JP6236864B2 - 癌の検出方法及び膵臓特異的リボヌクレアーゼ1を認識する抗体 - Google Patents
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Description
(1)糖タンパク質のN型糖鎖修飾可能部位であって、N型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定することを特徴とする癌の検出方法。
(2)癌が膵臓癌である、(1)に記載の方法。
(3)糖タンパク質が膵臓特異的RNase 1である(1)又は(2)に記載の方法。
(4)膵臓癌患者では健常人に比べてN型糖鎖が結合している部位の量が増加する、(2)又は(3)に記載の方法。
(5)下記A,Bにおいて、AとBとの比を求めることを特徴とする、癌の検出方法。
A=糖タンパク質のN型糖鎖修飾可能部位であって、N型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量
B=糖タンパク質のN型糖鎖修飾可能部位の量
(6)癌が膵臓癌である、(5)に記載の方法。
(7)糖タンパク質が膵臓特異的RNase 1である(5)又は(6)に記載の方法。
(8)上述の(6)又は(7)に記載の方法において、A=N型糖鎖が結合していない部位の量、であり、膵臓癌患者では、健常人と比べて、A/Bの値が小さくなる方法。
(9)上述の(6)又は(7)に記載の方法において、A=N型糖鎖が結合している部位の量、であり、膵臓癌患者では、健常人と比べて、A/Bの値が大きくなる方法。
(10)上述の(7)〜(9)いずれかに記載の方法において、膵臓特異的RNase 1の量を求め、その値を換算してBの値とする方法。
(11)N型糖鎖修飾可能部位が、配列番号2に示された配列の34番目、76番目及び88番目から選ばれる1つ以上のアスパラギン残基である、(1)〜(10)いずれか1項に記載の方法。
(12)N型糖鎖修飾可能部位が、配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基である、(11)に記載の方法。
(13)N型糖鎖修飾可能部位が、配列番号2に示された配列の76番目のアスパラギン残基である、(11)に記載の方法。
(14)N型糖鎖修飾可能部位が、配列番号2に示された配列の34番目のアスパラギン残基である、(11)に記載の方法。
(15)膵臓特異的RNase 1のN型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片。
(16)膵臓特異的RNase 1のN型糖鎖修飾可能部位に、糖鎖が結合していない場合に結合し、N型糖鎖が結合している場合に結合が阻害される、(15)に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
(17)抗原認識部位が、配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基を含む領域である(15)又は(16)に記載のモノクローナル抗体またはその断片。
(18)上述の(15)〜(17)のいずれか1項に記載されたモノクローナル抗体またはその断片と同時に膵臓特異的RNase 1に結合できることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその断片。
(19)(a)上述の(15)〜(17)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその断片、及び試料、を接触させ、(a)のモノクローナル抗体またはその断片と複合体を形成した膵臓特異的RNase 1を測定する、(1)〜(14)のいずれか1項に記載の方法。
(20)上述の(19)において、さらに(b)上述の(18)に記載のモノクローナル抗体またはその断片、を試料と接触させ、(a)及び(b)の2つのモノクローナル抗体または抗体断片と複合体を形成した膵臓特異的RNase 1を測定する方法。
(21)上述の(20)に記載の方法において、試料を、(a)又は(b)の一方と接触させる第一の接触工程と、第一の接触工程で得られたものに(a)又は(b)の他方を接触させる第二の接触工程を含む方法。
(22)上述の(15)〜(17)のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその断片を含有することを特徴とする医薬品。
(23)糖タンパク質のN型糖鎖修飾可能部位であって、N型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を質量分析法によって求める、(1)〜(14)いずれか1項に記載の方法。
(24)上述の(23)に記載の方法において、糖タンパク質のペプチド断片および/または糖ペプチド断片の質量を質量分析法によって測定する方法。
A=糖タンパク質のN型糖鎖修飾可能部位であって、N型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量
B=糖タンパク質のN型糖鎖修飾可能部位の量
癌としては特に限定されるものではないが、特に膵臓癌を検出することができる。測定対象となる糖タンパク質としては、特に限定はされないが、膵臓特異的RNase 1が好ましい。
免疫原の調製
