JP6313776B2 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。

近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６〜８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。

更に、本願出願人は、特許文献９〜１２に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）では、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。励起光が使用される場合には、励起光の集光領域に概ね一致する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。

特開２００５−０９８８７６ 特開２００８−２９２３７１ 特開２００９−２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８−０８０４１７ 特開２００７−２０５６５ 特開２００８−１１６４４０ 特開平４−３３７４４６号公報 国際公開第２０１１／１０８３６９ 国際公開第２０１１／１０８３７０ 国際公開第２０１１／１０８３７１ 国際公開第２０１２／０９９２３４

ところで、溶液中の粒子の濃度又はその他の状態（相互作用、結合・解離状態など）の検出又は分析に際して、粒子濃度の変化速度又は粒子の関わる反応の反応速度は、有用な情報となる。しかしながら、今までの走査分子計数法では、試料溶液中の観察対象となる発光粒子の濃度が時間と共に変化する場合に、かかる発光粒子濃度又はその変化速度を精度よく検出することは困難な場合がある。

上記の文献に記載されている如く、今までの走査分子計数法に於いては、典型的には、一つの態様として、任意に設定された計測時間に亘って試料溶液中にて光検出領域を移動しながら光計測を行い、得られた時系列の光強度値のデータ（時系列光強度データ）にて検出される発光粒子の信号の計数を行うか（特許文献９〜１１）、或いは、別の態様として、試料溶液中にて光検出領域を移動しながらの光計測と時系列光強度データに於ける発光粒子の信号の検出及び計数とが、任意に設定された粒子の検出数が得られるまで実行される（特許文献１２）。そして、発光粒子の濃度は、前者の態様の場合、設定された計測時間内の検出数から算定され、後者の場合、設定された粒子数の検出に要した計測時間から算定される。

しかしながら、観察対象となる発光粒子の濃度が未知である場合、或いは、時間と共に変化する場合、光計測を一定の計測時間に亘って又は一定検出数まで実行する態様では、設定された計測時間又は信号検出数に依存して、検出結果から算定される濃度値又は変化速度に於いて十分な精度が得られないことがある。

例えば、図９に示されている如く、一定の計測時間にて光計測を行う態様では、設定された計測時間が比較的短いとき（Ｔ１）、濃度の増加の速い発光粒子（Ａ、Ｂ、Ｃ）については、濃度が十分に高くなっているので検出可能であるが、濃度の増加の遅い発光粒子（Ｄ）については、濃度が低過ぎて検出困難となり得る。そこで、計測時間を比較的長く設定すると（Ｔ２）、濃度の増加の遅い発光粒子（Ｄ）は、検出可能なレベルまで濃度が増大するが、濃度の増加の速い発光粒子は、必要以上に長い時間に亘って光計測を実行することとなってしまう。また、濃度の増加の特に速い発光粒子（Ａ、Ｂ）の場合、濃度増加が飽和状態に達しているので、発光粒子濃度の時間変化を捉えることはできないこととなる。一方、一定の検出数が得られるまで光計測を行う態様では、設定された検出数が比較的大きいとき（Ｐ１）、濃度の増加の速い発光粒子（Ａ、Ｂ、Ｃ）については、比較的短時間にて計測を完了できるが、濃度の増加の遅い発光粒子（Ｄ）については検出に要した計測時間が非常に長くなり得る。そこで、設定される検出数を小さくしたときには（Ｐ２）、濃度の増加の遅い発光粒子（Ｄ）については検出に要した計測時間が十分に長く有意な値として得られるが、濃度の増加の速い発光粒子（Ａ、Ｂ、Ｃ）については、検出に要した計測時間が短過ぎて精度よく値を得ることが困難となり得る。また、濃度の増加の遅い発光粒子（Ｄ）と濃度の増加の速い発光粒子（Ａ、Ｂ、Ｃ）との濃度変化速度の差異は、検出に要した計測時間の差が十分に大きな値となるので、有意に検出可能であるが、濃度の増加の速い発光粒子（Ａ、Ｂ、Ｃ）の間に於ける濃度変化速度については、検出に要した計測時間が短過ぎてその差異を精度よく検出することは困難である。

即ち、走査分子計数法に於いて光計測を上記の如く一定の計測時間に亘って又は一定検出数まで実行する場合、観測対象となる発光粒子の濃度を或る程度予測して予め適当な長さの計測時間又は適当な大きさ信号検出数を設定することが望ましいところ、発光粒子濃度が変化する系に於いては、濃度の検出のために適切な計測時間又は信号検出数を設定することが困難あり、また、濃度変化速度又は反応速度を検出することも困難となる。また更に、光計測の実行中に濃度変化速度又は反応速度が変化する発光粒子の場合、光計測を一定の計測時間に亘って又は一定検出数まで実行する態様では、発光粒子の濃度又はその変化を精度よく検出することは一層困難となる。

かくして、本発明の主な課題は、観測対象となる発光粒子の濃度が時間と共に変化する場合に於いても、発光粒子濃度の算定又は濃度変化速度又は反応速度の検出が可能な走査分子計数法による新規な光分析技術を提供することである。

本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部が、時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って時系列の光強度データに於いて検出された発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測し、複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する装置によって達成される。

かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。また、特に、本発明に於いて観察対象とする発光粒子は、時間の経過とともに濃度が変化する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、典型的には、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。

