can be performed at low cost.

本発明の創傷治癒剤は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が４０〜８０％であり、前記タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）7配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）を有するタンパク質、（ＧＡＧＡＧＳ）11配列（５）及びＧＶＧＶＰ配列（３）を有するタンパク質又は（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）3ＧＫＧＶＰ配列（２７）を有するタンパク質である創傷治癒剤である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。 A wound healing agent of the present invention is a wound healing agent comprising GAGAGS sequence (1) and protein (A) having the following amino acid sequence (X) and / or the following amino acid sequence (X ′) and water, The total ratio of β-turn structure and random coil structure in the protein (A) obtained by the color spectrum method is 40 to 60%, and all the amino acid sequences (total number of amino acids in the protein (A) ( The ratio of the total number of amino acids in X) and the total number of amino acids in all the amino acid sequences (X ′) is 5 to 45%, and all the GAGAGS sequences relative to the total number of amino acids in the protein (A) ( 1) Ri amino acid number ratio 40% to 80% der in in the protein (a) has a (GAGAGS) 7 sequence (5) and (GVGVP) 2GKGVP sequence (6) Protein, a (GAGAGS) 11 sequence (5) and GVGVP sequence (3) protein or with a (GAGAGS) 4 sequence (5) and (GVGVP) Wound healing agents Ru protein der having 3GKGVP sequence (27).
Amino acid sequence (X): At least one amino acid sequence selected from the group consisting of VPGVG sequence (2), GVGVP sequence (3) and GAHGGPGPK sequence (4).
Amino acid sequence (X ′): an amino acid sequence in which one amino acid in the amino acid sequence (X) is substituted with lysine (K) or arginine (R), or two amino acids in the amino acid sequence (X) are lysine Amino acid sequence substituted with (K) and / or arginine (R).

本発明の創傷治癒剤において、タンパク質（Ａ）がアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）を有することにより、細胞と相互作用しやすく細胞親和性が高いことから、肉芽組織形成や上皮化促進作用を発揮することができる。
また、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が上記範囲であることで、タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）の細胞親和性が高くなることから、肉芽組織形成作用や上皮化促進作用に優れる。さらに、滲出液等を吸収しても膨潤することなく、長期的にゲル構造を保持することができる。加えて、時間の経過及び熱等の刺激を加える等によりゲル化するので、創傷部が創傷治癒剤で密閉され、菌の増殖を抑制することができる。またゲル化物は、湿潤環境を維持し細胞の増殖を促すことができる。
また、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合及びタンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が上記範囲であることで、創傷治癒剤の弾性率が皮膚の弾性率に近づく、即ち皮膚への追随性に優れたものとなることから、止血効果が高くなり患部の二次出血が抑制される。 In the wound healing agent of the present invention, since the protein (A) has the amino acid sequence (X) and / or the amino acid sequence (X ′), it easily interacts with cells and has high cell affinity. It can exert epithelialization promoting action.
Moreover, since the ratio of the total of the β-turn structure and the random coil structure in the protein (A) is within the above range, the cell affinity of the amino acid sequence (X) and / or amino acid sequence (X ′) in the protein (A) Since the property is high, it is excellent in granulation tissue forming action and epithelialization promoting action. Further, the gel structure can be maintained for a long time without swelling even when exudate is absorbed. In addition, since gelation occurs by applying a stimulus such as the passage of time and heat, the wound is sealed with a wound healing agent, and the growth of bacteria can be suppressed. The gelled product can maintain a moist environment and promote cell growth.
Further, the ratio of the total number of β-turn structures and random coil structures in protein (A) and the ratio of the number of amino acids in all GAGAGS sequences (1) to the total number of amino acids in protein (A) are within the above ranges. Since the elastic modulus of the wound healing agent approaches the elastic modulus of the skin, that is, excellent in followability to the skin, the hemostatic effect is enhanced and secondary bleeding in the affected area is suppressed.

本発明のタンパク質（Ａ）は、円二色性スペクトル法により求められるタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であるタンパク質である。タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等により、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合は異なる。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合は、細胞親和性、細胞の増殖促進及び二次出血抑制の観点から４０〜５７．５％が好ましく、さらに好ましくは４０〜５５％である。
上記割合は、タンパク質（Ａ）をリフォールディングさせることによって増加させることができる。また、上記割合はタンパク質（Ａ）を変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合は、下記測定法によって求める。 The protein (A) of the present invention is a protein having a total ratio of 40 to 60% of the β-turn structure and random coil structure in the protein (A) obtained by the circular dichroism spectrum method. Even if the protein sequence is the same, the ratio of the total of β-turn structure and random coil structure in protein (A) differs depending on the protein production method, protein purification method, pH of the solvent in which the protein is dissolved and the polarity of the solvent, etc. .
The total ratio of the β-turn structure and the random coil structure in the protein (A) is preferably 40 to 57.5%, more preferably 40 to 55, from the viewpoints of cell affinity, cell growth promotion, and suppression of secondary bleeding. %.
The ratio can be increased by refolding the protein (A). The ratio can be lowered by denaturing the protein (A) with a denaturant or heat.
The total ratio of the β-turn structure and the random coil structure in protein (A) is determined by the following measurement method.

＜タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定方法＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらの合計をβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合とする。 <Measuring method of ratio of total of β-turn structure and random coil structure in protein (A)>
Protein is dissolved in deionized water (4 ° C.) to a concentration of 0.3 mg / ml to prepare an aqueous protein solution. The aqueous solution of the prepared protein was measured with a circular dichroism spectrum measuring instrument (manufactured by JASCO Corporation, “J-820”) (measurement temperature: 4 ° C.), and secondary structure analysis program (JWSSE type: JASCO Corporation) The ratio of the β-turn structure and the ratio of the random coil structure are calculated using a company-made product, and the total of these is taken as the ratio of the total of the β-turn structure and the random coil structure.

本発明においてタンパク質（Ａ）は、下記アミノ酸配列（Ｘ）を少なくとも１個及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を少なくとも１個有するものである。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又はアミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
なお、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）をそれぞれ複数個有していてもよく、複数個ある場合のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とを共に有していてもよい。 In the present invention, the protein (A) has at least one amino acid sequence (X) below and / or at least one amino acid sequence (X ′) below.
Amino acid sequence (X): At least one amino acid sequence selected from the group consisting of VPGVG sequence (2), GVGVP sequence (3) and GAHGGPGPK sequence (4).
Amino acid sequence (X ′): An amino acid sequence in which one amino acid in amino acid sequence (X) is substituted with lysine (K) or arginine (R), or two amino acids in amino acid sequence (X) are lysine (K ) And / or an amino acid sequence substituted with arginine (R).
The protein (A) may have a plurality of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′). When there are a plurality of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′), They may be the same or different, and may have both the amino acid sequence (X) and the amino acid sequence (X ′).

アミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）のゲル化能の観点から、ＶＰＧＶＧ配列（２）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（３）が好ましい。   The amino acid sequence (X) is preferably a VPGVG sequence (2) and / or a GVGVP sequence (3) from the viewpoint of cell affinity and gelation ability of the protein (A).

アミノ酸配列（Ｘ’）としては、具体的には、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）のゲル化能の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。 Specific examples of the amino acid sequence (X ′) include GKGVP sequence (7), GKGKP sequence (8), GKGRP sequence (9), and GRGRP sequence (10).
The amino acid sequence (X ′) is at least one selected from the group consisting of a GKGVP sequence (7), a GKGKP sequence (8), and a GRGRP sequence (10) from the viewpoint of cell affinity and protein (A) gelation ability. The sequence is preferably GKGVP sequence (7) and / or GKGKP sequence (8).

タンパク質（Ａ）は、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）のゲル化能の観点から、アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。 The protein (A) is a polypeptide chain (Y) in which 2 to 200 amino acid sequences (X) are continuous from the viewpoint of cell affinity and gelation ability of the protein (A) and / or the following polypeptide chain. It is preferable to have (Y ′).
Polypeptide chain (Y ′): A polypeptide chain in which 0.1 to 20% of the total number of amino acids in the polypeptide chain (Y) is substituted with lysine (K) and / or arginine (R).

ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）_b配列、（ＧＶＧＶＰ）_c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）_d配列等が挙げられる。なお、ｂ〜ｄは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、ポリペプチド鎖（Ｙ）は同一でも異なっていてもよく、さらにタンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、（ＶＰＧＶＧ）_b配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）_c配列が好ましい。 Specific examples of the polypeptide chain (Y) include (VPGVG) _b sequence, (GVGVP) _c sequence and (GAHGGPGPK) _d sequence. Note that b to d are the numbers of consecutive amino acid sequences (X), respectively, and are integers of 2 to 200.
When the protein (A) has a plurality of polypeptide chains (Y) in one molecule, the polypeptide chains (Y) may be the same or different, and the polypeptide chain (Y) is added to the protein (A). When there are a plurality of amino acid sequences (X), the number of consecutive amino acid sequences (X) may be the same or different for each polypeptide chain (Y). That is, the consecutive number b to d of the amino acid sequence (X) may have a plurality of polypeptide chains (Y), or may have a plurality of polypeptide chains (Y) having different b to d.
The polypeptide chain (Y) includes (VPGVG) _b sequence and / or (GVGVP) _c sequence from the viewpoint of moderate cell affinity and the total ratio of β-turn structure and random coil structure in protein (A). Is preferred.

ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｄが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、アミノ酸配列（Ｘ）が連続する個数は２〜１００個（上記ｂ〜ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個（上記ｂ〜ｄが２〜５０）、特に好ましくは２〜４０個（ｂ〜ｄが２〜４０個）である。   The polypeptide chain (Y) is a polypeptide chain in which 2 to 200 amino acid sequences (X) are continuous (the above b to d are 2 to 200), but has a cell affinity and a β-turn structure in the protein (A). And the random coil structure, the number of consecutive amino acid sequences (X) is preferably 2 to 100 (b to d are 2 to 100), more preferably 2 to 50 ( The above b to d are 2 to 50), particularly preferably 2 to 40 (b to d are 2 to 40).

また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖であり、具体的には、アミノ酸配列（Ｘ）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ）において、アミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部がアミノ酸配列（Ｘ’）に置き換わったポリペプチド鎖が含まれる。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数に対するリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸数の合計数の割合は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜７％である。 The polypeptide chain (Y ′) is a polypeptide chain in which 0.1 to 20% of the total number of amino acids in the polypeptide chain (Y) is substituted with lysine (K) and / or arginine (R). Specifically, in the polypeptide chain (Y) in which the amino acid sequence (X) is continuous, a polypeptide chain in which part or all of the amino acid sequence (X) is replaced with the amino acid sequence (X ′) is included. .
In the polypeptide chain (Y ′), the ratio of the total number of amino acids substituted with lysine (K) and arginine (R) to the total number of amino acids in the polypeptide chain (Y) is expressed in the water of the protein (A). From the viewpoint of making the ratio of the total of the β-turn structure and the random coil structure in the protein (A) moderate, it is preferably 0.5 to 10%, more preferably 1 to 7%. .

ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中の全てのリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を、他のアミノ酸［グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）又はヒスチジン（Ｈ）］に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。   Whether it is a polypeptide chain (Y ′) is determined by replacing all lysine (K) and arginine (R) in the sequence of protein (A) with other amino acids [glycine (G), alanine (A), valine ( V), proline (P) or histidine (H)] to determine whether the polypeptide chain (Y) is obtained.

タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計個数は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜８０個であり、特に好ましくは１〜６０個である。   The total number of polypeptide chains (Y) and polypeptide chains (Y ′) in protein (A) is determined by the solubility of protein (A) in water, cell affinity, and β-turn structure in protein (A). From the viewpoint of making the ratio of the total of the random coil structure appropriate, 1 to 100 is preferable, more preferably 1 to 80, and particularly preferably 1 to 60.

タンパク質（Ａ）中に、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又はアミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数が異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（Ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）についても同様である。   When the protein (A) has a polypeptide chain (Y) in which the type of amino acid sequence (X) and / or the number of consecutive amino acid sequences (X) are different, each is counted as one, The number of peptide chains (Y) is the total. The same applies to the polypeptide chain (Y ′).

タンパク質（Ａ）は、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であるものであるが、細胞親和性の観点から、１０〜４０％が好ましく、さらに好ましくは１５〜３５％である。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。 In the protein (A), the ratio of the total number of amino acids in all amino acid sequences (X) and the number of amino acids in all amino acid sequences (X ′) to the total number of amino acids in the protein (A) is 5 to 45%. However, from the viewpoint of cell affinity, it is preferably 10 to 40%, more preferably 15 to 35%.
The ratio of the total number of amino acids in all amino acid sequences (X) and the total number of amino acids in all amino acid sequences (X ′) to the total number of amino acids in protein (A) can be determined by a protein sequencer. Specifically, it can be determined by the following measurement method.

＜タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ）中の全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸数｝］／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００ <Measurement method of the ratio of the total number of amino acids in all amino acid sequences (X) and the total number of amino acids in all amino acid sequences (X ′) to the total number of amino acids in protein (A)>
The protein (A) is decomposed to about 30 residues or less using two or more cleavage methods that can be cleaved at specific amino acid residues. Then, after separating by high performance liquid chromatography (HPLC), the amino acid sequence is read with a protein sequencer. Peptide mapping is performed from the obtained amino acid sequence to determine the entire sequence of protein (A). Thereafter, the ratio of the total number of amino acids in all amino acid sequences (X) and the total number of amino acids in all amino acid sequences (X ′) to the total number of amino acids in protein (A) is calculated using the measurement formula described below. To do.
Ratio (%) of the total number of amino acids in all amino acid sequences (X) and all amino acid sequences (X ′) in protein (A) = [{number of amino acid sequences (X)} × {Number of amino acids in amino acid sequence (X)} + {number of amino acid sequences (X ′)} × {number of amino acids in amino acid (X ′)}] / {total number of amino acids in protein (A)} × 100

なお、タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、以下のようにして上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」を求める。
まず、各種類のアミノ酸配列（Ｘ）について、「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」を求める。その全種類についての合計値を、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」とする。
タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）に対応する複数種類のアミノ酸配列（Ｘ’）を有する場合も同様にして、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数｝」を求める。 When the protein (A) has a plurality of types of amino acid sequences (X), “{number of amino acid sequences (X)} × {amino acid sequence (X ) The number of amino acids in}.
First, “{number of amino acid sequences (X)} × {number of amino acids in amino acid sequence (X)}” is determined for each type of amino acid sequence (X). The total value for all the types is defined as “{number of amino acid sequences (X)} × {number of amino acids in amino acid sequence (X)}” in the above formula.
Similarly, when the protein (A) has a plurality of types of amino acid sequences (X ′) corresponding to a plurality of types of amino acid sequences (X), “{number of amino acid sequences (X ′)} × {The number of amino acids in the amino acid sequence (X ′)} ”.

タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合［｛タンパク質（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は４０〜８０％であるが、細胞親和性、二次出血抑制及びβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、４２．５〜７７．５％が好ましく、さらに好ましくは４５〜７５％である。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。 In protein (A), the ratio of the number of amino acids in all GAGAGS sequences (1) to the total number of amino acids in protein (A) [{number of GAGAGS sequences (1) in protein (A) × 6} / {protein The total number of amino acids in (A)} × 100] is 40 to 80%, but from the viewpoint of making the cell affinity, suppression of secondary bleeding, and the ratio of the total of β-turn structure and random coil structure appropriate, 42. 5-77.5% is preferable, More preferably, it is 45-75%.
The ratio of the number of amino acids in all GAGAGS sequences (1) to the total number of amino acids in protein (A) can be determined by a protein sequencer. Specifically, it is determined by the following measurement method.

