JP6236185B1 - 脳の機能改善剤および脳の機能改善用飲食品 - Google Patents

Abstract

【課題】天然物由来の化合物の中から脳の機能改善作用を有するものを見出し、それを有効成分とする脳の機能改善剤および当該化合物を配合した脳の機能改善用飲食品を提供する。【解決手段】本発明に係る脳の機能改善剤の有効成分として、下記式（Ｉ）で表される化合物を用いる。また、本発明に係る脳の機能改善用飲食品に、下記式（Ｉ）で表される化合物を配合する。【選択図】なし

Description

本発明は、脳の機能改善剤および脳の機能改善用飲食品に関するものである。

高齢化社会となりつつある近年においては、心身ともに健康でありたいという願望がますます高まっている。ヒトは、高齢になるにつれ記憶力や学習能力が徐々に衰えていく。また、アルツハイマー病やパーキンソン病等においては、神経の変性による認知機能の障害が大きな問題となっている。一方、仕事環境、家庭的事情、人間関係などの様々なストレスによるうつ病等の気分障害をはじめ、高齢でなくとも脳の機能に問題を抱えている患者数は年々増加している。

従来から研究されている脳の機能の改善方法としては、脳における神経細胞への栄養や酸素の供給の改善（例えば、脳内グルコースの上昇、血流の改善等）；シナプス間隙で行われる神経伝達の改善（神経伝達物質の前駆体の供給、神経伝達物質の放出の増加、受容体の活性化、放出された神経伝達物質の変換阻害等）；などが挙げられる。

アルツハイマー病やパーキンソン病等の神経変性疾患においては、アミロイドβやαシヌクレイン等のタンパク質老廃物が脳から除去されずに蓄積し、かかる老廃物の蓄積が前述した神経変性疾患の一因になっていると考えられている。身体の他の部位ではリンパ系がタンパク質老廃物の除去に寄与しているが、リンパ系は脳には存在しないため、脳においてはタンパク質老廃物は分解除去されているものと考えられていた。しかし、近年、脳において、血管周囲腔やアストロサイトを流れる脳脊髄液等がタンパク質老廃物の除去に寄与していること、アストロサイトに高発現した水チャネルであるアクアポリン４（ＡＱＰ４）が脳脊髄液等の流量に大きく寄与していることが発見された（非特許文献１）。さらに、睡眠や麻酔時には脳脊髄液等の流量が増加しアミロイドβの除去速度も高まることが報告され（非特許文献２）、これら一連の脳内経路は「グリンパティック系」と名付けられ注目を集めている。そのため、かかるグリンパティック系の流量を増加させることができれば、アミロイドβやαシヌクレイン等のタンパク質老廃物を脳から効率的に除去することができ、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症といった神経変性疾患の予防、治療または改善につながるものと期待されている。

また、アストロサイトやマイクログリア等の活性化が、様々な脳の機能の障害に関連することが明らかになりつつある。例えば、老化した脳においては、マイクログリアが活性化した状態となって、神経障害因子であるＩＬ−１βの産生亢進が起こっており、神経障害の原因となる。ここで、神経障害の亢進または慢性化は、認知障害、抑うつ等のほか、アルツハイマー病やパーキンソン病等の神経変性疾患と関連があることが分かっている（非特許文献３）。そのため、神経障害を抑制することができれば、老化等による神経障害に起因して低下した認知機能（記憶能力や学習能力等）を改善させることができ、また認知機能障害、気分障害、さらにはアルツハイマー病やパーキンソン病等の神経変性疾患の予防、治療または改善につながるものと考えられている（非特許文献４）。一方で、脳において、ＴＧＦ−βやインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）が、神経障害を抑制する神経保護因子として作用することも知られている（非特許文献５，６）。

一方、食品成分が脳の機能に影響を及ぼすことが近年の研究で明らかになりつつあり、脳の機能改善、抗うつ、抗認知症などに関する効果を有する食品成分が注目されている。例えば、イチョウ葉エキスについては、脳の細胞の活性化作用等が知られている（特許文献１）。

