JP6226752B2 - 抗体のFc領域改変体 - Google Patents
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Description
つまり、これまでに見出された改変型Fc領域の多くは、機能増強に伴い抗体の利点のひとつである良好な安定性が失われている。
以上のように、活性と安定性の両面において優れたFc領域はこれまでに報告されていない。
本発明者らは鋭意研究を行った結果、抗体のFc領域を有するポリペプチドであって、該Fc領域のループ部位における少なくとも一つのアミノ酸を改変する事で、親ポリペプチドと比較して、安定性が向上したポリペプチドを取得することに成功した。
さらに、ループ部位のアミノ酸の改変を複数組み合わせることで、親ポリペプチドと比較して、熱安定性を向上させつつFcγRへの結合活性が維持又は増強したポリペプチド、及び熱安定性を向上させつつFcγRへの結合活性が減少したポリペプチドを取得することに成功した。さらには、熱安定性を向上させつつFcγRへの結合活性を調整するだけでなく、会合体含有量が減少したポリペプチドを取得することに成功した。
〔1〕 抗体のFc領域を有するポリペプチドであって、該Fc領域のループ部位における少なくとも一つのアミノ酸が改変され、親ポリペプチドと比較して安定性が向上したポリペプチド。
〔2〕 前記安定性が熱変性中点(Tm)を指標として評価あるいは判断される、〔1〕に記載のポリペプチド。
〔3〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング236番目、EUナンバリング237番目、EUナンバリング238番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング247番目、EUナンバリング250番目、EUナンバリング265番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング271番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング307番目、EUナンバリング309番目、EUナンバリング315番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング325番目、EUナンバリング326番目、EUナンバリング327番目、EUナンバリング329番目、EUナンバリング330番目、EUナンバリング333番目、EUナンバリング335番目、EUナンバリング337番目、EUナンバリング360番目、EUナンバリング385番目、EUナンバリング386番目、EUナンバリング387番目、EUナンバリング389番目、EUナンバリング428番目、及びEUナンバリング433番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕または〔2〕に記載のポリペプチド。
〔4〕 さらに、親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が維持又は増強した、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔5〕 さらに、親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少した、〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔6〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング325番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔7〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔4〕、〔6〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔8〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のIleへの置換、EUナンバリング266番目のアミノ酸のIleへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のGlnへの置換、EUナンバリング269番目のアミノ酸のAspへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のGluへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMet又はLeuへの置換、EUナンバリング300番目のアミノ酸のGluへの置換、EUナンバリング324番目のアミノ酸のHisへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸のSer又はAlaへの置換、及びEUナンバリング330番目のアミノ酸のHis又はTyrへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔4〕、〔6〕、〔7〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔9〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔3〕、〔5〕、〔6〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔10〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング267番目のアミノ酸のProへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のMet又はLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のGly、His又はMetのいずれかへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔3〕、〔5〕、〔6〕、〔9〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔11〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング295番