JP6273614B2 - 遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Description

この発明は遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体及びその製造方法に関するものである。

細胞の老化とともに遺伝子の損傷の発生頻度が増加する。もともと細胞には遺伝子修復の機能が備わっているものの、遺伝子の損傷の速度がさらに増加するため、遺伝子の修復が追いつかずに損傷が蓄積する。

この結果として蛋白質の合成が減少する。細胞内の蛋白質が多くの生命維持のために消耗すると細胞自体が次第に損傷を受け、死滅し、変異して機能が低下する。体の各器官において、多くの細胞がそのような状態に達すると、器官自体の能力を弱め、そして、次第に病気の症状となって現れるようになる。遺伝子修復の働きには、数種類が認められている。たとえば、ＤＮＡポリメラーゼとリガーゼの組み合わせによる修復機能がある。また、活性酸素による塩基の障害に対してはＯＧＧ１、つまり、８ヒドロキシル−２−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧと略される）の修復酵素である８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼである。

さらに、ＤＮＡポリメラーゼ３を介したＳＯＳ修復機能も存在し、いろいろな障害に対する修復機能が存在している。これらの遺伝子修復機能を活性化することは加齢や化学物質による遺伝子の障害を修復し、疾患を遺伝子から回復させることから好ましい。この遺伝子修復機能を活性化する研究が行われている。

遺伝子修復機能を活性化させる発明としては、たとえば、標的ＤＮＡのインビボ除去による遺伝子修復があるものの、細胞レベルでの治療であり生体には応用が限られる（例えば、特許文献１参照。）。また、ＤＮＡの標的改変の発明ではベクターによる遺伝子の調整が記載されている（例えば、特許文献２参照。）。

特願２０００−５９７４４４ 特願２０１３−５４１９４４

既存の物質による遺伝子修復の活性化作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。

そこで、副作用が弱く優れた遺伝子修復の活性化作用を呈する天然物及びそれを効率良く製造する製造方法が望まれている。

上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）で示される遺伝子修復の活性化作用を有するヘスペレチン誘導体に関するものである。

上記の目的を達成するために、請求項２に記載の発明は請求項１の式（１）で示される遺伝子修復の活性化作用を有するヘスペレチン誘導体の製造方法に関するものである。

この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。

請求項１に記載のヘスペレチン誘導体は遺伝子修復の活性化作用に優れている。

請求項２に記載の製造方法によれば、効率良く遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体を製造することが可能である。

以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。

遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体とは、下記の式（１）で示される構造からなるものである。

前記の式（１）のように遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体はヘスペレチンの１分子及びフェルラ酸の２分子から構成されている。これらの分子及びその結合はすべて自然界に存在する天然型であり、各分子間はエーテル結合を介して結合している。

このヘスペレチン誘導体はヘスペレチン及びフェルラ酸を原料として化学合成により得ることができる。しかし、その化学的な合成では原料の損失が多く、製造コストが高くなるため、産業への利用は限定される。化学合成された純度の高いヘスペレチン誘導体は分析の標準品や微量な試供品を得るために用いられる。

このヘスペレチン誘導体の構造を解析することは有効成分の特定ができる点から好ましい。また、製品や製剤に利用して販売する際の有効成分の含有量の指標として利用できることから好ましい。

このヘスペレチン誘導体の構造解析の一例として化学合成された高純度（純度９５％以上）の標準品を用いて重水素化ジメチルスルホキシド中の９０ＭＨｚのＨ−ＮＭＲにより解析した場合、ピークの位置は２．９９２、３．１４３、３．９３９、４．１５５、４．２１６、４．２４８、５．６０３、６．８３０、６．９９６、７．１２５、７．２１０、７．２４６、７．５６８、７．７２５、７．７３６、８．１４３、９．０７４、１０．０１０及び１３．２７４ｐｐｍに認められる。

