JP3559525B2 - 生成関数を用いて蛍光分子又は他の粒子を特徴付ける方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、蛍光分光法の分野、より詳しくは、試料中に存在する蛍光分子又は他の粒子に特有な物理量を測定するための方法に関する。
米国特許第４，１９８，５７１号には、少なくとも一つの焦点に合わせる（ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）手段が、環状型である、共焦点的に配列された第一及び第二の焦点に合わせる手段、一つの焦点に合わせる手段からの放射線を受け取るために配置された可干渉性（ｃｏｈｅｒｅｎｔ）放射線検出手段、及び焦点板中の対象を走査するための走査手段を含む走査顕微鏡が開示されている。
米国特許第５，８６６，９１１には、スポット中の蛍光種又は他の励起し得る種を励起させるために、標本中のスポットに光のビームの焦点を合わせる共焦点レーザー顕微鏡のような走査（ｓｃａｎｎｅｄ）光学系において、励起し得る種の励起光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）を消光させるために適合させた波長の光のビームを与えること、この第二ビームを中央の強度が最小なパターンにすること、及びこの中央の最小値を焦点を合わせられたスポットの中央の強度の最大値と重ねることにより、効果的な大きさの励起光が、スポットの大きさよりも小さくされるので、スポット内で消光する光の強度がスポットの中央からの距離と共に増加し、それにより、スポットの周囲の部分における優先的に（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）消光する励起光が減少するので、系の分解能が向上することが開示されている。
【０００２】
蛍光相関分光計（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＦＣＳ、先行技術）における実験の主要なデータは、微視的な測定体積（ｖｏｌｕｍｅ）から検出される光子カウント（ｐｈｏｔｏｎ ｃｏｕｎｔｓ）のシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。蛍光相関分析の本質的な属性（ａｔｔｒｉｂｕｔｅ）は、光子検出の二次の（ｓｅｃｏｎｄ ｏｒｄｅｒ）自己相関関数の計算である。これは、（光子カウントの）確率論的な（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）関数を、試料のいくつかのパラメーターを評価するための手段として用いられる所望の（ｅｘｐｅｃｔｅｄ）形を有する統計学的な関数に変換する方法である。しかし、光子カウントのシーケンスから試料に関する情報を得るための方法は、自己相関関数の計算だけではない。更なるアプローチは、所定の時間間隔（ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）当たりの光子カウント数の分布のモーメントアナリシス（ｍｏｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）及び直接的な分析に基づく（キアン（Ｑｉａｎ）及びエルソン（Ｅｌｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７： ５４７９ − ４８３、１９９０； キアン（Ｑｉａｎ）及びエルソン（Ｅｌｓｏｎ）、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ５７： ３７５ − ３８０、１９９０）。
【０００３】
試料中の粒子から検出される蛍光強度は、一定ではないが、光学システムの焦点に関する粒子の座標に依存する。従って、測定の信頼できる解釈により、照らされた（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ）測定体積の形状（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）が説明されるべきである。鐘型（ｂｅｌｌ−ｓｈａｐｅｄ）プロファイルの方が、長方形のものよりも光子カウント数の理論上の分布の計算が複雑であっても、光子カウント数の分布は、蛍光種の濃度及び比明度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）の値に依存するので、測定された光子カウント数の分布は、試料分析に用いることができる。“比明度”という用語は、試料のある場所、通常、空間 （ｓｐａｔｉａｌ）明度プロファイル関数が恒等（ｕｎｉｔｙ）である場所に位置する所定の種類の粒子によって放射された光からの検出器の平均カウント率（ｍｅａｎ ｃｏｕｎｔ ｒａｔｅ）を示す。
【０００４】
この種の分析の最初の実施（ｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、光子カウント数の分布のモーメントに基づいて示された（キアン（Ｑｉａｎ）及びエルソン（Ｅｌｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７： ５４７９ − ４８３、１９９０）。光子カウント数の分布Ｐ（ｎ）のκ次（κ−ｔｈ）階乗モーメントは、
【数７】

と定義される。
【０００５】
また、階乗モーメントは、階乗キュムラント（ｃｕｍｕｌａｎｔｓ）と密接に関係する。
【数８】

又は
【数９】

（
【数１０】

は、二項からなる係数であり、Ｋκは、キュムラントである。）理想的な解法（ｉｄｅａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）のために導かれたモーメントアナリシスで用いられる基本的な式（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、κ次数キュムラントと濃度（Ｃ_ｉ）及び比明度値（ｑ_ｉ）との関連を示す。
【０００６】
【数１１】

ここで、χκは、相対空間明度プロファイル（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｐａｔｉａｌ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ ｐｒｏｆｉｌｅ）Ｂ（ｒ）のκ次モーメントである：
【０００７】
【数１２】

【０００８】
ＦＣＳでは通常、体積の単位及びＢの単位は、χ_１＝χ_２＝１が得られる場合に選ばれる。この取り決め（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）を選ぶと、この等式における濃度は無次元であり、測定体積当たりの平均粒子数を表し、かつ数値Ｂ（０）で割った焦点に位置する場合、いずれの種の比明度も粒子からの平均カウント率に匹敵する。定数Ｂ（０）の値は、光学装置の特徴である。それは、空間強度プロファイルの評価されたパラメーターから計算することができる（下記参照）。
【０００９】
キアン（Ｑｉａｎ）及びエルソン（Ｅｌｓｏｎ）は、試料の未知のパラメーターを測定するために、最初の３つのキュムラントの実験値を用いた。高い信頼性をもって実験から測定され得るキュムラントの数は、通常３〜４である。これは、モーメントアナリシスの適用可能性の限界を定める。
【００１０】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ ９７／０５６１９（国際公開番号ＷＯ ９８／１６８１４）に詳細に記載された、いわゆる蛍光強度分布分析の背景にある（ｂｅｈｉｎｄ）概念は、細胞選別における理想的な場合と同様に、測定体積が均一に照らされる場合及び同時に照らされる粒子がほとんど一つも存在しない場合という理想的なケースを想像することにより、よく理解することができる。この環境下で、粒子が測定体積に入るそれぞれの場合、蛍光強度は所定のタイプの粒子の明度に対応する値に跳ね上がる。本来、この強度が任意の時間に起こる可能性は、所定の種類の濃度と測定体積の大きさの積（ｐｒｏｄｕｃｔ）に等しい。試料溶液中に存在し得る別の蛍光種は、この他の種に特徴的な別の値に跳ね上がる強度をもたらす。要約すると、光の強度の分布は、試料溶液中の各蛍光種の濃度及び比明度の値から、直接的な方法で測定される。
【００１１】
上述の理想的なケースでのみ、粒子の座標の関数として粒子から検出器に到達する光の強度が測定体積全体に亘って一定であり、かつゼロを超えることが予想され得る。最初の推定では、蛍光粒子の拡散が測定間隔Ｔの間無視できることも予想される。この２つの仮定の下、単一の蛍光種によって放射された光子カウント数の分布は、ダブルポアソニアン（ｄｏｕｂｌｅ Ｐｏｉｓｓｏｎｉａｎ）として分析的に表すことができる。即ち、この体積内の所定の種類の粒子数の分布はポアソニアンであるのに対し、所定の数の粒子を予想する光子数の条件付の（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）確率分布（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）もまたポアソニアンである。ダブルポアソン分布は、２つのパラメーター、即ち、測定体積中の平均粒子数ｃとドエル時間（ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ）当たりに単一の粒子によって放射される平均光子数ｑＴを持つ。単一の種類に対応する光子カウント数ｎの分布は、
【数１３】

として表される。式中、ｍは測定体積中の分子数より多い。Ｐ_ｉ（ｎ）がｉ種からの光子カウント数の分布を表す場合、結果として得られる分布Ｐ（ｎ）は、
【数１４】

として表される。
これは、Ｐ（ｎ）が一連の分布Ｐ_ｉ（ｎ）のたたみ込み（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）として算出され得ることを意味する。
【００１２】
ＦＣＳの場合のように、長方形試料プロファイルは、実験に殆ど適応し得ない理論上のモデルである。しかし、測定体積を多数の体積成分に分割することもでき、それらのそれぞれにおいて、分子の強度が一定であることを予想することもできる。従って、光子カウント数分布への体積成分からの寄与は、パラメーターｃｄＶ及びｑＴＢ（ｒ）によるダブルポアソニアンである（ここで、ｑはＢ＝１である選択された標準位置における分子からのカウント率を表し、Ｂ（ｒ）は、座標の空間明度プロファイル関数である）。光子カウント数全体の分布は、ダブルポアソニアンにおけるたたみ込み積分（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ）として表すことができる。積分の結果はお互いに体積成分の実際の位置には依存しないので、積分は、ここでは三次元よりもむしろ一次元の問題である。比喩的に言えば（Ｆｉｇｕｒａｔｉｖｅｌｙ）、例えば、Ｂ値の次元が減少する場合、体積成分の三次元配列を一次元配列に配列し直すこともできる。
【００１３】
（ＷＯ ９８／１６８１４として公開された）国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ ９７／０５６１９に記載の最初の（ｆｉｒｓｔ）実験のいくつかにおいて、光子カウント数分布は、たたみ込み技術を用いて実際に補正された（ｆｉｔｔｅｄ）。試料モデルは２０箇所の空間部からなり、それぞれを、その体積Ｖ_ｊ及び明度Ｂ_ｊによって特徴付けた。しかし、この国際特許出願に記載の技術は、診断又は薬剤開発の場合、又は１つより多い独立変数（ａｒｇｕｍｅｎｔ）を含む分布関数を分析する場合のように、分析されるべき多数の試料を含む場合、時間がかかり、かつ面倒である。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、蛍光強度変化の分析のための、使いやすく、かつより一層早い技術を提供することである。
【００１５】
本発明によれば、試料中の蛍光分子及び他の粒子を特徴付ける方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
ａ）一つ以上の光子検出器によって最初の時間間隔における光子カウント数を測定することにより、空間明度プロファイルが不均一な、少なくとも１つの測定体積において、上記の分子又は他の粒子によって放射された蛍光の強度変化を観察すること、
ｂ）測定された光子カウント数から、少なくとも１つの光子カウント数の分布、
【外７】

を決定すること、
ｃ）光子カウント数の分布
【外８】

を補正することにより、前記粒子を特徴付ける物理量を測定すること、ここで、補正の手順は、
【数１５】

と定義されるその生成関数（ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）による光子カウント数の分布
【外９】

の計算を含む。
【００１６】
以下で、“ヒストグラム”という語は、“実験的に決定された分布関数（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）”又は“実験的に決定された分布”の代わりにしばしば用いられるであろう。
【００１７】
分布Ｐ（ｎ）の生成関数の正式な（ｆｏｒｍａｌ）定義は以下の通りである：
【数１６】

【００１８】
カウント数分布分析において生成関数を興味深く（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）するものは、その対数の非加算性（ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ）である。異なる体積成分並びに異なる種のように、独立した供給源（ｓｏｕｒｃｅｓ）の光子カウント数分布の生成関数の対数は、関数（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（８）が、分布のたたみ込みを対応する生成関数にマッピングする（ｍａｐｓ）ので、組み合わされた分布の生成関数の計算のために単に加えられる。
【００１９】
詳細に開発された本発明に特有な四つの例を以下に記載する：
１．光子カウント数の単一の分布変化を補正し、特徴的な物理量として蛍光分子又は他の粒子の比明度を得る一次元蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ又は１Ｄ−ＦＩＤＡと表される）；
２．光子カウント数の同時分布の変化を補正し、特徴的な物理量として蛍光分子又は他の粒子の二つの比明度値を得る二次元蛍光強度分布分析（２Ｄ−ＦＩＤＡ）。２Ｄ−ＦＩＤＡは、以下に詳細に説明するように、偏光（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）モード又はスペクトルモードに適用することができる；
３．異なる幅のカウント （ｃｏｕｎｔｉｎｇ）時間間隔における光子カウント数の一連の分布変化を補正し、特徴的な物理量として比明度及び並進拡散時間（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅ）を得る蛍光強度多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）分布分析（ＦＩＭＤＡ）；及び
４．それぞれが同じカウント時間間隔に相当する光子カウント数の一連の分布変化を補正する蛍光自己たたみ込み（ａｕｔｏｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）強度分布分析（ＦＡＣＩＤ）。但し、二箇所のカウント時間間隔の間で異なる遅延時間を用いる。ＦＡＣＩＤからも、特徴的な物理量として比明度及び並進拡散時間が得られる。
【００２０】
特に好ましい態様において、同じ幅の連続した最初の時間間隔における蛍光強度の変化を観察することもできる。上述の例、１Ｄ−ＦＩＤＡ、２Ｄ−ＦＩＤＡ、ＦＩＭＤＡ及びＦＡＣＩＤは、利用可能な情報が最適に用いられる、この都合のよい態様を利用する。しかし、不連続な最初の時間間隔及び／又は異なる幅の最初の時間間隔を用いることもできる。典型的な最初の時間間隔は、マイクロ秒又は数十マイクロ秒オーダーの幅を有する。全てのデータを収集する時間は、通常数十分の一秒から数十秒までである。
【００２１】
更に好ましい態様において、段階ｂ）においてヒストグラム
【外１０】

が決定される光子カウント数｛ｎ_ｉ｝は、所定のルールに従い最初の時間間隔からの光子カウント数を加えることにより、最初の時間間隔｛Ｎ_ｊ｝における光子カウント数から得られる。１Ｄ−ＦＩＤＡ、２Ｄ−ＦＩＤＡ、ＦＩＭＤＡ及びＦＡＣＩＤもまた、この態様を利用することができる。
【００２２】
例えば、ルール
【数１７】

（ここで、Ｍは｛ｎ_ｉ｝が測定される時間間隔が最初の時間間隔より何倍長いかを表す整数である）に従い、最初の時間間隔｛Ｎ_ｊ｝における光子カウント数から算出されるヒストグラム
【外１１】

が決定される光子カウント数｛ｎ_ｉ｝の選択が興味深いこともある。１Ｄ−ＦＩＤＡ、２Ｄ−ＦＩＤＡ及びＦＩＭＤＡは、この態様を利用することが好ましい。
【００２３】
更なる態様において、光子カウント数｛ｎ_ｉ｝は、最初の時間間隔が時間遅延（ｔｉｍｅ ｄｅｌａｙ）によって分離されるというルールに従い、所定の最初の時間間隔から得られる。特に、以下のルールを適用することができる：
【数１８】

ここで、Ｍ及びＬは、正の整数であり、｛ｎ_ｉ｝はヒストグラム
【外１２】

が決定される光子カウント数であり、｛Ｎ_ｊ｝は、最初の時間間隔における光子カウント数である。この式において、２Ｍは（ｎ_ｉが測定される）カウント時間間隔当たりの最初の時間間隔の数であり、Ｌは、二箇所のカウント時間間隔の間の遅延を引き起こす失われた（ｍｉｓｓｅｄ）最初の時間間隔の数である。ＦＡＣＩＤは、この態様を利用することが好ましい。
【００２４】
段階ｂ）において単一のヒストグラム
【外１３】

を決定するだけでなく、むしろ一組のヒストグラム
【外１４】

を決定することが好ましい場合もある。これらは、一組の異なるルールに従って決定することができ、前記の一組のヒストグラムは、段階ｃ）において同時に補正される。例えば、異なる値のＭ及び／又はＬを含む一組のヒストグラムを同時に補正することもできる。ＦＩＭＤＡ及びＦＡＣＩＤは、この態様を利用する。
【００２５】
本発明による段階ｃ）において測定される典型的な物理量は、分子又は他の粒子の濃度、比明度及び／又は拡散係数である。
【００２６】
更に好ましい態様において、生成関数は、式
【数１９】

（ここで、ｃ（ｑ）は、比明度ｑの粒子密度であり、Ｔは測定間隔の長さであり、Ｂ（ｒ）は座標の関数としての空間明度プロファイルである。）
【００２７】
ｃ→ｃｄＶ、ｑ→ｑＢ（ｒ）として定義（８）を式（６）に適用すると、粒子の種類及び選択された体積成分ｄＶへの寄与を
【数２０】

と書くことができる。
【００２８】
従って、全光子カウント数分布の生成関数は、クローズド・フォーム（ｃｌｏｓｅｄ ｆｏｒｍ）で表すことができる。
【数２１】

【００２９】
高速フーリエ変換がその後行われる式（９）による数値積分（Ｎｕｍｅｒｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は、所定の試料（即ち、蛍光種の所定の濃度及び比明度値）に対応する理論上の分布Ｐ（ｎ）を算出する最も有効な手段である。仮に、
【数２２】

を選択すると、分布Ｐ（ｎ）及びその生成関数Ｇ（φ）は、フーリエ変換によって相関する。従って、その生成関数から光子カウント数の理論上の分布を計算する場合に、
【数２３】

の形の生成関数の独立変数を選択すること、及び高速フーリエ変換アルゴリズムを使用することが特に好ましい。１Ｄ−ＦＩＤＡ、２Ｄ−ＦＩＤＡ、ＦＩＭＤＡ及びＦＡＣＩＤは、この態様を利用することが好ましい。
【００３０】
本発明による段階ｃ）における理論上の分布Ｐ（ｎ）を算出する場合、空間明度プロファイルは、体積と空間明度との間の数学上の関係によってモデル化され得る。特に、以下の式によって空間明度プロファイルをモデル化することもできる：
【数２４】

ここで、ｄＶは体積成分を表し、χは相対空間明度の対数を表し、Ａ_０は体積の単位を選択する定数であり、ａ_１及びａ_２は空間明度関数の形の経験上評価されたパラメーターである。更に好ましい態様において、空間明度プロファイルを以下の式：
【数２５】

によってモデル化することもできる。
【００３１】
いくつかの蛍光種は、非常に幅広い比明度の分布を有することもある。例えば、非常に幅広い大きさの分布及び任意の数のレセプターを有すると考えられる小嚢は、任意の数のラベルされたリガンド分子を取り込むこともできる。そのような種類の種を含む試料に対するカウント数ヒストグラムを補正するためには、以下の方法において式（１０）を変更することが有効である。種内の粒子ｑの明度分布は以下のように数学的に表されるという仮定がなされる：
【数２６】

【００３２】
この式は、便宜上選択され、この分布の全てのモーメントは、以下の式を用いて分析的に算出され得る：
【数２７】

【００３３】
光子カウント数分布の修正された生成関数が直接得られる。式（９）は、以下のように書き直すことができる：
【数２８】

ここで、
【数２９】

【００３４】
ｑでの積分は、分析的に行うことができる：
【数３０】

【００３５】
パラメーターａ_ｉ及びｂ_ｉは、平均明度
【数３１】

及び明度分布
【数３２】

と、
【数３３】

によって相関する。
【００３６】
得られたカウント数の範囲において、特定のカウント数が得られる確率は、通常著しく （ｂｙ ｍａｎｙ ｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）変化する。例えば、図１の分布を参照。その結果、所定のカウント数でのイベント数（ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｖｅｎｔｓ）の変化（ｖａｒｉａｎｃｅ）は、カウント数に強く依存する。最小二乗補正 （ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｆｉｔｔｉｎｇ）のための重量の測定のために、全てのカウント間隔における光強度は独立していると推定することができる。この推定の下では、異なるカウント数ｎの選択におけるＭイベントの分布の問題があり、それぞれの特定の結果は、所定の実施の確率Ｐ（ｎ）を有する。分布の共分散マトリックス成分は、以下のように表すことができる：
【数３４】