上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。従って、逐次的に検出された光強度データに於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。かかる構成に於いて、時系列の光強度データに於いて逐次的に検出される発光粒子の信号に関して、後により詳細に説明される如く、順次発生する発光粒子の信号の発生時間の間隔は、試料溶液内の発光粒子の、そのときの濃度が高いほど、短くなる。即ち、光計測の実行中に試料溶液内の発光粒子の濃度が変化すると、これに対応して、発光粒子の信号の発生時間の間隔が変化することとなる。そこで、上記の本発明では更に、信号処理部に於いて、時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って時系列の光強度データにて検出された発光粒子の信号の発生時間の間隔が逐次的に計測され、かかる逐次的に計測された複数の信号発生時間間隔を用いて発光粒子の濃度を表わす指標値の決定が行われる。ここに於いて、「発光粒子の濃度を表わす指標値」とは、濃度値そのもの又は濃度に換算可能な任意の値であってよい。かかる構成によれば、観察対象とする発光粒子の濃度が時間と共に変化する場合であっても、発光粒子の濃度又はその指標値を時々刻々に追跡することが可能となる。

また、上記の構成によれば、発光粒子の濃度又はその指標値の時間変化を追跡することが可能となる。従って、上記の本発明の装置に於いて、信号処理部が複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を決定するよう構成されていてよい。なお、「濃度の変化速度を表わす指標値」とは、変化速度値そのもの又は変化速度値に換算可能な任意の値であってよい。かかる構成によれば、粒子の関わる種々の現象、例えば、構造変化、相互作用、結合・解離反応など、に於ける粒子濃度の変化速度又は粒子の関わる反応の反応速度の値が取得可能となり、粒子の関わる現象の検出又は分析に於いて有用な情報となる。

更に、逐次的に計測された複数の信号発生時間間隔を用いて得られた時々刻々の発光粒子の濃度値又はその指標値或いは濃度の変化速度値又はその指標値を用いることによって、観測対象となる発光粒子の任意の時間に於ける濃度値又はその指標値、例えば、反応又は濃度変化の初濃度又は飽和濃度など、を推定又は決定することが可能となる。従って、上記の本発明の装置に於いて、信号処理部は、複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて任意の時間に於ける発光粒子の濃度を表わす指標値を決定するよう構成されていてよい。

なお、上記の構成に於いて、逐次的に計測される発光粒子の信号の発生時間の間隔は、任意に設定された数の発光粒子の信号が発生する間隔であってよい。例えば、発光粒子の信号発生時間間隔は、一つの信号の発生から次の信号の発生までの時間間隔であってもよく、或いは、一つの信号の発生から複数個の信号が発生するまでの時間間隔であってもよい。任意に設定された数は、その数が把握されていれば、一回の光計測に於いて変化させてもよい。

上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測し、逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて発光粒子の濃度又は濃度変化速度を決定する光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する手順と、時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って時系列の光強度データに於いて検出された発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測する手順と、複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて、発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する手順とをコンピュータに実行させるコンピュータプログラムが提供される。なお、コンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に記憶されて提供される。コンピュータは、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、上記の手順を実現する。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよい。更に、上述のプログラムは、通信回線によってコンピュータへ配信され、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。

かかる構成に於いても、複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を算定する手順が設けられていてよく、発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する手順に於いて、複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて時系列の光強度データに於ける任意の時間に於ける発光粒子の濃度を表わす指標値の決定がなされてよい。また、発光粒子の信号の発生時間の間隔が所定の数の発光粒子の信号が発生する時間間隔であってよい。

更に、上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、発光粒子からの信号を個別に検出する光分析方法であって、発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測し、逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて発光粒子の濃度又は濃度変化速度を決定する光分析方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程と、時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って時系列の光強度データに於いて検出された発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測する過程と、複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて、発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する過程とを含む方法が提供される。

かかる構成に於いても、複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を算定する過程が設けられていてよく、発光粒子の濃度を決定する過程に於いて、複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて時系列の光強度データに於ける任意の時間に於ける発光粒子の濃度を表わす指標値の決定がなされてよい。また、発光粒子の信号の発生時間の間隔が所定の数の発光粒子の信号が発生する時間間隔であってよい。

上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。試料溶液に対する光検出領域の位置の移動方法及び態様、時系列光強度データに於ける光強度値から各発光粒子の信号の抽出もしくは検出する方法及び態様、絶対な濃度値を決定するためのパラメータを決定する方法及び態様等は、特許文献９〜１２等に記載されている方法及び態様と同様であってよい。

特許文献９〜１２等に記載されている如き、一定の計測時間に亘って又は一定検出数まで光計測を実行する走査分子計数法によれば、試料溶液内の発光粒子の濃度が準静的又は定常状態にある場合に、発光粒子の計数及び／又は濃度の決定を精度よく実行することができる。一方、本発明の如く、逐次的に検出される発光粒子の信号の発生時間間隔を参照し、逐次的に発光粒子の濃度値又は濃度変化速度或いはそれらの指標値を決定又は推定する態様によれば、試料溶液内の発光粒子の濃度が時間と共に変化する系、即ち、発光粒子濃度が動的状態にある場合に、発光粒子の濃度の変化又は濃度変化速度の変化を時間的に追跡することが可能となる。また、本発明の場合、発光粒子の濃度変化の挙動を追跡することが可能となるので、実際には、光計測を実行していない時間に於ける発光粒子の濃度値又はその指標値の推定も可能となる。更に、本発明に於いては、光計測の計測時間又は検出数を予め設定する必要はなく、観測対象となる発光粒子の濃度が予め或る程度把握されていなくても、発光粒子の濃度値又はその指標値の決定又は推定が達成でき、光計測の計測時間又は検出数の設定のための予備実験又は試行錯誤を行う必要性が低減するので、使用する試料溶液及び発光粒子の量を節約できる点で有利である。即ち、本発明の構成は、試料溶液内の発光粒子の濃度が準静的又は定常状態にある場合にも適用されてもよく、その場合にも、予備実験又は試行錯誤に使用する試料溶液及び発光粒子の量を節約できることとなる。更に又、本発明に於いては、発光粒子の濃度変化速度又は発光粒子の関わる反応の反応速度を検出することが可能となるので、粒子の状態の分析に於いて、今までの走査分子計数法では容易に得られなかった有用な情報が得られることとなる。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。

