JP6313776B2 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents
単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム Download PDFInfo
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Description
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
14a…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、特許文献9〜12に記載の走査分子計数法又はFCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過し、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1(B)に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図1(B)に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり(典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。)、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、1つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間(BIN TIME)毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ(図示せず)には、観察するべきウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列の光強度データに於いて発光粒子の信号の発生時間の間隔が逐次的に計測され、かかる逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて発光粒子濃度若しくは濃度変化速度又はそれらの指標値の決定が行われる。以下、本発明の走査分子計数法及び信号発生時間間隔を用いた発光粒子濃度若しくは濃度変化速度又はそれらの指標値の決定の原理について説明する。
「走査分子計数法」(特許文献9〜12)では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構(ミラー偏向器17)を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器10(マイクロプレート9)の水平方向の位置を移動して、図2(A)にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域CVの位置を移動しながら、即ち、光検出領域CVにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域CVが移動する間(図中、時間t0〜t2)に於いて1つの発光粒子の存在する領域を通過する際(t1)には、発光粒子から光が放出され、図2(B)に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度(Em)のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2(B)に例示されている如きパルス状の信号(有意な光強度)を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、FCS、FIDA等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
図9に関連して、既に述べた如く、特許文献9〜12に記載の走査分子計数法に於いては、光計測を上記の如く一定の計測時間に亘って又は一定の検出数まで実行し、試料溶液内の発光粒子の濃度値又はその指標値は、一定の計測時間内の検出数又は一定の検出数の検出に要した計測時間から算定される。かかる構成に於いては、精度よく或いは効率的に光計測及び発光粒子の濃度検出を行うためには、発光粒子の濃度が準静的又は定常的であり、試料溶液内の発光粒子の濃度値が或る程度予測できていることが好ましい。
Ti>Tii>Tiii>Tiv>Tv… …(1)
となる。従って、発光粒子の信号の発生時間の間隔を用いることにより、発光粒子濃度の算出が可能であり、更に、信号の発生時間の間隔を逐次追跡することによって発光粒子濃度の変化も追跡可能となる。発光粒子濃度と信号発生時間間隔との関係は、具体的には、下記のように与えられる。即ち、図2(D)に模式的に描かれている如く、試料溶液中の発光粒子濃度Cのとき、走査方向に垂直な方向の断面積Sの光検出領域CVが速度uにて時間τだけ移動する間に、光検出領域CVに包含される(即ち、検出される)発光粒子の数Pは、
P=CSuτ=Cπr2uτ …(2)
となる。ここに於いて、光検出領域CVの断面は、半径rの円として近似した。従って、一個の発光粒子の信号を検出するのに要する時間τ/P、即ち、一つの発光粒子の検出後に次の発光粒子の検出までの時間間隔(一粒子の信号発生時間間隔)Tj(=τ/P)は、
Tj=1/(Cπr2u) …(3)
により与えられる。よって、信号発生時間間隔Tjを計測することにより、発光粒子濃度Cは、
C=1/(Tjπr2u) …(4)
として算定される。なお、発光粒子の検出過程、即ち、信号の発生過程は、確率的であり、一粒子の信号発生時間間隔は、ばらつきが大きくなるところ、図2(C)に示されている如く、信号発生時間間隔Tjの計測と発光粒子の濃度値への換算を逐次的に実行し、逐次的な発光粒子の濃度値を参照することによって光計測を実行する間に亘る発光粒子の濃度値とその時間変化の挙動に於けるばらつきは或る程度相殺される。また、信号発生時間間隔は、所定の数の粒子の信号が発生した時間の間隔であってもよい。即ち、或る粒子の信号発生時間からk個目の粒子の信号発生時間までの時間間隔TKjであってよく、その場合、発光粒子濃度Cは、
C=k/(TKjπr2u) …(4a)
により与えられる。式(4a)の場合、時間分解能は低下するが、値のばらつきが抑制されることが期待される。kは、例えば、2〜50などの整数であってよい。
図1(A)に例示の光分析装置1を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、(1)発光粒子を含む試料溶液の調製、(2)試料溶液の光強度の測定及び発光粒子の検出・計数処理、及び(3)濃度・反応速度係数の算出等の分析が実行される。
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい(試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。)。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識(蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子)が任意の態様にて付加された粒子であってよい。また、本発明に於いては、発光粒子濃度の時間変化の挙動の追跡が可能であるので、例えば、結合解離反応や分子間相互作用によって濃度の変化する発光粒子、或いは、構造変化によって発光特性が変化する発光粒子が、観測対象となる粒子として利用可能である。