ヒト膵臓特異的RNase 1全長を含むポリペプチドを取得するために、昆虫細胞で発現可能なプラスミドベクターに成熟型ヒト膵臓特異的RNase 1(配列番号2)をコードする遺伝子配列を挿入した発現プラスミドを作製した。詳しく説明すると、昆虫細胞組換えタンパク質発現用プラスミドであるpIZ/V5His vector(ライフテクノロジー社)のマルチクローニングサイトに、5’上流側からヒトイムノグロブリンカッパー鎖をコードする遺伝子配列、Hisタグをコードする遺伝子配列、FLAGタグをコードする遺伝子配列、ヒト膵臓特異的RNase 1をコードする遺伝子配列(配列番号1)からシグナルペプチドであるアミノ酸1番から28番までに相当する84核酸残基の遺伝子を除いた領域(配列番号2)を挿入した。作製された発現プラスミドpIZ−KFH−hRNase1は、昆虫細胞株Sf9にCellfectin II (ライフテクノロジー社)を用いて遺伝子導入を実施したことにより、N末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加した組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌されたタンパク質は、培養上清から抗ヒトイムノグロブリンカッパー軽鎖抗体を用いたアフィニティー精製により濃縮精製して免疫原とした。
上述の免疫原を用いてマウスおよびラットに免疫を実施した。詳しくは、マウスへの免疫の場合、100μgの免疫原をフロイント完全アジュバンドと共に、6週齢Balb/c雌マウス腹腔に投与し初回免疫とした。その後、7日後、14日後、21日後、28日後、35日後に免疫原100μgをフロイント不完全アジュバンドと共に腹腔投与し、追加免疫とした。さらに、42日後に免疫原100μgを生理食塩水と共に腹腔投与し、最終免疫とした。ラットへの免疫の場合は、100μgの免疫原をフロイント完全アジュバンドと共に、6週齢WHY雌ラット両後肢フットパッドへ投与し初回免疫とした。その後、28日後に免疫原100μgを生理食塩水と共に後肢フットパッドへ投与し、最終免疫とした。
最終免疫の3日後に、マウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。ラットからは、腸骨リンパ節と鼠蹊リンパ節を摘出し、リンパ節細胞を得た。マウス脾臓細胞およびラットリンパ節細胞は、それぞれマウスミエローマ細胞株と電気細胞融合法により融合させた後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを添加したGIT培地(和光純薬工業株式会社)で細胞培養用96ウェルプレートに播種することにより、融合細胞を選択した。
マウス抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体産生融合細胞株は、融合細胞が培地中に分泌する抗体の、組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1に対する反応性を指標にしたELISA法によるスクリーニングにより選択した。スクリーニングに用いたELISAは以下の通りである。96穴マイクロタイタープレート(グライナー社製)の各ウェルに25ngのヤギ抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体(シグマアルドリッチ社製)を含むリン酸緩衝液(50mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4)を50μl加えて4℃16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(20 mM Tris−HCl, 150 mM NaCl,pH7.4)で3回洗浄した後、3%BSAを含むブロッキング溶液(3%BSA,20mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH7.4)を200μl加えて室温で2時間放置してブロッキングを行った(抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体固相化プレート)。各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後、0.5μg/mlとなるように希釈液(1%BSA、20mM Tris−HCl,150mM NaCl、0.05%Tween−20、pH7.4)で希釈した組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1を加え、室温で1時間放置した。各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液(20mM Tris−HCl,150mM NaCl、0.05% Tween−20、pH7.4)で3回洗浄した後、50μlの融合細胞培養上清を加えて室温で1時間放置した。次に、各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液で3回洗浄した後、0.01μgのホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識された抗マウスIgG抗体(Rockland社製)を含む希釈液を50μl加えて、室温で1時間放置した。最後に、各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液で3回洗浄した後、50μlのテトラメチルベンジジン(TMB)溶液(KPL社製)を添加して15分間発色させた後に、1Mのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、膵臓特異的RNase 1に強い親和性を示す抗体を産生する融合細胞を得た。得られた融合細胞は、限界希釈法によりモノクローン化され、モノクローナル抗体MrhRN0614を得た。