ここで、Ｍは実験当たりのカウント間隔数である。
【００３７】
式１７の共分散マトリックスは特異である（ｓｉｎｇｕｌａｒ）。我々が、重量マトリックスとして、以下のように表される、その“ウイーク・インバース（ｗｅａｋ ｉｎｖｅｒｓｅ）”対角線マトリックスを用いることが容認される：
【数３５】

【００３８】
分散マトリックス（１７）は、ヒストグラムの統計学上の実施の多項分布に相当する。カウント間隔数の合計が補正されるという制約を受けるポアソン分布は、多項分布になるであろう。これは、式（１８）に示すように、ポアソニアン重量の使用の論理的根拠（ｒａｔｉｏｎａｌｅ）である。
【００３９】
ｎ_ｋをｋ光子のカウントのイベント数の期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）とし、かつ
【数３６】

をそれらの合計とする。ｍ_ｋを、
【数３７】

により統計学上実施させる。実施ｍ_０、ｍ_１、・・・は、ポアソンの統計学、
【数３８】

に従うと仮定する。ここで、我々は
【数３９】

及び
【数４０】

という表記法を導入した。Ｍイベントを有する確率は、
【数４１】

である。
【００４０】
合計Ｍイベントある場合に、ｍ_０、ｍ_１、・・・イベントを有する条件付きの確率は、
【数４２】

又は、
【数４３】

である。
【００４１】
これは、我々が
【数４４】

を導入した多項分布であり、
【数４５】

は、多項係数である。
【００４２】
一般に、重量が有意義に（ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌｌｙ）規定された場合、線形又は線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）最小二乗補正は、評価されるパラメーターの値だけでなく、それらの共分散マトリックスももたらす（ｒｅｔｕｒｎｓ）。いくつかの簡単な場合に（例えば、長方形試料のプロファイル及び単一種に対して）、分析的に評価されるパラメーターの統計学上のエラーを表すことが可能であることが明らかになることもあるが、適用において、少なくとも二成分分析が通常興味深い。従って、統計学上のエラーの数の計算が満足されることもある。非相関測定（式（１７））の仮定による“理論上の”エラーに加え、いくつかの場合には、理論上のエラーが経験上得られ、個々の条件における一連の約１００回のＦＩＤＡ実験が行われた。一般に、経験上のエラーは理論上のものよりも３〜４倍高い。走査実験（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）では、経験上のエラーは、理論上のものに近いようである。それ故、我々は理論上のエラーが実際よりも少ない主な理由は、非相関測定であると確信している。表１は、本発明により光子カウント数ヒストグラム（ＦＩＤＡ）を補正することにより得られたパラメーターの理論上のエラーとモーメントアナリシスによって得られたものの比較である。エラー値は、一連のシミュレーションされたヒストグラムを処理することにより決定される。評価されるパラメーターの数が３より多い場合、本発明は、モーメントアナリシスよりも圧倒的に良好である。
【００４３】
【表１】

【００４４】
更に好ましい態様において、本発明による方法は、光子カウント数の同時分布の補正に適用される。２Ｄ−ＦＩＤＡは、この態様の例である。実験において、分子数が変化する微視的な体積からの蛍光は、２つの検出器を有する光学装置（例えば共焦点顕微鏡）を用いて観察される。２つの検出器は、異なる偏光又はスペクトル応答を有することもある。ある態様において、各種当たり二つの比明度値を有する蛍光種の濃度が測定される。偏光キューブ（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｃｕｂｅ）と共に使用される場合の二次元蛍光強度分布分析（２Ｄ−ＦＩＤＡ）は、異なる比偏光率を有する蛍光種を区別できるツール（ｔｏｏｌ）である。これは、単一の分子又は他の粒子の二つの物理的特徴の同時分析の典型例であり、単一の物理的特徴に注目する方法と比較して信頼性の大幅な向上をもたらす。
【００４５】
以下に、２Ｄ−ＦＩＤＡをより詳細に説明する。
予想される光子カウント数の二次元分布を表すためには、以下の仮定を用いることが有利である：
（Ａ）粒子の座標は任意であり、それぞれ独立である。
（Ｂ）粒子からの蛍光強度の寄与は、粒子の比明度と光学機器に特有の空間明度プロファイル関数との積として表すことができる。
（Ｃ）蛍光粒子の明度が拡散によって大幅に変化しない間、短いカウント時間間隔Ｔが選択される。
【００４６】
最初に、単一の蛍光種及び単一の小型開放体積成分（ｓｍａｌｌ ｏｐｅｎ ｖｏｌｕｍｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）からのカウント数の同時分布ｄＶを表す。体積成分は、座標ｒ及び空間明度Ｂ（ｒ）によって特徴付けられ、蛍光種は、その比明度値ｑ_１及びｑ_２によって特徴付けられる。ｑ_１及びｑ_２により、Ｂ（ｒ）＝１の場所に位置する粒子からの検出器による平均カウント率が示される。式χ_１＝χ_２
（ここで、
【数４６】

により、通常と同様にＦＣＳにおいてＢの単位を選択することが都合がよい。体積成分がｍ粒子を偶然含んでいる場合、体積成分からの時間間隔Ｔ当たりの予想される光子カウント数は、ｍｑ_１ＴＢ（ｒ）及びｍｑ_２ＴＢ（ｒ）であり、一方ｍ粒子からの光子カウント数の分布Ｐ（ｎ_１，ｎ_２｜ｍ）は、両方の検出器に対してそれぞれポアソニアンである：
【数４７】

【００４７】
一方、仮定（Ａ）の下、体積成分における所定の種の粒子数の分布は、平均ｃｄＶを有するポアソニアンである。ここで、ｃは濃度を表す：
【数４８】

【００４８】
体積成分からの光子カウント数の全体の分布は、式２２及び２３を用いて表すことができる：
【数４９】

【００４９】
上記の一次元の場合のように、光子カウント数の分布Ｐ（ｎ_１，ｎ_２）を表すには、
【数５０】

で表される、その生成関数が有用である。
【００５０】
式２４によって表される分布の生成関数は、
【数５１】

と表記することができる。
【００５１】
特に、ζ_ｋ＝ｅｘｐ（ｉφ_ｋ）を選ぶと、分布Ｐ（ｎ_１，ｎ_２）及びその生成関数Ｇ（φ_１，φ_２）は、二次元フーリエ変換によって相関する。異なる体積成分並びに異なる種のような、独立した供給源の光子カウント数分布の生成関数の対数は、組み合わされた分布の計算のために単に加えられる。それ故、光子カウント数の全体の分布は、閉じた形（ｃｌｏｓｅｄ ｆｏｒｍ）で表すことができる：
【数５２】

【００５２】
この式において、バックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）カウント率、検出器１によるλ_１及び検出器２によるλ_２からの寄与、並びに下付き文字ｉによって表される蛍光種からの寄与を積分した。その後高速フーリエ変換が行われる式２７による数値積分は、所定の試料（即ち、所定の濃度及び比明度値の蛍光種）に対応する理論上の分布Ｐ（ｎ_１，ｎ_２）の計算のために非常に有効な手段である。
【００５３】
空間明度関数は、式２７の右辺における空間積分（ｓｐａｔｉａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）によって説明される。三次元座標ｒを、一次元変数、即ち空間明度の単調な（ｍｏｎｏｔｏｎｉｃ）関数Ｂ（ｒ）と置換することにより、三次元積分を一次元のものに変形することができる。変数は、χ＝ｌｎ［Ｂ（０）／Ｂ（ｒ）］を選択することが都合がよい。空間明度プロファイルの十分に柔軟な（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）モデルは、以下の式によって表される：
【数５３】

【００５４】
得られたカウント数の間隔において、カウント数の特定の一対が得られる確率は、通常著しく変化する。その結果、ヒストグラムのデータ点の変化も、カウント数に強く依存する。最小二乗補正のための重量の測定のために、簡略化のため、全てのカウント間隔における粒子の座標が任意に選択されると仮定する。（これは、連続したカウント間隔における座標の相関を無視することを意味する。）この仮定の下では、カウント数ｎ_１、ｎ_２の異なる一対の選択におけるＭイベントの分布の問題があり、それぞれの特定の結果は、所定の実施確率Ｐ（ｎ_１，ｎ_２）を有する。ヒストグラムの共分散マトリックス成分は、以下のように表すことができる：
【数５４】

ここで、Ｍは実験当たりのカウント間隔数である。
【００５５】
式２９の共分散マトリックスは特異である。我々が、重量マトリックスとして、以下のように表される、その“ウイーク・インバース”対角線マトリックスを用いることが容認される：
【数５５】

【００５６】
一般に、重量が有意義に規定された場合、線形化最小二乗補正アルゴリズムは、評価されるパラメーターだけでなく、それらの共分散マトリックスももたらす。非相関測定の仮定（式（３０））に対応する“理論上の”エラーに加え、統計学上のエラーが経験的に測定されることもあり、同一条件において一連の約１００回の２Ｄ−ＦＩＤＡ実験が行われる。一般に、経験上のエラーは理論上のものよりも３〜４倍高い。理論上のエラーが実際より少ない主な理由は、間違いなく非相関測定の仮定であろう。
【００５７】
非相関測定の仮定により実際より少ない（ｕｎｄｅｒｅｓｔｉｍａｔｅｄ）エラー値が得られるとしても、それは、異なる実験条件並びに異なる分析方法の下での分析精度を比較できる、非常に有用な理論上の推定である。また、この推定は、一般に有用なツールであるデータシミュレーションの容易な方法をもたらす。データシミュレーションの単純かつ非常に迅速な方法は、光子カウント数の関数としての予想されるイベント数の計算及び各イベント数それぞれに対するランダムポアソンノイズ（ｒａｎｄｏｍ Ｐｏｉｓｓｏｎ ｎｏｉｓｅ）の加算（ａｄｄｉｔｉｏｎ）である。
【００５８】
表２に、２つの蛍光種の２つの選択された場合における、本発明による一次元及び二次元蛍光強度分析の理論上のエラーを示す。いずれの場合にも、２つの種の比明度値の比率は３である。２Ｄ−ＦＩＤＡの場合は、２つの検出器のスペクトル感度は、異なる種に合わせる。いずれの場合にも、データ収集時間を１０秒、時間窓（ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗ）を４０μｓ、及びバックグラウンドカウント率を１ｋＨｚとする。但し、評価されるパラメーターの統計学上のエラーは、２Ｄ−ＦＩＤＡでは大幅に低い。
【００５９】
【表２】

【００６０】
本発明による二次元蛍光強度分布分析は、以下において、従来技術のモーメントアナリシスの二次元一般化（ｇｅｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）と比較される。
【００６１】
分布Ｐ（ｎ_１，ｎ_２）の階乗モーメントは、
【数５６】

と表される。
【００６２】
階乗モーメントは、階乗キュムラントＫ_ｋｌと関連付けられる。
【数５７】

【００６３】
Ｃは、二項からなるカウントを表す。キュムラントは、簡単な関係によって、濃度及び比明度値によって表すことができる。
【数５８】

【００６４】
式χ_１＝χ_２によってＢの単位が選択される場合、χ_１はＶによって表される試料体積を意味し、式３３は以下のように表記することができる。
【数５９】

ここで、γは、明度プロファイルを特徴付ける一連の定数を表す：
【数６０】

【００６５】
モーメントアナリシスの原理は、実験からのいくつかのキュムラントの値を決定すること及び未知の濃度及び明度値に対して式３３の系を解くことである。
【００６６】
表３では、一連の３０個の任意のヒストグラムのカウント数を得ることによって決定し、同一の“試料”に対してシミュレーションした２Ｄ−ＦＩＤＡ（本発明）及び２Ｄ−ＭＡＦＩＤ（蛍光強度分布分析の一次元モーメントアナリシスが記載されている従来技術の一般化）の統計学上のエラーを表し、その後２Ｄ−ＦＩＤＡ及び２Ｄ−ＭＡＦＩＤを適用し、そして両方の場合に評価されたパラメーターの変化を測定する。但し、２Ｄ−ＭＡＦＩＤと比較した２Ｄ−ＦＩＤＡの利点は、評価されるべきパラメーター数と共に増加する傾向がある。
【００６７】
【表３】

エラー値は、一連のシミュレーションされたデータに適用された分析のそれぞれの（ｓｃａｔｔｅｒｅｄ）結果から算出する。
【００６８】
表４に、２Ｄ−ＦＩＤＡ（本発明）及び２Ｄ−ＭＡＦＩＤ（従来技術の標準化）の評価されたパラメーターの平均値（即ち、偏り（ｂｉａｓ））の相対偏差（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を示す。それぞれの場合、偏りは、カウント数の一連の３０個のシミュレーションされた任意のヒストグラムの分析から決定される。３つのケースを分析した。最初のケースでは、データシミュレーション及びデータ分析で同じモデルを使用した。２番目のケースでは、２番目の種の粒子は等価ではないが、２０パーセントの相対半値幅（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈａｌｆ−ｗｉｄｔｈ）においてそれらの個々の明度によって分類されると仮定して、カウント数のヒストグラムをシミュレーションさする。但し、分析において、この現象を意図的に（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ）無視した。もちろん、分析にはあまり適当でないモデルを適用することにより、評価されるパラメーターの偏りが生じる。３番目のケースは、２番目の種の個々の明度分布の相対半値幅が、小嚢の調製での通常の値である５０パーセントである以外は、２番目のものと同様である。ケース２及び３において２Ｄ−ＦＩＤＡの加重誤差 （ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕａｌｓ）をマッピングする場合、方法論的な（ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）偏差が顕著であるが、２Ｄ−ＦＩＤＡはやはり意味のある結果をもたらすことに注目する価値がある。これは、一般的な性質である：元のデータを直接補正する２Ｄ−ＦＩＤＡは、元のデータの数学的な変換を補正する方法である２Ｄ−ＦＩＤＡより完全なモデル（ｅｘａｃｔ ｍｏｄｅｌ）の必要性は少ない。
【００６９】
【表４】

【００７０】
本発明によれば、共焦点技術は、蛍光強度の変化の観察に特に適している。それらは、生体臨床医学、診断、高処理量薬剤スクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｕｔ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、ビーズ、小嚢、細菌、ウイルス等のような粒子の選別等の選別法（ｓｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）のような、幅広い利用分野に適用することができる。結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）焦点（共焦点）技術は、試料上の回折限界点（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｐｏｔ）に鋭く焦点を合わせられた光の点光源（ｐｏｉｎｔ ｓｏｕｒｃｅ）の使用に基づいている。放射光は、照射点（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｐｏｔ）と正確に同じ場所に位置する観察範囲（ｖｉｅｗｉｎｇ ａｒｅａ）を隔てる空間フィルター（ピンホール）を通して観察される。従って、照射及び検出アパーチャー（ａｐｅｒｔｕｒｅ）は、お互いに光学的につなげられる。対物レンズの光以外の焦点板から生じる光は跳ね返され、これにより、非常に小さな深さの場（ｆｉｅｌｄ）が効果的にもたらされる。それ故、本発明の特に好ましい態様において、段階ａ）では、蛍光強度の観察のために共焦点顕微鏡が使用される。高いシグナル−ノイズ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ）を達成するためには、励起光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）（１４）を与えるための放射線（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）源（１２）、測定体積（２６）内に励起光（１４）の焦点を合わせるための対物レンズ（２２）、測定体積から発生する （ｓｔｅｍｓ）放射光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）（３０）を検出するための検出器（４２）、放射光（３０）又は励起光（１４）の中央部を消去するための、放射光（３０）又は励起光（１４）の経路（３２）に位置する光を通さない手段（ｏｐａｑｕｅ ｍｅａｎｓ）（４４）を含む装置を用いて蛍光強度を観察することが有用である。図９に詳細に記載された光学装置を使用することが特に好ましいこともある。
【００７１】
図面の詳細な説明
図 １
テトラメチルローダミン色素の溶液から得られるカウント数ヒストグラム（ａ）、及び式（３６）、（３７）及び（３８）によって得られた最良の補正（ｂｅｓｔ ｆｉｔ）に対応する３つの誤差曲線（ｂ）を示す図１をここで説明する。最初の時間間隔は４０μ秒であった。データ収集時間は、６０秒であった。この１Ｄ−ＦＩＤＡ実験は、明度プロファイルの十分に柔軟なモデルを用いることの重要性を表す。これは、２Ｄ−ＦＩＤＡ、ＦＩＭＤＡ及びＦＡＣＩＤでも同様に重要である。
【００７２】
ＦＣＳにおいて最も幅広く使用されている空間プロファイルモデルは、単一のパラメーターの形、縦及び放射方向における軸次元率（ａｘｉａｌ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｒａｔｅ）を用いる三次元ガウス（Ｇａｕｓｓｉａｎ）プロファイルである。白丸を用いた誤差曲線は、ガウスプロファイルから得られ得る補正量を表す。誤差には、大きな系統偏差（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ）がある。ＦＣＳデータを補正するための十分に柔軟なモデルは、ＦＩＤＡの場合はむしろ柔軟でなく、適当でないモデルであることがわかった。
【００７３】
ヒストグラム
【外１５】

をより良好に補正する試料プロファイルのモデルは、ガウス−ローレンツ（Ｇａｕｓｓｉａｎ−Ｌｏｒｒｅｎｔｚｉａｎ）（白抜きの四角）であるが、このモデルはやはり柔軟性に欠ける。式（８）により、空間明度Ｂのある関数が体積に対して積分される。換言すれば、それはＦＩＤＡにおける所定の空間明度プロファイルを特徴付けるＢとＶとの間の関係である。例えば、ガウスプロファイルにより
【数６１】

という関係が得られる。ガウス−ローレンツプロファイルにより、
【数６２】

という関係が得られる。
いずれの関係も、かなり柔軟性に欠ける。即ち、測定されたデータを補正するために理論上計算された分布を調整するための空間形状パラメーターを何らもたらさない。
【００７４】
実験データを補正するに足る柔軟性を有するモデルを調べる場合、以下の関係を適用することが有用なこともある：
【数６３】

式（３８）の背景にある物理的モデル以外に正式な（ｆｏｒｍａｌ）モデルがある。式（３８）によって得られ得る補正量は、塗りつぶした四角の曲線によって表される。
【００７５】
図２
ここで図２に、ラベルされたリガンドの小嚢への結合反応をモデル化する場合のカウント数のシミュレーションされたヒストグラムを示す。最初の時間間隔は４０μ秒であり、式（３８）の空間パラメーターの値は、ａ_１＝ −０．４； ａ_２＝０．０８、バックグラウンドカウント率ｂ＝１．０ｋＨｚ、データ収集時間４秒であった。“リガンド”の曲線は、ｃ＝６．０；ｑ＝６．０／粒子；σ_ｑ＝０の種に相当する。“小嚢”の曲線は、ｃ＝０．０５；
【数６４】