図3(A)〜(B)は、図1(A)に例示の光分析装置1を用いて実行される本実施形態に於ける試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出及び信号発生時間間隔の計測の処理の一つの例をフローチャートの形式にて表したものである。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出及び発光粒子からの信号の検出の一連の処理が、任意に(比較的短く)設定される解析時間間隔t毎に実行され、発光粒子の信号が検出された場合に、その時間と、その前に発光粒子の信号が検出された時間との間の時間間隔(信号発生時間間隔Tn又はTKn)の計測が為され、好ましくは、リアルタイムに信号発生時間間隔Tn若しくはTKn又はその値から換算された発光粒子濃度値又はその指標値が表示される。そして、かかる処理が任意の時間に亘って連続的に反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ18の処理作動により実現されることは理解されるべきである。
図3(A)を参照して、具体的な操作処理に於いては、まず、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、光強度の測定、発光粒子の検出及び信号発生時間間隔の計測の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、信号発生時間間隔の計測に於いて参照する粒子数[間隔計測粒子数K](ステップ10)及び解析時間間隔tの読込(ステップ20)を行う。間隔計測粒子数Kは、1以上の任意の整数であってよい。解析時間間隔tは、好適には、光検出領域の移動速度(u)と寸法(2r)を考慮して、一つの発光粒子の信号の長さよりも十分に長い任意の時間(>2r/u)に設定されてよい。(一つの発光粒子の信号が二つ以上の解析時間間隔tに亘って出現することをできるだけ回避するためである。)間隔計測粒子数Kと解析時間間隔tは、任意の態様にて使用者により入力された値又はコンピュータ18に於いて適宜設定された値であってよい。
かくして、間隔計測粒子数Kと解析時間間隔tの読込が為されると、以下の如く、解析時間間隔t毎に、解析時間間隔tに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理、測定された光強度データからの発光粒子の信号の検出及び信号発生時間の記録(ステップ30)と、ステップ30にて検出された発光粒子信号の発生時間間隔を算定する処理(ステップ40)とが反復して実行される。なお、好適には、ステップ40にて算定された信号発生時間間隔又はそれから換算される発光粒子濃度値若しくはその指標値が、コンピュータ18のディスプレイに、時間経過に対する変化を使用者が視認できる態様(例えば、時間に対する変化を表すグラフ表示等)にてリアルタイムに表示されてよい(ステップ45)。以下、ステップ30〜45の処理について詳細に説明する。
図3(B)は、ステップ30に於ける処理過程の例をフローチャートの形式にて表したものである。同図を参照して、ステップ30に於ける処理過程に於いては、まず、ミラー偏向器17又はステージ位置変更装置17aを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔tに亘って為される(ステップ100)。かかる処理では、典型的には、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順、励起光を光検出領域に照射する手順(必要な場合のみ)及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射(必要な場合のみ)及び光強度の測定が開始される。測定が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器17によるミラー7(ガルバノミラー)の駆動又はステージ位置変更装置17aによるステージの駆動によって、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を測定する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2r)2=6D・Δτ …(5)
から、
Δτ=(2r)2/6D …(6)
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2r/Δτ=3D/r …(7)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、rが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の、例えば、15mm/sと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により解析時間間隔tに於ける試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出が実行される。
I=A・exp(−2t2/a2) …(8)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(8)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
かくして、解析時間間隔tに亘る時系列光強度データに於ける発光粒子信号の検出処理が為されると、検出された信号の発生時間間隔Tnが算定される。信号発生時間間隔Tnに於いては、間隔計測粒子数K=1であるときには、直前のステップ30にて検出された発光粒子信号の発生時間tpnと前回までに検出された発光粒子信号発生時間tp(n−1)との差分tpn−tp(n−1)がTn(tpn)として算定される。なお、一回の測定に於いて、最初に検出された発光粒子信号については、信号発生時間間隔Tnは、算定されなくてよい。また、直前のステップ30の解析時間間隔tにて二つ以上の発光粒子信号が検出された場合には、それぞれの発光粒子信号について、その直前に発生した発光粒子信号の発生時間から測った発光粒子信号発生時間が算定される。間隔計測粒子数K>1であるときには、信号発生時間間隔Tnは、発光粒子信号の検出数がKに達する毎に信号発生時間間隔TKnが算定されてよい。即ち、最初に検出された発光粒子信号の発生又は信号発生時間間隔TKnの算定を行った信号の発生からK個目の信号が発生したときに、その発生時間tpnと、最初に検出された発光粒子信号又は信号発生時間間隔の算定を行った信号の発生時間tp(n−1)との差分が信号発生時間間隔TKnとして算定される。