＜タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００ <Ratio of the number of amino acids in all GAGAGS sequences (1) to the total number of amino acids in protein (A)>
The protein (A) is decomposed to about 30 residues or less using two or more cleavage methods capable of cleaving at specific amino acid residues. Then, after separating by high performance liquid chromatography (HPLC), the amino acid sequence is read with a protein sequencer. Peptide mapping is performed from the obtained amino acid sequence to determine the entire sequence of protein (A). Thereafter, the ratio of the number of amino acids in all GAGAGS sequences (1) to the total number of amino acids in protein (A) is calculated by the measurement formula described below.
Ratio (%) of the number of amino acids in all GAGAGS sequences (1) to the total number of amino acids in protein (A) = [{number of GAGAGS sequences (1) × 6} / {of all amino acids in protein (A) Number} × 100

タンパク質（Ａ）はＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するが、タンパク質（Ａ）の細胞親和性、二次出血抑制及びβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、細胞親和性、二次出血抑制及びβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜２５個、最も好ましくは２〜１５である。 The protein (A) has the GAGAGS sequence (1), but from the viewpoint of making the protein (A) cell affinity, secondary hemorrhage suppression, and the ratio of the total of β-turn structure and random coil structure moderate, the GAGAGS sequence (1 ) Preferably has 2 to 200 continuous polypeptide chains (S).
In the polypeptide chain (S), the number of consecutive GAGAGS sequences (1) is 2 to 100 from the viewpoint of cytocompatibility, suppression of secondary bleeding, and appropriate ratio of the total of β-turn structure and random coil structure. Is preferable, more preferably 2 to 50, particularly preferably 2 to 25, and most preferably 2 to 15.

タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）及びポリペプチド鎖（Ｓ）からなる群より選ばれる配列を合計２個以上有する場合は、これらの間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）ではないペプチド配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸数は、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＹＹＡＡＧ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸数の割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、０〜２０％が好ましく、さらに好ましくは０〜１５％であり、特に好ましくは０〜１０％である。 The protein (A) is composed of an amino acid sequence (X), an amino acid sequence (X ′), a polypeptide chain (Y), a polypeptide chain (Y ′), a GAGAGS sequence (1), and a polypeptide chain (S). When having two or more selected sequences in total, an intervening amino acid sequence (Z) may be present between them. The intervening amino acid sequence (Z) is a peptide sequence in which one or more amino acids are linked, and is not a GAGAGS sequence (1), an amino acid sequence (X), or an amino acid sequence (X ′). The number of amino acids constituting the intervening amino acid sequence (Z) is preferably 1-30, more preferably 1-15, from the viewpoint of making the ratio of the total of the β-turn structure and random coil structure in the protein (A) appropriate. The number is particularly preferably 1 to 10. Specific examples of the intervening amino acid sequence (Z) include a VAAGY sequence (11), a GAAYAYAAG sequence (12), and an LGP sequence.
Ratio of the number of amino acids in all intervening amino acid sequences (Z) to the total number of amino acids in protein (A) [Σ {(number of amino acids in intervening amino acid sequence (Z)) × (number of intervening amino acid sequences (Z))] } / {Total number of amino acids in protein (A)} × 100] is preferably 0 to 20% from the viewpoint of making the ratio of the total of the β-turn structure and random coil structure in protein (A) moderate, Preferably it is 0 to 15%, and particularly preferably 0 to 10%.

タンパク質（Ａ）は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）及び介在アミノ酸配列（Ｚ）以外にも、両末端に末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもよい。タンパク質（Ａ）の両末端の構造が、ポリペプチド鎖（Ｙ）に末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合した構造であることが好ましい。末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）を有しないペプチド配列である。末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。末端アミノ酸配列（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。   The protein (A) may have a terminal amino acid sequence (T) at both ends in addition to the GAGAGS sequence (1), amino acid sequence (X), amino acid sequence (X ′) and intervening amino acid sequence (Z). Good. The structure at both ends of the protein (A) is preferably a structure in which the terminal amino acid sequence (T) is bound to the polypeptide chain (Y). The terminal amino acid sequence (T) is a peptide sequence in which one or more amino acids are bound, and does not have a GAGAGS sequence (1), an amino acid sequence (X), and an amino acid sequence (X ′). The number of amino acids constituting the terminal amino acid sequence (T) is preferably 1 to 100 from the viewpoint of cell affinity and the ratio of the total of β-turn structure and random coil structure in the protein (A). More preferably, it is 1-50, and particularly preferably 1-40. Specific examples of the terminal amino acid sequence (T) include MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPPSDPM sequence (13) and the like.

タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸数の割合［Σ｛（末端アミノ酸配列（Ｔ）中のアミノ酸数）×（末端アミノ酸配列（Ｔ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、０〜１５％が好ましく、さらに好ましくは０〜１３％であり、特に好ましくは０〜１０％である。   Ratio of the number of amino acids of all terminal amino acid sequences (T) to the total number of amino acids in protein (A) [Σ {(number of amino acids in terminal amino acid sequence (T)) × (number of terminal amino acid sequences (T))} / {Total number of amino acids in protein (A)} × 100] is from 0 to 15 from the viewpoint of cell affinity and the ratio of the total of β-turn structure and random coil structure in protein (A). % Is preferable, more preferably 0 to 13%, and particularly preferably 0 to 10%.

タンパク質（Ａ）は、生物工学的手法により細菌を用いて製造することがある。このような場合、発現させたタンパク質（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、タンパク質（Ａ）は上記末端アミノ酸配列（Ｔ）の他に、Ｎ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９^TM、ＣｒｕｚＴａｇ２２^TM、ＣｒｕｚＴａｇ４１^TM、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。 The protein (A) may be produced using bacteria by a biotechnological technique. In such a case, in order to facilitate the purification or detection of the expressed protein (A), the protein (A) has a special amino acid sequence at the N or C terminus in addition to the above terminal amino acid sequence (T). It may have a protein or peptide (hereinafter referred to as “purification tag”). As the purification tag, an affinity purification tag is used. Such purification tags include polyhistidine 6 × His tag, V5 tag, Xpress tag, AU1 tag, T7 tag, VSV-G tag, DDDDK tag, S tag, CruzTag09 ^™ , CruzTag22 ^™ , CruzTag41 ^™ , Glu. -Glu tag, Ha. There are 11 tags and KT3 tags.
An example of a combination of each purification tag (i) and a ligand (ii) that recognizes and binds the tag is shown below.
(I-1) glutathione-S-transferase (GTS) (ii-1) glutathione (i-2) maltose binding protein (MBP) (ii-2) amylose (i-3) HQ tag (ii-3) nickel ( i-4) Myc tag (ii-4) Anti-Myc antibody (i-5) HA tag (ii-5) Anti-HA antibody (i-6) FLAG tag (ii-6) Anti-FLAG antibody (i-7) 6 XHis tag (ii-7) Nickel or cobalt As a method for introducing the purified tag sequence, the nucleic acid encoding the purified tag is inserted into the 5 'or 3' end of the nucleic acid encoding the protein (A) in the expression vector. And a method using a commercially available vector for introducing a purification tag.

タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）のアミノ酸数と全ての末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸数と精製タグのアミノ酸数の合計数の割合は、二次出血抑制及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、０〜１５％が好ましく、さらに好ましくは０〜１３％であり、特に好ましくは０〜１０％である。   In protein (A), the ratio of the total number of amino acids of all intervening amino acid sequences (Z), the number of amino acids of all terminal amino acid sequences (T), and the number of amino acids of the purification tag to the total number of amino acids in protein (A) Is preferably from 0 to 15%, more preferably from 0 to 13%, particularly preferably from the viewpoint of moderate secondary bleeding suppression and the ratio of the total of the β-turn structure and random coil structure in the protein (A). Is 0 to 10%.

タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）並びにＧＡＧＡＧＳ配列（１）及び／又はポリペプチド鎖（Ｓ）を含む場合、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）の中βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）又はポリペプチド鎖（Ｙ’）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｓ）とが交互に化学結合していることが好ましい。   When protein (A) contains polypeptide chain (Y) and / or polypeptide chain (Y ′) and GAGAGS sequence (1) and / or polypeptide chain (S), cell affinity and protein (A) From the viewpoint of optimizing the total ratio of the medium β-turn structure and the random coil structure, the polypeptide chain (Y) or polypeptide chain (Y ′) and the GAGAGS sequence (1) or polypeptide chain (S) are alternately arranged. It is preferably chemically bonded.

ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）｝］は、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、１：０．１〜１：６が好ましく、さらに好ましくは１：０．２〜１：５であり、特に好ましくは１：０．２〜１：３であり、最も好ましくは１：０．４〜１：１である。   The ratio of the number of GAGAGS sequences (1) to the number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) [GAGAGS sequences (1): {amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′)}] From the viewpoint of making the ratio of the total of the β-turn structure and the random coil structure in the protein (A) moderate, 1: 0.1 to 1: 6 is preferable, and more preferably 1: 0.2 to 1: 5. Particularly preferred is 1: 0.2 to 1: 3, and most preferred is 1: 0.4 to 1: 1.

タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量は、細胞親和性及びタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、４０〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは５０〜１５０ｋＤａであり、特に好ましくは７０〜１２０ｋＤａである。   The molecular mass of the protein (A) by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) is from the viewpoint of making the cell affinity and the ratio of the total of the β-turn structure and random coil structure in the protein (A) appropriate. 40-200 kDa is preferable, More preferably, it is 50-150 kDa, Most preferably, it is 70-120 kDa.

好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質
（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質 A part of preferable protein (A) is illustrated below.
(A1) Protein (A11) in which amino acid sequence (X) is GVGVP sequence (3) (A11) Amino acid in polypeptide chain (Y1) having 2 to 200 consecutive GVGVP sequences (3) was substituted with lysine (K) A protein having a polypeptide chain (Y′1) and a polypeptide chain (S1) having 2 to 200 consecutive GAGAGS sequences (1)

（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が３個連続した（ＧＶＧＶＰ）₃配列（１４）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された（ＧＶＧＶＰ）₂ＧＫＧＶＰ配列（６）（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が７個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）₇配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）₂ＧＫＧＶＰ配列（６）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）₇配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）₂ＧＫＧＶＰ配列（６）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約８５ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ１Ｋ）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）₇配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）₂ＧＫＧＶＰ配列（６）をそれぞれ２０個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約９５ｋＤａの配列（１６）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ１Ｋ−２０）
（Ａ１１−１−２）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が１０個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）₁₀配列（２５）と（ＧＶＧＶＰ）₂ＧＫＧＶＰ配列（６）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）₁₀配列（２５）及び（ＧＶＧＶＰ）₂ＧＫＧＶＰ配列（６）をそれぞれを２０個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約１４０ｋＤａの配列（２２）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ２Ｋ−２０） (A11-1) (GVGVP) ₂ GKGVP sequence in which one amino acid of the polypeptide chain (Y11) of (GVGVP) ₃ sequence (14) in which three GVGVP sequences (3) are consecutive is substituted with lysine (K) (6) Protein (A11-1-1) GAGAGS sequence (1) having a polypeptide chain (S1) having 2 to 200 GAGAGS sequences (1) and 7 GAGAGS sequences (1) (GAGAGS) ) ₇ sequence (5) and (GVGVP) ₂ GKGVP sequence (6) and protein (i) (GAGAGS) ₇ sequence (5) and (GVGVP) ₂ GKGVP sequence (6) have 13 each having, these Protein (SELPS1K) having a molecular mass of about 85 kDa with an alternating chemical bond and a sequence (15)
(Ii) (GAGAGS) ₇ protein (SELPS1K-) having 20 sequences each of (5) and (GVGVP) ₂ GKGVP sequences (6), and having a molecular mass of approximately 95 kDa and having a molecular mass of about 95 kDa 20)
(A11-1-2) protein (i) (GAGAGS) ₁₀ sequence (25) having ₁₀ (GAGAGS) ₁₀ sequence (25) and (GVGVP) ₂ GKGVP sequence (6) in which 10 GAGAGS sequences (1) are continuous And (GVGVP) ₂ GKGVP sequence (6), each of which has 20 molecules (alternatively chemically bound to each other) and has a molecular mass of about 140 kDa (22) protein (SELPS2K-20)

（Ａ１１−２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が４個連続した（ＧＶＧＶＰ）₄配列（２６）のポリペプチド鎖（Ｙ１２）の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された（ＧＶＧＶＰ）₃ＧＫＧＶＰ配列（２７）（Ｙ’１２）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−２−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）₄配列（２６）と（ＧＶＧＶＰ）₃ＧＫＧＶＰ配列（２７）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）₄配列（２６）及び（ＧＶＧＶＰ）₃ＧＫＧＶＰ配列（２７）をそれぞれ１５個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約６５ｋＤａの配列（２４）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ４Ｋ−１５） (A11-2) (GVGVP) ₃ GKGVP sequence in which one amino acid of the polypeptide chain (Y12) of (GVGVP) ₄ sequence (26) in which four GVGVP sequences (3) are consecutive is substituted with lysine (K) (27) Protein (A11-2-1) GAGAGS sequence (1) having a polypeptide chain (S1) having 2 to 200 consecutive GAGAGS sequences (1) and 4 GAGAGS sequences (1) (GAGAGS) ) ₄ sequence (26) and (GVGVP) ₃ GKGVP sequence (27) and protein (i) (GAGAGS) ₄ sequence (26) and (GVGVP) ₃ GKGVP sequence (27) has 15 each having, these Protein (SELPS4K-15) having a molecular mass of about 65 kDa with an alternating chemical bond and a sequence (24)

（Ａ１２−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が１個と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１２−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が１個と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が１１個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）₁₁配列（２８）とを有するタンパク質
（ｉ）ＧＶＧＶＰ配列（３）、（ＧＡＧＡＧＳ）₁₁配列（２８）及びＧＡＡＹＹＡＡＧ配列（１２）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約９０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＥＬＰＳ３Ｋ−１３） (A12-1) one GVGVP sequence (3), and a protein (A12-1) GVGVP sequence (3) having a polypeptide chain (S1) having 2 to 200 consecutive GAGAGS sequences (1) , A protein having ₁₁ consecutive GAGAGS sequences (1) (GAGAGS) ₁₁ sequence (28) (i) 13 GVGVP sequences (3), (GAGAGS) ₁₁ sequences (28) and 13 GAAYAYAAG sequences (12) A protein of the sequence (23) having a molecular mass of about 90 kDa and having these chemically bonded alternately (SELPS3K-13)

（Ａ２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）であるタンパク質
（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）中のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質 (A2) A protein in which the amino acid sequence (X) is the VPGVG sequence (2) (A21) The amino acid in the polypeptide chain (Y2) having 2 to 200 consecutive VPGVG sequences (2) was substituted with K (lysine) A protein having a polypeptide chain (Y'2) and a polypeptide chain (S1) having 2 to 200 consecutive GAGAGS sequences (1)

本発明の創傷治癒剤は、上記タンパク質（Ａ）及び水を含むものである。
創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性、タンパク質（Ａ）のゲル化能及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、５〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜３０重量％、特に好ましくは１５〜３０重量％である。
創傷治癒剤中の水の含有量（重量％）は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性、タンパク質（Ａ）のゲル化能及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、５０〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは５５〜９０重量％であり、特に好ましくは７０〜８５重量％である。 The wound healing agent of this invention contains the said protein (A) and water.
The content (% by weight) of the protein (A) in the wound healing agent is determined from the viewpoint of the solubility of the protein (A) in water, the gelation ability of the protein (A), and the ease of application to a wound. The amount is preferably 5 to 30% by weight, more preferably 10 to 30% by weight, and particularly preferably 15 to 30% by weight based on the weight of the wound healing agent.
The content (% by weight) of water in the wound healing agent is determined based on the solubility of the protein (A) in water, the gelation ability of the protein (A), and the ease of application to the wound. Is preferably from 50 to 95% by weight, more preferably from 55 to 90% by weight, and particularly preferably from 70 to 85% by weight.

創傷治癒剤中の水としては、滅菌されたものであれば特に限定されるものではない。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃で２０分加熱して過熱滅菌した脱イオン水等が挙げられる。   The water in the wound healing agent is not particularly limited as long as it is sterilized. Sterilization methods include water through a microfiltration membrane with a pore size of 0.2 μm or less, water through an ultrafiltration membrane, water through a reverse osmosis membrane, and autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes to heat sterilize. And deionized water.

本発明の創傷治癒剤は、タンパク質（Ａ）及び水以外に無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもよい。
無機塩としては、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。なお、本明細書においてリン酸（塩）は無機塩に含まない。
創傷治癒剤中の無機塩の含有量（重量％）は、人間の体液と浸透圧を同等にするという観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．５〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜１．１重量％、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。 The wound healing agent of the present invention may contain an inorganic salt and / or phosphoric acid (salt) in addition to the protein (A) and water.
Specific examples of inorganic salts include sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, calcium bicarbonate, and magnesium bicarbonate. Is mentioned. In the present specification, phosphoric acid (salt) is not included in the inorganic salt.
The content (% by weight) of the inorganic salt in the wound healing agent is preferably 0.5 to 1.3% by weight based on the weight of the wound healing agent from the viewpoint of equalizing the osmotic pressure with human body fluid, More preferably, it is 0.7-1.1 weight%, Most preferably, it is 0.85-0.95 weight%.

リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸塩としては、リン酸のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
創傷治癒剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、創傷治癒の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。 Phosphoric acid (salt) means phosphoric acid and / or phosphate.
Examples of the phosphate include alkali metal salts and alkaline earth metal salts of phosphoric acid, and specific examples include sodium salts, potassium salts, calcium salts, and magnesium salts.
The content (% by weight) of phosphoric acid (salt) in the wound healing agent is preferably 0.10 to 0.30% by weight based on the weight of the wound healing agent, more preferably 0.8%, from the viewpoint of wound healing. It is 12 to 0.28% by weight, particularly preferably 0.14 to 0.26% by weight.

創傷治癒剤のｐＨは、タンパク質（Ａ）の安定性及び創傷治癒の観点から、５．０〜９．０が好ましく、さらに好ましくは６．０〜８．５である。この範囲であれば、創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）が変性することなく、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にでき、創傷治癒剤を用いて菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進することができる。   The pH of the wound healing agent is preferably 5.0 to 9.0, more preferably 6.0 to 8.5, from the viewpoint of protein (A) stability and wound healing. Within this range, the protein (A) in the wound healing agent is not denatured, and the total ratio of the β-turn structure and random coil structure in the protein (A) can be moderated. Proliferation can be suppressed, and granulation tissue formation and epithelialization can be promoted.

本発明の創傷治癒剤は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（創傷治癒剤の製造方法）
（１）本発明のタンパク質（Ａ）及び水を４〜２５℃で混合し、創傷治癒剤とする。水中には必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）が含まれていてもよい。また、タンパク質（Ａ）を水に溶解させた後、必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）を含むようにしてもよい。 The wound healing agent of this invention is obtained by mixing each component, and a manufacturing method is not specifically limited. An example is shown below.
(Method for producing wound healing agent)
(1) The protein (A) of the present invention and water are mixed at 4 to 25 ° C. to obtain a wound healing agent. The water may contain an inorganic salt and / or phosphoric acid (salt) as necessary. Moreover, after dissolving protein (A) in water, you may make it contain an inorganic salt and / or phosphoric acid (salt) as needed.

本発明の創傷治癒剤は、タンパク質（Ａ）及び水等を混合した直後は溶液状であるが、菌増殖抑制の観点から、時間の経過、熱等の刺激を加える等により流動性が低くなりゲル化することが好ましい。また、本発明の創傷治癒剤は、溶液状のものを患部へそのまま適用してもよいし、予めゲル化させて患部に適用してもよい。   The wound healing agent of the present invention is in the form of a solution immediately after mixing protein (A), water, etc., but from the viewpoint of inhibiting bacterial growth, the fluidity becomes low due to the passage of time, the addition of stimuli such as heat, etc. Gelling is preferred. Moreover, the wound healing agent of this invention may apply a solution-form thing as it is to an affected part, or may make it gelatinize previously, and may apply to an affected part.

溶液状の創傷治癒剤を患部へ適用する場合の創傷治癒剤の温度は、タンパク質（Ａ）の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜４７．５℃、特に好ましくは２５〜４５℃、最も好ましくは３０〜４０℃である。
また、創傷治癒剤を予めゲル化させて用いる場合のゲル化させる温度は、創傷治癒剤を短時間でゲル化させる観点から、２５℃〜８０℃が好ましい。８０℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。 The temperature of the wound healing agent in the case of applying the solution-like wound healing agent to the affected area is preferably 4 to 50 ° C., more preferably 4 to 47.5 from the viewpoint of the thermal stability and handling properties of the protein (A). ° C, particularly preferably 25 to 45 ° C, most preferably 30 to 40 ° C.
In addition, the gelling temperature when the wound healing agent is gelled in advance is preferably 25 ° C. to 80 ° C. from the viewpoint of gelling the wound healing agent in a short time. When it is 80 ° C. or lower, gelation can be achieved without deteriorating the function of the tissue regeneration material, and the time until gelation is appropriate.

創傷治癒剤の患部への適用方法としては、菌増殖抑制、肉芽組織形成、上皮化促進及び拘縮抑制の観点から、患部の欠損部分を埋めるように注入することが好ましい。
患部への適用方法の１例を下記に示す。
（創傷治癒剤の患部への適用方法）
（１）患部に創傷治癒剤を投与する。
（２）投与後、創傷治癒剤が患部から流出しないように、適当なドレッシングで被覆する。 As a method for applying the wound healing agent to the affected part, it is preferable to inject the wound part so as to fill the defective part from the viewpoint of suppression of bacterial growth, formation of granulation tissue, promotion of epithelialization and suppression of contracture.
An example of an application method to the affected area is shown below.
(Application method of wound healing agent to affected area)
(1) A wound healing agent is administered to the affected area.
(2) After administration, coat with an appropriate dressing so that the wound healing agent does not flow out of the affected area.

上記（２）で使用するドレッシングの材質としては、特に限定されないが、ポリウレタン、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル共重合体及びナイロン等が挙げられる。
ドレッシングの形状としては、創傷治癒剤を投与後に、創傷治癒剤が患部から流出しないように被覆できれば制限なく使用できるが、フィルム状が好ましい。 The dressing material used in the above (2) is not particularly limited, and examples thereof include polyurethane, silicone, polyvinyl alcohol, polypropylene, polyester, polystyrene, polyethylene, ethylene vinyl acetate copolymer, and nylon.
As the shape of the dressing, it can be used without limitation as long as it can be coated so that the wound healing agent does not flow out from the affected area after administration of the wound healing agent, but a film shape is preferred.

以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を意味する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the present invention is not limited to these examples. In the following, “part” means “part by weight” unless otherwise specified.

＜製造例１＞
［ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製］
○ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰＳ１Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰＳ１Ｋ生産株を用いて、タンパク質（Ａ）の一種である配列（１５）のＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）を生産する方法を示す。 <Production Example 1>
[Preparation of SELPS1K protein (A1-1)]
Production of SELPS1K protein (A1) According to the method described in Examples of Japanese Patent No. 4088341, a plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K was prepared.
The prepared plasmid was transformed into E. coli to obtain a SELPS1K production strain. Hereinafter, a method for producing the SELPS1K protein (A1) having the sequence (15), which is a kind of the protein (A), using the SELPS1K production strain will be described.

○ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰＳ１Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。 O Culture of SELPS1K protein (A1) An overnight culture of SELPS1K producing strain grown at 30 ° C was used to inoculate 50 ml of LB medium in a 250 ml flask. Kanamycin was added to a final concentration of 50 μg / ml, and the culture was incubated at 30 ° C. with stirring (200 rpm). When the culture solution became turbidity OD600 = 0.8 (absorbance meter UV1700: manufactured by Shimadzu Corporation), 40 ml was transferred to a flask preheated to 42 ° C. and cultured at the same temperature for about 2 hours. The cultured broth was cooled on ice, the turbidity OD600 of the broth was measured, and Escherichia coli was collected by centrifugation.

○ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の精製
集菌した大腸菌を用い、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８５ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（Ａ１）の精製物であるＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。 ○ Purification of SELPS1K protein (A1) Using collected E. coli, the following 1: lysis of cells, 2: removal of insoluble debris by centrifugation, 3: ammonium sulfate precipitation, 4: ultrafiltration, 5: anion exchange chromatography Protein was purified from E. coli biomass by chromatography, 6: ultrafiltration, 7: lyophilization. In this way, SELPS1K protein (A1-1), which was a purified product of protein (A1) of sequence (15) having a molecular mass of about 85 kDa, was obtained.

１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。 1: Bacterial cell dissolution To 100 g of collected Escherichia coli, 200 g of deionized water was added and the cell was dissolved with a high-pressure homogenizer (55 MPa) to obtain a cell solution containing the dissolved cells. Thereafter, the cell lysate was adjusted to pH 4.0 with glacial acetic acid.

２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。 2: Removal of insoluble debris by centrifugation Further, the cell lysate was centrifuged (6300 rpm, 4 ° C., 30 minutes), and the supernatant was collected.