σ_ｑ＝１５０．０の種に相当する。“混合物”の曲線は、それらの混合物に相当する。濃度及び比明度の値は、薬剤スクリーニングにおいて特徴的な状態をモデル化するために選択された。１Ｄ−ＦＩＤＡを適用すると、曲線（ｃ）の補正により、１３パーセントである小嚢のσ_ｑのエラーを除き、ほぼ３．５〜６の間である統計学上のエラーにより所定の“試料”を特徴化する５つのパラメーターの値が得られる。しかし、仮に小嚢のσ_ｑが補正されると、全ての統計学上のエラーは４パーセントより低くなる。
【００７６】
最も迅速なデータシミュレーションアルゴリズムでは、予想される分布を計算し、ｎのそれぞれの値に対するイベントの任意のポアソン数を得ることができる。任意のポアソン数は以下のように得る：所定の予想されるイベントの値Ｅに対し、シミュレーションされたイベント数Ｓを、不等式
【数６５】

によって０．０〜１．０の間のごく普通に（ｒｏｕｔｉｎｅｌｙ）得られた数Ｒから決定する。
【００７７】
体裁的な（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）エラーとして、全イベント数
【数６６】

は、予め与えられた数Ｍからわずかに外れることがある。時間がかかるが直接的なデータシミュレーションアルゴリズムから、蛍光に寄与する体積成分中の粒子の任意の形状が得られ、所定の粒子形状に対応する古典的な光強度が計算され、かつシミュレーションされた光子カウント数として、この強度に対応する任意のポアソン数が得られる。この過程がＭ回繰り返され、シミュレーションされたカウント数ヒストグラムが得られる。
【００７８】
図 ３ 〜 ８
図３〜８は、１Ｄ−ＦＩＤＡの理論上のエラーを表す。
図 ３
ｑの値に依存する、単一種の溶液の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す図３をここで説明する。以下の実験パラメーターの値を選択した：ｃ＝１．０； Ｔ＝２０μ秒；ａ_１＝ −０．４； ａ_２＝ ０．０８； ｂ ＝ １．０ ｋＨｚ； データ収集時間２秒。
【００７９】
図 ４
図４は、ｃの値に依存する、単一種の溶液の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す。以下の実験パラメーターの値を選択した：ｑ＝６０ｋＨｚ／粒子；Ｔ＝２０μ秒；ａ_１＝ −０．４； ａ_２＝ ０．０８； ｂ ＝ １．０ ｋＨｚ； データ収集時間２秒。
【００８０】
図 ５
ここで図５に、Ｔの値に依存する、単一種の溶液の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを示す。以下の実験パラメーターの値を選択する：ｃ＝１．０；ｑ＝３０．０ｋＨｚ／粒子（上のグラフ）；ｑ＝６０．０ｋＨｚ／粒子（下のグラフ）；ａ_１＝ −０．４； ａ_２＝ ０．０８； ｂ ＝ １．０ ｋＨｚ； データ収集時間２秒。
【００８１】
図 ６
図６は、Ｔの値に依存する、２種の混合物の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す。以下の実験パラメーターの値を選択する；ｃ_１＝０．１；ｃ_２＝２．０；ｑ_１＝２００．０ｋＨｚ／粒子；ｑ_２＝１０．０ｋＨｚ／粒子；ａ_１＝ −０．４； ａ_２＝ ０．０８； ｂ ＝ １．０ ｋＨｚ； データ収集時間１０秒。但し、明るい方の種のパラメーターの決定のためのＴの最適値は暗い方の種のものよりも低い。
【００８２】
図 ７
ｑ_１のｑ_２に対する比率に依存する、２種の混合物の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す図７をここで説明する。以下の実験パラメーターの値を選択する；ｑ_１＝５０．０ｋＨｚ／粒子；ｃ_１＝ｃ_２＝０．５；ａ_１＝ −０．４； ａ_２＝ ０．０８； ｂ ＝ １．０ ｋＨｚ； データ収集時間４０秒。
【００８３】
図 ８
図８は、濃度に依存する、２種の混合物の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す。ｃ_１＝ｃ_２で濃度を同時に変化させた。以下の実験パラメーターの値を選択した；ｑ_１＝７５．０ｋＨｚ／粒子；ｑ_２＝２５．０ｋＨｚ／粒子；ａ_１＝ −０．４； ａ_２＝ ０．０８； ｂ ＝ １．０ ｋＨｚ； データ収集時間６０秒。但し、最適濃度は試料体積当たり約１つの粒子である。これは、３つ未満のパラメーターが決定されるべき場合を除き、一般に当てはまる。
【００８４】
図 ９
本発明による方法を行う場合の使用に適合させた装置の１つの態様を示す図９をここで示す。装置１０は、干渉光の束によって試料を照らすための光源として働くレーザー１２、単色励起光１４を含む。励起光１４は、レンズ１６によって平行化され、二色鏡２０に到達する。光学軸１８と二色鏡の間の角度は４５°であることが好ましい。二色鏡２０は、試料体積２６内にその焦点２４を有する対物レンズ２２の方向に励起光１４を反射する。試料体積２６及び対物レンズ２２は、透明なカバーガラス２８によって、例えば、試料を収容する市販のマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）の底部によって、お互いに分離されることが好ましい。試料は好ましくは蛍光ラベルされた分子又は他の粒子を含む。適切な励起光１４による励起により、試料中の分子又は他の粒子が放射線３０を放射する。放射光３０は、対物レンズ２２を通り、放射線３０を透過する二色鏡２０に到達する。その後、放射光は、光学軸３２上でフィルター３４及びコリメーター（ｃｏｌｌｉｍａｔｏｒ）レンズ３６を通る。ピンホール３８は、コリメーターレンズ３６の焦点に位置する。ピンホール３８をとおる放射光３０は、更なるレンズ４０に到達し、その後、写真検出器（ｐｈｏｔｏ−ｄｅｔｅｃｔｏｒ）４２によって検出される。放射光３０の経路内に、特に二色鏡２０と写真検出器４２との間に、それにより放射光３０の中央部が通ることができなくなる光を通さない手段４４が備えられる。この放射光３０の中央部は、励起光１４の焦点の前又は後ろの光学軸３２上の領域から発生する。焦点２４又はその直接の近傍から発生する放射光３０のみがピンホール３８を通り、写真検出器４２に到達する。光を通さない手段４４を放射光３０の経路内へ配置する代わりに、励起光１４の経路に光を通さない手段４４に配置することもまた適当である。特に、光を通さない手段４４を、レーザー１２と二色鏡２０との間に配置することができる。ここで詳細に記載したように光を通さない手段４４を用いることにより、シグナル−ノイズ比が改善される。
【００８５】
図 １０
図１０Ａにおいて、同じ平均カウント率、
【数６７】

の５つの場合で計算された光子カウント数分布、Ｐ（ｎ）が示される。白抜きの記号は、単一種の溶液であるが、粒子当たりの平均カウント数ｑＴの値が異なる溶液に相当する。実線は、一方はｑＴ＝０．５であり他方はｑＴ＝８．０である２つの種の混合物に対して計算される。明らかに、曲線はお互いに著しく異なっている。重要なポイントは、本発明による１Ｄ−ＦＩＤＡは、個々の種の寄与を明確に分離できることである。
【００８６】
２つの異なる色素、０．５ｎＭのローダミン６Ｇ（Ｒｈ６Ｇ）及び１．５ｎＭのテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、並びに２つ（０．８ｎＭのＴＭＲ、０．１ｎＭのＲｈ６Ｇ）の混合物の純粋な溶液の光子カウント数の分布を表す図１０Ｂをここで示す。主な装置は、蛍光相関研究のためにごく普通に用いられる共焦点顕微鏡（コンフォコール（ＣｏｎｆｏＣｏｒ）（登録商標）；エボテックバイオシステムズ・アンド・カールツァイス（ＥＶＯＴＥＣ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）、ドイツ）である。波長５１４．５ｎｍのアルゴン・イオンレーザーからの（約８００μＷまで）弱められた（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）ビームは、通常のＦＣＳ実験のスポットの２倍の大きさである、約０．５μｍのスポットへ集められ、その結果、ローダミン６Ｇの場合、拡散時間は約２００μ秒となった。励起強度は、一般に、自己相関関数の三重項（ｔｒｉｐｌｅｔ ｔｅｒｍ）の約１５パーセント振幅を特徴とする値以下に保たれる。蛍光放射は、アバランシェフォトダイオード検出器ＳＰＣＭ−ＡＱ １３１（ＥＧ＆Ｇ）を用いて顕微鏡の焦点板上のピンホールによって検出される。光子カウント数のヒストグラムは、Ｔ＝４０μ秒のドエル時間で測定された。データ収集時間は５０秒であった。これらのヒストグラムは、１Ｄ−ＦＩＤＡのための入力データとして用いられる。多成分補正（ｆｉｔ）分析の結果を以下の表５に示す。χ^２値は
【数６８】

によって計算した。ここで、ｎ_ｐは、測定されたヒストグラム
【外１６】

の長さであり、ｎ_ｆｉｔは補正（ｆｉｔ）パラメーターの数である。前記の多成分分析において、一定の数の蛍光種を仮定し、光子カウント数の測定されたヒストグラムを補正し、未知の濃度及び比明度の値を評価する。
【００８７】
【表５】

【００８８】
すべての場合において、脱イオン水を用いて測定される場合、バックグラウンドカウント率を１．０５ｋＨｚに補正した。ａ_１が１．０に補正される場合、ａ_２及びａ_３は予め標準化された値である。表５における理論上の統計学的なエラーは、理論上の重量：
【数６９】

と一致する。
【００８９】
この式は、光子カウントの数のＮ個の独立した測定の単純な仮定の下で導かれる。現実に、連続した測定は相関しているので、補正アルゴリズムによって得られた評価されるパラメーターのエラーは、実際の統計学的なエラーを低く見積もる。我々は、一連の３０〜２００回の別々の測定から、これらの統計学的なエラーは理論上のエラーの約３倍大きいことを経験的に決定した。
【００９０】
Ｒｈ６Ｇの典型的な誤差を図１０Ｃに示す。
１Ｄ−ＦＩＤＡを非常に頻繁に用いて、蛍光種の所定数を仮定し、この仮定の下で測定された分布と理論上の分布との間の最も良好な補正を見出す。しかし、１Ｄ−ＦＩＤＡは、蛍光粒子の比明度の連続した分布を仮定して適用することもできる。この方法は、補正（ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎｓ）を用いる反比例関数（ＩＴＲ）として一般に知られている。１Ｄ−ＦＩＤＡにおけるＩＴＲ分析の結果を、それらの比明度の関数として粒子数の分布を表す図１０Ｄに示す。このようなＩＴＲ分析は、線形補正及び濃度を負でない値にすることにより行われる。ＩＴＲは、特に、試料組成からの事前の（ｐｒｉｏｒｉ）情報が与えられないか、試料組成が不均一である試料のために有益なツールである。点線は、単一の色素（Ｒｈ６Ｇ及びＴＭＲ）の溶液に、実線はそれらの混合物に対応する。縦座標により、共焦点体積成分（左：単一色素、右：混合物）内の平均粒子数が得られる。装置の詳細については、図１０Ｂの説明を参照。理想的な結果は、単一種の溶液の場合は単一のδ−ピークであり、混合物の場合は２つのδ−ピークである。実際は、ＩＴＲ出力スペクトルピークの幅は、比明度値の分布の実際の幅からだけでなく、入力データの精度及び線形補正の特別な実施からも測定される：即ち、幅広いスペクトルが実験値並びに狭いものを補正するならば、ＩＴＲには幅広いものが好ましい。
【００９１】
図 １１
更なる例として、ラベル化又は非ラベル化相補性オリゴヌクレオチド及び制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＫｐｎ ＩによるＤＮＡハイブリッドのその後の対称な切断による５’−（６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））でラベルされた４０ｍｅｒ類のハイブリダイゼーションの研究に、本発明による１Ｄ−ＦＩＤＡが適用された。この研究で用いられた特定のオリゴヌクレオチドは、
ＴＡＭＲＡ−ＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴ（５’−ＴＡＭＲＡ−オリゴＡ）及び
ＴＡＭＲＡ−ＡＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＴ（５’−ＴＡＭＲＡ−オリゴＢ）
であった。
【００９２】
それらのＨＰＬＣ純度のものを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） （ワイテルスタット（Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）、ドイツ）から購入した。約３００μＷに弱めた４ｍＷのヘリウム／ネオンレーザー（ユニフェーズ（Ｕｎｉｐｈａｓｅ））を用いて５４３／５８０ｎｍの励起／放射波長で上記のＦＣＳ読み取り機において、全ての測定が行われた。水のバックグラウンドは、８００Ｈｚ以下であった。測定のために、試料のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を１ｎＭに希釈し、２０μｌを、室温で８つのウェルを有する（８−ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）カバーガラス（ナルゲ・ヌンク（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ））において分析した。７０％ホルムアミド含有１０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＮａＣｌ及び０．５μＭのオリゴヌクレオチド濃度でハイブリダイゼーション反応を行った。９５℃で２分間変性を行い、融点Ｔｍより１０−１５度低い最適温度Ｔｘ（ヒーティングブロック（Ｈｅａｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）、テシュネ（Ｔｅｃｈｎｅ））に従って５５−６０℃で４０分間、次のハイブリダイゼーションを行った。Ｔｍは、以下のように算出される：Ｔｍ ＝ ８１．５ ＋１６．６ （ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］） ＋ ０．４１ （％Ｇ＋Ｃ） − ６００／Ｎ （Ｎ ＝ ４０； ％Ｇ＋Ｃ ＝ ４２．５）。制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＫｐｎ ＩによってハイブリッドＤＮＡの制限消化分析を行った。異なる大きさのフラグメントを得るために、制限部位を選択した。３７℃、１時間、３３ｍＭのトリス／酢酸（ｐＨ ７．９）、１ｍＭの酢酸マグネシウム、６．６ｍＭの酢酸カリウム及び０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンにおいて切断反応を行った。反応経過は、一桁の大きさの範囲内の分子当たりの蛍光強度の大幅なシフトを特徴とする（図１１Ａ−Ｅ）。得られた２つの生成物ピークは、ハイブリダイズされていない種が検出され得る１つの単一ハイブリダイゼーション種に相当することに注目することが重要である。これは、二重ラベルされたハイブリッドと比較して異なる明度を有する信号が得られたラベル化／非ラベル化オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いるハイブリダイゼーション／切断実験において容易に示すことができた（図１２Ａ、Ｂ）。そのような２つのピーク構造の１つの例は、２つの構造的な状態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｅｓ）の間の転位（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の結果である構造的な変化であろう。この挙動は、ラベルの極性、非極性、及び消光 （ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）環境による構造的な動力学の３つの状態のモデルを用いて説明される（エゲリング（Ｅｇｇｅｌｉｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １５５６ − １５６１）。このデータから、構造的な変化は、ＤＮＡの長さ及びラベル数に大きく依存するという結論を得ることができる。ワンラベル（ｏｎｅ−ｌａｂｅｌ）ハイブリッドを研究する場合、小さな消化されたＤＮＡフラグメントは、単一の明度を示し、抽出物（ｅｄｕｃｔ）の２つのピークの濃度比は１つの成分の方へシフトする。更なる結果として、小さなフラグメントは、低分子明度を示し、大きなフラグメントは高明度値に相当する。
【外１７】

【００９３】
図 １２
両酵素に対する対称な切断部位に基づき、同じ大きさ及び更に非常に類似した分子明度のＤＮＡフラグメントが予想され得る。図１２Ａ及びＢにより、そのような結果が観察され、理論的な関係Ｑ_１ ＋ Ｑ_２ ＝ Ｑ_３ ＋ Ｑ_４が実験的に立証されたことが明確に示される。制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＫｐｎ Ｉを単独又は組み合わせることにより、ハイブリッドＤＮＡの制限消化分析を行った。制限部位により対称に切断されたフラグメントが得られる（２×１２ｍｅｒｓ、二重消化（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ）に対し１×１６ｍｅｒ）。［●］はラベルされたＤＮＡに相当する。Ｑ_{０１−０３}：ＤＮＡハイブリッドの強度、Ｑ_ｉ： 切断生成物の強度。単一または二重にラベルされたＤＮＡ構造を用いる切断生成物の全ての測定のバルクにより、単一の測定において個々の構造によって観察された強度全てを分類することが可能になる。これは本発明の方法の特徴であり、他の既知の分析方法を何ら用いることができない。
【００９４】
図 １３ 及び １４
ここで図１３及び１４を説明する。２Ｄ−ＦＩＤＡのための装置の中央光学部として、ＦＣＳ分光計の場合にように、共焦点顕微鏡を使用する（コッペル（Ｋｏｐｐｅｌ）ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． １６： １３１５ − １３２９、１９７６）。蛍光の励起のため、Ａｒからのビーム又は緑色Ｈｅ−Ｎｅレーザーを中性のフィルターによって弱め、ビーム伸張器に通し、二色鏡によって顕微鏡の対物レンズに当てる。粒子をゆっくり拡散させるいくつかの実験において、レーザー走査顕微鏡で知られたツールとして、試料走査と組み合わせたビーム走査を用いる。二色鏡によって同じ対物レンズにより蛍光を集め、焦点外の光を遮断するために用いる共焦点ピンホールに焦点を合わせる。顕微鏡の蛍光収集経路においてアパーチャーの約４分の１を閉じる同心の光を通さないスポットを用いることにより、縦方向の分解能は更に改善される。ピンホールを通る光は、２つの検出器による検出のためのビームスプリッター（ｂｅａｍ ｓｐｌｉｔｔｅｒ）によって分けられる。一般のタイプの２Ｄ−ＦＩＤＡ実験によれば、ビームスプリッターは偏光キューブ又は二色鏡のいずれかである。最初の場合は、一般的なスペクトルバンド−パスフィルター（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｂａｎｄ−ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）が用いられるのに対し、二色ＦＩＤＡの場合は、各検出器はその前に異なるバント−パスフィルターを有する。光子カウント検出器は、カナダのＥＧ＆Ｇオプトエレクトロニクス（ＥＧ＆Ｇ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）のケイ素アバランシェフォトダイオードモジュールＳＰＣＭ−ＡＱ−１３１である。検出器からのＴＴＬパルスは、コンピューターの差込式カードとしてのエボテックバイオシステムズＡＧ（ＥＶＯＴＥＣ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ＡＧ）（ハンブルグ、ドイツ）製２チャンネルカウンターによってカウントされる。カウント数分布は、３２ＭＢオンボード（ｏｎｂｏａｒｄ）バッファーからのデータを読み取る間に計算される。それ自身はオンライン法である。ＦＣＳ測定は、検出器の出力を相関計へ送り込むことにより、ＦＩＤＡ実験と並行して行うことができる。
【００９５】
両検出器に対するバックグラウンドカウント率の値は、２回蒸留した水における別々の実験によって決定される。バックグラウンド光の強度が変動しないことの主な要因は、水からのラマン拡散である。
【００９６】
観察される試料体積の半径は、元のレーザービームの適当な拡大倍率を選択することにより調整することができる。約０．６μｍの焦点ビーム半径を用いると、単純な有機色素分子（例えばＴＡＭＲＡ）の場合、拡散時間は、カウンターの４０μｓのドエル時間と比較して長いと考えられる約２６０μｓになるので、カウント間隔の間の一定の分子明度の推定は妥当である。励起強度は、分子当たりの高カウント率と三重項（ｔｒｉｐｌｅｔ ｓｔａｔｅ）の低い集合（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）との間の妥協点（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）に調整される。三重項集合は、約１５パーセントに保たれる。更に高い三重項集合値は、明らかな空間明度プロファイルを大きくゆがめることもある。一連の実験の準備（ｓｅｔ−ｕｐ）の間に相関計（ＡＬＶ−５０００、ＡＬＶ、ランゲン（Ｌａｎｇｅｎ）、ドイツ）によって三重項の集合を測定した。
【００９７】
方法論的なテスト実験のために、２つの異なる色素、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びローダミンレッドＸ（ＲＲＸ）を選択した。レーザー波長５４３．５ｎｍにおいて、これらの色素は、異なる放射スペクトル並びに異なる消光係数を有する。これらの実験では、検出器の前に広帯域（ｗｉｄｅｂａｎｄ）４０／６０ビームスプリッターを用いる。“赤”チャンネルのスペクトルフィルターは、中央波長が６０５ｎｍでありＦＷＨＭが５０ｎｍであるのに対し、“黄色−緑”チャンネルに対する対応する数値は、５７５ｎｍ及び３０ｎｍである。観察体積中の平均分子数が、０．２３〜０．９２ｎＭの濃度に対応する０．５〜２．０の範囲になるように、蒸留水中で色素を希釈した。
【００９８】
それぞれの実験に対して、水を浸した（ｗａｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）対物レンズ（ツァイスＣ−アポクロマト（Ｚｅｉｓｓ Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ） ４０ｘ１．２ Ｗ Ｋｏｒｒ）から試料を分離するカバーガラス上に約２０μｌの試料溶液を滴下した。６０秒間で各ヒストグラムを得た。それぞれの色素を別々に測定したが、異なる濃度比の色素の混合物も測定した。ＴＡＭＲＡにおける実験から、空間明度プロファイルを示すパラメーターを測定し、ａ_１＝−０．４０５及びａ_２＝０．０７７２の値での他の試料のその後の分析において補正した。その方法によって得られた２種の特定のパラメーターの値がどれほど良好であったかを見るために、混合物を測定して分析した。
【００９９】
例として、図１３は、純粋なＴＡＭＲＡ溶液の場合に測定されたカウント数ヒストグラムを視覚化する。Ｚ軸に対応する値は、所定の一対のカウント数ｎ_１及びｎ_２に対するイベント数である。分布を補正することにより、平均粒子数ｃＶ＝１．１３９±０．００５、“赤”チャンネルの場合の比明度ｑ_１＝７９．４±０．５ｋＨｚ、及び“黄色−緑色”の場合のｑ_２＝５０．９±０．３ｋＨｚが得られる。テスト実験の分析の結果を表６に示す。色素分子のガラス表面への吸着が実際の濃度に大きく影響するので、調製物の希釈率から計算される濃度値による試料の特定は行わなかった。同様の理由により、試料毎に良好に再現されなかった；実施毎の濃度値のシフトもしばしば観察され得る。しかし、比明度値は良好に再現される。示された統計学的なエラーの値は、非相関測定の仮定に対応する理論上の値の３倍である。３は、経験上の因子である。統計的なエラーに加え、適度な大きさの試料毎の偏差も顕著である。
【０１００】
【表６】