特開２００７−２７７１８３号公報

Sci Transl Med.，2012年，vol.4，issue 147，pp.147ra111 Science，2013年，vol.342，issue 6156，pp.373-377 臨床神経学，2014年，54巻，12号，pp.1119-1121 精神神経学雑誌，2012年，114巻，2号，pp.124-133 Glia，2014年，vol.62，issue 6，pp.881-895 Int. J. Mol. Sci.，2015年，vol.17，issue 1，25

本発明は、天然物由来の化合物の中から脳の機能を改善する作用を有するものを見出し、それを有効成分とする脳の機能改善剤、ならびに当該化合物を配合した脳の機能改善用飲食品を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明に係る脳の機能改善剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とすることを特徴とする。また、本発明に係る脳の機能改善用飲食品は、下記式（Ｉ）で表される化合物を配合したことを特徴とする。

本発明によれば、上記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有させることにより、作用効果に優れた脳の機能改善剤を提供することができる。さらに、上記式（Ｉ）で表される化合物を配合することにより、上記作用に優れた脳の機能改善用飲食品を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態に係る脳の機能改善剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とするものである。また、本実施形態に係る脳の機能改善用飲食品は、下記式（Ｉ）で表される化合物が配合されるものである。

上記式（Ｉ）で表される化合物は、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロピオン酸（3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)propionic Acid）とも呼ばれるケイ皮酸誘導体である。以下、本明細書において、上記式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）ということがある。

化合物（Ｉ）は、例えば、化合物（Ｉ）を含有する植物抽出物から単離・精製することにより製造することができる。この場合、このような化合物（Ｉ）を含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって得ることができる。化合物（Ｉ）を含有する植物としては、例えば、米、大麦、小麦、大豆、小豆、とうもろこし等が挙げられる。

また、化合物（Ｉ）は、例えば、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸（3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)propenoic Acid）もしくはその誘導体、またはこれらを含有する組成物（例えば、植物の破砕物または抽出物等）を、フェノール酸還元酵素を有する微生物により醗酵させ、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸を化合物（Ｉ）に変換した後、得られた醗酵物を抽出・単離・精製することにより製造することもできる。３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸を含有する組成物としては、例えば、コーヒー、コムギ、トウモロコシ、トマト、マテ、ヨモギ、ゴボウ等の植物の破砕物および抽出物などが挙げられる。また、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸は木本植物および草本植物におけるリグニンの構成成分であるため、リグニンまたはこれを含有する組成物を醗酵原料として利用してもよい。一方、フェノール酸還元酵素を有する微生物としては、例えば、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus gallinarum、Enterococus faecalis等の乳酸菌などが挙げられる。

上記植物または醗酵物等から化合物（Ｉ）を抽出・単離・精製する方法は特に限定されず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出処理は、抽出原料としての上記植物または醗酵物を乾燥した後、そのまままたは粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供すればよい。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。

抽出溶媒としては、極性溶媒を使用することが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独でまたは２種以上を組み合わせて、室温または溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。

抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。

２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を抽出溶媒として使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比が９：１〜１：９（容量比）であることが好ましく、７：３〜２：８（容量比）であることがさらに好ましい。また、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族ケトンとの混合比が９：１〜２：８（容量比）であることが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水と多価アルコールとの混合比が５：５〜１：９（容量比）であることが好ましい。

抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温または還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。

以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物または当該抽出液の乾燥物から化合物（Ｉ）を単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、抽出物を展開溶媒に溶解し、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、化合物（Ｉ）を含む画分を回収する方法等が挙げられる。この場合、展開溶媒は使用する固定相に応じて適宜選択すればよいが、例えば固定相としてシリカゲルを用いた順相クロマトグラフィーにより抽出物を分離する場合、展開溶媒としてはクロロホルム：メタノール＝９５：５等が挙げられる。さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られた化合物（Ｉ）を含む画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。

〔脳の機能改善剤〕
以上のようにして得られる化合物（Ｉ）は、優れた脳の機能改善作用を有しているため、脳の機能改善剤の有効成分として用いることができる。本実施形態に係る脳の機能改善剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等の幅広い用途に使用することができる。