さらに、このヘスペレチン誘導体は高速液体クロマトグラフィーや質量分析装置で解析され、その構造が同定される。

この構成成分であるヘスペレチンは天然に存在している化合物である。ヘスペレチンの化学式はＣ１６Ｈ１４Ｏ６であり、分子量は３０２．３である。

もともと、このヘスペレチンはフラバノンの一種であり、抗炎症作用、抗腫瘍作用、脂肪燃焼作用、神経保護作用に働きを呈するものの、吸収、体内動態や薬力学的に十分ではなかった。そこで、より吸収が良く、効果の強い誘導体が望まれていた。

このヘスペレチン誘導体ではヘスペレチンはベンゼン環の２つ水酸基で２分子のフェルラ酸のメソキシ基とそれぞれエーテル結合を形成している。すなわち、ヘスペリチンのベンゼン環の４位及び５位である。脱メチルによるエーテル結合である。

このヘスペレチンとフェルラ酸の結合によりこのヘスペレチン誘導体は安定的に、かつ、吸収率と反応性が高くなる。つまり、ベンゼン環による疎水性とフェルラ酸の水酸基による水溶性が加わり、両親媒性を呈することにより吸収が高まる。ヘスペリチン単体と比較して約３倍に増加する。さらに、ヘスペリチンの複素環の５位と７位のフリーの水酸基の反応性が高まることは好ましい。

もう一つの構成成分であるフェルラ酸は化学式Ｃ１０Ｈ１０Ｏ４で天然に存在する桂皮酸の一種である。このフェルラ酸は植物や動物に保持され、フェニルアラニンなどから生合成される。

フェルラ酸はもともとシナモンなどの植物の葉や果実から採取される成分であり、抗酸化作用が強いことから防腐剤、抗菌剤、抗アレルギー剤として利用されており、その安全性は確認されている。

このヘスペレチン誘導体ではフェルラ酸部分は抗酸化作用の他に、ＤＮＡの分子を加齢、酸化、活性酸素や紫外線から防御して遺伝子を保護する働きがある。遺伝子の安定化に寄与している。また、ラジカルスカベンジャー作用を呈してラジカルを消去する。

さらに、フェルラ酸のカルボン酸部分は弱酸性に荷電していることから、耐酸性が強く、経口摂取された場合に、胃酸に対して抵抗性を示し、吸収率が高まることは、好ましい。また、弱酸性であるため、皮膚に塗布した場合、皮膚に対して刺激性がないことは好ましい。

このヘスペレチン誘導体は両親媒性であることにより、細胞内に浸透しやすく、また、核膜内に到達しやすく、遺伝子に直接作用することは好ましい。

ミトコンドリアの内膜でヘスペレチン部分は疎水性的に核膜に浸透して遺伝子修復酵素を活性化する。標的になる遺伝子修復酵素はＤＮＡポリメラーゼ及び８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼまたは８−ヒドロキシルデオキシグアニンＤＮＡグリコシターゼ（いずれもＯＧＧ１と略す）が主体である。

ＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子の修復はＳＯＳ修復といわれ、塩基の変化や付加体に働き、ＤＮＡ鎖の切断と複製を行う工程からなる。このＤＮＡポリメラーゼによる修復は１日に１万回以上行われている。

ＯＧＧ１による遺伝子修復は８ＯＨｄＧのような塩基の酸化体の排除と正常な塩基の組み込みを行う工程である。このヘスペレチン誘導体はこれらの遺伝子修復酵素の活性化を行うこと及び遺伝子を酸化物質や活性酸素から防御する働きにより遺伝子修復を活性化させる。遺伝子修復酵素の活性化には酵素活性の活性化と酵素のｍＲＮＡ転写レベルでの活性化の両方による。

このヘスペレチン誘導体による遺伝子修復の活性化は核内に遺伝子が存在するすべての細胞に働く。

遺伝子の障害の方法も活性酸素、フリーラジカル、紫外線、化学物質、医薬品の副作用、金属、加齢などすべての物質による障害に対応する。

また、このヘスペレチン誘導体は脂溶性と水溶性の両方の性質を呈することから動物の細胞膜及び植物や酵母の細胞壁を通過し、細胞内に吸収されやすい。

さらに、皮膚の角質細胞膜も通過しやすく、角質層のバリア機能を維持することは肌の件健康や美容の点から好ましい。また、このヘスペレチン誘導体は細胞膜を通過し、皮膚細胞内で遺伝子修復を活性化して細胞の再生や機能を促進することから好ましい。