図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、発光粒子信号の発生時間間隔を計測して発光粒子濃度を決定する原理を説明する図である。図２（Ｄ）は、光検出領域の通過領域の模式図である。 図３（Ａ）は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図であり、図３（Ｂ）は、光計測から発光粒子信号の検出までの処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図５は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図６は、実施例１に於いて使用された発光粒子の反応のモデル図である。 図７（Ａ）は、実施例１に於いて得られた発光粒子信号の発生時間間隔（一粒子の発生時間間隔）の時間変化であり、図７（Ｂ）は、発光粒子信号の発生時間間隔から換算された発光粒子濃度の時間変化である。 図８（Ａ）は、実施例１に於いて得られた発光粒子信号の発生時間間隔（５０粒子の発生時間間隔）の時間変化であり、図８（Ｂ）は、発光粒子信号の発生時間間隔から換算された発光粒子濃度の時間変化である。なお、図８（Ａ）に於いて、縦軸の発生時間間隔は、計測された５０粒子の発生時間間隔の１／５０の値を示している。 図９は、時間と共に濃度が変化する発光粒子の濃度の時間変化を模式的に示した図であり、走査分子計数法に於いて、光計測を一定の計測時間（Ｔ１、Ｔ２）に亘って又は一定検出数（Ｐ１、Ｐ２）まで実行する態様にて検出される結果の状態を説明している。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。

光分析装置の構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、特許文献９〜１２に記載の走査分子計数法又はＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ^２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。

更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。また、上記の光路を変更して光検出領域の絶対的な位置を移動する方式によって光検出領域を走査軌道に沿って周回移動させると同時に、試料溶液の位置を移動する方式により、試料溶液内に於ける光検出領域の走査軌道の位置が所定の移動経路に沿って移動されてもよい。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の走査軌道は、円形、楕円形等の閉じた循環経路であってよく、試料溶液の位置の移動経路は、円形、楕円形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。

観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。

コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。

本発明の光分析技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列の光強度データに於いて発光粒子の信号の発生時間の間隔が逐次的に計測され、かかる逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて発光粒子濃度若しくは濃度変化速度又はそれらの指標値の決定が行われる。以下、本発明の走査分子計数法及び信号発生時間間隔を用いた発光粒子濃度若しくは濃度変化速度又はそれらの指標値の決定の原理について説明する。

１.走査分子計数法の原理
「走査分子計数法」（特許文献９〜１２）では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。

２．信号発生時間間隔を用いた発光粒子濃度の決定
図９に関連して、既に述べた如く、特許文献９〜１２に記載の走査分子計数法に於いては、光計測を上記の如く一定の計測時間に亘って又は一定の検出数まで実行し、試料溶液内の発光粒子の濃度値又はその指標値は、一定の計測時間内の検出数又は一定の検出数の検出に要した計測時間から算定される。かかる構成に於いては、精度よく或いは効率的に光計測及び発光粒子の濃度検出を行うためには、発光粒子の濃度が準静的又は定常的であり、試料溶液内の発光粒子の濃度値が或る程度予測できていることが好ましい。

ところで、図２（Ｃ）に模式的に描かれている如く、走査分子計数法により得られる時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号の発生頻度は、発光粒子濃度が高いほど、多くなるので、信号の発生した時間の間隔は狭くなる。即ち、例えば、発光粒子濃度が時間と共に増大する場合、図示の如く、信号発生時間間隔Ｔｊは、
Ｔｉ＞Ｔii＞Ｔiii＞Ｔiv＞Ｔv… …（１）
となる。従って、発光粒子の信号の発生時間の間隔を用いることにより、発光粒子濃度の算出が可能であり、更に、信号の発生時間の間隔を逐次追跡することによって発光粒子濃度の変化も追跡可能となる。発光粒子濃度と信号発生時間間隔との関係は、具体的には、下記のように与えられる。即ち、図２（Ｄ）に模式的に描かれている如く、試料溶液中の発光粒子濃度Ｃのとき、走査方向に垂直な方向の断面積Ｓの光検出領域ＣＶが速度ｕにて時間τだけ移動する間に、光検出領域ＣＶに包含される（即ち、検出される）発光粒子の数Ｐは、
Ｐ＝ＣＳｕτ＝Ｃπｒ^２ｕτ …（２）
となる。ここに於いて、光検出領域ＣＶの断面は、半径ｒの円として近似した。従って、一個の発光粒子の信号を検出するのに要する時間τ／Ｐ、即ち、一つの発光粒子の検出後に次の発光粒子の検出までの時間間隔（一粒子の信号発生時間間隔）Ｔｊ（＝τ／Ｐ）は、
Ｔｊ＝１／（Ｃπｒ^２ｕ） …（３）
により与えられる。よって、信号発生時間間隔Ｔｊを計測することにより、発光粒子濃度Ｃは、
Ｃ＝１／（Ｔｊπｒ^２ｕ） …（４）
として算定される。なお、発光粒子の検出過程、即ち、信号の発生過程は、確率的であり、一粒子の信号発生時間間隔は、ばらつきが大きくなるところ、図２（Ｃ）に示されている如く、信号発生時間間隔Ｔｊの計測と発光粒子の濃度値への換算を逐次的に実行し、逐次的な発光粒子の濃度値を参照することによって光計測を実行する間に亘る発光粒子の濃度値とその時間変化の挙動に於けるばらつきは或る程度相殺される。また、信号発生時間間隔は、所定の数の粒子の信号が発生した時間の間隔であってもよい。即ち、或る粒子の信号発生時間からｋ個目の粒子の信号発生時間までの時間間隔Ｔ^Ｋｊであってよく、その場合、発光粒子濃度Ｃは、
Ｃ＝ｋ／（Ｔ^Ｋｊπｒ^２ｕ） …（４ａ）
により与えられる。式（４ａ）の場合、時間分解能は低下するが、値のばらつきが抑制されることが期待される。ｋは、例えば、２〜５０などの整数であってよい。