なお、本実施形態に係る脳の機能改善剤の有効成分として、単離した化合物（Ｉ）に替えて、化合物（Ｉ）を含有する組成物を用いてもよい。ここで、本実施形態における「化合物（Ｉ）を含有する組成物」には、化合物（Ｉ）を含有する植物を抽出原料として得られる抽出物、化合物（Ｉ）を含有する醗酵物、および当該醗酵物を抽出原料として得られる抽出物等が含まれる。また、「抽出物」には、抽出処理により得られる抽出液、当該抽出液の希釈液もしくは濃縮液、または当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物が含まれる。

本実施形態に係る脳の機能改善剤の有効成分として、化合物（Ｉ）を含有する組成物を用いる場合は、精製して化合物（Ｉ）の純度を高めたものを使用することが好ましい。化合物（Ｉ）の純度を高めたものを有効成分として使用することによって、より一層作用効果に優れた脳の機能改善剤を得ることができる。

化合物（Ｉ）が有する脳の機能改善作用は、例えば、アストロサイトＡＱＰ４発現促進作用、アストロサイトＴＧＦ−β発現促進作用およびアストロサイトＩＬ−１０発現促進作用からなる群より選択される１種または２種以上の作用に基づいて発揮される。ただし、化合物（Ｉ）が有する脳の機能改善作用は、上記作用に基づいて発揮される脳の機能改善作用に限定されるものではない。

また、化合物（Ｉ）は、そのアストロサイトＡＱＰ４発現促進作用、アストロサイトＴＧＦ−β発現促進作用またはアストロサイトＩＬ−１０発現促進作用を利用して、アストロサイトＡＱＰ４発現促進剤、アストロサイトＴＧＦ−β発現促進剤またはアストロサイトＩＬ−１０発現促進剤の有効成分として使用してもよい。

本実施形態に係る脳の機能改善剤は、化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する組成物のみからなるものでもよいし、化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する組成物を製剤化したものでもよい。

本実施形態に係る脳の機能改善剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。脳の機能改善剤は、他の組成物（例えば、脳の機能改善用飲食品等）に配合して使用することができるほか、錠剤、カプセル剤等として使用することができる。

本実施形態に係る脳の機能改善剤を製剤化した場合、化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する組成物の含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。

なお、本実施形態に係る脳の機能改善剤は、必要に応じて、脳の機能改善作用を有する他の天然抽出物等を、化合物（Ｉ）または化合物（Ｉ）を含有する組成物とともに配合して有効成分として用いることができる。

本実施形態に係る脳の機能改善剤の患者に対する投与方法としては、経口投与、静脈内投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防または治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本実施形態に係る脳の機能改善剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。

本実施形態に係る脳の機能改善剤は、有効成分である化合物（Ｉ）が有するアストロサイトＡＱＰ４発現促進作用、アストロサイトＴＧＦ−β発現促進作用およびアストロサイトＩＬ−１０発現促進作用からなる群より選択される１種または２種以上の作用を通じて、脳におけるタンパク質老廃物のグリンパティック系による除去排出効率を高めるとともに、神経障害を抑制し、さらに神経細胞を保護し、以上の作用により、記憶能力や学習能力の向上；健忘症や老年性認知機能障害の予防、治療または改善；アルツハイマー病やパーキンソン病等の神経変性疾患の予防、治療または改善；うつ病等の気分障害の予防、治療または改善；に用いることができる。ただし、本実施形態に係る脳の機能改善剤は、これらの用途以外にもアストロサイトＡＱＰ４発現促進作用、アストロサイトＴＧＦ−β発現促進作用またはアストロサイトＩＬ−１０発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

また、本実施形態に係る脳の機能改善剤は、優れた脳の機能改善作用を有するので、これらの作用機構に関する研究のための試薬としても好適に利用することができる。

〔脳の機能改善用飲食品〕
化合物（Ｉ）は、優れた脳の機能改善作用を有しているため、脳の機能改善用の飲食品に配合するのに好適である。この場合、化合物（Ｉ）をそのまま配合してもよいし、化合物（Ｉ）から製剤化した脳の機能改善剤を配合してもよい。

ここで、飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口または消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品等の区分に制限されるものではない。したがって、本実施形態における「飲食品」は、経口的に摂取される一般食品、健康食品（機能性飲食品）、保健機能食品（特定保健用食品，栄養機能食品）、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。