植物に対してはこのヘスペレチン誘導体が植物の細胞壁と細胞膜を通過して植物細胞内に入り、遺伝子修復を促進し、花の開花や結実、果実の成長を促進して植物の寿命を延長することは好ましい。すなわち、植物活性化剤としての働きがある。

また、このヘスペレチン誘導体は両親媒性であり、水溶性の化粧水と油性のクリームのいずれにも配合できる点は好ましい。

このヘスペレチン誘導体は遺伝子の修復に働き、細胞の増殖、正常なコラーゲンやエラスチン産生を促進することにより皮膚細胞機能を促進することは好ましい。

神経細胞においても細胞内の遺伝子修復を活性化する。神経細胞は認知症、アルツハイマー症などで活性酸素やアミロイドβたんぱく質による遺伝子の障害を受けやすく、遺伝子は修復されにくいという弱点がある。そのため、このヘスペレチン誘導体による遺伝子修復の活性化は神経の働きを回復させることは神経疾患の防御と回復の目的で好ましい。

また、神経終末からの神経伝達物質の放出を促進して神経伝達を高めることは好ましい。

運動神経細胞の神経末端からのアセチルコリンの放出を高めることにより筋肉の収縮を高めて神経と筋肉の活動性を増すことは好ましい。

また、このヘスペレチン誘導体は皮膚細胞の遺伝子修復を高めてコラーゲンやエラスチンの産生を高めることは好ましい。化粧料としての利用が高まることから好ましい。

このヘスペレチン誘導体は心筋梗塞においては冠状動脈の梗塞や虚血状態でも心筋細胞の遺伝子修復を活性化して心臓の活動を活性化して強心作用を発揮することは好ましい。

特に、梗塞部位の血管においてはこのヘスペレチン誘導体は血管新生を促進し、血流の改善し、血圧を低下させる。

また、このヘスペレチン誘導体はアスリートや運動時、筋肉を増強したい場合、筋肉細胞での脂肪の輸送を促進して遺伝子レベルでのエネルギー産生を活性化することから好ましい。

このヘスペレチン誘導体は生体内では腎臓や肝臓のエステラーゼにより分解され、尿中に***される。分解されて構成成分である安全性の高いヘスペレチン及びフェルラ酸に分解される。したがって、このヘスペレチン誘導体は体内に蓄積されることはなく、分解も生体内酵素で行われ、分解物も天然物であることから安全性が高い。

さらに、ヘスペレチン部分には植物の生育を促進する植物活性化作用があることからこのヘスペレチン誘導体にも植物の生育を促進できる点は産業上の利用の点から好ましい。

また、植物が細菌やウイルスに感染した場合、遺伝子が障害を受ける場合がある。このような遺伝子の障害に対して遺伝子修復を活性化することは好ましい。

このヘスペレチン誘導体は天然にも存在しており、キンカンやマルキンカンなどのかんきつ類や植物にも極微量認められる。

このヘスペレチン誘導体を精製により上記の植物から抽出することは可能である。ただし、精製には大量の原料を必要とし、有機溶媒などを利用することから産業上への利用は制限される。

このヘスペレチン誘導体はキンカンの果実を発酵法などにより増加させることは好ましい。発酵法としては大豆と混合して納豆菌やベニコウジ菌により発酵させて得る。用いる菌体は食用に利用できるものであるため、安全性が高い。

この製造方法は食経験があり、ヘスペレチン誘導体の産生量も多いことから好ましい。

得られたヘスペレチン誘導体を医薬品素材として利用する場合、目的とするヘスペレチン誘導体を精製することは、目的とするヘスペレチン誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。