【０１０１】
混合物を用いて測定したヒストグラムが純粋な色素の場合に測定したものと質的に異なっていることは注目に値する。図１４は、ＴＡＭＲＡとＲＲＸとの混合物を用いて測定した分布の補正の加重誤差を視覚化する。上のグラフは、２種の存在を仮定した場合の適当な分析に相当する；極めて任意かつ均一に誤差がばらついている。下のグラフは、単一種のみが存在するとの仮定に相当する；この場合、測定された分布と算出された分布との間には大きな違いがある。ｎ_１は、“赤”検出器によって得られたカウント数であり、ｎ_２は、“黄色−緑”検出器によって得られたカウント数である。
【０１０２】
図 １５ 及び １６
伝統的な蛍光偏光の研究において、蛍光の２つの偏光成分の平均強度は、直接測定される。強度の変動は、ここで直接の興味の対象ではなく、むしろ統計学的なエラーの原因として考えられている。蛍光的にラベルされた結合対を含む試料の蛍光偏光値の変化は、分子体積の変化を引き起こし、これにより、平衡結合（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）の直接的な情報がもたらされる。蛍光偏光測定は、リアルタイムで行うこともでき、結合及び解離反応の運動学上の分析が行われる。最も幅広く用いられている蛍光偏光適用の一つは、治療効果のある、及び法的に認められていない（ｉｌｌｉｃｉｔ）薬剤の検出のために使用される競合イムノアッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）である。蛍光偏光の方法は、１０年以上の間、臨床的イムノアッセイのために用いられていた。同種の（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＦＰＩＡ（イムノアッセイにおける蛍光偏光）は、ＲＩＡ又はＥＬＩＳＡのような通常の異種のイムノアッセイにおいて広く一般に認められている（ｗｅｌｌ−ａｃｃｅｐｔｅｄ）利点を有する。しかし、個々の偏光種の分離は不可能であるので、それは、多結合段階反応が研究されるべき場合は達成できない。それ故、リガンド結合曲線のみが、偏光の全体的な減少を示す。このことは、力学的な（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ）結合定数が決定できないことを意味する。試料体積並びに質量制限（ｍａｓｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓ）において、更なる限界が見られる。
【０１０３】
本発明による二次元蛍光強度分布分析により、通常蛍光異方性に隠れている情報の全ての内容を利用することができ、それにより、上記の限界が克服される。２Ｄ−ＦＩＤＡは、１つの測定において各蛍光種当たりの２つの特異的な量：分子当たりの蛍光強度及び所定のモデルの異方性を直接決定する。この追加の情報に基づき、全ての関与している種の図解（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）、更に結合挙動の定量化が可能である。２Ｄ−ＦＩＤＡ異方性は、多数の結合段階、凝集及びマルチメリゼーション（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）現象を示す系の定量的な説明のための理想的なツールである。
【０１０４】
以下に、その偏光モードにおける２Ｄ−ＦＩＤＡの適用を説明する。ここでは、テオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）抗原とアンチテオフィリン抗体との間の相互作用を研究した。
【０１０５】
テオフィリン治療は、数年間喘息治療の基礎であったので、血清中のテオフィリン値の分析及び調整が強く要求されている。本発明の可能性を示すため、ポリクローナルアンチテオフィリン血清からのテオフィリン抗原のアンチテオフィリン抗体への結合が研究されている。組み込まれたスペーサーを有する、又は有さない５’−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）によって抗原をラベルした。古典的なＦＰ分析において、抗体との相互作用において、これらの結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、低い異方性値（それぞれ０．０３７及び０．０５５）を示した。従って、それらは、本発明の感度を表すための重大な（ｃｒｉｔｉｃａｌ）基礎を形成する。
【０１０６】
結合実験のために、抗体の貯蔵液及び抗原を０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）含有ＰＢＳバッファー中で希釈した。化合物を混合した後、混合物を室温で３０分間インキュベートした。結合体の空間特性を釣り合わせ、Ｈｅ／Ｎｅレーザー（ユニフェーズ（Ｕｎｉｐｈａｓｅ））の５４３ｎｍ線において系を励起した。２つの例として、抗体希釈値は異なるがリガンド濃度が［Ｌ］＝２ｎＭと一定の場合の、光子カウント数の測定されたジョイントヒストグラム（ｊｏｉｎｔ ｈｉｓｔｇｒａｍｓ）及び試料に適用された２Ｄ−ＦＩＤＡの結果を、図１５及び１６に示す。抗体濃度は、効果的な希釈を示す任意の単位中のものである。各検出チャンネルにおける水のバックグラウンドは、１ｋＨｚ以下であった。
【０１０７】
図 １７−１９
本発明による二色蛍光強度分布分析において、２つの検出器をスペクトル的に調整して異なる色の２つのラベルからの蛍光を観察する。下記の分析タイプでは、リガンド分子は“緑色”にラベルされる。各小嚢が多数のレセプターを運ぶので、結合度の低い試料中の小嚢を、大幅に高い“緑色”の比明度によって結合度の高い試料中の小嚢と区別することができる。小嚢は、更に“赤色”に染色される。“赤色”の小嚢の比明度は、リガンド分子の結合によっては変わらないが、“赤色”の染色は、（“赤色”では殆ど見えない）結合していない（ｆｒｅｅ）リガンド分子と（非常に低い結合の場合に、結合していないリガンド分子とほぼ同じ“緑色”の明度である）小嚢との間の定数を増加させる手段である。単一の試料の２つの蛍光種からの光子カウント数の測定された二次元分布への寄与は、この分析タイプにおいて実際に大きく異なっているので、分析は非常に信頼できる。
【０１０８】
本発明による二次元蛍光強度分布の利点を示すために、ＴＡＭＲＡでラベルされたソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）−１４（ＳＭＳ１４−５ＴＡＭＲＡ）のヒト２型高アフィニティーソマトスタチンレセプターＳＳＴＲ−２への結合（Ｐ．ショフター（Ｐ． Ｓｃｈｏｅｆｆｔｅｒ）ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．、２８９、１６３ − １７３、１９９５）が、生物学的システムとして選択された。レセプターを、ＣＣＬ３９ｈｓｓｔ２細胞と表した。この細胞系から小嚢を調製し、親油性トレーサーＤｉＣ_１８（５）によって染色した。プロテアーゼ阻害剤存在下で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．６）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％（ｗ／ｖ）の蛍光活性剤（ｆｌｕｏｒｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）ＦＣ−１３５、１．３３％のＤＭＳＯ中で結合反応を行った。分析原理の概略図を図１７に示す。
【０１０９】
２つのスペクトル的に異なるラベルの蛍光の励起のため、２５０μＷに減じられたネオジム：ヤグ（Ｙａｇ）レーザーの５３２ｎｍ線及び２５μＷに減じられたＨｅ−Ｎｅレーザーの６３２ｎｍ線を同時に使用した。２のレーザービームの調整不良（ｍｉｓａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を最小化するため、それら両方を、顕微鏡によって焦点に集める前に単一の光ファイバーに通した。また、集めた蛍光ビームを、２つの検出器に分ける前に、単一のピンホールに通した。中央の波長が５９０ｎｍ、ＦＷＨＭが６０ｎｍである光学的バンドパスフィルター及び中央の波長が６９０ｎｍ、ＦＷＨＭが４０ｎｍであるもう一つのものを、２つの検出器の前で使用し、２つのラベルから別々に観察した。小嚢はゆっくりと拡散する粒子であるので、この実験では、１つの方向で周波数２５Ｈｚ、振幅１００μｍのシヌソイドの（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ）ビーム走査、その他の方向で８秒間のデータ収集時間当たり５００μｍの試料走査を用いて、各試料の０．０５ｍｍ^２の範囲を走査した。
【０１１０】
図１８において、高結合度及び低結合度に相当する２つの典型的なカウント数ヒストグラムの例を比較する。図１８Ａでは、大過剰の非蛍光コンペティター（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ） （ＳＲＩＦ−１４、ＳＩＧＭＡ；コンペティター１μＭ、全リガンド３ ｎＭ）を加えることにより、リガンドに結合する小嚢（ＳＭＳ１４−５ＴＡＭＲＡ）を競合させる。コンペティターなしで得られるヒストグラム（図１８Ｂ）は、ｎ_２方向において、コンペティターが存在する場合よりも広がっていることがはっきり見られる。ｎ_２方向は、ラベルされたリガンドの緑色蛍光を表すので、リガンド結合のための測定である。
【０１１１】
本発明による２Ｄ−ＦＩＤＡを、それぞれの測定されたヒストグラムに適用した。二色補正アルゴリズムを用いて、結合していないリガンド及び小嚢に結合したリガンドの濃度（共焦点体積中の粒子数）及び蛍光明度値を得た。コンペティターが存在する場合（低い結合）であっても、小嚢は結合していないリガンドから良好に分離された。コンペティターの添加により、小嚢の緑色蛍光の減少及び結合していないリガンドの濃度の増加が引き起こされる。リガンドが小嚢から完全には解離しないという事実は、分析において用いられる小嚢の量に依存する非特異的結合によるものである。
【０１１２】
次に、投与量応答（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ）曲線の記録及びＥＣ_５０値の決定のために、１０ｐＭ 〜１μＭ未満 （各１０回の測定）でコンペティターを滴定した。図１９に示すように、２Ｄ−ＦＩＤＡ分析により、標準偏差が極めて低い典型的なＳ字型競合曲線が得られる。測定されたＥＣ_５０値は、０．８７ｎＭであり、他の評価方法（データは示さず）を用いて得られたＥＣ_５０値と良好に一致する。それ故、高結合と低結合とを区別することが可能なだけだけでなく、本発明による２Ｄ−ＦＩＤＡ分析によって、結合度の小さな変化を決定することもできる。これは、高処理量スクリーニングにおける分析阻害剤（“ｈｉｔｓ”）の同定をしようとする場合に特に重要である。要約すると、２Ｄ−ＦＩＤＡ分析は、小嚢に基づく結合分析に適合した、信頼できる方法であり、高処理量スクリーニングに既に良好に（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ）適用されている。
【０１１３】
図 ２０
ここで、図２０を説明する。好ましい態様によれば、段階ｂ）においてヒストグラム
【外１８】

が決定される光子カウント数｛ｎ_ｉ｝は、所定のルールに従い最初の時間間隔からの光子カウント数を加えることにより、最初の時間間隔における光子カウント数｛Ｎ_ｊ｝から得られる。例えば、ルール
【数７０】

（ここで、Ｍは、｛ｎ_ｉ｝が測定される時間間隔が最初の時間間隔より何倍長いかを表す整数である）
に従い、最初の時間間隔における光子カウント数｛Ｎ_ｊ｝から計算される分布関数
【外１９】

が決定される光子カウント数｛ｎ_ｉ｝の選択が興味深いこともある。行Ｎは、最初の時間間隔窓を示す。行ｎ_ｉは、ルールに従ってｎ_ｉを算出するために選択された最初の時間窓を表す。このルールは、ＦＩＭＤＡの場合のカウント時間間隔の長さが異なる一連のヒストグラムを作るために適用される。
【０１１４】
図 ２１
図２１は、最初の時間間隔を時間遅延によって分けるというルールに従い、所定の最初の時間間隔から光子カウント数｛ｎ_ｉ｝が得られる更なる態様を示す。特に、以下のルールを適用することができる：
【数７１】