上記の如く、逐次的に信号発生時間間隔を計測して発光粒子濃度の値を算定する態様によれば、まず、発光粒子濃度の時間変化の挙動が把握可能となる。従って、時間と共に発光粒子濃度が変化する系に於いて、発光粒子濃度を時間の経過に沿って追跡が可能となる。これにより、追跡された発光粒子濃度値に対してフィッティング等の処理を用いて発光粒子濃度の変化速度、或いは、発光粒子の関わる反応の反応速度の決定が可能となる。かかる濃度変化速度或いは反応速度は、発光粒子濃度の変化のメカニズムに関する分析又は考察に於いて有用な情報となる。

また、上記の態様によれば、発光粒子濃度の時間変化の挙動が把握可能となるので、予め発光粒子の濃度レベルを把握して光計測のための一定の計測時間又は一定の検出数を設定する必要がないことは理解されるべきである。即ち、光計測中にリアルタイムに信号発生時間間隔の計測又は濃度値への換算を実行し、信号発生時間間隔又は濃度値を参照し、発光粒子濃度の時間変化の挙動が或る程度把握された段階で光計測を終了する、といった処理手順により、発光粒子濃度値の計測がなされてよい。この場合、発光粒子濃度の時間変化の挙動が或る程度把握可能になるまで光計測を実行した段階に於いて、その発光粒子濃度の時間変化の挙動を参照することにより、発光粒子濃度が準静的若しくは定常的であるか、動的であるかが判断でき、その時点で、一定の計測時間又は一定数の検出が完了することを待たずに光計測を終了しても、発光粒子濃度の時間変化の挙動から或る程度の精度にて発光粒子濃度値の決定されることが期待される。換言すれば、逐次的に計測された信号発生時間間隔を参照する上記の態様によれば、予め発光粒子の濃度値又は濃度変化速度のレベルが把握されていなくても、適当なレベルの精度にて走査分子計数法による発光粒子濃度の決定が可能となる。

更に、上記の態様によれば、発光粒子濃度の時間変化の挙動が把握されることから、実際には光計測を行っていない時間に於ける発光粒子濃度の推定も可能である。即ち、例えば、任意の反応に於ける反応開始時の発光粒子濃度或いは十分に時間が経過した後又は反応が飽和に達した時の発光粒子濃度は、把握された発光粒子濃度の時間変化の挙動（濃度変化速度等）から推定可能となる。また更に、発光粒子の濃度変化速度が時間と共に変化する場合でも、把握された発光粒子濃度の時間変化の挙動に基づいて、時々刻々の発光粒子濃度値の推定が可能となることは理解されるべきである。

処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定及び発光粒子の検出・計数処理、及び（３）濃度・反応速度係数の算出等の分析が実行される。

（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。また、本発明に於いては、発光粒子濃度の時間変化の挙動の追跡が可能であるので、例えば、結合解離反応や分子間相互作用によって濃度の変化する発光粒子、或いは、構造変化によって発光特性が変化する発光粒子が、観測対象となる粒子として利用可能である。

（２）試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出
図３（Ａ）〜（Ｂ）は、図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いて実行される本実施形態に於ける試料溶液の光強度の測定と発光粒子の検出及び信号発生時間間隔の計測の処理の一つの例をフローチャートの形式にて表したものである。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出及び発光粒子からの信号の検出の一連の処理が、任意に（比較的短く）設定される解析時間間隔ｔ毎に実行され、発光粒子の信号が検出された場合に、その時間と、その前に発光粒子の信号が検出された時間との間の時間間隔（信号発生時間間隔Ｔｎ又はＴ^Ｋｎ）の計測が為され、好ましくは、リアルタイムに信号発生時間間隔Ｔｎ若しくはＴ^Ｋｎ又はその値から換算された発光粒子濃度値又はその指標値が表示される。そして、かかる処理が任意の時間に亘って連続的に反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ１８の処理作動により実現されることは理解されるべきである。