医薬品としては注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。

経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤はシェラックまたは砂糖などで被覆することもできる。

また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。

非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。

注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。

食品製剤としては遺伝子修復を活性化するため、エナジードリンクや強壮性の食品に利用される。神経活動を促進することから神経細胞の遺伝子の障害を介した神経のリハビリ用食品や学習時の食事などに利用される。また、美容食品にも利用される。保健機能食品として栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。

得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、筋肉の遺伝子の障害の回復、老化の抑制と運動能力の向上を目的とした飼料やペット用サプリメントとして利用される。

化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。

化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。

ここで製造された化粧料は皮膚の障害された遺伝子の修復やコラーゲンやエラスチンなどの増加及び肌の健康維持の目的で利用される。

また、このヘスペレチン誘導体は遺伝子が障害された歯肉細胞の機能の維持を目的とした歯磨き剤、洗口液や歯磨きペーストなどに利用できる。

また、植物に対しては遺伝子の障害を回復させることにより果実の結実と収穫量の増加を目的とした植物活性化剤として利用することができる。

この植物活性化剤は希少な蘭やマツバランなどの花の栽培促進の目的で利用でき、果実や野菜、穀類の栽培を安定化させる。植物工場における野菜や果実の栽培にも利用でき、栽培効率を上げることができる。

次に、キンカンの果実、大豆粉末と納豆菌を添加して発酵させた発酵液をベニコウジ菌で発酵する工程からなる式（１）で示される遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体の製造方法について説明する。

ここでいう式（１）で示されるヘスペレチン誘導体とはヘスペレチンの１分子及びフェルラ酸の２分子から構成されている。これらの結合はすべて天然型であり、物質の間はエーテル結合を介して結合している。

このヘスペレチン誘導体のヘスペレチン及びフェルラ酸は天然に存在し、食経験も豊富であり、安全性が認められていることから好ましい。

この誘導体は皮膚、神経、骨、筋肉、肝臓や腎臓などにも働き、障害された遺伝子を修復させることにより、身体機能を回復させる。

この製造方法とはキンカンの果実、大豆粉末と納豆菌を添加して発酵させた発酵液をベニコウジ菌で発酵する工程からなる。

原料となる物質はキンカンの果実、大豆粉末、納豆菌及びベニコウジ菌である。

ここでいうキンカン学名Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａは金柑であり、ミカン科キンカン属 の常緑低木の総称である。別名はマルミキンカン、マルキンカンである。果実は果皮ごと食され、果皮のついたまま甘く煮て、砂糖漬け、蜂蜜漬け、甘露煮にもされ、食経験が豊富である。また、民間薬として咳や、のどの痛みに効果がある。

使用するのはキンカンの果実であり、種子を含有していても良い。果肉と果実の両方を含むことはコスト的に好ましい。

キンカンの果実は日本、アメリカ、アジア、その他の国で採取されたいずれのものでも良いが、品質が高く、価格の点から、日本産は品質が良いことから好ましい。

キンカンの果実は乾燥され、粉末化されることが好ましく、発酵の前にオートクレーブ滅菌されることは発酵をスムーズに行うることから好ましい。

３マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。

原料となる大豆粉末は、日本産、中国産、アメリカ産、ロシア産などいずれの産地の大豆でも利用できるが、トレーサビリティーが確実であり、生産者が明確である日本産が好ましい。

このうち、有機栽培や無農薬で栽培された大豆は有害な農薬や金属を含有しないことから、さらに好ましい。

大豆は使用に際して、株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０、中山技術研究所製ＤＭ−６などの粉砕機で粉砕される。これにより発酵の工程が効率的に進行されやすい。

さらに、キンカンの果実と大豆は粉砕後、オートクレーブなどにより滅菌されることは雑菌の繁殖を防御できることから好ましい。

用いる納豆菌は学名バチルス サブチリスで日本では納豆の製造に汎用され、食経験が豊富で有用な食用菌である。沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。用いる納豆菌は高い発酵性を呈する。