ラット抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体産生融合細胞株は、融合細胞が培地中に分泌する抗体の、ヒト膵臓癌細胞(Capan1)由来の膵臓特異的RNase 1に対する反応性を指標にしたELISA法によるスクリーニングにより選択した。スクリーニングに用いたELISAは以下の通りである。96穴マイクロタイタープレート(グライナー社製)の各ウェルに25ngのマウス抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体(MrhRN0614)を含むリン酸緩衝液(50mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4)を50μl加えて4℃、16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(20mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH7.4)で3回洗浄した後、3%BSAを含むブロッキング溶液(3%BSA,20mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH7.4)を200μl加えて室温で2時間放置してブロッキングを行った(抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体固相化プレート)。各ウェルを300μlの洗浄液(20mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH7.4)で3回洗浄した後、希釈液(1%BSA、20mM Tris−HCl,150mM NaCl、0.05% Tween−20、pH7.4)で2倍に希釈したヒト膵臓癌細胞(Capan1)の培養上清を加え、室温で1時間放置した。各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液(20mM Tris−HCl,150mM NaCl、0.05% Tween−20、pH7.4)で3回洗浄した後、50μlの融合細胞培養上清を加えて室温で1時間放置した。次に、各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液で3回洗浄した後、0.01μgのHRP標識された抗ラットIgG抗体(American Qualex Antibodies社製)を含む希釈液を50μl加えて、室温で1時間放置した。最後に、各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液で3回洗浄した後、50μlのTMB溶液を添加して15分間発色させた後に、1Mのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、膵臓特異的RNase 1に強い親和性を示す抗体を産生する融合細胞を得た。得られた融合細胞は、限界希釈法によりモノクローン化され、モノクローナル抗体RrhRN0723を得た。
哺乳動物発現系による組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1の調製
哺乳動物細胞でヒト膵臓特異的RNase 1全長を含むポリペプチドを取得するために、pcDNA3.1−mycHisベクター(ライフテクノロジー社)にヒト膵臓特異的RNase 1をコードする遺伝子配列(配列番号2)を挿入した発現ベクターを作製した。より詳しくは、免疫原の調製のために作製した昆虫細胞発現用プラスミド(pIZ−KFH−hRNase1)の組換え体タンパク質をコードする遺伝子配列部分を分子生物学的手法によりpcDNA3.1−mycHisベクター(ライフテクノロジー社)に挿入してpcDNA−KFH−hRNase1を作製した。作製した哺乳動物細胞用発現プラスミドは、チャイニーズハムスター卵巣由来培養細胞株(以下、CHO−K1株)にLipofectamine 2000(ライフテクノロジー社)を用いて遺伝子導入を実施したことにより、N末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加した組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌されたタンパク質は、培養上清から抗ヒトイムノグロブリンカッパー軽鎖抗体を用いたアフィニティー精製により濃縮精製して組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1を取得した。精製された組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1は、抗体の特異性を明らかにする実験に供された。