３：硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。 3: Ammonium sulfate precipitation A saturated ammonium sulfate solution was added to the collected supernatant so that the ammonium sulfate concentration was 25% by weight. Then, after leaving still for 8 to 12 hours, the deposit was collect | recovered by centrifugation. The collected precipitate was dissolved in deionized water. Similarly, a saturated ammonium sulfate solution was added to the dissolved liquid so that the ammonium sulfate concentration was 25% by weight. Then, after leaving still for 8 to 12 hours, the deposit was collect | recovered by centrifugation. The collected precipitate was dissolved in deionized water to obtain a solution.

４：限外濾過
３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファイバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、２０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。 4: Ultrafiltration The solution obtained in 3 was subjected to an ultrafiltration apparatus (Holofiber: manufactured by GE Healthcare) having a molecular weight of 30,000 cut. The solution obtained in 3 was subjected to ultrafiltration using 20 times the amount of deionized water to obtain a protein after ultrafiltration.

５：陰イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。 5: Anion exchange chromatography AKTAPprim (Amersham) in which the protein after ultrafiltration was dissolved in 10 mM sodium acetate buffer to 20 g / L, and an anion exchange column HiPrepSP XL16 / 10 (manufactured by GE Healthcare) was set. Made). The eluted fraction was collected using 500 mM sodium acetate buffer as the eluent.

６：限外濾過
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。 6: Ultrafiltration The solution obtained in 5 was treated in the same manner as in “4: Ultrafiltration” to obtain a protein after ultrafiltration.

７：凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して３ｇ／Ｌとし、水位が１０ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−３０℃、２４時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が５Ｐａ以下、−３０℃で、１１０時間かけて１次乾燥、真空度が５Ｐａ以下、３０℃で、４８時間かけて２次乾燥させ、精製したＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。 7: Lyophilization The protein was dissolved in deionized water to 3 g / L, and placed in a stainless steel vat so that the water level was 10 mm or less. Then, it put into the freeze dryer (made by Nippon Techno Service Co., Ltd.), and it was made to freeze over -30 degreeC and 24 hours. After freezing, the SELPS1K protein (A1-1) was purified by primary drying over 110 hours at a vacuum degree of 5 Pa or less and −30 ° C., and secondary drying over 48 hours at a vacuum degree of 5 Pa or less and 30 ° C. Got.

○ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の同定
得られたＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を下記の手順で同定した。
抗ラビットＳＥＬＰＳ１Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対する抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロット法により分析した。ウエスタンブロット法の手順は下記の通りとした。見かけ分子質量８５ｋＤａの位置に、各抗体に抗体反応性を示すバンドが見られた。 また、アミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所製）を用いたアミノ酸組成分析より得られたＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）のアミノ酸の組成比率（実測値）と、合成遺伝子配列から推測されるＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）のアミノ酸の組成比率（理論値）を表１に示す。
これらから、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）はＧＶＧＶＰ配列（３）が３個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）中のバリン（Ｖ）のうち１個がリシン（Ｋ）に置換された（ＧＶＧＶＰ）₂ＧＫＧＶＰ配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が７個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）₇配列（５）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（１５）のタンパク質であることを確認した。 ○ Identification of SELPS1K protein (A1-1) The obtained SELPS1K protein (A1-1) was identified by the following procedure.
The analysis was carried out by Western blotting using an anti-rabbit SELPS1K antibody and an anti-6 × His antibody (Roland) against a 6 × His tag of the C-terminal sequence. The Western blot procedure was as follows. A band showing antibody reactivity with each antibody was observed at a position of an apparent molecular mass of 85 kDa. In addition, the amino acid composition ratio (actual value) of the SELPS1K protein (A1-1) obtained by amino acid composition analysis using an amino acid analysis system (Prominence Shimadzu Corporation) and the SELPS1K protein (A1) estimated from the synthetic gene sequence Table 1 shows the composition ratio (theoretical value) of amino acids -1).
From these, in the SELPS1K protein (A1-1), one of valine (V) in a polypeptide chain (Y) in which three GVGVP sequences (3) are continuous was substituted with lysine (K) (GVGVP) _2. 7 polypeptide chains (Y'11) of GKGVP sequence (6) and 7 consecutive GAGAGS sequences (1) (GAGAGS) ₇ 13 polypeptide chains (Y11) of sequence (5), which are alternately It was confirmed that the protein was a protein of the sequence (15) formed by chemical bonding.

＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３％ ブロモフェノールブルー、及び３０％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃で５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレン（以下、単に「メンブレン」ともいう）にトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗ＳＥＬＰＳ１Ｋ抗体及び抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）が分解吸収され、無くなったと判断した。 <Western blot method>
Western blotting sample 20 μL with 3 × SDS processing buffer (containing 150 mM Tris HCl (pH 6.8), 300 mM dithiothreitol, 6% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.3% bromophenol blue, and 30% glycerol) 10 μL was added and heated at 95 ° C. for 5 minutes to prepare a sample for electrophoresis. SDS-PAGE was performed using 15 μL of the sample for electrophoresis. The gel after electrophoresis was transferred to a polyvinylidene fluoride membrane (hereinafter also simply referred to as “membrane”), which was then blocked with buffer (20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20, and 5% skim milk. And the membrane was subjected to blocking treatment by shaking at room temperature for 1 hour. After the blocking treatment, the membrane was washed with TBS-T (containing 20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM NaCl, and 0.1% Tween 20) for 2 minutes. Next, the membrane is immersed in a primary antibody solution (primary antibody: a solution obtained by diluting anti-SELPS1K antibody and anti-His-tag antibody (manufactured by Rockland) to 1/500 with TBS-T), and left at 4 ° C. overnight. The antibody reaction was performed. After the reaction, this membrane was washed 4 times with TBS-T for 5 minutes, and then a solution of a secondary antibody (secondary antibody: ECL anti--) capable of binding to the primary antibody and conjugated with horseradish peroxidase as a labeling enzyme. Rabbit IgG HRP linked F (ab ') 2 fragment (manufactured by GE Healthcare Bioscience) diluted to 1/2000 in TBS-T) and left at room temperature for 30 minutes for antibody reaction Went. After the reaction, the membrane was washed 4 times with TBS-T for 5 minutes, and then subjected to an enzyme reaction using ECL-Advanced Western Blotting Detection Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience). Using a luminometer ForECL (manufactured by Amersham), a high sensitivity instant black-and-white film (manufactured by Fujifilm Corporation) was exposed to light to visualize the band. When the band could not be confirmed with the naked eye, it was determined that the SELPS1K protein (A1-1) was absorbed and lost.

○βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定
得られたＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。
＜βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定＞
ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を算出した。結果を表２に示す。 ○ Measurement of total ratio of β-turn structure and random coil structure Using the obtained SELPS1K protein (A1-1), the total ratio of β-turn structure and random coil structure was measured by the following procedure.
<Measurement of total ratio of β-turn structure and random coil structure>
The SELPS1K protein (A1-1) was dissolved in deionized water (4 ° C.) to a concentration of 0.3 mg / ml to prepare an aqueous SELPS1K protein (A1-1) solution. The prepared SELPS1K protein (A1-1) aqueous solution was measured with a circular dichroism spectrometer (JASCO: J-820) (measurement temperature: 4 ° C.), and secondary structure analysis program (JWSSE type: JASCO Corporation) The total ratio of the β-turn structure and random coil structure was calculated. The results are shown in Table 2.

＜製造例２＞
製造例１の「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−２）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、８Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計３回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。 <Production Example 2>
In “Production of SELPS1K protein (A1-1)” in Production Example 1, between “5: Anion exchange chromatography” and “6: Ultrafiltration” in “Purification of SELPS1K protein (A1)”, A SELPS1K protein (A1-2) was prepared in the same manner except that “5-2: Refolding (large dilution method)” was performed, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.
5-2: Refolding (large dilution method)
An anion exchange chromatography elution fraction was prepared with a 10M urea solution, which is a protein denaturant, so as to be an 8M urea solution, and allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours. The prepared solution was put into a dialysis membrane (manufactured by Viscose Companies, Inc.) and dialyzed for 12 hours against 10 times volume of deionized water of the eluted fraction. Thereafter, the deionized water was discarded, and newly dialyzed for 12 hours against 10 times the volume of deionized water of the eluted fraction. This operation was repeated three times, a total of three times, and then the solution in the dialysis membrane was recovered.