この納豆菌はキンカンの果実と大豆からなるヘスペレチンとフェルラ酸の結合反応を促進する。

前記の発酵に関するそれぞれの添加量はキンカンの果実の乾燥粉末１重量に対し、大豆粉末は０．０１〜６重量及び納豆菌は０．００１〜０．０６重量が好ましい。納豆菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。

前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。

また、この発酵は４１〜４４℃に加温され、発酵は１日間から１４日間行われる。目的とするヘスペレチン誘導体をＨＰＬＣやＴＬＣにより定量することならびに菌体の増殖性を確認することにより、発酵の工程管理を実施することは産生量が調整されることから好ましい。

前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。

この発酵の工程によって生成されるヘスペレチン誘導体はその結合が不安定であり、分解されやすいことから次のベニコウジ菌による発酵を行い、目的とするヘスペレチン誘導体の結合を安定化させる。

用いるベニコウジ菌は学名Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの糸状菌であり、古くから日本、中国や台湾において紅酒や豆腐ようなどの発酵食品に利用されている。また、沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。ベニコウジ菌は発酵効率に優れており、また、安全性も高い。

前記の発酵に関するそれぞれの添加量は前記の発酵物１重量に対してベニコウジ菌は０．０００５〜０．０９重量が好ましい。ベニコウジ菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。

前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。

また、この発酵は４０〜４４℃に加温され、発酵は１日間から２１日間行われる。この発酵の工程によってベニコウジ菌の酸化及び還元作用によりこのヘスペレチン誘導体の構造が安定化される。

前記の発酵物は含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収し、菌を滅菌でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。また、得られた発酵物を超音波処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。

前記の還元反応物から、目的とするヘスペレチン誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。

例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするヘスペレチン誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。

例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。

アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。

これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。

分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。

これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。

これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。

得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して２〜４０倍量が好ましく、４〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から１０〜３０℃が好ましく、１２〜２５℃がより好ましい。

分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。

セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。

ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。

ヘスペレチン誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするヘスペレチン誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから好ましい。

また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られるヘスペレチン誘導体が安定に維持されることから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。

また、このヘスペレチン誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。

以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。

静岡県で栽培されたキンカン（学名Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の果実を静岡県清水市の紅光から購入して用いた。この果実を水道水で水洗後、天日で乾燥させ、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル）にて粉砕し、キンカンの果実の乾燥粉末粉砕物を１．０ｋｇ得た。なお、種皮及び種子も含有していた。

また、北海道産の大豆（学名Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）をミキサー（クイジナート製）に供し、大豆の粉砕物１．０ｋｇを得た。前記のキンカンの果実と大豆の粉砕物をオートクレーブ（ＳＤＬ−３２０、トミー製）に供し、１２１℃、２０分間、滅菌した。

これらを清浄な発酵タンク（滅菌された発酵用丸形４０リットルタンク、遠藤科学製）に入れ、滅菌された水道水５ｋｇを添加し、攪拌した。

これとは別に、納豆本舗製の粉末納豆菌（学名Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１０ｇを上記の発酵タンクに供し、滅菌した大豆粉末と前培養させた発酵準備液を用意した。

前記の前培養した納豆菌の発酵準備液とキンカンの果実の乾燥粉末と大豆とを入れた発酵タンクに添加し、攪拌後、４１〜４３℃の温度範囲で加温し、発酵させた。

発酵過程では通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行い、７日間発酵させた。発酵終了後、発酵タンクより発酵物を取り出し、煮沸滅菌した。この発酵物を濾過布により濾過して、納豆菌による発酵液１．２ｋｇを得た。この発酵液１ｋｇに対して紅麹本舗製のベニコウジ菌（学名Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）の１０ｇを添加して４１〜４２℃で７日間発酵させた。

この発酵物にエタノールを添加して発酵を停止した。さらに、煮沸滅菌した。これを濾過し、濾過液を目的とするヘスペレチン誘導体とした。これを検体１とした。

さらに、構造解析及び実験の目的で精製物を得た。つまり、前述の検体１のヘスペレチン誘導体の１００ｇに７％エタノール含有精製水の２Ｌを添加し、ダイヤイオン（ＡＭＰ０３型、三菱化学製）５００ｇを７％エタノール液に懸濁して充填したガラス製カラム（遠藤科学製）に供した。