前項で作製した発現ベクター(pcDNA−KFH−hRNase1)を鋳型として、RCR変異導入法によってアミノ酸置換変異を繰り返し導入することで、糖鎖修飾欠損変異導入抗原を発現するプラスミドを作製した。PCR変異導入法には、PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ株式会社)を使用し、添付の説明書に従って実施した。詳しくは、N型糖鎖修飾可能部位のコンセンサス配列(Asn−Xaa−Ser/Thr、Xaaはプロリン以外のアミノ酸残基を指す)の3番目のアミノ酸残基をセリン残基もしくはスレオニン残基以外のアミノ酸に置換することで、糖鎖修飾欠損変異組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1を発現するプラスミドを作製した(表1)。作製した糖鎖修飾欠損変異導入発現プラスミドは、CHO−K1株にLipofectamine 2000(ライフテクノロジー社)を用いて遺伝子導入を実施したことにより、N末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加した糖鎖修飾欠損変異組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌された糖鎖修飾欠損変異組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1は、抗体の特異性を明らかにする実験に供された。
糖鎖修飾欠損変異組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1に対する抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体の反応性は、以下に記載するサンドイッチELISA法により測定した。96穴マイクロタイタープレート(グライナー社製)の各ウェルに25ngのヤギ抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体(シグマアルドリッチ社製)を含むリン酸緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4)を50μl加えて4℃16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(20mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH7.4)で3回洗浄した後、3%BSAを含むTBS溶液を200μl加えて室温で2時間放置してブロッキングを行った(抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体固相化プレート)。各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後、前述の糖鎖修飾欠損変異導入発現プラスミドが遺伝子導入されたCHO−KI細胞の培養上清を加え、室温で1時間放置した。各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液(20mM Tris−HCl,150mM NaCl、0.05% Tween−20、pH7.4)で3回洗浄した後、25ngのHRP標識マウス抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体(MrhRN0614)または、25ngのHRP標識ラット抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体(RrhRN0723)を含む希釈液を50μl加え、室温で1時間放置した。最後に、各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液で3回洗浄した後、50μlのTMB溶液を添加して10分間発色させた後に、1Mのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。
前述の発現ベクター(pcDNA−KFH−hRNase1)を鋳型として、RCR変異導入法によってアミノ酸置換変異を導入することで、アミノ酸置換変異導入抗原を発現するプラスミドを作製した。PCR変異導入法には、PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ株式会社)を使用し、添付の説明書に従って実施した。詳しくは、配列番号2において85番目のアミノ酸から92番目のアミノ酸残基をそれぞれ別のアミノ酸残基に置換することで、アミノ酸置換変異組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1を発現するプラスミドを作製した(表2)。作製したアミノ酸置換変異導入発現プラスミドは、CHO−K1株にLipofectamine 2000(ライフテクノロジー社)を用いて遺伝子導入を実施したことにより、N末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加したアミノ酸置換変異導入組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌されたアミノ酸置換変異導入組換え体ヒト膵臓特異的RNase 1は、抗体の特異性を明らかにする実験に供された。