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔12〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMet又はLeuへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸のSer又はAlaへの置換、及びEUナンバリング330番目のアミノ酸のHis又はTyrへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔4〕、〔11〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔13〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔3〕、〔5〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔14〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸のLys又はSerへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLys又はHisへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPhe又はAspへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔3〕、〔5〕、〔13〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔15〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔3〕、〔5〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔16〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔3〕、〔5〕、〔15〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔17〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔3〕、〔5〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔18〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔3〕、〔5〕、〔17〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔19〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔3〕、〔5〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔20〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔3〕、〔5〕、〔19〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔21〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変部位が、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔3〕、〔5〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔22〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔3〕、〔5〕、〔21〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔23〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング247番目、EUナンバリング250番目、EUナンバリング307番目、EUナンバリング309番目、EUナンバリング315番目、EUナンバリング360番目、EUナンバリング385番目、EUナンバリング386番目、EUナンバリング387番目、EUナンバリング389番目、EUナンバリング428番目、及びEUナンバリング433番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔24〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング247番目のアミノ酸のValへの置換、EUナンバリング250番目のアミノ酸のPhe、Ile、Met、Val、Trp、又はTyrのいずれかへの置換、EUナンバリング307番目のアミノ酸のAla、Gln、又はProのいずれかへの置換、EUナンバリング309番目のアミノ酸のAla、Arg、又はProのいずれかへの置換、EUナンバリング315番目のアミノ酸のAlaへの置換、EUナンバリング360番目のアミノ酸のHisへの置換、EUナンバリング385番目のアミノ酸のAspへの置換、EUナンバリング386番目のアミノ酸のProへの置換、EUナンバリング387番目のアミノ酸のGluへの置換、EUナンバリング389番目のアミノ酸のSerへの置換、EUナンバリング428番目のアミノ酸のHis、Trp、Tyr、またはPheのいずれかへの置換、及びEUナンバリング433番目のアミノ酸のLysへの置換からなる群より選択される少なくも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔4〕、〔23〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔25〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング298番目又はEUナンバリング309番目のアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔1〕〜〔3〕、〔5〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔26〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング309番目のアミノ酸のAspへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔1〕〜〔3〕、〔5〕、〔25〕のいずれか一項に記載のポリペプチド。