ここで、Ｍ及びＬは正の整数であり、｛ｎ_ｉ｝はヒストグラム
【外２０】

が決定される光子カウント数であり、かつ｛Ｎ_ｊ｝は最初の時間間隔における光子カウント数である。このルールは、ＦＡＣＩＤの場合の異なるヒストグラムの決定に適用される。
【０１１５】
図 ２２−２７
ここで、図２２〜２７を説明する。
細胞表面レセプターの機能及び活性の研究は、現代生物学及び薬理学の全研究分野の主流をなす。膜レセプターは、血漿膜を横切る細胞外信号を細胞内で変換するので、多細胞生物内の伝達（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）において重要な役割を果たす。膜レセプターの２つの重要な種類は、成長因子レセプター及びＧ蛋白質結合（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ）レセプター（ＧＰＣＲ）である。成長因子レセプターは、細胞の分化及び成長において重要な役割を果たすレセプターチロシンキナーゼの群に属する。この種類に属するレセプターは、表皮成長因子レセプター群、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）レセプター群及びインシュリンレセプター類を含む（Ｍｃ Ｉｎｎｅｓ Ｃ． ＆ Ｓｙｋｅｓ Ｂ．Ｄ． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、４３、３３９ − ３６６、１９９７； Ｒｉｅｓｅ Ｄ．Ｊ． ＆ Ｓｔｅｒｎ Ｄ． Ｆ．、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２０、４１ − ４８、１９９８； Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｈ． ＆ Ｉｂａｎｅｚ Ｃ．Ｆ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ６、１１ − １８、１９９３）。Ｇ蛋白質結合レセプターは、神経伝達物質及びホルモンのような細胞外因子の結合により様々な工程のトランスメンブレン信号変換（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を媒介する７つのα−ヘリカルトランスメンブレンドメインを含む不可欠な（ｉｎｔｅｇｒａｌ）細胞蛋白質の上科である（ジー（Ｊｉ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、１７２９９ − １７３０２、１９９８； ゲザー（Ｇｅｔｈｅｒ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３、１７９７９ − １７９８２、１９９８； ウェスＪ．（Ｗｅｓｓ Ｊ．）、ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１、３４６ − ３５４、１９９７）。
【０１１６】
殆どの場合、レセプターは、放射性リガンド（ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ）結合分析を用いて生化学的及び薬理学的に研究される。これらの実験では、結合した、又は結合していないリガンドの分離をしばしば含む、放射線でラベルされたリガンドの膜画分又は細胞全体への結合を観察する。本発明による方法を用いると、蛍光ラベルされた分子又は粒子の、単一分子値でのそれらの分子明度及び濃度に関する特徴化が可能である。リガンドとレセプターとの相互作用の研究に、この方法がどのように適用され得るかを以下に記載する。レセプターを担持した（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ）小嚢上への蛍光リガンド分子の積み重なりにより、結合されたリガンドを未結合リガンドと区別することができ、その結果、単一の蛍光リガンド分子と比べて粒子明度が増加する。本発明による蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）により、分子明度におけるこれらの違いを定量することができ、かつ結合していない、及び結合しているリガンドの完全な濃度が、分離の必要なしに１つの測定で測定される。ＦＩＤＡは、高度に焦点に集められたレーザービームを利用するので、検出体積は約１フェムトリッターの大きさである。液体のハンドリングの現在の（ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）実用上の限界である１μｌに試料体積を減らすことができるので、貴重な生物学的材料及び化学的化合物が大幅に節約される。ＦＩＤＡは研究及び高処理量薬学的スクリーニングに対する本質的な利益をもたらす、レセプター−リガンド研究のための理想的な方法であることがこれらの結果から示された：それは、幅広く適用することができ、危険かつ効果な放射性プローブの使用を回避し、洗浄段階の必要性をなくし（即ち、本発明は、均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）分析方法を提供する）、かつ試薬の消費の大幅な減少を可能にする。
【０１１７】
上記のレセプターの両方の種類は、癌、神経変性疾患（ｎｅｏｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、心臓血管異常（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）及びＡＩＤＳのような多数の疾患において重要な役割を果たすので、重要な薬剤のターゲットである。ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１）、１７０ｋＤのレセプターチロシンキナーゼ及びβ２−アドレナリン作用性レセプター、我々のモデル系としてのＧ蛋白質結合レセプター。
【０１１８】
以下の実験プロトコルを用いた：
材料．テトラメチルローダミンでラベルされた表皮成長因子（ＴＭＲ−ＥＧＦ）、非ラベル化表皮成長因子（ＥＧＦ）及びボディピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）ＦＬ−ＣＧＰ １２１７７（ボディピィＦＬ： ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ（ｂｏｒａ）−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ｉｎｄａｃｅｎｅ）−３−プロピオン酸； ＣＧＰ １２１７７： ４−（３−（（１，１−ジメチルエチル）アミノ（−２−ヒドロキシプロピル（−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン ヒドロ−クロライド）を、モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）、オランダ）から購入した。アメリカ型組織培養収集（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、ヒトの表皮上の癌腫（Ａ４３１）細胞及びヒトの結腸癌腫腫瘍（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ）（ＨＣＴ）細胞を得た。Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）からベータセルリン（Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）及びヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）を、ＲＢＩ（ナチック（Ｎａｔｉｃｋ）、米国）からＣＧＰ １２１７７Ａを購入した。
【０１１９】
方法．細胞系及び膜調製．野生型ヒトβ２アドレナリン作用性レセプターｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡ３内でクローン化した。プラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされ、かつ安定なクローンを記載されたように選択した（ガビロンドＡ．Ｍ．（Ｇａｂｉｌｏｎｄｏ Ａ．Ｍ．）、ヘグラーＪ．（Ｈｅｇｌｅｒ Ｊ．）、クラセルＣ．（Ｋｒａｓｅｌ Ｃ．）、ボイビン−ジャーンズＶ．（Ｂｏｉｖｉｎ−Ｊａｈｎｓ Ｖ．）、へインＬ．（Ｈｅｉｎ Ｌ．）、ローセＭ．Ｊ．（Ｌｏｈｓｅ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４、１２２８５ − １２２９０、１９９７）。膜調製のために、氷***解バッファー（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．４、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート^ＴＭミニＥＤＴＡ−フリー（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^ＴＭ Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ）、ロシェ・モレキュラー・バイオケミオカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を含有する０．５ｍＭのＥＤＴＡ） ２ｍｌの中で、約２×１０^８個の細胞を再懸濁させた。氷上でドウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）均質化によって細胞をばらばらにし、９００×ｇで１０分間、遠心分離で破壊されていない細胞及び核を取り除いた。上清を貯留し、１００，０００×ｇで２０分間（４℃）で遠心分離した。０．５ｍｌの結合分析バッファー中で膜ペレットを再懸濁し、ブラッドフォードプロテインアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ））を用いて蛋白質濃度を測定した。液体中で、膜をアリコート中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１２０】
結合研究．典型的な実験は、５０〜５００μｇ／ｍｌの膜蛋白質、最終体積が４０μｌの異なる濃度の蛍光リガンド及びコンペティターを含んでいた（詳細は図の説明（Ｆｉｇｕｒｅ ｌｅｇｅｎｄｓ）を参照）。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．８ ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＢＳＡ及び０．１％のＣＨＡＰＳ中で、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）結合研究を行った。β２アドレナリン作用性レセプターのための結合分析バッファーは、７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＢＳＡ 及び０．１％のＣＨＡＰＳを含んでいた。８ウェルガラスチャンバー（Ｎｕｎｃ）中で測定を行った。１μｌの試料体積を用いる実験に対し、ウェル当たりの総容量１．５μｌで、専有液体分配単位（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｌｉｑｕｉｄ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）及び高密度試料キャリアー（ナノキャリアー（Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ））を用いた（エボテックバイオシステムズＡＧ（ＥＶＯＴＥＣ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ＡＧ））。
【０１２１】
データ分析． カスクＰ．（Ｋａｓｋ Ｐ．）、パロＫ．（Ｐａｌｏ Ｋ．）、Ｕｌｌｍａｎｎ Ｄ． ＆ Ｇａｌｌ Ｋ． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６、１３７５６ − １３７６１、１９９９； この内容は、本明細書に開示として援用される）に記載の光学装置と共に、共焦点顕微鏡（コンフォコール（Ｃｏｎｆｏｃｏｒ）、エボテックバイオシステムズ（ＥＶＯＴＥＣ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ＡＧ）及びカールツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）、ジェナ（Ｊｅｎａ）ドイツ）を用いた。ウェル当たり４０μ秒のドエル時間及び４−８秒のデータ収集時間で光子カウント数を測定した。約３００μＷに減じられたヘリウム／ネオンレーザーを用いて励起／放射波長が５４３／５８０ｎｍでＴＭＲ−ＥＧＦによって測定を行った。約２ｍＷに減じられたアルゴン^＋レーザーを用いて励起／放射波長が４８８／５２０でボディピィＦＬ−ＣＧＦ １２１７７によって測定を行った。本発明による方法は、ＦＣＳのように、共焦点体積に出入りする蛍光粒子の任意の拡散に頼っている（カスクＰ．（Ｋａｓｋ Ｐ．）、パロＫ．（Ｐａｌｏ Ｋ．）、Ｕｌｌｍａｎｎ Ｄ． ＆ Ｇａｌｌ Ｋ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６、１３７５６ − １３７６１、１９９９； リーグラーＲ．（Ｒｉｇｌｅｒ Ｒ．）、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４１、１７７ − １８６、１９９５）。蛋白質のような単一の粒子と比べて膜粒子の拡散時間が非常に長いので（平均拡散時間τ＝１０−１００ｍｓ対約２００μｓ−単一分子に対して１ｍｓ）、十分多数の膜質状小嚢を検出し得るように、二次元走査アプローチを利用する。これは、レーザービーム発振器及び可動性試料ステージを用いて達成される。
試料内に２つの異なる蛍光種、即ち蛍光リガンド及びそれらの表面に積み重なった蛍光リガンドを有する小嚢の存在を仮定すると、これらの２成分の分子明度及び完全な濃度を測定するために、光子カウント数ヒストグラムは、カスクＰ．（Ｋａｓｋ Ｐ．）、パロＫ．（Ｐａｌｏ Ｋ．）、Ｕｌｌｍａｎｎ Ｄ． ＆ Ｇａｌｌ Ｋ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６、１３７５６−１３７６１、１９９９； この内容は、本明細書に開示として援用される）による多成分補正によって補正される。結合した、又は結合していないリガンドの濃度は、そのデータから推定される。小嚢へ結合したリガンド量は、濃度において（ｎＭ、結合したリガンド）、又は部分的な（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）結合として（リガンドの合計で割った結合したリガンド）得られる。最大値の半分の置換（一方の結合モデルに対する非線形最小二乗曲線補正ＩＣ_５０）をもたらす濃度から、チェンＹ．（Ｃｈｅｎｇ Ｙ．）及びプルソフＷ． Ｈ． （Ｐｒｕｓｏｆｆ Ｗ． Ｈ．） （Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２２、３０９９ − ３１０８、１９７３）によるＫＩ ＝ ＩＣ_５０／（１ ＋ （ｌｉｇａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ／ Ｋ_Ｄ）の関係を用いて、見かけの（Ａｐｐａｒｅｎｔ）アフィニティー（Ｋ_Ｉ）を算出した。プリズム（Ｐｒｉｓｍ）３．０（グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）、サンディエゴ、米国）を用いて実験データを分析した。
【０１２２】
蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）により、結合において粒子明度の変化が起こる場合の蛍光分子の分子相互作用が研究される。試料中の各蛍光種の分子明度及びそれらのそれぞれの完全な濃度が測定されるので、分子相互作用を説明する定量データが得られる。図２２は、本発明による方法によって観察された蛍光ラベルされた分子のレセプター担持小嚢への結合の概略図を示す。中央の黒い四角によって共焦点体積を表す。Ａ：膜がない場合に、共焦点体積は結合していない蛍光リガンド分子のみを含有する。蛍光リガンドの分子明度は、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の固有の性質であり、分子に結合する。Ｂ：結合していないリガンドに対する典型的な分子明度７ｋＨｚでＡに示された試料の場合に得られた明度分布。Ｃ：小嚢の添加後、リガンド結合が起こり、共焦点体積は小嚢に結合した、及び結合していないリガンドで占められている。Ｄ：Ｃに示す試料の明度分布。非結合リガンドの分子明度は、７ＫＨｚのままである。この場合、小嚢の分子明度は９８ｋＨｚであった（結合していないリガンドの１４倍、小嚢当たり１４のリガンド分子の結合に相当）。これは、レセプター発現値に依存している。典型的には、小嚢当たり１０−５００個のリガンド分子を見つけることができる。注：大きさは測定していない。従って、結合において全ての蛍光が変化しないとしても、結合のモル濃度並びに非結合リガンドのモル濃度は、何ら分離を必要とせずに、単一の測定によって定量的に測定される。
【０１２３】
本発明による方法は、ＴＭＲでラベルされたＥＧＦとそのレセプター、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１）との相互作用を特徴付けるために用いられた。供給源として、ＥＧＦＲを過剰発現する（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）ことが知られているＡ４３１細胞を使用した（Ｍｃクロック（Ｍｃ Ｃｕｌｌｏｃｈ）ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３０、１２６５−１２７８、１９９８）。図２３は、Ａ４３１細胞から調製された膜へのＴＭＲ−ＥＧＦのリガンド結合特性を示す。０．２５−１８ｎＭのリガンド濃度を、全体積４０μｌ中で、最終濃度５０μｇ／ｍｌで未精製の膜画分と共にインキュベートした。室温での２０分のインキュベート期間の後、測定を行い、結合していない、及び結合したリガンド濃度を測定した。ＴＭＲでラベルされたＥＧＦの膜への結合は、飽和され得て、かつ過剰の非ラベル化ＥＧＦによって競合され得る。１μＭのＥＧＦの存在下、非特異的結合を測定した。示した結果は、典型的な実験からのものであり、標準偏差（ＳＤ）を、エラーバーとして示す。測定された解離定数（Ｋ_Ｄ）３．１±０．２ｎＭは、放射性リガンド結合分析におけるコンペティターとして蛍光ラベルされたＥＧＦを使用した初期の報告と一致する（キャラウェイ（Ｃａｒｒａｗａｙ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６、８８９９−８９０６、１９９１）。細胞当たり約６×１０^６の結合部位に相当する６０ｐｍｏｌ／ｍｇの発現値（Ｂ_ｍａｘ）が観察され、これにより、Ａ４３１におけるＥＧＦＲの発現値は、初期の報告によって立証されたように、大幅に上に調整される（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ことが示された。
【０１２４】
本発明による方法が、大幅に低く、より生理学的な発現値を示す生物学的システムにも適用可能であることを示すために、ヒトの結腸癌腫腫瘍（ＨＣＴ）細胞を使用した。図２４は、ＨＣＴ細胞から調製された膜へのＴＭＲ−ＥＧＦ結合を示す。ＨＣＴ細胞から調製された量が増えた未精製膜は、非ラベル化ＥＧＦの存在下及び欠乏下で２ｎＭのＴＭＲ−ＥＧＦと共にインキュベートされた。本発明の方法により、全体の非特異的結合を測定した。リガンド結合は、部分的な結合として表される（リガンドの合計で割ったリガンド結合）。ＨＣＴ細胞から調製した膜は、ＴＭＲ−ＥＧＦに結合し、そこでは、特異的結合は全結合の７０−８０％であった。図２３においてＡ４３１に対して示したように、アフィニティー及び発現の値は、飽和曲線（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）において測定された。Ｋ_Ｄは３ｎＭであった。これは、Ａ４３１細胞中のＥＧＦレセプターのアフィニティーと非常に類似している（図２３参照）。Ｂ_ｍａｘは、４００ｆｍｏｌ／ｍｇの膜蛋白質であった。これは、約１０，０００−２０，０００個の結合部位／細胞に相当し、要するに、Ａ４３１細胞の場合より１００倍より更に低い。この実験は、レセプター過剰発現細胞系だけでなく、それらの自然な環境にあるものと同等のレセプター密度を用いてもＦＩＤＡを使用することができることを示す。
【０１２５】
ＥＧＦレセプターは異なる成長因子（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２、Ｅｒｂ−Ｂ３及びＥｒｂＢ−４； リーゼ（Ｒｉｅｓｅ）ら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２０、４１−４８、１９９８）に結合する関連するレセプターチロシンキナーゼの群の一部であるので、ＴＭＲ−ＥＧＦのＨＣＴ膜との相互作用を、更に特徴付けた。ＥＧＦとの顕著な配列の一致を示す哺乳類ポリペプチド成長因子の数は、近年劇的に増加し、かつベータセルリン及びヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）を含む。図２５は、ＥＧＦレセプターの薬理学的プロファイルを表す。非ラベル化ＥＧＦ、ベータセルリン及びヘパリン結合表皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）は、ＴＭＲ−ＥＧＦ及び示された濃度のコンペティターと共にＨＣＴ膜をインキュベートする競合アッセイによって測定された。本発明による方法によって結合を測定し、コンペティターが存在しない場合のものに標準化した。得られたアフィニティーは、ＥＧＦの場合は０．３５±０．１２ｎＭ、ベータセルリンの場合は０．２３±０．０２ｎＭ及びＨＢ−ＥＧＦの場合は１．４±０．３ｎＭであった。
【０１２６】
更なる系として、β２アドレナリン作用性レセプターを用いた。何故なら、Ｇ蛋白質結合レセプターの大きな群に対する周知のモデルシステムであるからである（コビルカ（Ｋｏｂｉｌｋａ）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５８７−１１４、１９９２）。蛍光ラベルされたＣＧＰ １２１７７、β２アドレナリン作用性レセプター拮抗剤をリガンドとして選択した（ハイザー（Ｈｅｉｔｈｉｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３、９１２６−９１３４、１９９４）。図２６は、ボディピィＦＬ−ＣＧＰ １２１７７のリガンド結合特性を表す。濃度の増加したボディピィＦＬ−ＣＧＰ １２１７７を、ヒトβ２アドレナリン作用性レセプターを発現するＨＥＫ細胞から得られた未精製膜画分と共にインキュベートした。最終的な膜濃度は、全体積４０μｌにおいて１３０μｇ／ｍｌであった。１μＭのプロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）の存在下で非特異的結合を測定し、全結合から引いた。示した結果は、典型的な実験からのものであり、標準偏差（ＳＤ）を、エラーバーとして示す。ボディピィＦＬ−ＣＧＰ １２１７７は、結合部位の外見上（ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ）均質な集合に結合した。リガンドの結合は、単一部位モデルを用いた統計学的な最良の補正であり、平均アフィニティーは０．７ｎＭで、標準フィルター結合分析を用いる場合に得られる結果と同様であり（ハイザー（Ｈｅｉｔｈｉｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３、９１２６ − ９１３４、１９９４）、かつＢ_ｍａｘは４ｐｍｏｌ／ｍｇであった。非ラベル化ＣＧＰ １２１７７との競合実験により、０．８ｎＭのＫ_Ｉが得られ、これは、蛍光ラベルの結合がレセプターに対するアフィニティーに大きく影響しないことを示す。
【０１２７】
図２７は、４０μｌ及び１μｌの分析体積におけるボディピィＦＬ−ＣＧＰ １２１７７結合の阻害を表す。非ラベル化リガンド（ＣＧＰ １２１７７Ａ）を、示した濃度でのコンペティターとして使用した。最大の結合において、結合を１００％に標準化した。４０μｌ及び１μｌの試料体積中で結合分析を行った。１μｌの試料体積を含む実験の場合、専有液体分配単位及び試料キャリアーを用いた（エボテックバイオシステムズＡＧ（ＥＶＯＴＥＣ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ＡＧ））。ＣＧＦ１２１７７の場合に得られたアフィニティーは、分析体積４０μｌ中０．７±０．１ｎＭであり、１μｌ中０．９±０．１であった。この実験により、ＦＩＤＡの特有の感度を強調され、かつ試料体積の、及びそれによる高処理量薬剤スクリーニングのために要求される生物学的材料の大幅な減少の大きな機会が主張される。
【０１２８】
リガンド−レセプター相互作用の研究は、膜レセプター機能の生物学的及び薬理学的特徴化のために重要なツールである。特に、市場の全ての薬剤の約３０−５０％が、ＧＰＣＲに作用すると評価されているので、Ｇ蛋白質結合レセプターは、薬学的薬剤開発プログラムのために非常に重要である（グダーマン（Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７３、５１−６３、１９９５）。伝統的に、レセプター研究の大多数は、放射性ラベル化リガンドを用いて行われ、そこでは、非ラベル化リガンドからの結合は、濾過又は遠心分離のいずれかによって分離される。近年、シンチレーション接近分析（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙｓ）は、レセプター−リガンド結合研究のための広範な使用が見出された。ここで、結合イベントは、シンチラント含有 （ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ビーズ上に固定された膜への放射性リガンドの接近によって検出されるので、分離の必要がなくなる（ハート（Ｈａｒｔ）、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６、２６５−２６７， １９７９）。しかし、これらの方法の欠点は、潜在的に危険な、放射性化合物に曝されている状態、ラベル化リガンドの制限された貯蔵（ｓｈｅｌｆ）半減期、及び試薬のハンドリング及び処分のための特別な要求である。従って、全蛍光の検出（ハイザー（Ｈｅｉｔｈｉｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３、９１２６−９１３４、１９９４； イングレーゼ（Ｉｎｇｌｅｓｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、２３７２ − ２３７７、１９９８）、蛍光消光／スペクトルシフト（タイリ（Ｔａｉｒｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、１５８５０−１５８６４、１９９８）、蛍光偏光（タイリ（Ｔａｉｒｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、１５８５０−１５８６４、１９９８）又はレーザー走査イメージ化（ズック（Ｚｕｃｋ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１１１２２−１１２７、１９９９）の使用に基づく、いくつかの蛍光系検出法が、近年のレセプター−リガンド研究に適用されている。
【０１２９】
本発明による方法に基づき、リガンドのそれらの同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）レセプターとの相互作用を定量的に特徴付けるために、蛍光強度分布分析を用いることができる。ＦＩＤＡは、単一分子感度（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）によって相互作用の研究を可能にするので、上記の方法に大きな利点をもたらす。モデルシステムとしてＥＧＦ及びβ２アドレナリン作用性レセプターを使用すると、上記の例において、アフィニティー及びレセプター発現値を単純な方法で定量できることが示された。それらの結果は、ＦＩＤＡを用いて得られた薬理学的プロファイルは、古典的な放射性リガンド結合分析によって得られたものと一致することを示す。レセプターの低い値を示す細胞を用いてリガンド−レセプター相互作用を研究するためにも、ＦＩＤＡを用いることができることも示された。これは、ＧＰＣＲ類のために特に重要である。なぜなら、それらは典型的に初期細胞中で低密度で見られ、かつ機能的レセプターの過剰発現を達成することがしばしば困難だからである。ＦＩＤＡは、多数の蛍光分子の小嚢への結合における粒子明度の増加を定量することができるので、蛍光消光又はスペクトルシフトのような蛍光パラメーターの変化が起こることは必要ではなく、このアプローチの幅広い適用を可能にする。ＦＩＤＡでは、結合していない、及び結合したリガンドの両者のモル濃度は、１つの測定において測定され、それにより、各試料中で全リガンドがどの程度多く存在するかに応じて内部制御をもたらす。共焦点装置を用いるＦＩＤＡの大きな利点は、検出の体積がほぼ細菌細胞の大きさで、小さいことである。分析体積の小型化は、現代の薬学的薬剤スクリーニングにおいて重要な戦略である。なぜなら、化学的化合物の増加数は、生物学的ターゲット、生物学的試薬の消費、及び化学的又は天然の化合物の数の増加数に対してスクリーニングしなければならないので、主な問題となるからである。従って、シグナル−ノイズ比を弱めることなく、現在の液体のハンドリングの限界である１μｌに試料体積を減少させることができ、それにより特有の感度を示すので、本発明に基づくＦＩＤＡ及び関連する好ましい共焦点法は、これらの目的に理想的に適合する。
【０１３０】
我々の研究室において、ＦＩＤＡは、いくつかの異なるタイプのＧ蛋白質結合レセプターの研究に良好に適用された。これらは、ケモキン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）レセプター、ドーパミンレセプター及びいくつかのペプチドレセプターを含む。これらの分析システムは、小さなラベル化分子（作用薬又はこの研究において記載したような拮抗剤）、ペプチド及び蛋白質（データは示さず）の使用を含む。また、その技術は、１μｌフォーマット（ｆｏｒｍａｔ）中の生存細胞への分子の結合の測定に良好に適用することができる。これは、高処理量スクリーニングにおける初期組織の直接的な使用のエキサイティングな機会を開く。要するに、ＦＩＤＡは、リガンド−レセプター研究のために理想的な方法である；それは、放射性同位体の使用及び分離段階を回避し、幅広く適用可能であり、かつ試薬の消費を大幅に減少させるので、研究、高処理量スクリーニングに対し、及び薬理的プロファイリングに対し、大きな利点をもたらす。
【０１３１】
図 ２８−３０
更なる例は、様々な幅のカウント時間間隔で同時に記録した一組の光子カウント数ヒストグラムの全体的な分析に基づく。図２０に記載の方法により、カウント時間間隔を測定することができる。この蛍光強度多分散分析（ＦＩＭＤＡ）は、比分子明度及び並進拡散時間の両者に基づき、蛍光種を区別する。単一の測定から得られた、組み合わされた情報は、１つの次元により読み出しを効果的に増加させ、それによりＦＣＳ及びＦＩＤＡの個々の限界を打ち破る。その方法は、生命科学にいずれも大きく関連する、レセプター及びリガンド又は抗体及び抗原を含む分子相互作用を観察するために幅広く適用することができる。
【０１３２】
以下に、我々の実験の目的に適当な推定である、ＦＩＤＡ理論の修正を示す。ＦＩＤＡでは、光子カウント数分布Ｐ（ｎ）の便宜的な表現は、
【数７２】