＜製造例３＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約９５ｋＤａの配列（１６）のＳＥＬＰＳ１Ｋ−２０タンパク質（Ａ２）をコードしたｐＰＴＳ０００２」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ２−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Production Example 3>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pPTS0002 encoding SELPS1K-20 protein (A2) of sequence (16) having a molecular mass of about 95 kDa” is used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”. (A2-1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜製造例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約１４０ｋＤａの配列（２２）のＳＥＬＰＳ２Ｋ−２０タンパク質（Ａ８）をコードしたｐＰＴＳ０００８」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ８−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Production Example 4>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pPTS0008 encoding SELPS2K-20 protein (A8) of sequence (22) having a molecular mass of about 140 kDa” is used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”. (A8-1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約９０ｋＤａの配列（２３）のＳＥＬＰＳ３Ｋ−１３タンパク質（Ａ９）をコードしたｐＰＴＳ０００９」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ９−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Production Example 5>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pPTS0009 encoding SELPS3K-13 protein (A9) of sequence (23) having a molecular mass of about 90 kDa” is used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”. (A9-1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜製造例６＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約６５ｋＤａの配列（２４）のＳＥＬＰＳ４Ｋ−１５タンパク質（Ａ１０）をコードしたｐＰＴＳ００１０」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ１０−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Production Example 6>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pPTS0010 encoding SELPS4K-15 protein (A10) of sequence (24) having a molecular mass of about 65 kDa” is used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”. (A10-1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜比較製造例１＞
製造例１の「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−３）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
５’’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。 <Comparative Production Example 1>
In “Preparation of SELPS1K protein (A1-1)” in Production Example 1, “5: Anion exchange chromatography” instead of “5: Anion exchange chromatography” in “Purification of SELPS1K protein (A1)” SELPS1K protein (A1-3) was prepared in the same manner except that, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.
5 ″: Affinity Chromatography The protein after “4: Ultrafiltration” is purified by affinity chromatography using HIs-tag (Clontech, TALON (registered trademark) Single Step Columns) and eluted fractions. Was recovered.

＜比較製造例２＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約８５ｋＤａの配列（１７）のタンパク質（Ａ３）をコードしたｐＰＴＳ０００３」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ３−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Comparative Production Example 2>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pPTS0003 encoding protein (A3) of sequence (17) having a molecular mass of about 85 kDa” is used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”, protein (A3- 1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜比較製造例３＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約６０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（Ａ４）をコードしたｐＰＴＳ０００４」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ４−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Comparative Production Example 3>
In the production example 1, a protein (A4−4) was used in the same manner except that “pPTS0004 encoding a protein (A4) of sequence (18) having a molecular mass of about 60 kDa” was used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”. 1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜比較製造例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約１１０ｋＤａの配列（１９）のタンパク質（Ａ５）をコードしたｐＰＴＳ０００５」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ５−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Comparative Production Example 4>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pPTS0005 encoding protein (A5) of sequence (19) having a molecular mass of about 110 kDa” is used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”, protein (A5- 1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜比較製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約１２５ｋＤａの配列（２０）のタンパク質（Ａ６）をコードしたｐＰＴＳ０００６」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ６−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Comparative Production Example 5>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pPTS0006 encoding a protein (A6) of sequence (20) having a molecular mass of about 125 kDa” is used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”, protein (A6- 1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜比較製造例６＞
製造例１において、「ＳＥＬＰＳ１ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０００１」に代えて、「分子質量が約５０ｋＤａの配列（２１）のタンパク質（Ａ７）をコードしたｐＰＴＳ０００７」を用いる以外は同様にして、タンパク質（Ａ７−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Comparative Production Example 6>
In the same manner as in Production Example 1, except that “pPTS0007 encoding protein (A7) of sequence (21) having a molecular mass of about 50 kDa” is used instead of “plasmid pPTS0001 encoding SELPS1K”, protein (A7− 1) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜比較製造例７＞
製造例１の「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−４）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。 <Comparative Production Example 7>
In the same manner as in “Production of SELPS1K protein (A1-1)” in Production Example 1, except that “5: Anion exchange chromatography” in “Purification of SELPS1K protein (A1-1)” is not performed, SELPS1K protein ( A1-4) was prepared, and the total ratio of the β-turn structure and the random coil structure was measured. The results are shown in Table 2.

＜実施例１＞
ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１）を作製した。 <Example 1>
A wound healing agent prepared by dissolving SELPS1K protein (A1-1) in 20 mM phosphate buffer (NaCl: 8 g / L, KCl: 0.2 g / L, pH 7.4) to 20% by weight ( 1) was produced.

＜実施例２〜６＞
実施例１において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）」に代えて表３に記載のタンパク質（Ａ）を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（２）〜（６）を作製した。 <Examples 2 to 6>
In Example 1, wound healing agents (2) to (6) were prepared in the same manner except that the protein (A) shown in Table 3 was used instead of “SELPS1K protein (A1-1)”.

＜比較例１〜７＞
実施例１において、「ＳＥＬＰＳ１Ｋタンパク質（Ａ１−１）」に代えて表３に記載のタンパク質（Ａ）を用いる以外は同様にして、比較用の創傷治癒剤（７）〜（１３）を作製した。 <Comparative Examples 1-7>
In Example 1, comparative wound healing agents (7) to (13) were prepared in the same manner except that the protein (A) shown in Table 3 was used instead of “SELPS1K protein (A1-1)”. .

＜比較例８＞
カルボキシメチルセルロースゲルであるイントラサイトゲル（スミス＆ネフュー社製）を比較用の創傷治癒剤（１４）として用いた。 <Comparative Example 8>
Intrasite gel (Smith & Nephew), which is a carboxymethylcellulose gel, was used as a comparative wound healing agent (14).

＜評価１＞
（タンパク質（Ａ）のゲル化能評価）
創傷治癒剤（１）〜（１４）を３７℃で静置し、ゲル化するまでの時間を測定した。ゲル化をしたかどうかの確認は、創傷治癒剤（１００μＬ）が入ったプラスティックチューブ容器（エッペンドルフチューブ、１．５ｍＬ）を５分毎に転倒し、溶液が垂れない場合はゲル化しているとし、溶液が垂れる場合はゲル化していないと判断した。また、ゲル化するまでに２時間以上を要する場合はゲル化しないと判断した。結果を表３に示す。 <Evaluation 1>
(Evaluation of gelation ability of protein (A))
The wound healing agents (1) to (14) were allowed to stand at 37 ° C., and the time until gelation was measured. To confirm whether gelation has occurred, the plastic tube container (Eppendorf tube, 1.5 mL) containing the wound healing agent (100 μL) is tumbled every 5 minutes, and if the solution does not drip, it is gelled. When the solution dripped, it was judged that it was not gelled. Moreover, when it took 2 hours or more to gelatinize, it judged that it did not gel. The results are shown in Table 3.

＜評価２＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤（１）〜（１４）を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間５、１０日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１１個作製した。
作製した治療期間５日目の病理標本用いて、パニキュラス（筋様膜）からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は病理標本１１個の平均値である。
また、治療期間１０日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は病理標本１１個の平均値である。 <Evaluation 2>
(Treatment test with a full-thickness layer model using healthy guinea pigs)
Healthy guinea pig std Hartley (manufactured by SLC Japan) 7 weeks old was depilated under anesthesia, and a 10 x 10 mm full-thickness skin defect wound was created with the fat layer completely exposed on the sterilized guinea pig dorsal skin, After hemostasis and drying, wound healing agents (1) to (14) were respectively injected, and a polyurethane film was adhered. Then, gauze was put on each wound part, and the wound part periphery was fixed with the nylon thread | yarn. On the 5th and 10th treatment period, the specimen was sacrificed, the skin including the wound was collected, and a pathological specimen (HE staining) was prepared. Eleven pathological specimens were prepared for each wound healing agent.
Using the prepared pathological specimen on the fifth day of the treatment period, the granulation tissue height from the paniculus (muscle-like membrane) was measured using a micro ruler. The evaluation results are shown in Table 3. The evaluation result is an average value of 11 pathological specimens.
Moreover, the epithelialization length extended from normal tissue was measured using the micro ruler using the pathological specimen of the treatment period 10th day. The evaluation results are shown in Table 3. The evaluation result is an average value of 11 pathological specimens.