アミノ酸置換変異導入抗原に対する抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体の反応性は、以下に記載するサンドイッチELISA法により測定した。96穴マイクロタイタープレート(グライナー社製)の各ウェルに25ngのヤギ抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体(シグマアルドリッチ社製)を含むリン酸緩衝液(50mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4)を50μl加えて4℃16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(20 mM Tris−HCl,150mM NaCl,pH7.4)で3回洗浄した後、3%BSAを含むTBS溶液を200μl加えて室温で2時間放置してブロッキングを行った(抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体固相化プレート)。各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後、アミノ酸置換変異導入抗原を発現するプラスミドが遺伝子導入されたCHO−KI細胞の培養上清を加え、室温で1時間放置した。各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液(20mM Tris−HCl,150mM NaCl、0.05% Tween−20、pH7.4)で3回洗浄した後、25ngのHRP標識マウス抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体(MrhRN0614)または、25ngのHRP標識ラット抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体(RrhRN0723)を含む希釈液を50μl加え、室温で1時間放置した。最後に、各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液で3回洗浄した後、50μlのTMB溶液を添加して10分間発色させた後に、1Mのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。
CHO−K1細胞で発現させた88番目アスパラギン残基のみが糖鎖修飾を受ける糖鎖修飾欠損変異導入ヒト膵臓特異的RNase 1(m001)をウエスタンブロット法により分析した。即ち、変異未導入組換え抗原WTと糖鎖修飾欠損変異導入抗原m001を、抗ヒトイムノグロブリンカッパー軽鎖抗体を使用して免疫沈降後にSDS−PAGE法により分離した。分離されたタンパク質は、PVDF膜に転写した後に膵臓特異的RNase 1のN末端側14アミノ酸配列を認識する抗ヒト膵臓特異的RNase 1抗体(RN15013)と反応させて検出した。発現した組換え体タンパク質のうち、WTでは糖鎖が付加していない分子から糖鎖が1、2、3箇所に付加した分子まで検出され糖鎖付加量にばらつきがあり、m001では糖鎖が一箇所付加した分子と糖鎖が付加していない分子の2種類が含まれることが明らかとなった(図3)。
生体試料を被検体として以下のサンドイッチELISAによって測定した。
ヒト生体試料中の膵臓特異的RNase 1のN型糖鎖修飾可能部位のうち、N型糖鎖が結合していない部位を測定するために、健常人血清(40検体)、膵臓癌患者血清(50検体、BioTheme社)、膵臓疾患患者血清(非癌、12検体、BioTheme社)、乳癌患者血清(20検体 BioTheme社)、良性乳腺腫瘍患者血清(18検体)、前立腺癌患者血清(24検体、SLR社)、前立腺肥大症患者血清(24検体、SLR社)を用意した(表3)。
以下の手順に従って、膵臓特異的RNase 1の糖鎖修飾可能部位Asn88を認識して結合する抗体を作製し、ウェスタンブロット法の1次抗体として使用した。
配列番号2のアミノ酸配列85〜95に相当する部分を化学合成したペプチド(配列番号4)をKLHに縮合して免疫原とし、それを用いてラットに免疫を実施した。詳しくは、100μgの免疫原をフロイント完全アジュバンドと共に、6週齢WHY雌ラット両後肢フットパッドへ投与し初回免疫とした。その後、28日後に免疫原100μgを生理食塩水と共に後肢フットパッドへ投与し、最終免疫とした。
最終免疫の3日後に、免疫したラットの腸骨リンパ節と鼠蹊リンパ節を摘出し、リンパ節細胞を得た。ラットリンパ節細胞は、マウスミエローマ細胞株と電気細胞融合法により融合させた後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを添加したGIT培地(和光純薬工業株式会社)で細胞培養用96ウェルプレートに播種することにより、融合細胞を選択した。
前述の融合細胞が培地中に分泌する抗体について、スクリーニング用ペプチド(配列番号5又は6)をBSAに縮合させたスクリーニング抗原を用いたELISA法によりスクリーニングを行い、ラット抗ヒト膵臓特異的RNase 1ペプチド抗体産生融合細胞株を選択した。スクリーニングに用いたELISAは以下の通りである。96穴マイクロタイタープレート(グライナー社製)の各ウェルに、25ngのスクリーニング用ペプチド縮合BSAを含むリン酸緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.4)をそれぞれ50μl加えて4℃、16時間固定した。これらのウェルを300μlの洗浄液(20mM Tris−HCl,150mM NaCl、pH7.4)で3回洗浄した後、3%BSAを含むブロッキング溶液(3%BSA,20mM Tris−HCl,150mM NaCl、pH7.4)を200μl加えて室温で2時間放置してブロッキングを行った(スクリーニング用ペプチド縮合BSA固相化プレート)。