（ｉ）初期設定
図３（Ａ）を参照して、具体的な操作処理に於いては、まず、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、光強度の測定、発光粒子の検出及び信号発生時間間隔の計測の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、信号発生時間間隔の計測に於いて参照する粒子数［間隔計測粒子数Ｋ］（ステップ１０）及び解析時間間隔ｔの読込（ステップ２０）を行う。間隔計測粒子数Ｋは、１以上の任意の整数であってよい。解析時間間隔ｔは、好適には、光検出領域の移動速度（ｕ）と寸法（２ｒ）を考慮して、一つの発光粒子の信号の長さよりも十分に長い任意の時間（＞２ｒ／ｕ）に設定されてよい。（一つの発光粒子の信号が二つ以上の解析時間間隔ｔに亘って出現することをできるだけ回避するためである。）間隔計測粒子数Ｋと解析時間間隔ｔは、任意の態様にて使用者により入力された値又はコンピュータ１８に於いて適宜設定された値であってよい。

（ii）発光粒子数の検出
かくして、間隔計測粒子数Ｋと解析時間間隔ｔの読込が為されると、以下の如く、解析時間間隔ｔ毎に、解析時間間隔ｔに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理、測定された光強度データからの発光粒子の信号の検出及び信号発生時間の記録（ステップ３０）と、ステップ３０にて検出された発光粒子信号の発生時間間隔を算定する処理（ステップ４０）とが反復して実行される。なお、好適には、ステップ４０にて算定された信号発生時間間隔又はそれから換算される発光粒子濃度値若しくはその指標値が、コンピュータ１８のディスプレイに、時間経過に対する変化を使用者が視認できる態様（例えば、時間に対する変化を表すグラフ表示等）にてリアルタイムに表示されてよい（ステップ４５）。以下、ステップ３０〜４５の処理について詳細に説明する。

（ａ）光強度の測定
図３（Ｂ）は、ステップ３０に於ける処理過程の例をフローチャートの形式にて表したものである。同図を参照して、ステップ３０に於ける処理過程に於いては、まず、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔ｔに亘って為される（ステップ１００）。かかる処理では、典型的には、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順、励起光を光検出領域に照射する手順（必要な場合のみ）及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射（必要な場合のみ）及び光強度の測定が開始される。測定が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７によるミラー７（ガルバノミラー）の駆動又はステージ位置変更装置１７ａによるステージの駆動によって、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を測定する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、測定された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の測定中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域ＣＶを略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが、図４（Ｃ）最上段に例示されている如く励起光強度分布と略同様の略釣鐘状となって、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ｒの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２ｒ）^２＝６Ｄ・Δτ …（５）
から、
Δτ＝（２ｒ）^２／６Ｄ …（６）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２ｒ／Δτ＝３Ｄ／ｒ …（７）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^−１０ｍ^２／ｓ程度であると予想される場合には、ｒが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の、例えば、１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

（ｂ）発光粒子に対応する信号の検出
上記の処理により解析時間間隔ｔに於ける試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出が実行される。

時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図４（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ^２／ａ^２） …（８）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（８）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）

時系列光強度データからの発光粒子の検出を行う処理のより具体的な手法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３（Ｂ）−ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。

しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、式（８）の如きガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図５左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなり、その信号の発生時間ｔｐｎ（例えば、ピーク時）が検出され記録される。一方、図５右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。また、一つの解析時間間隔ｔの時系列光強度データ上に二つ以上の発光粒子信号が発生する場合もあるので、検出された発光粒子の信号の数が計数されるようになっていてもよい（ステップ１６０）

上記のステップ１３０〜１６０の処理に於けるパルス信号の探索、判定及び発生時間の記録は、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行される（ステップ１７０）。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データの全てに於いてパルス信号の探索が終了すると、ステップ３０は終了し、ステップ４０が実行される。

（iii）信号発生時間間隔の算出（及び表示・更新）
かくして、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データに於ける発光粒子信号の検出処理が為されると、検出された信号の発生時間間隔Ｔｎが算定される。信号発生時間間隔Ｔｎに於いては、間隔計測粒子数Ｋ＝１であるときには、直前のステップ３０にて検出された発光粒子信号の発生時間ｔｐｎと前回までに検出された発光粒子信号発生時間ｔｐ（ｎ−１）との差分ｔｐ_ｎ−ｔｐ_{（ｎ−１）}がＴｎ（ｔｐ_ｎ）として算定される。なお、一回の測定に於いて、最初に検出された発光粒子信号については、信号発生時間間隔Ｔｎは、算定されなくてよい。また、直前のステップ３０の解析時間間隔ｔにて二つ以上の発光粒子信号が検出された場合には、それぞれの発光粒子信号について、その直前に発生した発光粒子信号の発生時間から測った発光粒子信号発生時間が算定される。間隔計測粒子数Ｋ＞１であるときには、信号発生時間間隔Ｔｎは、発光粒子信号の検出数がＫに達する毎に信号発生時間間隔Ｔ^Ｋｎが算定されてよい。即ち、最初に検出された発光粒子信号の発生又は信号発生時間間隔Ｔ^Ｋｎの算定を行った信号の発生からＫ個目の信号が発生したときに、その発生時間ｔｐ_ｎと、最初に検出された発光粒子信号又は信号発生時間間隔の算定を行った信号の発生時間ｔｐ_{（ｎ−１）}との差分が信号発生時間間隔Ｔ^Ｋｎとして算定される。