〔27〕 抗体のFc領域を有するポリペプチドにおいて、該Fc領域のループ部位に少なくとも一つのアミノ酸改変を加えることにより、親ポリペプチドと比較して安定性を向上させる方法。
〔28〕 前記安定性を熱変性中点(Tm)を指標として評価あるいは判断する、〔27〕に記載の方法。
〔29〕 以下の工程を含む、抗体のFc領域を有し、該Fc領域のループ部位における少なくとも一つのアミノ酸が改変され、親ポリペプチドと比較して安定性が向上したポリペプチドの製造方法;
(a)抗体のFc領域を有するポリペプチドにおいて、該Fc領域のループ部位に少なくとも一つのアミノ酸改変を加える工程、
(b)前記工程(a)で改変されたポリペプチドの安定性を測定する工程、および
(c)親ポリペプチドと比較して、安定性が向上したポリペプチドを選択する工程。
〔30〕 以下の工程を含む、抗体のFc領域を有し、該Fc領域のループ部位における少なくとも一つのアミノ酸が改変され、親ポリペプチドと比較して安定性が向上したポリペプチドの製造方法;
(a)親ポリペプチドと比較して、安定性が向上するように、当該ポリペプチドをコードする核酸を改変する工程、
(b)宿主細胞に当該改変された核酸を導入し発現するように培養する工程、
(c)宿主細胞培養物から当該ポリペプチドを回収する工程。
〔31〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング236番目、EUナンバリング237番目、EUナンバリング238番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング247番目、EUナンバリング250番目、EUナンバリング265番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング271番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング307番目、EUナンバリング309番目、EUナンバリング315番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング325番目、EUナンバリング326番目、EUナンバリング327番目、EUナンバリング329番目、EUナンバリング330番目、EUナンバリング333番目、EUナンバリング335番目、EUナンバリング337番目、EUナンバリング360番目、EUナンバリング385番目、EUナンバリング386番目、EUナンバリング387番目、EUナンバリング389番目、EUナンバリング428番目、及びEUナンバリング433番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔30〕のいずれか一項に記載の方法。
〔32〕 さらに親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性を維持又は増強するように改変する工程を含む、〔27〕〜〔31〕のいずれか一項に記載の方法。
〔33〕 さらに、親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少するように改変する工程を含む、〔27〕〜〔31〕のいずれか一項に記載の方法。
〔34〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング325番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔33〕のいずれか一項に記載の方法。
〔35〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔32〕、〔34〕のいずれか一項に記載の方法。
〔36〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のIleへの置換、EUナンバリング266番目のアミノ酸のIleへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のGlnへの置換、EUナンバリング269番目のアミノ酸のAspへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のGluへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMet又はLeuへの置換、EUナンバリング300番目のアミノ酸のGluへの置換、EUナンバリング324番目のアミノ酸のHisへの置換、EUナンバリング326番目のアミノ酸のSer又はAlaへの置換、及びEUナンバリング330番目のアミノ酸のHis又はTyrへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔32〕、〔34〕、〔35〕のいずれか一項に記載の方法。
〔37〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔31〕、〔33〕、〔34〕のいずれか一項に記載の方法。
〔38〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング267番目のアミノ酸のProへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のMet又はLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のGly、His又はMetのいずれかへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔31〕、〔33〕、〔34〕、〔37〕のいずれか一項に記載の方法。
〔39〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング295番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔32〕のいずれか一項に記載の方法。
〔40〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング295番目のMet又はLeuへの置換、EUナンバリング326番目のSer又はAlaへの置換、及びEUナンバリング330番目のHis又はTyrへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔32〕、〔39〕のいずれか一項に記載の方法。