各ウェルを300μlの洗浄液で3回洗浄した後、50μlの融合細胞培養上清をそれぞれのウェルに加えて室温で1時間放置した。次に、各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液で3回洗浄した後、0.01μgのHRP標識された抗ラットIgG抗体(American Qualex Antibodies社製)を含む希釈液を50μl加えて、室温で1時間放置した。最後に、各ウェルを300μlの界面活性剤を含む洗浄液で3回洗浄した後、50μlのTMB溶液を添加して15分間発色させた。その後、1Mのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。抗ヒト膵臓特異的RNase 1ペプチド抗体産生融合細胞株の選定基準は、前述のスクリーニング用ペプチドのうち、配列番号5のペプチドに反応し、かつ配列番号6のペプチドには反応しない抗体を産生する融合細胞とした。なお、配列番号5のペプチドは、天然型の膵臓特異的RNase 1(配列番号2)の85〜95番目に相当する配列を含むものである。また配列番号6のペプチドは、配列番号5のペプチドにおいて5番目のAsn残基をAsp残基に置換した配列に相当し、当該置換箇所は配列番号2の88番目Asn残基に相当するものである。
得られたラット抗ヒト膵臓特異的RNase 1ペプチド抗体(RN3F34)の抗原認識特異性を確認する為に、Asn88の糖鎖修飾可能部位のみが残された糖鎖修飾欠損変異導入ヒト膵臓特異的RNase 1(m001)に対する反応性を、ウェスタンブロット法により確認した。図8に示すように膵臓特異的RNase 1のN末端側14アミノ酸配列に結合する抗体RN15013では、m001に糖鎖が結合した高分子量側の分子と、糖鎖が結合していない低分子量側の分子の両方が検出された。これに対して、RN3F34抗体では、糖鎖が結合していない低分子量側の分子のみが検出された。以上の結果から、作製したラット抗ヒト膵臓特異的RNase 1ペプチド抗体(RN3F34)は、Asn88に糖鎖が結合した構造の膵臓特異的RNase 1には結合しない抗体であることが確認された。
ラット抗ヒト膵臓特異的RNase 1ペプチド抗体(RN3F34)を使用して、PNGaseFによる脱糖鎖処理をしたヒト血清中の膵臓特異的RNase 1をウェスタンブロット法で検出し、ヒト血清中の膵臓特異的RNase 1のAsn88における糖鎖結合の有無を測定した。即ち、健常人血清5検体と膵臓癌患者血清6検体から、MrhRN0614抗体を使用して免疫沈降法により膵臓特異的RNase 1を抽出し、可溶化変性バッファーで膵臓特異的RNase 1を変性した後に、PNGaseFによって脱糖鎖処理を行った。処理された試料は、ウェスタンブロット法によって解析した。検出には、膵臓特異的RNase 1のN末端側14アミノ酸配列を認識するRN15013と、抗ヒト膵臓特異的RNase 1ペプチド抗体RN3F34を使用した。図9に示したように、RN15013では健常人血清、膵臓癌患者血清ともに一定量の膵臓特異的RNase 1が検出され、両者の間に著しい差は認められなかった。一方、RN3F34による検出では、健常人血清では膵臓特異的RNase 1が検出されたのに対し、膵臓癌患者血清では検出されない、または検出量が健常人血清と比べて著しく低いという結果となった。この結果から、膵臓癌患者血清中の膵臓特異的RNase 1は、健常人血清に比べて、Asn88にN型糖鎖が結合している場合が多いことが確認できた。
ヒト膵臓特異的RNase 1を特異的に認識し、かつ3つの糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に拘らず結合可能な2つの抗体を使用した免疫測定試薬と、Asn88に糖鎖が結合していないRNase 1を特異的に測定する免疫測定試薬を作製して、それぞれの試薬で血清試料中のRNase 1を測定した。具体的には、ヒト膵臓特異的RNase 1を特異的に認識し、かつ3つの糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に拘らず結合可能な2つの抗体としては、前述のMrhRN0614とRrhRN1111を用いた。RrhRN1111は、RrhRN0723を取得した際に、3つの糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に拘らず結合可能な抗体として単離されたものである。RrhRN1111の抗原認識特異性は、実施例2で抗体の特異性の測定に使用した、糖鎖修飾欠損変異抗原を用いたELISA法と同じ方法で検討した。結果を図10に示す。横軸は、各抗体が変異未導入組換え抗原WTに対する結合量を1.0とした時の相対値を示す。縦軸は、各糖鎖修飾欠損変異導入抗原を示す。塗りつぶしの横棒はRrhRN0723抗体の結合量、白抜きの横棒はRrhRN1111抗体の結合量を示す。図10に示した通り、RrhRN0723は、糖鎖修飾可能部位全てに変異を入れ糖鎖修飾を全く受けない変異体m000に対して反応性がないのに対して、RrhRN1111のm000に対する反応性は、変異未導入組換え抗原WTと比べて約90%の反応性を保持している。よって、RrhRN1111は3つの糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に拘らず結合可能な抗体であると確認された。