＜評価３＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの菌増殖抑制試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、緑膿菌１０⁶個／１創傷部となるように播種し、創傷治癒剤（１）〜（１４）を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間３日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、細菌コロニー法にて細菌数を測定した。評価結果は表３に示す。 <Evaluation 3>
(Bacteria growth inhibition test in a full-thickness layer model using healthy guinea pigs)
Healthy guinea pig std Hartley (manufactured by SLC Japan) 7 weeks old was depilated under anesthesia, and a 10 x 10 mm full-thickness skin defect wound was created with the fat layer completely exposed on the sterilized guinea pig dorsal skin, After hemostasis and drying, seeding was performed so that 10 ⁶ Pseudomonas aeruginosa / 1 wounds were made, wound healing agents (1) to (14) were injected, and a polyurethane film was attached. Then, gauze was put on each wound part, and the wound part periphery was fixed with the nylon thread | yarn. On the third day of the treatment period, the specimen was sacrificed, the skin containing the wound was collected, and the number of bacteria was measured by the bacterial colony method. The evaluation results are shown in Table 3.

＜評価４＞
（ミニブタを用いた全層欠損層モデルでの二次出血スコアリング試験）
クラウン系ミニブタ（株式会社ジャパンファーム クラウン研究所製）１０ヶ月齢を麻酔下で除毛し、消毒したミニブタ背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面（直径１７ｍｍ）の全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤（１）〜（１４）を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間３日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。なお、創傷治癒剤についてそれぞれ病理標本を１３個作製した。作製した病理標本について、患部全体に対する痂皮の割合を、以下の５段階の評価基準で評価し、スコアリングした。結果を表３に示す。なお、評価結果は病理標本１３個の平均値である。下記点数が低いほど、二次出血が抑制できていることを示す。
１点：患部全体に対する痂皮の割合が２０％未満
２点：患部全体に対する痂皮の割合が２０％以上４０％未満
３点：患部全体に対する痂皮の割合が４０％以上６０％未満
４点：患部全体に対する痂皮の割合が６０％以上８０％未満
５点：患部全体に対する痂皮の割合が８０％以上 <Evaluation 4>
(Secondary bleeding scoring test using a full-thickness layer model using minipigs)
Crown-type minipig (Japan Farm, Inc., Crown Research Laboratories Co., Ltd.) 10 months of age under hair removal under anesthesia to create a full-thickness skin defect wound with a wound surface (diameter 17 mm) with the fat layer completely exposed on the sterilized minipig back skin Then, after hemostasis and drying, wound healing agents (1) to (14) were respectively injected and a polyurethane film was adhered. Then, gauze was put on each wound part, and the wound part periphery was fixed with the nylon thread | yarn. On the 3rd day of the treatment period, the specimen was sacrificed, the skin including the wound was collected, and a pathological specimen (HE staining) was prepared. In addition, 13 pathological specimens were prepared for each wound healing agent. About the produced pathological specimen, the ratio of the crust to the whole affected part was evaluated according to the following five evaluation criteria and scored. The results are shown in Table 3. The evaluation result is an average value of 13 pathological specimens. It shows that the secondary bleeding can be suppressed, so that the following score is low.
1 point: The ratio of crust to the whole affected area is less than 20% 2 points: The ratio of crust to the whole affected area is 20% to less than 40% 3 points: The ratio of crust to the whole affected area is 40% to less than 60% 4 points : The ratio of crust to the whole affected area is 60% or more and less than 80% 5 points: The ratio of crust to the whole affected area is 80% or more

表３の結果から、本発明の創傷治癒剤は、肉芽組織形成性、上皮化促進作用及び菌増殖抑制作用が比較例と同等又はそれ以上であり、創傷治癒剤として優れていることがわかる。さらに本発明の創傷治癒剤は、患部の二次出血の抑制効果が極めて高いことが分かる。   From the results of Table 3, it can be seen that the wound healing agent of the present invention has granulation tissue forming properties, epithelialization promoting action and fungus growth inhibitory action equivalent to or higher than those of the comparative examples and is excellent as a wound healing agent. Furthermore, it can be seen that the wound healing agent of the present invention has an extremely high effect of suppressing secondary bleeding in the affected area.

本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制効果、肉芽組織形成、上皮化促進作用に優れており、また、患部の二次出血を抑制する。したがって、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創等の疾患ないし創傷による患部を治癒する創傷治癒剤として有効である。   The wound healing agent of the present invention is excellent in the effect of inhibiting bacterial growth, granulation tissue formation and epithelialization promotion, and suppresses secondary bleeding in the affected area. Therefore, it is effective as a wound healing agent for healing a disease such as a burn, a skin wound, a skin exfoliation wound, and a traumatic skin defect wound or an affected part caused by a wound.

Claims (6)

ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が４０〜６０％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５〜４５％であり、前記タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が４０〜８０％であり、前記タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）7配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（６）を有するタンパク質、（ＧＡＧＡＧＳ）11配列（５）及びＧＶＧＶＰ配列（３）を有するタンパク質又は（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）3ＧＫＧＶＰ配列（２７）を有するタンパク質である創傷治癒剤。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／若しくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。 A wound healing agent comprising a GAGAGS sequence (1) and a protein (A) having the following amino acid sequence (X) and / or the following amino acid sequence (X ′) and water, which is obtained by the circular dichroism spectrum method The total ratio of the β-turn structure and the random coil structure in the protein (A) is 40 to 60%, and the number of amino acids in all the amino acid sequences (X) with respect to the total number of amino acids in the protein (A) The ratio of the total number of amino acids in the amino acid sequence (X ′) is 5 to 45%, and the ratio of the number of amino acids in all the GAGAGS sequences (1) to the total number of amino acids in the protein (A) proteins with but Ri 40% to 80% der, the protein (a) is a (GAGAGS) 7 sequence (5) and (GVGVP) 2GKGVP sequence (6), (GAGA S) 11 sequence (5) and GVGVP protein having sequence (3) or (GAGAGS) 4 sequence (5) and wound healing agents Ru protein der having (GVGVP) 3GKGVP sequence (27).
Amino acid sequence (X): At least one amino acid sequence selected from the group consisting of VPGVG sequence (2), GVGVP sequence (3) and GAHGGPGPK sequence (4).
Amino acid sequence (X ′): an amino acid sequence in which one amino acid in the amino acid sequence (X) is substituted with lysine (K) or arginine (R), or two amino acids in the amino acid sequence (X) are lysine Amino acid sequence substituted with (K) and / or arginine (R). 前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数と前記アミノ酸配列（Ｘ）及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝］が１：０．１〜１：６である請求項１に記載の創傷治癒剤。   Ratio of the number of GAGAGS sequences (1) to the total number of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′) [GAGAGS sequences (1): {of amino acid sequences (X) and amino acid sequences (X ′)] The wound healing agent according to claim 1, wherein the total}] is from 1: 0.1 to 1: 6. 前記タンパク質（Ａ）が、前記アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、前記タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計個数が１〜１００個である請求項１又は２に記載の創傷治癒剤。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：前記ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。 The protein (A) has a polypeptide chain (Y) and / or a polypeptide chain (Y ′) described below in which one kind of the amino acid sequence (X) is continuous, and is in the protein (A). The wound healing agent according to claim 1 or 2, wherein the total number of the polypeptide chain (Y) and the polypeptide chain (Y ') is 1 to 100.
Polypeptide chain (Y ′): A polypeptide chain in which 0.1 to 20% of the total number of amino acids in the polypeptide chain (Y) is substituted with lysine (K) and / or arginine (R). 前記タンパク質（Ａ）が、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１〜３のいずれかに記載の創傷治癒剤。   The wound healing agent according to any one of claims 1 to 3, wherein the protein (A) has a polypeptide chain (S) in which 2 to 200 GAGAGS sequences (1) are continuous. 前記タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が４０〜２００ｋＤａである請求項１〜４のいずれかに記載の創傷治癒剤。 The wound healing agent according to any one of claims 1 to 4 , wherein the protein (A) has a molecular mass of 40 to 200 kDa as determined by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis). 創傷治癒剤の重量を基準として、前記タンパク質（Ａ）が５〜３０重量％である請求項１〜５のいずれかに記載の創傷治癒剤。
The wound healing agent according to any one of claims 1 to 5 , wherein the protein (A) is 5 to 30% by weight based on the weight of the wound healing agent.