既に触れた如く、ステップ10〜45に於ける処理は、任意の時間に亘って解析時間間隔t毎に反復して実行されてよい。この点に関し、図3(B)のステップ100の光強度の測定は、好適には、測定の開始から終了まで、ステップ100以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行される。即ち、図3の処理サイクルに於いては、一つのサイクルの解析時間間隔tに亘るステップ100の光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔tに亘るステップ100の光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ18に於いて、完了したサイクルの解析時間間隔tに亘って取得された光強度データからの発光粒子の信号の検出・信号発生時間間隔の決定の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに発光粒子の検出・信号発生時間間隔の決定が達成されることとなる。
上記の如く、光測定中に時間の経過と共に信号発生時間間隔を計測することにより、発光粒子の濃度の時間変化が観測されることとなるので、かかる計測結果から濃度変化速度が算定可能である。発光粒子濃度の時間変化の態様は、発光粒子の関わる現象(構造変化、結合・解離反応等)のメカニズムによって異なるので、適切に選択されたメカニズムから想定されるモデル式(時間の関数である濃度値の式等)を観測された発光粒子の濃度の時間変化へフィッティングすることによって、濃度変化速度値、変化速度係数等が算出される。また、観測された発光粒子の濃度の時間変化に適合する発光粒子の関わる現象のメカニズムを見出すことができた場合には、光計測を実行していない時間領域に於ける発光粒子濃度値及び/又は濃度変化速度値が推定可能となり得る。更に、発光粒子濃度変化が準静的又は定常的である場合には、信号発生時間間隔は、実質的に変化しないこととなるので、光計測が実行された間に於ける信号発生時間間隔の平均値又は信号発生時間間隔から換算された濃度値の平均値から、発光粒子濃度値を精度よく決定できることが期待される。
S=N/(C・NA・uo・τo) …(9)
により与えられる(ここで、NAは、アボガドロ数である。)。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたSの平均値が光検出領域の断面積Sとして採用されるようになっていてよい。なお、光検出領域の断面積Sは、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてもよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Cと発光粒子の数Nとの関係(式(9))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
20μ秒<パルス幅<200μ秒
ピーク強度>1(フォトン/10μ秒)
相関係数>0.95
を満たすパルス状信号を、発光粒子の信号の特徴を有する信号として判別した。
[E]+[S]<−>[ES]→[P] …(10)
かかる反応式に於いて、DNaseI−核酸結合体が反応生成物へ変化する反応速度は、
d[P]/dt=k[ES] …(11)
により与えられ、[P]は、
[P]=k[ES]t+C
により与えられると想定される。ここで、tは、経過時間であり、kは、反応速度係数であり、Cは、積分定数(反応生成物の初濃度)である。なお、本実験の条件では、DNaseI−核酸結合体濃度[ES]が高く、その変化が殆どないと考えられるので、結局、d[P]/dtは、実質的に一定であり、反応生成物濃度[P]、即ち、検出される発光粒子濃度は、
[P]=vt+C …(12)
により、直線近似することが可能である(vは、濃度変化速度である。)。
DNaseI−:[P]=2.99+2.27×10−5t
DNaseI+:[P]=3.44+0.00129t
即ち、DNaseIによる消化反応速度は、0.00129[fM/s]であり、DNaseIの添加がない場合は、実質的に濃度変化がないことが観察された。この結果は、本実験の発光粒子濃度値は、式(12)により与えられる濃度値にて適合し、検出された信号が、発光粒子の光を表す信号であることを強く示唆している。また、本実験の条件に於いては、DNaseIの量が核酸に比して高く、[ES]は、[S]の初濃度[S]0に実質的に等しいと考えられるので、[P]は、
[P]=k[ES]t+C=k[S]0t+C …(13)
にて与えられる。従って、反応速度(濃度変化速度)を算出することにより、初濃度[S]0が既知である場合には、速度係数kが算定される。一方、速度係数kが既知である場合には、基質初濃度[S]0が算定できることとなる。更に、上記の如く、適合する反応のメカニズムが確認できた場合には、上記の反応式(11)又は(13)から実際に光計測を行っていない時間の発光粒子濃度も推定可能であることは理解されるべきである。
Claims (12)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の信号の各々を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って前記時系列の光強度データに於いて検出された前記発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測し、複数の前記逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて、前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する装置。 - 請求項1の装置であって、前記信号処理部が前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて前記発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を決定する装置。
- 請求項1又は2の装置であって、前記信号処理部が前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて任意の時間に於ける前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する装置。
- 請求項1、2又は3の装置であって、前記発光粒子の信号の発生時間の間隔が所定の数の発光粒子の信号が発生する間隔である装置。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程と、
前記時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って前記時系列の光強度データに於いて検出された前記発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測する過程と、
複数の前記逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて、前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する過程と