F3/t=F3値/トータル値 (1)
図11にその結果を示す。健常人から得られた血清検体中のF3/t値は、0.8−1.0前後であるのに対して、膵臓癌患者検体から得られた検体においては、0.1−0.7前後に幅広く分布しており、健常人検体と有意に差があることが確認できた。
G3/t=1−(F3/t) (2)
実施例6 抗原固相競合法による測定
膵臓特異的RNase 1のAsn88糖鎖修飾可能部位において糖鎖が結合していない部位の量を、抗原固相競合法により測定する方法を構築した。即ち、膵臓癌由来培養細胞株Capan 1の培養上清から、RrhRN0723固定化カラムを使用してRrhRN0723抗体に反応するRNase 1を精製した。この抗原を濃縮後、タンパク質測定キットにより抗原溶液のタンパク質濃度を決定した。精製したRNase 1は、ビオチン導入試薬 (sulfoNHS−LCLC−biotin、Thermo scientific社製)を用いてビオチン化し、固相用抗原とした。ストレプトアビジン固定化ダイナビーズ(Dynal社)に対して、100μlビーズ懸濁液に対して約2.5μgの上述のRNase 1を固定化して抗原固相化ビーズを作製した。
Claims (11)
- 膵臓特異的リボヌクレアーゼ1の配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基であって、N型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定し、膵臓癌患者では健常人に比べてN型糖鎖が結合している部位の量が増加することを特徴とする、膵臓癌の検出方法。
- 下記A,Bにおいて、AとBとの比を求め、
A=膵臓特異的リボヌクレアーゼ1の配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基であって、N型糖鎖が結合していない部位の量
B=膵臓特異的リボヌクレアーゼ1の配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基の量
膵臓癌患者では、健常人と比べて、A/Bの値が小さくなることを特徴とする、膵臓癌の検出方法。 - 下記A,Bにおいて、AとBとの比を求め、
A=膵臓特異的リボヌクレアーゼ1の配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基であって、N型糖鎖が結合している部位の量
B=膵臓特異的リボヌクレアーゼ1の配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基の量
膵臓癌患者では、健常人と比べて、A/Bの値が大きくなることを特徴とする、膵臓癌の検出方法。 - 請求項2又は3に記載の方法において、膵臓特異的リボヌクレアーゼ1の量を求め、その値を換算してBの値とする方法。
- 膵臓特異的リボヌクレアーゼ1の配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基を含む領域を特異的な抗原認識部位の一部とし、当該アスパラギン残基にN型糖鎖が結合していない場合に特異的に結合し、N型糖鎖が結合している場合に特異的な結合が阻害されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
- (a)請求項5に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、及び試料、を接触させ、(a)のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と複合体を形成した膵臓特異的リボヌクレアーゼ1を測定する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項6に記載の方法において、さらに(b)請求項5に記載されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と同時に膵臓特異的リボヌクレアーゼ1に特異的に結合できるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、を試料と接触させ、(a)及び(b)の2つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と複合体を形成した膵臓特異的リボヌクレアーゼ1を測定する工程を含む方法。
- 請求項7に記載の方法において、試料を、(a)又は(b)の一方と接触させる第一の接触工程と、第一の接触工程で得られたものに(a)又は(b)の他方を接触させる第二の接触工程を含む方法。
- 請求項5に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含有し、請求項1〜4、6〜8のいずれかに記載の方法に用いられることを特徴とする膵臓癌の検出試薬。
- 膵臓特異的リボヌクレアーゼ1の配列番号2に示された配列の88番目のアスパラギン残基であって、N型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を質量分析法によって求める、請求項1〜4いずれか1項に記載の方法。
- 請求項10に記載の方法において、膵臓特異的リボヌクレアーゼ1のペプチド断片および/または糖ペプチド断片の質量を質量分析法によって測定する方法。
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