化合物（Ｉ）または上記脳の機能改善剤を飲食品に配合することにより、脳の機能改善作用、アストロサイトＡＱＰ４発現促進作用、アストロサイトＴＧＦ−β発現促進作用またはアストロサイトＩＬ−１０発現促進作用を飲食品に付与することができる。

化合物（Ｉ）、または化合物（Ｉ）から製剤化した脳の機能改善剤を飲食品に配合して脳の機能改善用飲食品とする場合、それらにおける有効成分の配合量は、使用目的、症状、性別等を考慮して適宜変更することができるが、添加対象となる飲食品の一般的な摂取量を考慮して、成人１日あたりの抽出物摂取量が約１〜１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。なお、添加対象飲食品が顆粒状、錠剤状またはカプセル状の飲食品の場合、化合物（Ｉ）、または化合物（Ｉ）から製剤化した脳の機能改善剤の添加量は、添加対象飲食品に対して通常０．１〜１００質量％であり、好ましくは５〜１００質量％である。

本実施形態に係る脳の機能改善用飲食品は、化合物（Ｉ）をその活性を妨げないような任意の飲食品に配合したものであってもよいし、化合物（Ｉ）を主成分とする栄養補助食品であってもよい。

本実施形態に係る脳の機能改善用飲食品を製造する際には、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類などの任意の助剤を添加して任意の形状の飲食品にすることができる。

化合物（Ｉ）を配合し得る飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液および調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などが挙げられ、これらの飲食品に化合物（Ｉ）を配合するときに、通常用いられる補助的な原料や添加物を併用することができる。

なお、本実施形態に係る脳の機能改善剤および脳の機能改善用飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ，ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。

以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。なお、本試験例においては、被験試料として化合物（Ｉ）（東京化成工業社製，3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)propionic Acid，試料１）を使用した。

〔試験例１〕アストロサイトにおけるＡＱＰ４ ｍＲＮＡ発現促進作用試験
化合物（Ｉ）（試料１）について、以下のようにしてアストロサイトにおけるＡＱＰ４ ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。

正常マウス由来アストロサイト（ＡＳＴＣ５７）を、７５ｃｍ² フラスコにてアストロサイト用培養メディウム（ＡＳＴＭ）を用い、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＡＳＴＭで希釈した後、３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に２ｍＬずつ播種し（３×１０^５ ｃｅｌｌｓ／シャーレ）、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下でサブコンフルエントになるまで培養した。

培養後に培地を除去し、ＡＳＴＭに溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＡＳＴＭを用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、RNAqueous phenol free total RNA isolation kit（invitrogen社製，Cat. No. AM1912）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、１００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。

この総ＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ４および内部標準であるβ−アクチンについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＡＱＰ４ ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、β−アクチンの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりＡＱＰ４ ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。

ＡＱＰ４ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加時の補正値
Ｂ：試料無添加時の補正値
結果を表１に示す。

表１に示すように、化合物（Ｉ）（試料１）は、優れたＡＱＰ４ ｍＲＮＡ発現促進作用を有していることが確認された。

〔試験例２〕アストロサイトにおけるＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡ発現促進作用試験
化合物（Ｉ）（試料１）について、以下のようにしてアストロサイトにおけるＴＧＦ−β ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。

正常マウス由来アストロサイト（ＡＳＴＣ５７）を、７５ｃｍ² フラスコにてアストロサイト用培養メディウム（ＡＳＴＭ）を用い、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＡＳＴＭで希釈した後、３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に２ｍＬずつ播種し（３×１０^５ ｃｅｌｌｓ／シャーレ）、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下でサブコンフルエントになるまで培養した。

培養後に培地を除去し、ＡＳＴＭに溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表２を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＡＳＴＭを用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、RNAqueous phenol free total RNA isolation kit（invitrogen社製，Cat. No. AM1912）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、１００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。

この総ＲＮＡを鋳型とし、ＴＧＦ−β１および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。

ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加時の補正値
Ｂ：試料無添加時の補正値
結果を表２に示す。

表２に示すように、化合物（Ｉ）（試料１）は、優れたＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡ発現促進作用を有していることが確認された。

〔試験例３〕ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現促進作用試験
化合物（Ｉ）（試料１）について、以下のようにしてＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。