を含む方法。 - 請求項5の方法であって、更に、前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて前記発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を決定する過程を含む方法。
- 請求項5又は6の方法であって、前記発光粒子の濃度を決定する過程に於いて、前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて任意の時間に於ける前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する方法。
- 請求項5、6又は7の方法であって、前記発光粒子の信号の発生時間の間隔が所定の数の発光粒子の信号が発生する間隔である方法。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する手順と、
前記時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って前記時系列の光強度データに於いて検出された前記発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測する手順と、
複数の前記逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて、前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する手順と
をコンピュータに実行させるコンピュータプログラム。 - 請求項9のコンピュータプログラムであって、更に、前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて前記発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を算定する手順をコンピュータに実行させるコンピュータプログラム。
- 請求項9又は10のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の濃度を決定する手順に於いて、前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて前記時系列の光強度データに於ける任意の時間に於ける前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定するコンピュータプログラム。
- 請求項9、10又は11のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の信号の発生時間の間隔が所定の数の発光粒子の信号が発生する間隔であるコンピュータプログラム。
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Family Cites Families (61)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4251733A (en) | 1978-06-29 | 1981-02-17 | Hirleman Jr Edwin D | Technique for simultaneous particle size and velocity measurement |
JPS63147419A (ja) | 1986-12-11 | 1988-06-20 | 松下電器産業株式会社 | 電気湯沸し器 |
JPH0337446A (ja) | 1989-07-04 | 1991-02-18 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | 同調型動吸振器の同調装置 |
JPH04337446A (ja) | 1991-05-15 | 1992-11-25 | Hitachi Ltd | 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置 |
FI98765C (fi) | 1995-01-16 | 1997-08-11 | Erkki Soini | Virtaussytometrinen menetelmä ja laite |
US5866336A (en) | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
EP0836090A1 (en) | 1996-10-12 | 1998-04-15 | Evotec BioSystems GmbH | Method of analysis of samples by determination of the distribution of specific brightnesses of particles |
US6235471B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Caliper Technologies Corp. | Closed-loop biochemical analyzers |
US6710871B1 (en) | 1997-06-09 | 2004-03-23 | Guava Technologies, Inc. | Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples |
GB2326229A (en) | 1997-06-13 | 1998-12-16 | Robert Jeffrey Geddes Carr | Detecting and analysing submicron particles |
SE9800360D0 (sv) | 1998-02-06 | 1998-02-06 | Goeteborg University Science I | Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules |
US6388788B1 (en) | 1998-03-16 | 2002-05-14 | Praelux, Inc. | Method and apparatus for screening chemical compounds |
US20030036855A1 (en) | 1998-03-16 | 2003-02-20 | Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey | Method and apparatus for screening chemical compounds |
CA2324262C (en) | 1998-03-16 | 2010-05-25 | Praelux Incorporated | Confocal microscopy imaging system |
US6376843B1 (en) | 1999-06-23 | 2002-04-23 | Evotec Oai Ag | Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions |
JP3559525B2 (ja) | 1999-04-29 | 2004-09-02 | エボテック オーアーイー アクチェンゲゼルシャフト | 生成関数を用いて蛍光分子又は他の粒子を特徴付ける方法 |