と規定される、その生成関数である。
【０１３３】
ＦＩＤＡ理論は、（ｉ）カウント時間間隔中、分子は動かない、及び（ｉｉ）分子からの光束は、空間明度関数Ｂ（ｒ）（これは、装置を特徴付ける分子の空間座標の関数である）と（ある分子種を特徴付ける）比明度ｑとの積として表すことができる。これらの２つの仮定の下、体積成分ｄＶから分子によって放射された光子カウント数の分布は、ダブルポアソニアンであり、対応する生成関数は、
【数７３】

を読み取る。ここで、ζは生成関数の複合独立変数（ｃｏｍｐｌｅｘ ａｒｇｕｍｅｎｔ）であり、ｃは分子の濃度であり、Ｔはカウント時間間隔の幅である。例えば、異なる体積成分又は種のような、独立した原因からの寄与が、寄与する生成関数の掛け合わせ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）によって組み合わされるので、この表現は都合がよい。単一種に対する生成関数Ｐ（ｎ）は、
【数７４】

であり、一方、多数の種に対する計算により、簡単に
【数７５】

が得られる。
【０１３４】
式４４の右辺の積分は、数学的に計算されるが、空間座標上の三次元積分の代わりに、一次元積分座標χ＝ｌｎ［Ｂ_０／Ｂ（ｒ）］が導入される。従って、明度Ｂと座標χとの関係は、Ｂ（χ）＝Ｂ_０ｅ⁻χである。ＦＩＤＡでは、式
【数７６】

によって、一次元的な表現で明度プロファイルを説明する関数ｄＶ／ｄχを表すのに適していることが見出された。
ここで、ａ_１及びａ_２は、測定されたヒストグラムの補正に高精度で十分な柔軟性を与える経験上の調整パラメーターである。係数Ａ_０及びＢ_０の選択は、Ｖ及びＢの単位の選択にほかならない。通常、それらは
【数７７】

【数７８】

の条件から測定される。
【０１３５】
今まで、ＦＩＤＡ理論の簡単なバージョンを説明した。ＦＩＭＤＡの目的のためには、カウント間隔中分子が動かないという仮定をやめなければならない。驚くべきことに、式４２並びに以下の等式は捨て去られないであろうが、いくつかの変数の意味は変わるであろう。χは、やはり空間明度プロファイルに関する関数であるが、ここでは、その位置よりもむしろ分子の経路を特徴付ける。Ｂは、分子の固定された位置において測定されるよりもむしろ経路に亘って平均化された空間明度である。Ｖは、空間中の体積ではないが、ｄＶ／ｄχは、やはり分子が所定のχの値を有する確率を表す。ｃ及びｑが本来の意味のままである場合、Ａ_０、ａ_１及びａ_２がカウント時間間隔Ｔにどの程度依存するかを予想する理論が展開されなければならないであろう。しかし、別のアプローチが選択された。標準化条件はそのままであった（式４６及び４７）。一組の異なる時間窓に対し、Ａ_０、ａ_１及びａ_２の値の一つの選択を適用することさえも可能である。この選択の結論は、式４２−４４においてｃが見掛けの濃度（ｃ_ａｐｐ）であり、ｑが見掛けの明度（ｑ_ａｐｐ）であり、いずれもカウント時間間隔Ｔに依存するということである。
【０１３６】
以下に、ｃ_ａｐｐ及びｑ_ａｐｐがどの程度Ｔに依存するかを予想する理論を示す。単一種の場合を研究し、式４３に対応する分布の第一及び第二階乗キュムラントを計算する。階乗キュムラントは、
【数７９】

と定義され、
【数８０】

【数８１】

が得られる。ここで、式４６及び４７によって得られる標準化条件を用いた（注、式４９及び５０は、仮定ｉ及びｉｉ）の下で得られたキアン（Ｑｉａｎ）及びエルソン（Ｅｌｓｏｎ）の式（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５７：３７５−３８０，１９９０）と完全に一致する）。式４９から、
【数８２】

と結論付けることができる。ここで、〈Ｉ〉≡〈ｎ〉_Ｔ／Ｔは、Ｔの選択には依存しない平均カウント率である。我々は、カウント数分布Ｐ（ｎ；Ｔ）の第二キュムラントと蛍光強度の自己相関関数Ｇ（ｔ）＝〈Ｉ（０）Ｉ（ｔ）〉−〈Ｉ〉^２との間の以下の関係
【数８３】

を用い続けるであろう。
【０１３７】
【数８４】

という表記を導入し、式５２及び５０から
【数８５】

が導かれる。
【０１３８】
式５１及び５４から、
【数８６】

【数８７】

を得る。
【０１３９】
最後の段階として、ＦＣＳからのＧ（ｔ）の式を式４３に代入した。ガウスの明度関数を適用し、かつ三重項トラッピング（ｔｒｉｐｌｅｔ ｔｒａｐｐｉｎｇ）を無視すると（アラゴン（Ａｒａｇｏｎ）及びペコラ（Ｐｅｃｏｒａ）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．６４：１７９１−１８０３、１９７６）、
【数８８】

放射方向の場合をσ_ｒ及び縦方向の場合をσ_ｚと表す。ここで、ガウスのプロファイルはｅ^１／２倍減少した。式５３の積分から
【数８９】

が得られる。ここで、ｔ＝ＤＴσ_ｒ ^２／及びβ＝σ_ｒ ^２／σ_ｚ ^２である。下記に説明した理由により、式５８において最初のオーダーの項を計算することが有用である：
【数９０】

【０１４０】
しかし、理論的な考察並びに測定から、ガウス又は他のガウス−ローレンツのような簡単な物理的モデルは、実際の明度プロファイルを正確に表さないことがわかる（カスク（Ｋａｓｋ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１３７４６−１３７６１、１９９９）。従って、式５９を修正し、補正パラメーターａを導入した。これは、式５９の最初のオーダーの項を保っている：
【数９１】

【０１４１】
ガウスの明度プロファイルは、２番目のオーダーの項を適合させることにより、ａ＝２／３と一致するであろう。しかし、むしろａは、経験上のパラメーターに選ばれ、補正法（ｆｉｔｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって決定される。
【０１４２】
関連する別の現象は、三重項励起状態への分子のトラッピングによる強度変動のものである（ウィーデングレン（Ｗｉｄｅｎｇｒｅｎ）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ，９９：１３３６８−１３３７９、１９９５）。特に三重項寿命（典型的には２μ秒）と比較可能なＴの値において、良好な補正を得るために、Ｇ（ｔ）に更なる因子を導入する：
【数９２】

ここで、κは一重項から三重項への遷移率であり、τは三重項の寿命である。式５１により、
【数９３】

が得られる。
【０１４３】
光子カウント数の大きい方のキュムラントのみに影響する拡散と異なり、三重項補正もまた、１番目のキュムラントが１／（１＋κτ）倍シフトする。
【数９４】

【数９５】

【０１４４】
ｃ_ａｐｐ及びｑ_ａｐｐ（三重項因子を含む）の場合のこれらの式を導いた後、データシミュレーション及び実験は、それらの妥当性を立証すべきである。
【０１４５】
以下の実験プロトコルを用いた。
実験装置．ＦＩＭＤＡの中央の光学部は、蛍光相関分光法で用いられるような共焦点顕微鏡である（コッペル（Ｋｏｐｐｅｌ）ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１６：１３１５−１３２９、１９７６；リグラー（Ｒｉｇｌｅｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２２：１６９−１７５、１９９３ａ）。蛍光の励起のために、連続波レーザーからのビームを、帯電していない密度フィルターによって８００μＷまで減じさせ、ビーム伸張器に通し、そして二色鏡によって顕微鏡の対物レンズに向ける。二色鏡、スペクトルバンドパスフィルターを通して同じ対物レンズによって蛍光を集め、焦点を外れた光を遮断するために働く共焦点ピンホールに焦点を合わせる。ピンホールを通る光を、ケイ素光子カウントモジュール（ＳＰＣＭ−ＡＱ−１３１、ＥＧ＆Ｇオプトエレクトロニクス（ＥＧ＆Ｇ Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）、ボードロイル（Ｖａｕｄｒｅｕｉｌ）、カナダ）によって検出する。コンピューター差込式カードとしてエボテック（ＥＶＯＴＥＣ）において作成された電子カウンターは、検出器からのＴＴＬパルスを連続的に集め、３２ＭＢオンボードバッファーから、予め選択された幅の時間窓全てに対するカウント数ヒストグラムをリアルタイムで計算する（４０、６０、１２０、２００、４００、６００、８００、１２００、１６００、２０００μ秒）。検出器の出力を相関計へ送り込むことにより、ＦＩＭＤＡ実験と並行してＦＣＳ測定を行うことができる。
【０１４６】
この研究において用いられる様々なフルオロフォアのスペクトルの必要性を満足するために、異なるレーザー及びスペクトルバンドパスフィルターを用いた。生体分子に結合したＣｙ５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、バックス（Ｂｕｃｋｓ）、英国）に対し、赤色レーザーダイオード（クリスタル社（Ｃｒｙｓｔａｌ ＧｍｂＨ）、ベルリン、ドイツ；６３５ｎｍ）及び中央の波長が６７０ｎｍであるバンドパスフィルター（６７０ＤＦ４０、オメガオプティカル（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ）、ブラットレボロ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ）、ＶＩ）の配列を用いた。ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）にラベルされた分子の場合、これは、周波数を２倍にしたＮｄ−ＹＡＧレーザー（μグリーン４６０１；ユニフェーズ（Ｕｎｉｐｈｓｅ）、サンジョゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）、ＣＡ；５３２ｎｍ）及び５９０ＤＦ６０フィルターの配列である。
【０１４７】
元のレーザービームの適当な拡大倍率（ｆａｃｔｏｒ）を選択することにより、共焦点ビーム半径を０．７５μｍまで調整した結果、結合していない色素Ｃｙ５に対し、平均並進拡散時間は３６０μ秒であった。時間窓を４０μｓから２ｍｓに増やすと、この拡散をはっきり観察することができる。図２８で見ることができるように、０．８ｎＭのＣｙ５溶液の選択されたカウント数ヒストグラムは著しく異なっている。しかし、分布の形の間の主な違いは、カウント時間間隔の長さによって平均カウント数が変化することによるものである。蛍光分子の拡散は、小さいだけであるが、依然として顕著な各分布の形の変化を引き起こす。
【０１４８】
バックグラウンドカウント率の値は、２回蒸留された（ｂｉｄｉｓｔｉｌｌｅｄ）水における別々の実験において一般に測定され、通常０．５ｋＨｚになる。バックグラウンド光強度がこのように変化しないことの主な要因は、水からのラマン拡散である。
【０１４９】
データシミュレーション．慎重に選択されたパラメーター（明度値及び拡散係数）を表す分子の混合物を含む実際の試料を調製する代わりに、シミュレーションされたデータを用いて、新しい方法のいくつかの評価を行った。ＦＩＭＤＡ、ＦＩＤＡ及びＦＣＳに対する相関関数に対するいくつかのヒストグラム組を、以下のアルゴリズムに従ってシミュレーションした。閉じた長方形の容器中で、所定の数の分子を、大きな（典型的には３６０×３６０×７２０）分離した空間グリッド点上に最初に任意に分布させる。各分子は、必然的な（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ）拡散シミュレーションに付され、そして所定の拡散係数に相当する周波数で、ｘ−、ｙ−又はｚ−方向のいずれかで１つのグリッド単位によって任意にジャンプする。“焦点”は、容器の中央に配置され、かつ明度分布は三次元全てにおいてガウシアン（Ｇａｕｓｓｉａｎ）であると推定される。所定の時間間隔組に亘って分子から明度の積分を計算する場合、分子は任意に捕集され、並びに三重項励起状態（暗い部分）から放出される。ここで、混合物の進化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を説明する、所定幅の基本的な時間間隔（例えば５μｓ）に亘る明度の積分の配列（ａｒｒａｙ）を計算することができる。その後、明度の積分は光子カウント数に変換され、次いでＦＩＭＤＡ、ＦＩＤＡ並びにＦＣＳに対する相関関数に対するヒストグラムの計算に用いられた。
【０１５０】
シミュレーション容器の限定された大きさにより、相関関数のいくつかのひずみ（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｓ）（即ち、式５７からの偏差）を予想することができる。ひずみは、統計学的なノイズ値より実際は低い。従って、シミュレーションは、得られたパラメーターの統計学的なエラーを評価するのに適当なツールであると考えられた。この目的のために、所定の分子パラメーター組による実験の３０個の実施を典型的にシミュレーションし、それから標準偏差及び標準偏差の平均値に対する比として変動係数（ＣＶ）を算出した。
【０１５１】
生物学的システム． Ｔｈｅ Ｇｒｂ２ （ＳＨ２）−ホスホペプチド（ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）相互作用．最近の抗腫瘍研究は、チロシンキナーゼ成長因子レセプターに集中している（レビツキ（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２６：１−１３、１９９４； アレサンドロ（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ） ら、Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１３：１６７−１８８， １９９６； フレット（Ｆｕｒｅｔ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４１：３４４２−３４４９、１９９８）。このレセプターのシグナル変換経路における重大な関連は、そのホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基（ｐＴｙｒ）のアダプター蛋白質Ｇｒｂ２（成長因子レセプター結合蛋白質２）のＳｒｃ−相同２（ＳＨ２）ドメインとの相互作用である。認識のために、レセプターの最小のペプチド配列（ｐＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ）は十分である（ミュラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１６５００−１６５０５、１９９６； Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４６：６３３−６３７， １９９７； フレット（Ｆｕｒｅｔ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４１：３４４２−３４４９、１９９８）。このペプチドモーティブ（ｍｏｔｉｖｅ）の結合パートナー、Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインは、近傍の配列から独立した機能的蛋白質モジュールに折り重なることができる（ブッカー（Ｂｏｏｋｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５８：６８４−６８７， １９９２； オベルドイン（Ｏｖｅｒｄｕｉｎ）ら、Ｃｅｌｌ ７０：６９７−７０４、１９９２）。従って、我々は、モデルシステムとして、蛍光ラベルされたホスホペプチド（ｐＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５）） （１３８７ Ｄａ）と相互作用させるため、担持された（ｂａｒｅ）ＳＨ２ドメイン（１４．３ｋＤａ）を選択した。
【０１５２】
Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインは、他に記載されているように調製した（ローエンスタイン（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｃｅｌｌ ７０：４３１−４４２、１９９２； バウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：１７９９−１８０７、１９９４； ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１６５００−１６５０５、１９９６）。マニュアルＦｍｏｃ固相化学（ｍａｎｕａｌ Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｃｈｅｍｉｄｔｒｙ）を用いてホスホペプチドを合成し、リシン残基によってＣｙ５−ＮＨＳを用いてラベルした。主な認識モーティブｐＴｙｒとの色素の可能な相互作用を最小化するために、追加のバリンを導入した。最終化合物、ｐＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５）は、質量スペクトル計（ＬＣ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）、ＵＶ／ＶＩＳ、及び蛍光分光法によって特徴付けられた。
【０１５３】
以下の結果が得られた。
データシミュレーション及びテスト実験． 最初に、１ｎＭのＴＡＭＲＡ溶液において一連の測定を行い、ＦＩＭＤＡ並びにＦＣＳと並行してデータを収集した。この一連の実験は、それぞれ２秒続き、類似の分子パラメーターを用いてシミュレーションにおいて繰り返された。これらの実験の目的は、シミュレーションは実際の実験の合理的なモデルであるか、特に、データシミュレーションが評価されるパラメーターの統計学的なエラーを予想する合理的な手段であるかを立証することである。シミュレーションされたデータから得られたパラメーターの変動係数は、表７において見ることができるように、実際の実験の結果と確かに一致する。
【０１５４】
【表７】

【０１５５】
ＦＩＭＤＡとＦＣＳの能力を比較することを目的として、極めて短い時間範囲で別の一連のテスト実験を繰り返し、三重項成分のパラメーターを評価した。この目的のために、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、及び１０２４μｓの一連のカウント時間間隔を選択した。これらの実験を１６秒継続した。表８に示した結果は、ＦＩＭＤＡによって評価された三重項パラメーターに対する値は、ＦＣＳの結果と同様に励起強度に依存することを示す。
【０１５６】
【表８】