上記の如く信号発生時間間隔Ｔｎ又はＴ^Ｋｎが算定されると、既に触れた如く、かかる値がコンピュータ１８のディスプレイ上に表示されてよい。表示は、信号発生時間間隔の時間変化が容易に把握できるように横軸が計測開始からの経過時間であり、縦軸が信号発生時間間隔であるグラフ形式であることが好ましいが、これに限定されない。更に、式（４）又は（４ａ）を用いて信号発生時間間隔を発光粒子濃度Ｃに換算した値又は発光粒子濃度Ｃの時間変化の把握可能な任意の指標値（例えば、信号発生時間間隔の逆数など）をグラフ形式で表示されてもよい。

（ｄ）測定の終了
既に触れた如く、ステップ１０〜４５に於ける処理は、任意の時間に亘って解析時間間隔ｔ毎に反復して実行されてよい。この点に関し、図３（Ｂ）のステップ１００の光強度の測定は、好適には、測定の開始から終了まで、ステップ１００以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行される。即ち、図３の処理サイクルに於いては、一つのサイクルの解析時間間隔ｔに亘るステップ１００の光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔ｔに亘るステップ１００の光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ１８に於いて、完了したサイクルの解析時間間隔ｔに亘って取得された光強度データからの発光粒子の信号の検出・信号発生時間間隔の決定の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに発光粒子の検出・信号発生時間間隔の決定が達成されることとなる。

上記の如く、光測定中に信号発生時間間隔又は発光粒子濃度の時間変化がリアルタイムに把握できる態様によれば、かかる時間変化を参照して間隔計測粒子数Ｋと解析時間間隔ｔは、適宜変更されてもよい。また、一連の処理は、任意の時点で終了されてよい。光測定中に信号発生時間間隔又は発光粒子濃度の時間変化がリアルタイムに把握できていれば、使用者は、装置１に対して、かかる時間変化を参照して任意の時点で測定の終了を指示し、これにより、測定が終了されてよい（ステップ５０）。一方、使用者が測定の終了指示を与えない場合には、一定の時間の経過後又は信号の検出数が一定値に達した後、自動的に終了するようになっていてもよい。理解されるべきことは、本発明に於いては、発光粒子濃度の時間変化が観測されることとなるので、発光粒子濃度変化の動的な挙動が把握できる結果が得られた時点で測定が終了されてよい、ということである。

（３）濃度値又は濃度変化速度値の算出等の分析
上記の如く、光測定中に時間の経過と共に信号発生時間間隔を計測することにより、発光粒子の濃度の時間変化が観測されることとなるので、かかる計測結果から濃度変化速度が算定可能である。発光粒子濃度の時間変化の態様は、発光粒子の関わる現象（構造変化、結合・解離反応等）のメカニズムによって異なるので、適切に選択されたメカニズムから想定されるモデル式（時間の関数である濃度値の式等）を観測された発光粒子の濃度の時間変化へフィッティングすることによって、濃度変化速度値、変化速度係数等が算出される。また、観測された発光粒子の濃度の時間変化に適合する発光粒子の関わる現象のメカニズムを見出すことができた場合には、光計測を実行していない時間領域に於ける発光粒子濃度値及び／又は濃度変化速度値が推定可能となり得る。更に、発光粒子濃度変化が準静的又は定常的である場合には、信号発生時間間隔は、実質的に変化しないこととなるので、光計測が実行された間に於ける信号発生時間間隔の平均値又は信号発生時間間隔から換算された濃度値の平均値から、発光粒子濃度値を精度よく決定できることが期待される。

ところで、信号発生時間間隔から発光粒子濃度へ換算する式（４）又は（４ａ）に於いて、光検出領域の通過領域の断面半径ｒは、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されるか、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出・計数を行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、移動速度ｕｏにて或る時間τｏに亘って実行された光強度の測定に於ける発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、
Ｓ＝Ｎ／（Ｃ・Ｎ_Ａ・ｕｏ・τｏ） …（９）
により与えられる（ここで、Ｎ_Ａは、アボガドロ数である。）。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＳの平均値が光検出領域の断面積Ｓとして採用されるようになっていてよい。なお、光検出領域の断面積Ｓは、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてもよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（９））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。

上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。

酵素による消化反応によって発光強度が増大するよう構成された発光標識された核酸を観察対象粒子として用いて走査分子計数法を実行し、その際、信号の発生時間間隔を参照して発光粒子（発光強度の増大した核酸分子）の濃度の時間変化が追跡可能であることを検証した。

試料に於いて、観察対象粒子として、５’末端に蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎが付加され、 ３’末端に消光分子であるＢＨＱ３が付加された５塩基のｐｏｌｙ−Ｔを反応バッファ(40mM Tris-HCl pH 7.5, 8mM MgCl2, 5mM DTT)中に１０ｐＭにて溶解し、試料溶液とした。上記のｐｏｌｙ−Ｔは、塩基配列：ATTO647N-TTTTT-BHQ3を有し、かかる粒子に於いては、未反応の状態では、図６左に模式的に描かれている如く、ＡＴＴＯ６４７Ｎ（ＦＤ）から放出された光ＥｍがＢＨＱ３（Ｑ）に吸収されるために実質的に光が外部に放出されないが、図６右に模式的に描かれている如く、ＤＮＡ消化酵素（ＤＮａｓｅＩ）により、塩基鎖が切断されると、ＡＴＴＯ６４７Ｎから放出された光Ｅｍが、吸収されることなく、外部へ放出されることとなるので、発光粒子として観測可能となる。なお、ｐｏｌｙ−Ｔは、シグマジェノシス社に依頼して合成した。