これに１０Ｌの７％エタノール液を添加して清浄し、さらに、２５％エタノール液を１Ｌ添加して洗浄した。また、６０％エタノール液を１Ｌ添加して目的とするヘスペレチン誘導体を溶出させ、この溶出液を濃縮して精製した。精製されたヘスペレチン誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。これを真空乾燥させ、ヘスペレチン誘導体の精製物５５ｇを得てこれを検体２とした。収率は約５．５％であり、天然物から製造するには十分な収量であり、この製造方法が優れた製法であることが確認された。

以下に、ヘスペレチン誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）

上記のように得られた検体２をエタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。

さらに、これを核磁気共鳴装置（９０ＭＨｚ、Ｈ−ＮＭＲ、ブルカー製）で解析した結果、検体１と検体２からヘスペレチンの１分子とフェルラ酸の２分子からなるヘスペレチン誘導体が検出された。

すなわち、重水素化ジメチルスルホキシド中のＨ−ＮＭＲ測定の結果、ピークの位置は２．９９２、３．１４３、３．９３９、４．１５５、４．２１６、４．２４８、５．６０３、６．８３０、６．９９６、７．１２５、７．２１０、７．２４６、７．５６８、７．７２５、７．７３６、８．１４３、９．０７４、１０．０１０及び１３．２７４ｐｐｍに認められた。

上記の解析結果から化学的に合成した標準品と同一構造を呈することが判明した。すなわち、検体２からヘスペレチン１分子とフェルラ酸の２分子がエーテル結合した目的とするヘスペレチン誘導体であると確認できた。

以下にヒト皮膚表皮細胞を用いた皮膚作用試験について述べる。なお、この試験方法は生化学的に成分の効果を検証できる再現性のある常法である。
（試験例２）

クラボウより購入したヒト由来表皮細胞（表皮由来、エピーダーセル）を用いた。培養液として５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ製）に播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。ここに紫外線照射装置（クオークテクノロジー製）により２８０ｎｍの紫外線を１時間照射した。ここに、前記の検体１、検体２及び陽性対照としてＥＧＦ（フナコシ製、表皮成長因子）をいずれも０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養して試験した。

培養液を採取後、表皮細胞の生存率をトリパンブルー法により計数した。その後、表皮細胞の懸濁液を調製した。ここからｍＲＮＡを核酸抽出キット（フナコシ製）により抽出した。常法に従い、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＤＮＡポリメラーゼ及び８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１と略す）のｍＲＮＡを定量した。同時に、細胞懸濁液中の８−ＯＨｄＧ量をキット（日本老化制御研究所製）にて定量した。８−ＯＨｄＧに特異的なモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡキットである。

なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。溶媒を添加した溶媒対照群と比較した。

その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加によりヒト由来表皮細胞数は溶媒対照群に比して平均値として１８９％に増加した。また、検体２では２７４％に増加した。一方、ＥＧＦでは１６６％となった。この結果、検体１及び検体２の方がＥＧＦよりも優れた細胞活性化作用を呈した。

上記の細胞中のＤＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では１２コピー、検体１処理群では２４４コピー、検体２処理群では１４８０コピ−、ＥＧＦ処理群では１２９コピーであった。

ＤＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で著しく、ＥＧＦより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復酵素の活性化作用を示していた。

上記の細胞中のＯＧＧ１のｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では１８コピー、検体１処理群では３１１コピー、検体２処理群では２０９８コピ−、ＥＧＦ処理群では２２１コピーであった。

ＯＧＧ１のｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で高く、ＥＧＦより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復酵素の活性化作用を示していた。