〔41〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目又はEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔31〕、〔33〕のいずれか一項に記載の方法。
〔42〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸のLys又はSerへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLys又はHisへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPhe又はAspへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔31〕、〔33〕、〔41〕のいずれか一項に記載の方法。
〔43〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔31〕、〔33〕のいずれか一項に記載の方法。
〔44〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔31〕、〔33〕、〔43〕のいずれか一項に記載の方法。
〔45〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔31〕、〔33〕のいずれか一項に記載の方法。
〔46〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング239番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔31〕、〔33〕、〔45〕のいずれか一項に記載の方法。
〔47〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔31〕、〔33〕のいずれか一項に記載の方法。
〔48〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔31〕、〔33〕、〔47〕のいずれか一項に記載の方法。
〔49〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔31〕、〔33〕のいずれか一項に記載の方法。
〔50〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング235番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔31〕、〔33〕、〔49〕のいずれか一項に記載の方法。
〔51〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング247番目、EUナンバリング250番目、EUナンバリング307番目、EUナンバリング309番目、EUナンバリング315番目、EUナンバリング360番目、EUナンバリング385番目、EUナンバリング386番目、EUナンバリング387番目、EUナンバリング389番目、EUナンバリング428番目、及びEUナンバリング433番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔32〕のいずれか一項に記載の方法。
〔52〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング247番目のアミノ酸のValへの置換、EUナンバリング250番目のアミノ酸のPhe、Ile、Met、Val、Trp、又はTyrのいずれかへの置換、EUナンバリング307番目のアミノ酸のAla、Gln、又はProのいずれかへの置換、EUナンバリング309番目のアミノ酸のAla、Arg、又はProのいずれかへの置換、EUナンバリング315番目のアミノ酸のAlaへの置換、EUナンバリング360番目のアミノ酸のHisへの置換、EUナンバリング385番目のアミノ酸のAspへの置換、EUナンバリング386番目のアミノ酸のProへの置換、EUナンバリング387番目のアミノ酸のGluへの置換、EUナンバリング389番目のアミノ酸のSerへの置換、EUナンバリング428番目のアミノ酸のHis、Trp、Tyr、またはPheのいずれかへの置換、及びEUナンバリング433番目のアミノ酸のLysへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔32〕、〔51〕のいずれか一項に記載の方法。
〔53〕 前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング298番目又はEUナンバリング309番目のアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異を導入する、〔27〕〜〔31〕、〔33〕のいずれか一項に記載の方法。
〔54〕 前記Fc領域のループ部位におけるアミノ酸改変が、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング309番目のアミノ酸のAspへの置換からなる群より選択される、少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、〔27〕〜〔31〕、〔33〕、〔53〕のいずれか一項に記載の方法。
〔55〕 前記改変が、ヒトIgGのFc領域を有するポリペプチドにおける改変である、〔27〕〜〔54〕のいずれか一項に記載の方法。
〔56〕 抗体のFc領域を有するポリペプチドであって、Fc領域のループ部位の少なくとも一つのアミノ酸が改変され、親ポリペプチドと比較して安定性が向上したポリペプチドをコードする核酸。
〔57〕 〔56〕に記載の核酸を含むベクター。
〔58〕 〔57〕に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
〔59〕 〔1〕〜〔26〕のいずれかに記載のポリペプチド、または〔27〕〜〔55〕のいずれかに記載の方法により作製されたポリペプチドを含有する医薬組成物。
〔60〕 〔59〕に記載の医薬組成物を含有する免疫炎症性疾患または癌の治療剤又は予防剤。