【０１５７】
短い方の時間窓（２μｓ）は三重項寿命と等しいので、ＦＩＭＤＡにおける三重項パラメーターの評価は、間接的であるため、ＦＩＭＤＡの結果は、わずかに片寄っており、ＦＣＳと比べて高いＣＶ値を有する。しかし、モデルにおける三重項の補正の主な目的は、三重項パラメーターを測定することではなく、補正の質を向上させ、かつ明度及び拡散パラメーターにおけるゆがみ（ｂｉａｓ）の原因を取り除くことである。
【０１５８】
三成分分析の場合のＦＩＭＤＡに対するヒストグラムもシミュレーションした。２つの成分は同じ明度値（１２０ｋＨｚ）を有しており、別の一対は同じ拡散時間（１９２μｓ）を有していた。多数のフリーのパラメーターにより、実験のシミュレーションの継続時間は６０秒に増加したので、補正されたパラメーターの変動には、合理的な限界があった。この実験では、全てのパラメーターが補正された。ｘ−ｙ座標として明度及び拡散時間を取り、強度の寄与を表す縦座標を取った面内の垂直なバーとして、即ち、濃度と明度との積として、図２９に結果を示す。異なる成分に対応する個々のバーの位置のばらつきは、グループ間の距離よりもはるかに小さいので、３成分ははっきり区別される。注、ＦＩＤＡのみでは、同じ明度を有する成分は区別できず、一方ＦＣＳのみでは、同じ拡散時間を有する成分は区別されないままである。
【０１５９】
生物学的システム．新しい方法の実験的利用は、前述で導入されたＧｒｂ２（ＳＨ２）−ホスホペプチド相互作用の結合定数の測定によってここで示されるであろう。この目的のために、ｐＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５）濃度を０．４ｎＭで一定に保って滴定実験を行い、同時にＳＨ２を滴定に付した（０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、 ３、１０、３０、１００、及び１３０ μＭ）。全ての実験は、同一条件下で、即ち、同じバッファー（滅菌濾過された水、５０ｍＭのリン酸Ｎａバッファー ｐＨ ７．８、５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；Ｔ＝２０℃）、及び測定当たり３０秒のデータ獲得時間で行われ、試料当たり３０回繰り返された。それぞれの単一の測定において、同じ一組の１０個の異なる時間窓を用いた（４０、６０、１２０、２００、４００、６００、８００、１２００、１６００、２０００μｓ）。その結果、全体的に補正された１０個の異なる光子カウント数ヒストグラムが得られた。
【０１６０】
最初の段階として、純粋な結合体溶液に適用された単一成分分析から、拡散時間τ_１＝４０７±６μｓ及び分子明度ｑ_１＝３１．７±０．３ｋＨｚが測定された。余分のＳＨ２（１３０μＭ）を０．４ｎＭの結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に添加した結果、ＳＨ２に結合した多数の結合体を含む試料が得られた。複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）は、フリーの結合体と比べて長い拡散時間及び高い分子明度の両方を特徴としていた。方法により補正されたτ_１及び／又はｑ_１を含む２成分補正を用いて、この混合物を３つの方法全て（ＦＩＭＤＡ、ＦＩＤＡ及びＦＣＳ）によってその後分析した。分析のこの段階の結果を表９に示す。全ての方法によって類似のパラメーターの値が得られることが示され得る。２つの独立した方法によって、即ち、一連の３０回の測定の結果の統計学的分析から、及びシミュレーションから、対応するＣＶ値を再度測定した。成分の明度値の違いが小さい（３０％）ことによる困難性を有するＦＩＤＡを除き、統計学的エラーの２つの評価は合理的に良好に一致しており、異なる方法に対応するＣＶ値は類似している。その他の成分がこの試料中の大部分を占めているので、混合物の評価された濃度の相対エラーは高い。
【０１６１】
【表９】

【０１６２】
研究の次の段階として、３μＭのＳＨ２を含む試料を分析した。複合体とフリーの結合体とのほぼ同じ割合での混合物を得るために、この特定の濃度を選択した。拡散係数の２倍の違いのみによって、及び比明度のより小さな違いによっても、成分を区別することはかなり困難であるので、ここでは複合体の拡散時間及び明度を表９の値に補正した。補正した分子パラメーターによって、全ての方法によって濃度を高い信頼性をもって区別した。分析のこの段階の結果を表１０にまとめる。
【０１６３】
【表１０】

【０１６４】
同様の方法で、一連のＳＨ２濃度全部を補正した。図３０は、ＦＩＭＤＡの場合に算出された部分結合（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｂｏｕｎｄ） （ｃ複合体／（ｃ複合体＋ｃ結合体）を実線で表す。双曲線補正（ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ ｆｉｔ）の結果、ＳＨ２−ホスホペプチド相互作用に対する結合定数Ｋ_Ｄ＝１．６８±０．２７μＭが得られた。ＦＣＳ及びＦＩＤＡによって、比較可能な結合曲線も得られ（データは示さず）、Ｋ_Ｄ値はそれぞれ２．２６±０．２８μＭ及び１．７０±０．２９μＭであった。
【０１６５】
図３０のデータは、ＦＩＭＤＡが分子複合体の形成の観察に適した方法であることを示す。ＦＣＳ及びＦＩＤＡ実験により、この特定のＳＨ２−ホスホペプチド相互作用に対して同様のＫ_Ｄが得られた。文献には、アフィニティーがペプチド配列により著しく変化すると報告されている（ミュラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１６５００−１６５０５、１９９６； グラム（Ｇｒａｍ）ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４６：６３３−６３７、１９９７； フレット（Ｆｕｒｅｔ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４１：３４４２−３４４９、１９９８）。高アフィニティーは、Ｋ_Ｄ＝１０−１００ｎＭの範囲である。しかし、ホスホペプチドの＋４位（ｐＴｈｒを０位とし、“＋”はＣ末端上で、及び“−”はＮ末端上で続いている）のリシン（及びそれに結合したＣｙ５）により、アフィニティーはマイクロモルの範囲に低下する。この結果は、ＳＨ２−ドメインへの結合定数を増加させる、Ｃ末端上の‘適当な’位置に結合した親油基の重要性と良好に一致する（フレット（Ｆｕｒｅｔ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４１：３４４２−３４４９、１９９８）。例えば、 （ｐＴｙｒ＋３位の）Ｖａｌは、ＳＨ２−ドメインにおいて大きな疎水性範囲とファンデルワールス結合（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ ｃｏｎｔａｃｔ）を作っている。
【０１６６】
この研究の驚くべき結果の一つは、各実験において、ＦＩＭＤＡによって評価された拡散時間の統計学的な精度は、ＦＣＳによって評価されたものと同様に良好であり、又は更に良好であることである。これは、反直感的な（ｃｏｕｎｔｅｒ ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ）結果である。なぜなら、ＦＣＳは拡散依存性相関関数Ｇ（ｔ）の補正に直接向けられるのに対し、ＦＩＭＤＡでは拡散時間は間接的にのみ評価されるためであり、即ち、時間窓の幅における見掛けの明度の依存性によるものであるからである。
【０１６７】
この点での更なる観察は、拡散時間に対するＣＶ値は明度値に対するものより一般に高いことである。これは、理論上のシミュレーションにも当てはまるので、測定原理に基づく効果をもたらす。この現象は、これらの量を測定する異なる方法によって定量的に説明することができる。簡略化のため、内部の一定の明度プロファイルＢ（ｒ）によって観察体積を推測することができる。この場合は、その比明度を測定するために、体積に入る分子の平均カウント率を測定することのみを要する。これは、所定時間間隔当たり多くの光子の検出を必要とするが、原則として単一の過程（ｐａｓｓａｇｅ）から達成することができる。一方、拡散時間を評価するためには、各時間で多数の光子が検出され得るとしても、多数のイベントを平均化することを必然的に要求する、拡散が行われる過程の平均経過時間を決定しなければならない。従って、補正された経過時間の実験において、分子の比明度は、原則としてその拡散時間よりも高い精度をもって測定され得る。
【０１６８】
従来技術のＦＣＳに対するＦＩＭＤＡ及びＦＩＤＡの利点は、いずれの方法でも、ＦＣＳにおいて二乗される（ｓｑｕａｒｅｄ）濃度と明度との積の代わりに、試料中の成分の真の（ｇｅｎｕｉｎｅ）濃度が得られる。上記の例で行われたように、少なくとも１つの２分子明度値の独立した測定のみが、ＦＣＳにおいて２つの成分を明確に区別することを可能にする。しかし、ＦＣＳの未熟な使用者は、２つの成分が区別されると、同じ分子明度であると、しばしば黙って（ｓｉｌｅｎｔｌｙ）考える。この仮定は、大きく偏った結果を引き起こし得る。本発明によれば、ＦＩＤＡ及びＦＩＭＤＡは、この問題を分析の焦点とする。
【０１６９】
示した態様の他の利点は、その万能性（ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）である。ＦＣＳ及びＦＩＤＡが生化学的反応において特定の読み出しを検出できないとしても、ＦＩＭＤＡは達成可能であろう。生化学的反応は、２成分の結合に必ずしも限定されないが、何らかの目的の化学反応であり得る。単一の測定において２つの物性を記録するために一つの検出器のみを用いることにより、ＦＩＤＭＡは貴重な分析進行時間を短縮する、極めて効率的な方法となる。
【０１７０】
図 ３１−３３
更なる実験において、本発明による方法を、ハイブリドーマ細胞表面上に直接位置するモノクローナル抗体の迅速かつ定量的なスクリーニングに適用した。臨床的診断において、かつ治療薬としてのモノクローナル抗体の拡大している市場は、抗原特異的ハイブリドーマの検出及び単離のための、より迅速で、かつより定量的な方法の必要性を生じさせている。現在は、ハイブリドーマ細胞融合（ｆｕｓｉｏｎｓ）の効率的なスクリーニングは、分泌されたモノクローナル抗体の特異性及びアフィニティーが時間及び労働集約的な方法において測定されるという事実によって制限される。
【０１７１】
共焦点蛍光に基づくアプローチを以下に説明する。ここでは、これらのパラメーターは、培養培地中にまだ放出されていないが生成ハイブリドーマ細胞の表面と未だに物理的に結合している抗体分子の均質な結合分析において測定される。この直接的な細胞結合分析を蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）と組合せると、テオフィリン−及びβ−アミロイド特異的モノクローナルＫ抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）は、対応するハイブリドーマ細胞の表面において直接測定することができた。この感度が高い共焦点スクリーニングアプローチは、異種のハイブリドーマ細胞の集合の間で抗原特異的クローンの単離を促進するための強力な技術をもたらす。
【０１７２】
ハイブリドーマ細胞系を生成する一般的な技術が良好に確立されているが、所定の抗原に対する合理的なアフィニティーを有する単一特異性クローンのスクリーニング及び選択に関する多くの時間と努力がやはり存在する。マウスの免疫法及びスプレノサイト（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）及びネズミ（ｍｕｒｉｎ）骨髄腫細胞系の融合に続く、主な制限段階は、殆ど機能しないハイブリドーマ細胞の異種の集団の間の個々のハイブリドーマクローンの検出及び単離である。一般に、目的の抗体を生成する細胞は、単一クローン性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を確保するために、柔らかい寒天中で、又はマルチウェルプレートにおける限定的な希釈によってクローン化される。ハイブリドーマクローンの培養液の上清は、その後、所望の抗体の存在に関して、酵素関連免疫吸着剤分析（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ）（ＥＬＩＳＡｓ）によって特徴付けられる。これらの確立された抗体生成方法を用いると、大きな細胞集団の効果的なスクリーニングは、２つの主要な方法に制限される。まず、適用された異種検出分析は、非常に長い多段階工程であり、生成された抗体のアフィニティー（Ｋ_Ｄ）の正確なデータを与えない。第二に、これらの分析は、かなり感度が低く、かつ単一のハイブリドーマ細胞によって生成することができない培養液上清中で、抗体分子の濃度が相対的に高いことを要する。従って、抗原特異的ハイブリドーマクローンの検出及び単離のためには、融合された細胞系の多くの時間を要する培養が必要であり、スクリーニングは数百個のクローンに制限される。
【０１７３】
代わりの戦略が説明された。ここでは、通常の蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）（ＦＡＣＳ）技術が、表面Ｉｇ発現（ｓｕｒｆａｃｅ Ｉｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に基づくハイブリドーマ細胞の選択的なクローニングのための手段として適用された。免疫グロブリンの量は、蛍光標識化抗原を用いて、ハイブリドーマ表面上で直接測定されるか（マーダーＰ．（Ｍａｒｄｅｒ Ｐ．）ら、サイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ） １１：４９８−５０５、１９９０； メイルホックＥ． （Ｍｅｉｌｈｏｃ Ｅ．）ら、Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１：１６７−１７４、１９８９）、又は分泌された抗体が人為的に細胞に拘束された（ａｒｒｅｓｔｅｄ） （マンツＲ．（Ｍａｎｚ Ｒ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２：１９２１−１９２５、１９９４； ウエーバーＪ． Ｃ． （Ｗｅａｖｅｒ Ｊ． Ｃ． ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：５８３−５８５、１９９７）。いくつかの研究において、細胞結合Ｉｇは、モノクローナル抗体を細胞培養培地内に分泌するハイブリドーマの能力と相関し得た（センＳ．（Ｓｅｎ Ｓ．）ら、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １２：５７１−５７６、１９９０）。主な障害（ｄｒａｗ−ｂａｃｋ）としては、これらのアプローチは、生成されたモノクローナル抗体の結合アフィニティーに関する情報を何ら与えない異種の分析を使用していた。
【０１７４】
本発明によれば、均質な免疫アッセイに基づく直接的な戦略が示される。ここでは、ハイブリドーマ細胞表面上に直接位置する蛍光ラベルされた抗原のそれらの相補的モノクローナル抗体との相互作用を観察するために、共焦点蛍光顕微鏡を適用した。大容量の培養培地内に分泌される可溶性抗体分子と比較する場合、表面に拘束された（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｒｒｅｓｔｅｄ）抗体画分は、更に短い時間内にハイブリドーマ細胞上ではるかに高い局所的濃度をもたらす。単一の分子及び粒子のように、異なる蛍光種の濃度及び明度の値を同時に測定することができる。ハイブリドーマ細胞表面上に表れた蛍光ラベルされた抗原と抗体との結合において、複合体の明度は結合した抗原数と共に増加する。その後、複合体はフリーの抗原によって正確に区別することができ、かつフリーの、及び結合した分子の濃度を定量的に測定することができる。モデルハイブリドーマ細胞系、小さなハプテン（ｈａｐｔｅｎ）であるテオフィリンに向けられた生成モノクローナル抗体に対し、表面に結合した抗体のＫ_Ｄ−値を測定した。並行して行われる蛍光相関分光（ＦＣＳ）測定によって、蛋白質Ｇアフィニティークロマトグラフィーによって精製された、対応する抗体の比較可能なＫ_Ｄ−値を測定した。
【０１７５】
材料及び方法．テオフィリン特異的モノクローナル抗体のその同種の抗原テオフィリン（１，３−ジメチルキサンチン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ））との結合反応を測定するために、共焦点蛍光顕微鏡（例えば、市販の蛍光相関分光計コンフォコール（Ｃｏｎｆｏｃｏｒ）、ツァイス・アンド・エボテック（Ｚｅｉｓｓ ａｎｄ ＥＶＯＴＥＣ、ドイツ）並びに蛍光相関分光法（ＦＣＳ）及び蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）検出技術を使用した。
【０１７６】
ハイブリドーマ細胞系：記載した実験に使用したハイブリドーマ細胞系は、テオフィリンに特異的に結合するモノクローナル抗体を安定的に生成することが示された（ＡＴＣＣ登録番号：ＨＢ−８１５２）。
【０１７７】
テオフィリン−ＴＡＭＲＡ結合体の合成：テオフィリンとテトラメチルローダミン誘導体（ＴＡＭＲＡ）の共有結合は、以下のプロトコルを用いることによって固相上で行われた：標準ＰｙＢＯＰ活性化（ｓｔａｎｄａｒｄ ＰｙＢＯＰ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ） （２６ｍｇのベンゾトリアゾール−１−ｙｌ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、５．５μｌのＮ−メチルモルフォリンを含む２５０μｌのジメチルホルムアミド）を用いて、１１．０ｍｇのＮ−α−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−γ −（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ジアミノ酪酸（Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）を、１０ｍｇの４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂 （導入： ０．５ｍｍｏｌ／ｇ）と結合させた。Ｆｍｏｃ基の切断後（２５０μｌの２０％ピペリジン含有ジメチルホルムアミド、２０分間）、ＰｙＢＯＰ活性化（２６ｍｇのベンゾトリアゾール−１−ｙｌ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、５．５μｌのＮ−メチルモルフォリンを含む１２５μｌのジメチルホルムアミド／１２５μｌのＮ−メチルピロリドン）を用いることにより、６．７ｍｇの８−（３−カルボキシプロピル）−テオフィリンを、樹脂結合ジアミノ酪酸と結合させた。３００μｌの５０％のトリフルオロ酢酸含有ジクロロメタンによって１５分間２回処理した結果、Ｂｏｃが切断された。０．５ｍｌの１０％のＮ−エチルジイソプロピルアミン含有ジメチルホルムアミドで１０分間洗浄及び中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｓｔｉｏｎ）した後、１３．２ｍｇの５−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ、ＳＥ）を含む５００μｌのジメチルホルムアミドを添加し、反応を一晩進行させた。反応混合物を濾過し、１００ｍｌのジクロロメタンで５回樹脂を洗浄した。２５０μｌの１０％のトリフルオロメタンスルホン酸を含むトリフルオロ酢酸による２．５時間の処理により、得られたモルフォリン結合体を樹脂から切断した。減圧下の濾過によって樹脂を除去した。未精製の精製物を沈殿させるために、８−１０倍量の冷たいｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを加えて濾過した。最後に、蛍光テオフィリン−ＴＡＭＲＡ結合体を、逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０１７８】
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）−先行技術：ＦＣＳは、小さな分子に対する大きな分子の並進拡散の違いを利用し、分子相互作用における分子量の大きな変化を検出し、それによりリガンドの結合画分と非結合画分を識別する。照らされた共焦点の焦点を通って拡散する各分子は、その一連の行程（ｊｏｕｒｎｅｙ）全体において蛍光量のバースト（ｂｕｒｓｔｓ）を生じさせ、全体に亘る蛍光シグナルの特徴的な変動を生じさせる。各光子バーストの長さは、分子が共焦点の焦点に留まる時間に対応する。放射された光子は、高感度単一光子検出装置によって、時間を分割する方法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｍａｎｎｅｒ）で記録される。この検出方法により、単一分子感度が得られるが、拡散が任意の方法であるという事実は、分子の最小の集合に対する拡散イベントが、統計学的に信頼性の高い情報を得るために平均化されることを要する。拡散イベントの検出は、溶液中で異なる蛍光種を、例えばフリーのリガンド結合したリガンドを区別するパラメーターとして働く拡散係数を測定可能にする。
【０１７９】
蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）−本発明の一態様：溶液中の粒子の混合物の蛍光明度の分析のための方法であるＦＩＤＡは、ＦＣＳ分析に用いられる、同様の光学的かつ電子的構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に基づいているが、分析のための異なるアルゴリズムを利用する。（本発明の一態様を表す）この方法は、光子カウント数のヒストグラムを測定し、かつ所定の粒子当たりの平均カウント率として表される比明度の関数として蛍光粒子の濃度を決定する。それは、異種の試料における様々な蛍光種の濃度の測定に適用でき、非常に特殊な適用、例えば薬剤開発及び診断に対する基本的な研究から、様々な分野において有益なツールである。一例として、それにより、フリーの、又は多価レセプター、例えば二価抗体分子に結合する蛍光ラベルされた抗原間を区別することができる。この結合反応は、溶液中の単一の抗体分子に対して、並びにハイブリドーマ細胞の表面上に固定される抗体分子に対して測定することができる。
【０１８０】
テオフィリン−ＴＡＭＲＡの特異的ハイブリドーマ細胞系ＨＢ−８１５２の細胞表面上に拘束された抗体への結合反応は、ＦＩＤＡによって測定された。対照として、無関係な（ｕｎｒｅｌａｔｅｄ）β−_１−４０アミロイド特異的ハイブリドーマ細胞系ＰＳ１−８Ａ１−Ｃ６−Ｄ６をテオフィリン−ＴＡＭＲＡ結合体と共にインキュベートした場合に、細胞関連蛍光シグナルは何ら検出されなかった（図３１）。融合した（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ハイブリドーマ培養液の細胞数は１ｍｌ当たり１．６×１０^６個と測定され、各単一実験に対して１００μｌ中に約０．５×１^０６個のハイブリドーマ細胞を有するアリコートが使用された。１００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）バッファー中で５分間細胞を洗浄し、分析物から可溶性抗体を除去した。続いて、テオフィリン−ＴＡＭＲＡ結合体を異なる濃度０、０．４、２、８、１６、４０、２００、８００ｎＭで含む１００μｌのＰＢＳ中で３０分間、細胞をインキュベートした。各測定に対して、各細胞懸濁液５０μｌをチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中でピペッティングし、ＦＩＤＡ（波長：励起：５４３ｎｍ及び放射：５７２ｎｍ）を用いて、コンフォコール（ＣｏｎｆｏＣｏｒ）中で分析した。４つの別々の測定において、それぞれの単一実験の場合のハイブリドーマ細胞の蛍光ラベル度を測定した。ＨＢ−８１５２抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）は、３３．１ｎＭ＋／−７．６ｎＭと算出された。対照として、ハイブリドーマクローンＰＳ１−８Ａ１−Ｃ６−Ｄ６の場合は、特異的蛍光シグナルは何ら測定されなかった。
【０１８１】
競合実験において、ハイブリドーマＨＢ−８１５２細胞に対するテオフィリン−ＴＡＭＲＡ結合の特異性は、非変性（ｎｏｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）テオフィリンの濃度の上昇によって競合的に（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ）阻害された。ハイブリドーマ細胞系ＨＢ−８１５２に対するテオフィリン−ＴＡＭＲＡ結合の阻害は、同じ分析プロトコル及び図３１に記載したＦＩＤＡ分析を用いることによって測定された。唯一の例外は、テオフィリン−ＴＡＭＲＡ（８０ｎＭ）の濃度を一定にして、非ラベル化テオフィリンコンペティターと異なる濃度：１、１０、１００、３００、６００、１０００、２０００、５０００ｎＭで混合して用いることにより、ハイブリドーマ細胞をラベルしたことである。ＩＣ５０値は、２５０．１ｎＭ＋／−２５．５ｎＭと算出された。対照として、テオフィリン−ＴＡＭＲＡ結合体のアミロイド特異的ハイブリドーマクローンＰＳ１−８Ａ１−Ｃ６−Ｄ６との結合は何ら測定されなかった（図３２）。
【０１８２】
参考として、ハイブリドーマＨＢ−８１５２培養培地から精製された分泌された抗体分子を用いる独立したＦＣＳ測定において、テオフィリン特異的抗体の測定された解離定数（Ｋ_Ｄ）を確認した（図３３）。従って、分泌されたモノクローナルＩｇＧ抗体分子は、蛋白質Ｇアフィニティークロマトグラフィーを用いてハイブリドーマＨＢ−８１５２培養培地から精製され、かつ精製された抗体溶液の濃度は分光器を用いて（ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ）測定された。蛍光テオフィリン−ＴＡＭＲＡ結合体を含む（１ｎＭ）１００μｌのＰＢＳバッファー中で、精製された抗体を以下の濃度：０、１、５、１０、５０、１００、２００、５００ｎＭに希釈した。混合物を３０分間インキュベートすることにより、抗体：：テオフィリン−ＴＡＭＲＡ複合体が形成された。３０μｌのアリコートをチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に移し、ＦＣＳを用いてコンフォコール（Ｃｏｎｆｏｃｏｒ）中で分析した。可溶性抗体分子に対する解離定数（Ｋ_Ｄ）は、２４．６ｎＭ＋／−１１．５ｎＭと算出された。これは、細胞のＦＩＤＡ測定で得られた結果と比較され得る。
【０１８３】
免疫グロブリン、サイトカイン、成長因子、又はホルモンのような分泌された生体分子の定量的測定は、診断又は薬理学のような分野において有益なツールである。一般に、これらの分子の濃度及び薬理活性は、細胞から細胞外培地へ実際に放出された分子について測定される。ここで、細胞結合抗体の画分が、共焦点顕微鏡及びＦＩＤＡによって測定される代わりの方法を示す。通常のＦＡＣＳと比べると、本発明によるこの技術は本質的な利点を有する：
【０１８４】
第一に、共焦点顕微鏡は、単一分子の検出を可能にすることにより、はるかに高い感度をもたらす。それに対して、ＦＡＣＳは、共焦点的でない（ｎｏｎ−ｃｏｎｆｏｃａｌ）レンズのため、かなり感度が低く、その適用は、染色された細胞の検出に限定される。
【０１８５】
第二に、均質な結合分析を用いることができ、それによりアフィニティーの低いＩｇＧ又はＩｇＭを生成する、好ましくないハイブリドーマクローンの親和力によって行われる選択（ａｖｉｄｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）が妨げられる。また、溶液系分析は、間違った正の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）クローンの選択を引き起こす異種の固相分析において観察される非特異的相互作用を減少させる。
【０１８６】
第三に、飽和濃度下で蛍光抗原によってハイブリドーマ細胞がラベルされる場合、細胞の絶対（ａｂｓｏｌｕｔｅ）明度により、生成された抗体分子の量が示される。それ故、ハイブリドーマが必ずしも均質な培養液とは限らないので、効率的な抗体生成が維持されていることは、“良好な”生産者（ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ）の連続的な選択を表すであろう。
【０１８７】
四番目の、恐らく最も重要であることは、生成された抗体の結合アフィニティーに従って、一価の蛍光抗原がハイブリドーマに結合することである。抗原濃度を増加させた場合の蛍光ラベルされたハイブリドーマの異なる明度から、抗体のＫ_Ｄ−値を算出することができる。前述のＩｇ生成能力と比べ、このパラメーターは、ハイブリッド細胞のクローン集団内でしばしば観察される統計学的な変動による影響を受けない。それ故、単一の細胞から検出されたシグナルは、異なるアフィニティーで抗体を生成するハイブリッドクローンを区別するのに十分な情報を既に与えている。
【０１８８】
示された技術により、ここでは、高アフィニティー抗体を生成する稀少な（ｒａｒｅ）細胞がはるかに早い時間の点（ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）において検出され、それにより生成を行わない（ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）クローンによる過剰成長（ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ）が妨げられるであろう。その結果、この技術は、ハイブリドーマから得られる全体的に利用可能な抗体のレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を増やし、かつ新たに（ｆｒｅｓｈｌｙ）融合された細胞系からの単一特異性ハイブリッドクローンの選択的な単離を促進するであろう。更なる重要な治療又は診断の適用は、幹細胞又は癌細胞のような稀少なイベントの単離である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、テトラメチルローダミン（ａ）の色素溶液から得られたカウント数ヒストグラム及び異なる補正法に対応する誤差曲線（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｃｕｒｖｅｓ）を示す。
【図２】図２は、ラベルされたリガンドの小嚢への結合反応をモデル化する場合のカウント数のシュミレーションされたヒストグラムを示す。
【図３】図３は、ｑ値に依存する、単一種の溶液の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す。
【図４】図４は、ｃ値に依存する、単一種の溶液の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す。
【図５】図５は、Ｔ値に依存する、単一種の溶液の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す。
【図６】図６は、Ｔ値に依存する、２種の混合物の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す。
【図７】図７は、ｑ_２のｑ_１に対する比に依存する、２種の混合物の評価されたパラメーターｃ及びｑの理論上のエラーを表す。
【図８】図８は、濃度に依存する、２種の混合物の評価されたパラメーターの理論上のエラーを表す。
【図９】図９は、本発明による方法を行う場合の使用に適合された装置を表す。
【図１０】図１０Ａにおいて、同じ平均カウント数
【数９６】