測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、３６μＬの上記の試料溶液に対して４０ＵのＤＮａｓｅＩ（タカラ社）を添加した後に素早く撹拌して、上記の走査分子計数法に従って光強度の計測を開始した。光強度の計測に於いては、励起光は、６４２ｎｍのレーザ光（出力１ｍＷ）を用い、検出光波長帯域は、バンドパスフィルターを用いて６６０〜７１０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域は、ミラー偏向器によって円軌道に沿って走査速度６９ｍｍ／ｓにて移動した。また、フォトンカウンティングのＢＩＮ ＴＩＭＥは１０μ秒とした。

更に、光強度の測定により取得された時系列のフォトンカウントデータに於ける発光粒子の信号の検出処理に於いては、まず、スムージング処理(Savisky-Golay法に従って１３のデータ点にて移動平均を取る処理を５回繰り返した。)を行い、スムージングされたデータの一次微分値を用いてパルス状信号の存在する領域（パルス存在領域）を特定した。そして、かかる特定されたパルス存在領域に対して最小二乗法によりガウス関数をフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定し、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜２００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス状信号を、発光粒子の信号の特徴を有する信号として判別した。

図７（Ａ）及び図８（Ａ）は、それぞれ、上記の要領にて検出された時系列光強度データ上の発光粒子の信号の発生時間間隔を計測開始後からの経過時間に対してプロットしたグラフである。図７（Ａ）は、１粒子毎の信号発生時間間隔（Ｋ＝１）であり、図８（Ａ）は、５０粒子毎の信号発生時間間隔（Ｋ＝５０）である。同図に於いては、ＤＮａｓｅＩの添加を行った場合（ＤＮａｓｅＩ＋）とＤＮａｓｅＩの添加を行わなかった場合（ＤＮａｓｅＩ−）の信号発生時間間隔が示されている。なお、図示の実験に於いて、ＤＮａｓｅＩの添加を行った場合（ＤＮａｓｅＩ＋）に於いて、ＤＮａｓｅＩの添加から撹拌に要した時間は、約１５秒であった。また、図７（Ｂ）及び図８（Ｂ）は、それぞれ、式（４）及び（４ａ）を用いて、図７（Ａ）及び図８（Ａ）に於ける信号発生時間間隔から換算された発光粒子濃度値の時間変化を示している。

図７（Ａ）及び図８（Ａ）を参照して理解される如く、ＤＮａｓｅＩの添加を行わなかった場合（ＤＮａｓｅＩ−）に於いては、信号発生時間間隔は、ゆらぎは大きいが、時間の経過に伴って長さが一方向に変化する傾向は観察されなかった。一方、ＤＮａｓｅＩの添加を行った場合（ＤＮａｓｅＩ＋）、計測開始直後には、信号発生時間間隔が０．２〜０．２５秒であったが、時間の経過に伴って漸減する傾向が観察された（計測開始後６０００秒に於いて、約０．０７秒）。また、図７（Ｂ）及び図８（Ｂ）から理解される如く、信号発生時間間隔の時間変化に対応して、ＤＮａｓｅＩの添加を行わなかった場合（ＤＮａｓｅＩ−）には、発光粒子濃度値の実質的な変化は観られなかったが、ＤＮａｓｅＩの添加を行った場合（ＤＮａｓｅＩ＋）には、発光粒子濃度値の有意な増加が観察された。これらの結果は、図６に関連して説明された如く、ＤＮａｓｅＩの消化によって、ｐｏｌｙ−Ｔが切断され、蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎと消光分子ＢＨＱ３とが互いに分離し、これにより、蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎの光が吸収されることなく、外部に放出されるようになったこと、そして、かかるＤＮａｓｅＩの消化反応が時間の経過とともに進行して検出されるｐｏｌｙ−Ｔ（発光粒子）の濃度が増大したことを示している。即ち、本発明の教示に従って、走査分子係数法により得られる時系列光強度データ上にて検出される発光粒子の信号の発生時間間隔を参照することによって、発光粒子の濃度の変化が観測可能であることが示された。また、図７（Ａ）、（Ｂ）と図８（Ａ）、（Ｂ）とのグラフを比較すると、前者に比して、後者の方が値のばらつきが小さいことが観察される。このことは、信号発生時間間隔の計測の際に、信号発生時間間隔の時間変化が把握できる程度に於いて、信号発生時間間隔を数個の信号の発生時間の間隔とすることによって、値のばらつきを抑制できることを示している。

更に、上記の結果（図８（Ｂ））を用いて、計測された発光粒子濃度値の時間変化がＤＮａｓｅＩによる核酸の消化反応のメカニズムと整合するか否かを検証した。ＤＮａｓｅＩによる核酸の消化反応に於いて、ＤＮａｓｅＩ濃度（酵素濃度）［Ｅ］、核酸濃度（基質濃度）［Ｓ］、濃度［ＥＳ］及び反応生成物濃度［Ｐ］は、下記の反応式に従うと考えられる。
［Ｅ］＋［Ｓ］＜−＞［ＥＳ］→［Ｐ］ …（１０）
かかる反応式に於いて、ＤＮａｓｅＩ−核酸結合体が反応生成物へ変化する反応速度は、
ｄ［Ｐ］／ｄｔ＝ｋ［ＥＳ］ …（１１）
により与えられ、［Ｐ］は、
［Ｐ］＝ｋ［ＥＳ］ｔ＋Ｃ
により与えられると想定される。ここで、ｔは、経過時間であり、ｋは、反応速度係数であり、Ｃは、積分定数（反応生成物の初濃度）である。なお、本実験の条件では、ＤＮａｓｅＩ−核酸結合体濃度［ＥＳ］が高く、その変化が殆どないと考えられるので、結局、ｄ［Ｐ］／ｄｔは、実質的に一定であり、反応生成物濃度［Ｐ］、即ち、検出される発光粒子濃度は、
［Ｐ］＝ｖｔ＋Ｃ …（１２）
により、直線近似することが可能である（ｖは、濃度変化速度である。）。