US8264680B2 (en) | 1999-05-28 | 2012-09-11 | Yokogawa Electric Corporation | Biochip reader and electrophoresis system |
US6965113B2 (en) | 2000-02-10 | 2005-11-15 | Evotec Ag | Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness |
US20010035954A1 (en) | 2000-03-10 | 2001-11-01 | Rahn John Richard | Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering |
DE10035190C5 (de) | 2000-07-20 | 2009-07-16 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung |
US6947133B2 (en) | 2000-08-08 | 2005-09-20 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors |
DE10038528A1 (de) | 2000-08-08 | 2002-02-21 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung |
HU226937B1 (en) | 2000-11-17 | 2010-03-29 | Mta Szegedi Biolog Koezpont | Method and apparatus for determining polarization amount of material by a laser scanning microscope |
WO2002048693A1 (fr) | 2000-12-14 | 2002-06-20 | Olympus Optical Co., Ltd. | Analyseur fluorometrique et analyse fluorometrique |
US6782297B2 (en) | 2001-05-24 | 2004-08-24 | Eric Paul Tabor | Methods and apparatus for data smoothing |
US6750963B2 (en) | 2002-05-21 | 2004-06-15 | Agilent Technologies, Inc. | Imaging systems for signals on a surface |
WO2004042404A1 (en) | 2002-11-07 | 2004-05-21 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Fret probes and methods for detecting interacting molecules |
US7038848B2 (en) | 2002-12-27 | 2006-05-02 | Olympus Corporation | Confocal microscope |
JP4315794B2 (ja) | 2002-12-27 | 2009-08-19 | オリンパス株式会社 | 共焦点顕微鏡 |
JP2005098876A (ja) | 2003-09-25 | 2005-04-14 | Institute Of Physical & Chemical Research | 2成分相互作用分析方法 |
JP2008514955A (ja) | 2004-09-28 | 2008-05-08 | シンギュレックス・インコーポレイテッド | サンプル分析システムおよび方法 |
KR20070107743A (ko) | 2005-01-31 | 2007-11-07 | 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 | 투과성 있는 혼탁한 매질 내의 입자들을 특성화하는 방법및 그 장치 |
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US8445655B2 (en) | 2006-06-16 | 2013-05-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Functional nucleic acid ligands to fluorescent proteins |
WO2008007580A1 (fr) | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Olympus Corporation | Procédé d'analyse de particules fines |
US20080052009A1 (en) | 2006-08-23 | 2008-02-28 | Washington, University Of | Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements |
GB0618057D0 (en) | 2006-09-14 | 2006-10-25 | Perkinelmer Ltd | Improvements in and relating to scanning confocal microscopy |
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WO2008080417A1 (en) | 2006-12-28 | 2008-07-10 | Flult Biosystems Gmbh | A method of determining characteristic properties of a sample containing particles |
EP2124085A4 (en) | 2007-02-14 | 2010-04-28 | Nikon Corp | CONFOCAL SLOTTED SCANNING MICROSCOPE |
JP2008292371A (ja) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Institute Of Physical & Chemical Research | 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法 |
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CA2709217C (en) | 2007-12-19 | 2021-01-05 | Singulex, Inc. | Scanning analyzer for single molecule detection and methods of use |
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