を有するが、試料組成が異なる場合に計算された光子カウント数分布、Ｐ（ｎ）をプロットする。図１０Ｂは、ローダミン６Ｇ（Ｒｈ６Ｇ）及びテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、並びにこれら２つの色素の混合物の純粋な溶液の光子カウント数のヒストグラムのグラフである。
【図１１】Ｒｈ６Ｇの場合の典型的な誤差を図１０Ｃに示す。図１０Ｄは、図１０Ｂの曲線に適用したＩＴＲ分析（線形補正（ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）及び濃度を負でない値（ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｖａｌｕｅｓ）にすることによる反比例関数（ｉｎｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ））の結果を示す。
【図１２】図１１は、ハイブリダイズされた（Ａ−Ｃ）、及び制限酵素で切断された（Ｄ，Ｅ）ラベルされたオリゴヌクレオチドのＩＴＲ分析を示す。お互いの間で１０％未満の変動を示す、２０個体のセットの１０秒間の測定から曲線を得る。
【図１３】図１２は、異なる組み合わせのラベル及び非ラベル化オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び制限酵素切断を表す。
【図１４】図１３は、ＴＡＭＲＡ溶液において測定した光子カウント数のジョイントヒストグラムのグラフによる表示（ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）である。
【図１５】図１４は、ＴＡＭＲＡ（５’−（６’−カルボキシテトラメチルローダミン）とＲＲＸ（ローダミンレッドＸ）との混合物から得られたカウント数のジョイントヒストグラムの加重された誤差のグラフによる表示である。
【図１６】図１５は、テオフィリン濃度は２ｎＭと等しいが、抗体濃度が異なる場合に測定した蛍光の“平行”及び“垂直”偏光成分の光子カウント数のジョイントヒストグラムを表す。
【図１７】図１６は、テオフィリン濃度は等しいが抗体濃度が異なる試料からのデータに適用した２Ｄ−ＦＩＤＡの結果を表す。
【図１８】図１７は、小嚢当たりの多数の結合部位による二色２Ｄ−ＦＩＤＡの原理を表す。
【図１９】図１８は、ＳＭＳ−１４（ソマトスタチン）のＳＳＴＲ−２（ヒト２型高アフィニティーソマトスタチンレセプター（ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ−２ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）への結合度が低い（Ａ）及び高い（Ｂ）条件において測定した“緑”及び“赤”の光子カウント数のジョイントヒストグラムを表す。
【図２０】図１９は、ＳＭＳ−１４のＳＳＴＲ−２への結合反応の競合曲線（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）を示す。
【図２１】図２０は、段階ｂ）においてヒストグラム
【外２１】

が決定される光子カウント数｛ｎ_ｉ｝が、所定のルールに従う最初の時間間隔からの光子カウント数を足し合わせることにより、最初の時間間隔｛Ｎ_ｊ｝における光子カウント数から得られる態様を表す。
【図２２】図２１は、光子カウント数｛ｎ_ｉ｝が、最初の時間間隔が時間遅延によって分離されるというルールに従って所定の最初の時間間隔から得られる更なる態様を表す。
【図２３】図２２は、蛍光ラベルされた分子の、本発明を用いて観察されたレセプター担持（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ）小嚢への結合の概略図である。
【図２４】図２３は、ＴＭＲ−ＥＧＦのＡ４３１細胞から調製された膜へのリガンド結合特性を表す。
【図２５】図２４は、ＴＭＲ−ＥＧＦの、ＨＣＴ細胞から調製された膜への結合を示す。
【図２６】図２５は、ＥＧＦレセプターの薬理学プロファイルを表す。
【図２７】図２６は、ボディピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）ＦＬ−ＣＧＰ １２１７７のリガンド結合特性を表す。
【図２８】図２７は、４０μｌ及び１μｌの分析体積におけるボディピィ（Ｂｏｄｉｐｙ）ＦＬ−ＣＧＰ １２１７７結合の阻害を示す。
【図２９】図２８は、異なるタイムウィンドゥＴで記録された０．８ｎＭのＣｙ５溶液のカウント数ヒストグラムを表す。
【図３０】図２９は、３成分の混合物のシュミレーションされたデータの補正結果を示す。それら成分のシュミレーションされた明度（ｋＨｚ）及び散乱時間（μｓ）の値は、（３０ｋＨｚ， １９２μｓ）； （１２０ｋＨｚ， １９２μｓ）； （１２０ｋＨｚ， ６４ μｓ）である。全強度への寄与は、それぞれ１０．８、２０．４及び１４．４である。グラフは、２０個の独立したシュミレーションの実施からのＦＩＭＤＡの結果を表す。それぞれのシュミレーションは、６０秒継続する実験に相当する。
【図３１】図３０は、ｐＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５） のＳＨ２への結合を表す。実線は双曲線補正から得られ、Ｋ_Ｄ＝１．６８±０．２７μＭの結合定数が得られる。
【図３２】図３１は、テオフィリンに特異的なハイブリドーマ細胞系ＨＢ−８１５２の表面上に暴露された（ｅｘｐｏｓｅｄ）モノクローナル抗体の結合定数（Ｋ_Ｄ）の測定を表す。
【図３３】図３２は、ハイブリドーマ細胞系ＨＢ−８１５２の表面上に暴露されたモノクローナル抗体へのテオフィリン−ＴＡＭＲＡの特異的結合のＩＣ_５０測定を表す。
【図３４】図３３は、テオフィリンに特異的なハイブリドーマ細胞系ＨＢ−８１５２の培養培地から精製された可溶性モノクローナル抗体のアフィニティー定数の測定を表す。

Claims (20)

1. 試料中の蛍光分子又は他の粒子を特徴付けるための方法であって、
   ａ）一つ以上の光子検出器による最初の時間間隔における光子カウント数の測定により、不均一な空間明度プロファイルの少なくとも一つの測定体積における上記の分子又は他の粒子によって放射された蛍光の強度の変動を観察すること、
   ｂ）測定された光子カウント数から、光子カウント数の少なくとも一つの分布
   【外１】

   

   を決定すること、
   ｃ）実験によって決定された光子カウント数の分布
   【外２】

   

   を補正することにより、前記粒子に特有な物理量を決定すること、
   の段階を含み、補正法が、
   

   

   と定義される、その生成関数による光子カウント数Ｐ（ｎ）の理論上の分布関数の計算を含むことを特徴とする方法。
2. 最初の時間間隔が同じ幅の連続した間隔である請求項１に記載の方法。
3. 段階ｂ）において、分布
   【外３】

   

   の決定に供される光子カウント数｛ｎ_ｉ｝が、所定のルールに従い最初の時間間隔からの光子カウント数を足し合わせることにより、最初の時間間隔｛Ｎ_ｊ｝における光子カウント数から導かれる請求項１又は２に記載の方法。
4. 段階ｂ）において、分布
   【外４】

   

   の決定に供される光子カウント数｛ｎ_ｉ｝が、
   

   

   （式中、Ｍは、｛ｎ_ｉ｝が決定される時間間隔が最初の時間間隔より何倍長いかを表す整数である。）というルールに従い最初の時間間隔｛Ｎ_ｊ｝における光子カウント数から算出される請求項３に記載の方法。
5. 段階ｂ）において、光子カウント数｛ｎ_ｉ｝が、最初の時間間隔が時間遅延によって分離されるというルールに従い所定の最初の時間間隔から算出される、請求項３に記載の方法。
6. 段階ｂ）において、分布
   【外５】

   

   の決定に供される光子カウント数｛ｎ_ｉ｝が、所定のルール
   

   

   （式中、Ｍ及びＬは正の整数である。）に従い最初の時間間隔｛Ｎ_ｊ｝における光子カウント数から算出される、請求項５に記載の方法。
7. 段階ｂ）において、一連の分布
   【外６】

   

   が、一連の異なるルールに従って決定され、前記一連の分布は段階ｃ）において同時に補正される請求項３〜６の１項に記載の方法。
8. 段階ｃ）において、異なる値のＭ及び／又はＬを有する一連の分布が同時に補正される請求項６及び７に記載の方法。
9. 段階ｃ）の少なくとも一つの物理量が粒子の濃度である請求項１〜８の１項に記載の方法。
10. 段階ｃ）において、少なくとも一つの物理量が粒子の比明度である請求項１〜９の１項に記載の方法。
11. 段階ｃ）において、少なくとも一つの物理量が拡散係数である請求項１〜１０の１項に記載の方法。
12. 生成関数が式
    

    

    （式中、ｃ（ｑ）は比明度ｑを有する粒子の密度であり、Ｔはカウント間隔の長さであり、かつＢ（ｒ）は座標の関数としての空間明度プロファイルである。）を用いて算出される請求項１〜１１の１項に記載の方法。
13. 生成関数の独立変数がζ＝ｅ^−ｉφの形で選択され、その生成関数からの光子カウント数の理論上の分布の計算において、高速フーリエ変換アルゴリズムが用いられる請求項１〜１２の１項に記載の方法。
14. 段階ｃ）において、理論上の分布Ｐ（ｎ）を算出する場合に、体積と空間明度の間の数学的な関係によって空間明度プロファイルがモデル化される請求項１〜１３の１項に記載の方法。
15. 段階ｃ）において、理論上の分布Ｐ（ｎ）を算出する場合に、以下の式：
    

    

    （式中、ｄＶは体積成分を表し、χは相対空間明度の対数を表し、Ａ_０は体積の単位を選択する定数であり、かつａ_１及びａ_２は経験上評価されたパラメーターである。）によって空間明度プロファイルがモデル化される請求項１４に記載の方法。
16. 段階ｃ）において、理論上の分布Ｐ（ｎ）を算出する場合に、以下の式：
    

    

    （式中、ｄＶは体積成分を表し、χは相対空間明度の対数を表し、Ａ_０は体積の単位を選択する定数であり、かつａ_１、ａ_２、及びａ_３は経験上評価されたパラメーターである。）によって空間明度プロファイルをモデル化する請求項１４に記載の方法。
17. 段階ａ）において、蛍光強度を観察するために、共焦点光学装置が使用される請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記蛍光分子又は他の分子が均質な蛍光分析を適用して特徴付けされる請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 診断、高処理量薬剤スクリーニング、分子の性質の最適化及び特異的細胞又は懸濁可能な（ｓｕｓｐｅｎｄａｂｌｅ）担体の集合の同定において使用するための請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 励起光（１４）を与えるための放射線源（１２）、
    測定体積内に励起光（１４）の焦点を合わせるための対物レンズ（２２）、
    測定体積（２６）から発生する励起光（３０）を検出するための検出器（４２）、
    測定体積（２６）から発生する放射光（３０）の検出のための検出器（４２）、及び
    放射光（３０）又は励起光（１４）の中央部を消去するための、放射光（３０）又は励起光（１４）の経路（３２）に位置する光を通さない手段（４４）
    を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法を行うための共焦点装置の使用。

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