かくして、図８（Ｂ）の結果に対して式（１２）をフィッティングすると、図中の直線ＦＬにて示されている如く、計測された発光粒子濃度の時間変化は、ほぼ、式（１２）に一致し、近似直線は、それぞれ、下記の通りとなった。
ＤＮａｓｅＩ−：［Ｐ］＝２．９９＋２．２７×１０^−５ｔ
ＤＮａｓｅＩ＋：［Ｐ］＝３．４４＋０．００１２９ｔ
即ち、ＤＮａｓｅＩによる消化反応速度は、０．００１２９［ｆＭ／ｓ］であり、ＤＮａｓｅＩの添加がない場合は、実質的に濃度変化がないことが観察された。この結果は、本実験の発光粒子濃度値は、式（１２）により与えられる濃度値にて適合し、検出された信号が、発光粒子の光を表す信号であることを強く示唆している。また、本実験の条件に於いては、ＤＮａｓｅＩの量が核酸に比して高く、［ＥＳ］は、［Ｓ］の初濃度［Ｓ］_０に実質的に等しいと考えられるので、［Ｐ］は、
［Ｐ］＝ｋ［ＥＳ］ｔ＋Ｃ＝ｋ［Ｓ］_０ｔ＋Ｃ …（１３）
にて与えられる。従って、反応速度（濃度変化速度）を算出することにより、初濃度［Ｓ］_０が既知である場合には、速度係数ｋが算定される。一方、速度係数ｋが既知である場合には、基質初濃度［Ｓ］_０が算定できることとなる。更に、上記の如く、適合する反応のメカニズムが確認できた場合には、上記の反応式（１１）又は（１３）から実際に光計測を行っていない時間の発光粒子濃度も推定可能であることは理解されるべきである。

かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、走査分子計数法に於いて信号発生時間間隔を逐次的に計測することにより、発光粒子の濃度の時間変化が追跡可能であり、これにより、発光粒子の濃度が時間と共に変化する系、即ち、発光粒子濃度が動的状態にある場合についても、発光粒子の濃度値又はその指標値の推定も可能となり、発光粒子の濃度変化速度又は発光粒子の関わる反応の反応速度を検出することが可能であることが示された。また、発光粒子濃度が準静的又は定常的な状態にある場合について、発光粒子濃度の概算値が未知であっても、信号発生時間間隔の時間変化を参照することによって、発光粒子濃度が準静的又は定常的な状態であることが判別されれば、予め発光粒子濃度の推定値がなくても、比較的広範囲の発光粒子濃度について、その値を精度よく検出できることとなる。

Claims (12)

1. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
   前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
   前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
   前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の信号の各々を個別に検出する信号処理部とを含み、
   前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って前記時系列の光強度データに於いて検出された前記発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測し、複数の前記逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて、前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する装置。
2. 請求項１の装置であって、前記信号処理部が前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて前記発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を決定する装置。
3. 請求項１又は２の装置であって、前記信号処理部が前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて任意の時間に於ける前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する装置。
4. 請求項１、２又は３の装置であって、前記発光粒子の信号の発生時間の間隔が所定の数の発光粒子の信号が発生する間隔である装置。
5. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
   前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
   前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、
   前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程と、
   前記時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って前記時系列の光強度データに於いて検出された前記発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測する過程と、
   複数の前記逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて、前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する過程と
   を含む方法。
6. 請求項５の方法であって、更に、前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて前記発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を決定する過程を含む方法。
7. 請求項５又は６の方法であって、前記発光粒子の濃度を決定する過程に於いて、前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて任意の時間に於ける前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する方法。
8. 請求項５、６又は７の方法であって、前記発光粒子の信号の発生時間の間隔が所定の数の発光粒子の信号が発生する間隔である方法。
9. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
   前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
   前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する手順と、
   前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する手順と、
   前記時系列の光強度データに於ける時間の経過に沿って前記時系列の光強度データに於いて検出された前記発光粒子の信号の発生時間の間隔を逐次的に計測する手順と、
   複数の前記逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて、前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定する手順と
   をコンピュータに実行させるコンピュータプログラム。
10. 請求項９のコンピュータプログラムであって、更に、前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて前記発光粒子の濃度の変化速度を表わす指標値を算定する手順をコンピュータに実行させるコンピュータプログラム。
11. 請求項９又は１０のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の濃度を決定する手順に於いて、前記複数の逐次的に計測された信号発生時間間隔を用いて前記時系列の光強度データに於ける任意の時間に於ける前記発光粒子の濃度を表わす指標値を決定するコンピュータプログラム。
12. 請求項９、１０又は１１のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の信号の発生時間の間隔が所定の数の発光粒子の信号が発生する間隔であるコンピュータプログラム。

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