正常マウス由来アストロサイト（ＡＳＴＣ５７）を、７５ｃｍ² フラスコにてアストロサイト用培養メディウム（ＡＳＴＭ）を用い、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＡＳＴＭで希釈した後、３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に２ｍＬずつ播種し（３×１０^５ ｃｅｌｌｓ／シャーレ）、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下でサブコンフルエントになるまで培養した。

培養後に培地を除去し、ＡＳＴＭに溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表３を参照）および終濃度１μｇ／ｍＬに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ，E.coli O111;B4，ＤＩＦＣＯ社製）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加・ＬＰＳ添加のＡＳＴＭを用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、RNAqueous phenol free total RNA isolation kit（invitrogen社製，Cat. No. AM1912）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、１００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。

この総ＲＮＡを鋳型とし、ＩＬ−１０および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。

ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加時の補正値
Ｂ：試料無添加時の補正値
結果を表３に示す。

表３に示すように、化合物（Ｉ）（試料１）は、優れたＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現促進作用を有していることが確認された。

〔試験例４〕アストロサイト細胞毒性試験
化合物（Ｉ）（試料１）について、以下のようにしてアストロサイトへの細胞毒性を試験した。

正常マウス由来アストロサイト（ＡＳＴＣ５７）を、アストロサイト用培養メディウムを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を５．０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＡＳＴＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を除去し、ＡＳＴＭに溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を各ウェルに２００μＬずつ添加し、４日間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＡＳＴＭを用いて同様に培養した。

アストロサイトに対する細胞毒性は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。すなわち、４日間培養後、培地を除去し、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＡＳＴＭに溶解したＭＴＴを各ウェルに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。得られた結果から、下記の式によりアストロサイト細胞生存率（％）を算出した。

アストロサイト細胞生存率（％）＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ｓｔ：被験試料添加でのブルーホルマザン生成量
Ｃｔ：試料無添加でのブルーホルマザン生成量
結果を表４に示す。

表４に示すように、化合物（Ｉ）（試料１）は、細胞毒性が低いことが確認された。

〔配合例１〕
常法により、以下の組成を有する脳の機能改善用錠剤を製造した。
化合物（Ｉ） ５．０ｍｇ
ドロマイト（カルシウム20％、マグネシウム10％含有） ８３．４ｍｇ
カゼインホスホペプチド １６．７ｍｇ
ビタミンＣ ３３．４ｍｇ
マルチトール １３６．８ｍｇ
コラーゲン １２．７ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル １２．０ｍｇ

〔配合例２〕
常法により、以下の組成を有する脳の機能改善用経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
化合物（Ｉ） ０．３質量％
ソルビット １２．０質量％
安息香酸ナトリウム ０．１質量％
香料 １．０質量％
硫酸カルシウム ０．５質量％
精製水 残部（１００質量％）

〔配合例３〕
常法により、下記の組成を有するコーヒー飲料を製造した。
化合物（Ｉ） ０．１質量部
コーヒー抽出液（Ｌ（明度）＝２０、Ｂｒｉｘ＝３） ４０質量部
マルチトール ２質量部
香料 適量
水 残部（１００質量部）

本発明に係る脳の機能改善剤および脳の機能改善用飲食品は、記憶能力や学習能力の向上；健忘症や老年性認知機能障害の予防、治療または改善；アルツハイマー病やパーキンソン病等の神経変性疾患の予防、治療または改善；うつ病等の気分障害の予防、治療または改善；などに大きく貢献できる。

Claims (2)

1. 下記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とし、アストロサイトＡＱＰ４発現促進作用、アストロサイトＴＧＦ−β発現促進作用およびアストロサイトＩＬ−１０発現促進作用からなる群より選択される１種または２種以上の作用に基づく脳の機能改善用途に用いられることを特徴とする脳の機能改善剤。
   

   
2. 下記式（Ｉ）で表される化合物を配合し、アストロサイトＡＱＰ４発現促進作用、アストロサイトＴＧＦ−β発現促進作用およびアストロサイトＩＬ−１０発現促進作用からなる群より選択される１種または２種以上の作用に基づく脳の機能改善用途に用いられることを特徴とする脳の機能改善用飲食品。