上記の細胞中の８ＯＨｄＧ量は溶媒対照群では５７０ｎｇ、検体１処理群では４３ｎｇ、検体２処理群では２６ｎｇ、ＥＧＦ処理群では４８８ｎｇであった。

８ＯＨｄＧは遺伝子が活性酸素により修飾された変異した状態であり、遺伝子の障害をあらわしている。検体１及び検体２でこの値が低く、ＥＧＦの働きより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復の活性化作用を示していた。

一方、安全性試験の一環として人工皮膚であるＥｐｉＳｋｉｎ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）を用いた皮膚刺激性実験では、検体１及び検体２の添加により刺激性は認められず、安全性が確認された。なお、この方法は細胞を用いる皮膚刺激性試験評価法として動物を使用しない方法として確立されている。

以下にヒト神経細胞の障害モデルを用いた障害に対する試験について述べる。なお、この試験方法は生化学的に成分の働きを検証できる再現性のある常法である。
（試験例３）

コスモバイオから購入したヒト神経細胞（Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ（ＨＮ））を用いた。培養液として専用の培養液（神経細胞増殖培地）を用いて培養した１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。これに１％の神経毒であるアクリルアミド水溶液を添加して神経細胞を刺激した。

ここに、前記の実施例１で得られた検体１及び検体２、陽性対照としてＮＧＦ（フナコシ(株)、ヒトタイプ）をいずれも０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。

培養終了後、細胞数を顕微鏡的に計数した。さらに、上記と同様の方法により、遺伝子修復の働きを検証した。すなわち、細胞の懸濁液を調製し、ここからｍＲＮＡを核酸抽出キット（フナコシ製）により抽出した。常法に従い、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＤＮＡポリメラーゼ及び８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１と略す）のｍＲＮＡを定量した。同時に、細胞懸濁液中の８−ＯＨｄＧ量をキット（日本老化制御研究所製）にて定量した。８−ＯＨｄＧに特異的なモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡキットである。

その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加により神経細胞数は溶媒対照群に比して平均値として１６１％に増加した。また、検体２では２２６％に増加した。一方、ＮＧＦでは１３８％となった。この結果、検体１及び検体２の方がＮＧＦよりも優れた細胞活性化作用を呈した。

上記の細胞中のＤＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では２０コピー、検体１処理群では２５０コピー、検体２処理群では１５１１コピ−、ＮＧＦ処理群では１２８コピーであった。

ＤＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で高く、ＮＧＦより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復酵素の活性化作用を示していた。

上記の細胞中のＯＧＧ１のｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では２４コピー、検体１処理群では２３９コピー、検体２処理群では１７７８コピ−、ＮＧＦ処理群では１９１コピーであった。

ＯＧＧ１のｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で高く、ＮＧＦより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復酵素の活性化作用を示していた。

上記の細胞中の８ＯＨｄＧ量は溶媒対照群では２４９ｎｇ、検体１処理群では３１ｎｇ、検体２処理群では１９ｎｇ、ＮＧＦ処理群では１９１ｎｇであった。

８ＯＨｄＧは遺伝子が活性酸素により修飾された変異した状態であり、遺伝子の障害をあらわしている。検体１及び検体２でこの値が低く、ＮＧＦの働きより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復の活性化作用を示していた。

本発明で得られるヘスペレチン誘導体は遺伝子修復を活性化させ、皮膚細胞や神経細胞などの細胞機能を増進させる。これにより国民のＱＯＬを改善し、健康な労働人口を増加させ、かつ、医療費を削減できる。

本発明で得られるヘスペレチン誘導体は皮膚の細胞を増加させ、遺伝子修復作用を活性化した。これにより化粧料としてシワやタルミなどの皮膚トラブルに悩む方の皮膚の改善に貢献し、化粧品業界の発展に寄与する。

本発明で得られるヘスペレチン誘導体は発酵法により製造されることから機能性を有する食品として利用でき、食品産業や発酵業界の発展に寄与する。

Claims (2)

1. 下記の式（１）で示される遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体。
   
2. キンカンの果実、大豆粉末と納豆菌を添加して発酵させた発酵液をベニコウジ菌で発酵させる工程からなる請求項１の式（１）で示される遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体の製造方法。