〔61〕 免疫炎症性疾患が関節リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、巨赤血球性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、慢性活動型肝炎、糸球体腎炎、間質性肺腺維症、多発性硬化症、パジュット症、オステオポローシス、多発性骨髄腫、ブドウ膜炎、急性及び慢性脊椎炎、痛風性関節炎、炎症性腸疾患、成人呼吸促進症候群(ARDS)、乾癬、クローン病、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、過敏症、ぜん息、筋肉変性、悪液質、全身性強皮症、限局性強皮症、シェーグレン症候群、ベーチェット病、ライター症候群、I型及びII型糖尿病、骨吸収疾患、移植片vs.宿主反応、虚血性再灌流外傷、アテローム硬化症、脳トラウマ、多発生硬化症、大脳マラリア、敗血症、敗血性ショック、トキシックショック症候群、発熱、及び染色によるマルギアス(malgias)、再生不良性貧血、溶血性貧血、突発性血小板減少症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本病、天疱瘡、IgA腎症、花粉症、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、ウェゲナー肉腫、結節性動脈炎、混合性結合組織病、または線維筋痛症である、〔60〕に記載の治療剤又は予防剤。
〔62〕 癌が膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、その他の腺組織の癌、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、黄紋筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、線維肉腫、悪性末梢神経腫瘍、消化管間質系腫瘍、類腱腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、又はその他の実質臓器の腫瘍である、〔60〕に記載の治療剤または予防剤。
〔63〕 〔1〕〜〔26〕のいずれかに記載のポリペプチド、または〔27〕〜〔55〕のいずれかに記載の方法により作製されたポリペプチドを対象に投与する工程を含む、免疫炎症性疾患または癌を治療又は予防する方法。
〔64〕 免疫炎症性疾患または癌の治療又は予防において使用するための、〔1〕〜〔26〕のいずれかに記載のポリペプチド、または〔27〕〜〔55〕のいずれかに記載の方法により作製されたポリペプチド。
〔65〕 免疫炎症性疾患または癌の治療剤又は予防剤の製造における、〔1〕〜〔26〕のいずれかに記載のポリペプチド、または〔27〕〜〔55〕のいずれかに記載の方法により作製されたポリペプチドの使用。
〔66〕 〔1〕〜〔26〕のいずれかに記載のポリペプチド、または〔27〕〜〔55〕のいずれかに記載の方法により作製されたポリペプチドを使用する工程を含む、免疫炎症性疾患または癌の治療剤又は予防剤を製造する方法。
さらに本発明は、抗体Fc領域のループ部位にアミノ酸置換を導入することで親ポリペプチドと比較して、該Fc領域を有するポリペプチドの安定性を向上させる方法を提供する。さらに本発明は、抗体Fc領域のループ部位にアミノ酸置換を導入することで親ポリペプチドと比較して安定性が向上した該Fc領域を有するポリペプチドの製造方法を提供する。
天然型IgGのFc領域とは、天然に見出されるIgGを起源とするFc領域と同一のアミノ酸配列を包含するFc領域を意味する。天然型IgGのFc領域は図3(配列番号:11〜14)に示しているが、例えば天然型ヒトIgG1を起源とするFc領域、天然型ヒトIgG2を起源とするFc領域、天然型ヒトIgG3を起源とするFc領域、天然型ヒトIgG4を起源とするFc領域を意味する。天然型IgGのFc領域にはそれから自然に生じる変異体等も含まれる。
Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分消化した後に、プロテインAカラムに吸着された画分を再溶出することによって好適に取得され得る。かかる蛋白質分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切に設定することにより制限的にFabやF(ab')2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやパパイン等が例示できる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が維持または増強するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が維持または増強するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング295番目、EUナンバリング326番目及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が維持または増強するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング247番目、EUナンバリング250番目、EUナンバリング307番目、EUナンバリング309番目、EUナンバリング315番目、EUナンバリング360番目、EUナンバリング385番目、EUナンバリング386番目、EUナンバリング387番目、EUナンバリング389番目、EUナンバリング428番目、及びEUナンバリング433番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング239番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング234番目、EUナンバリング235番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドと比較してFcγRへの結合活性が減少するポリペプチドとしては、例えば前記Fc領域のループ部位における、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング309番目のアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異が導入されているポリペプチドを挙げることができる。
FcγIIAのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:3(BC020823.1)及び4(AAH20823.1)に、
FcγIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:5(BC146678.1)及び6(AAI46679.1)に、
FcγIIIAのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:7(BC033678.1)及び8(AAH33678.1)に、及び
FcγIIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:9(BC128562.1)及び10(AAI28563.1)に記載されている(カッコ内はRefSeq登録番号を示す)。
尚、FcγRIIaには、FcγRIIaの131番目のアミノ酸がヒスチジン(H型)あるいはアルギニン(R型)に置換された2種類の遺伝子多型が存在する(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990)。
例えば、上記の測定法で測定した結合量において、親ポリペプチドの各FcγRに対する結合量を100とした場合のポリペプチド変異体の各FcγRに対する結合量(以下、結合量比という)が、好ましくは120以上、150以上、200以上、300以上に向上しているものを言う。
例えば、上記の測定法で測定した結合量において、親ポリペプチドの各FcγRに対する結合量を100とした場合のポリペプチド変異体の各FcγRに対する結合量(以下、結合量比という)が、好ましくは80以上かつ120以下であるものを言う。
例えば、別のFc領域に対する改変として、ヒトIgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)に対して、EUナンバリング238番目のProをAspに置換する改変および/またEUナンバリング328番目のLeuをGluに置換する改変を挙げることができる。ヒトIgGにEUナンバリング238番目のProをAspに置換した改変および/またEUナンバリング328番目のLeuをGluに置換した改変を導入することにより、親ポリペプチドと比較して、FcγRI、FcγRIIIaおよびFcγRIIaのR型、H型のいずれの遺伝子多型に対しても結合活性が維持あるいは減少し、かつFcγRIIbに対する結合活性が増強したポリペプチドを提供することが可能である。
抗体の血漿中滞留性を制御するために、本発明のアミノ酸の改変と抗体の等電点の値(pI値)を改変させるためのアミノ酸の改変を組み合わせることが可能である。定常領域の改変については、例えば、公知の文献(J. Immunol. 2006, 176(1):346-356やNat. Biotechnol. 1997 15(7):637-640等)に記載のEUナンバリング250位や428位等のアミノ酸の改変が挙げられる。また、可変領域の改変としてWO2007/114319やWO2009/041643に記載のアミノ酸の改変が挙げられる。改変されるアミノ酸は、抗原結合活性を有するポリペプチドの表面に露出しているアミノ酸が好ましい。例えば、本発明のポリペプチドが重鎖定常領域を有する場合、重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリング196位のアミノ酸の置換が挙げられる。重鎖定常領域がIgG4の場合、例えば196番目のリジンをグルタミンに置換することでpI値を低くし、血漿中滞留性を高めることが可能である。また、血漿中滞留性はFcRnに対する結合力を改変することによっても制御可能である。FcRnに対する結合力改変のためのアミノ酸改変としては、例えば、公知の文献(The Journal of Biological Chemistry vol.276, No.9 6591-6604, 2001やMolecular Cell, Vol.7, 867-877, 2001)に記載の抗体重鎖定常領域のアミノ酸の置換が挙げられる。
例えば、本発明のポリペプチドがIgG4重鎖定常領域を有する場合、酸性条件下におけるIgG4のhalf-molecule化を抑え安定な4鎖構造(H2L2構造)を維持することが好ましい。そのため、4鎖構造の維持に重要な役割を果たしているEUナンバリング409位のアミノ酸であるアルギニン(Immunology 2002, 105, 9-19)を、酸性条件下においても安定な4鎖構造を維持するIgG1タイプのリジンに置換することが好ましい。このような改変を本発明のアミノ酸の改変と組合わせて用いることができる。
本発明のアミノ酸の改変とWO2009/041613に記載の方法を組合わせることが可能である。具体的には、例えば本発明のポリペプチドがIgG1重鎖定常領域を有する場合、IgG1重鎖定常領域のC末端の2アミノ酸、すなわちEUナンバリング446番目のグリシン及び447番目のリジンを欠損させる改変を本発明の実施例に基づくアミノ酸の改変と組み合わせ、ヘテロジェニティーの低減を図ることが可能である。
本発明のアミノ酸の改変と脱アミド化反応の抑制のためのアミノ酸の改変を組合わせることが可能である。脱アミド化反応は、特にアスパラギン(N)とグリシン(G)が隣接した部位(・・・NG・・・)において起こりやすいことが報告されている(Geigerら J. Bio. Chem. 1987; 262:785-794)。本発明のポリペプチドにアスパラギンとグリシンが隣接した部位が存在する場合には、当該アミノ酸配列を改変することにより脱アミド化反応を抑制することができる。具体的には例えば、アスパラギンとグリシンどちらか一方若しくは両方のアミノ酸配列を他のアミノ酸に置換する。より具体的には例えば、アスパラギンをアスパラギン酸に置換する。
例えば以下の(a)〜(c)のような点について改変する事を目的として、アミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することができる;
(a) シート構造、若しくは、らせん構造の領域におけるポリペプチドの背骨構造、
(b) 標的部位における電荷若しくは疎水性、または
(c)側鎖の大きさ。
(1) 疎水性: ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2) 中性親水性: cys、ser、thr、asn、gln;
(3) 酸性: asp、glu;
(4) 塩基性: his、lys、arg;
(5) 鎖の配向に影響する残基: gly、pro;及び
(6) 芳香族性: trp、tyr、phe。
・哺乳動物の抗体産生細胞
・抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換された真核細胞
より具体的には、例えばFc領域の糖鎖にシアル酸を付加したものであってもよい(MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.)。
さらに、本発明は上述のいずれかに記載のアミノ酸配列が改変されたFc領域を有する抗体を提供する。
本発明の抗体は、抗原の種類、抗体の由来などは限定されず、いかなる抗体でもよい。抗体の由来としては、特に限定されないが、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体などを挙げることができる。
また、抗体遺伝子を取得する方法としてBernasconiら(Science (2002) 298, 2199-2202)またはWO2008/081008に記載のようなB細胞クローニング(それぞれの抗体のコード配列の同定およびクローニング、その単離、およびそれぞれの抗体(特に、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4)の作製のための発現ベクター構築のための使用等)の手法が、上記のほか適宜使用され得る。
他のタンパク質、生理活性ペプチドとしては、例えば受容体、接着分子、リガンド、酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の製造方法の一態様として、例えば抗体のFc領域を有し、該Fc領域のループ部位における少なくとも一つのアミノ酸が改変され、親ポリペプチドと比較して安定性が向上したポリペプチドの製造方法を提供する。
例えば以下の工程を含む製造方法を挙げることができる;
(a)抗体のFc領域を有するポリペプチドにおいて、該Fc領域のループ部位に少なくとも一つのアミノ酸改変を加える工程、
(b)前記工程(a)で改変されたポリペプチドの安定性を測定する工程、および
(c)親ポリペプチドと比較して、安定性が向上したポリペプチドを選択する工程。
(a)親ポリペプチドと比較して、安定性が向上するように、当該ポリペプチドをコードする核酸を改変する工程、
(b)宿主細胞に当該核酸を導入し発現するように培養する工程、
(c)宿主細胞培養物から当該ポリペプチドを回収する工程。
TS1〜TS67の改変部位については上述の通りである。
本発明は、本発明のポリペプチド又はFc融合タンパク質分子を含有する医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、本発明の上記ポリペプチド又はFc融合タンパク質分子に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
アラニン:Ala:A
アルギニン:Arg:R
アスパラギン:Asn:N
アスパラギン酸:Asp:D
システイン:Cys:C
グルタミン:Gln:Q
グルタミン酸:Glu:E
グリシン:Gly:G
ヒスチジン:His:H
イソロイシン:Ile:I
ロイシン:Leu:L
リジン:Lys:K
メチオニン:Met:M
フェニルアラニン:Phe:F
プロリン:Pro:P
セリン:Ser:S
スレオニン:Thr:T
トリプトファン:Trp:W
チロシン:Tyr:Y
バリン:Val:V
一般的に、βシート構造はアミノ酸改変による構造変化が生じやすいこと、改変による熱安定性の低下が生じやすいことが知られている(Biochemistry 1994;33:5510-5517、Nature 1994;367:660-663)。そこで、本発明ではFc領域のループ部分を改変することによる熱安定性の向上を試みた。
変異を導入していないB3(GpH7-B3/GpL16-k0:GpH7(配列番号:17)、B3(配列番号:16)、GpL16(配列番号:18)、k0(配列番号:19))のTmは約68℃であり、この値よりも高いTmを示した変異体を表1−1および表1−2にまとめた。
実施例1のデータと構造情報(Nature 2000 ; 406 : 267-273)に基づいて熱安定性の向上する効果が特に優れていると考えられる改変を幾つか選択した。選択した単独の改変、または複数の改変を、Anti-GPC3抗体(GpH7-G1d/GpL16-k0:GpH7(配列番号:17)、G1d(配列番号:15)、GpL16(配列番号:18)、k0(配列番号:19)、Anti-IL6R抗体(MH0-G1d/ML0-k0:GpH7(配列番号:17)、G1d(配列番号:15)、ML0(配列番号:21)、k0(配列番号:19)のH鎖に対して導入し、表2に示したTS1〜TS19(配列番号:26〜44)を作製した。同時に、ジスルフィド結合導入によるIgGの形での熱安定性改善効果を評価するため、先行論文において報告されているm01ならびにm02の改変(J Biol Chem. 2009;284:14203-14210)をanti-IL6RのH鎖に導入し、TSm01ならびにTSm02の改変体を作製した(配列番号:24、25)。各抗体の発現と精製は参考例1で記した方法で実施した。
抗体のFc領域の改変には、エフェクター機能であるADCC活性などの機能を増強させたFc領域、またはエフェクター機能であるADCC活性などの機能を低下させたFc領域が報告されている(参考文献:current opinion,2009,20,685-691)。エフェクター機能を増強させた抗体は主にがん抗体に、エフェクター機能を低下させた抗体は中和抗体、Enbrel、OrencisなどのReceptor-Fc fusionなどに有用だと考えられ、それぞれの目的において使い分けることが重要である。
安定性向上を目的とした改変を導入するにあたり、エフェクター機能が重要であるがん抗体においては、hFcgRsに対する結合を維持していることは重要である。実施例3においてhFcgRsへの結合を維持しているTS1〜TS8の改変を組み合わせ、表5に示したTS20〜TS27の改変体を新たに作製した(配列番号:45〜52)。各抗体の発現と精製は参考例1で記した方法で実施した。調製した抗体は参考例2に示した方法でTmを評価し、結果を表6に示した。
安定性向上を目的とした改変を導入するにあたり、中和抗体においてエフェクター機能はできる限り低下していたほうが望ましい。実施例3においてhFcgRsへの結合が低下したTS9〜TS19の改変を組み合わせ、表8に示したTS28〜TS43の改変体を新たに作製した(配列番号:53〜68)。各抗体の発現と精製は参考例1で記した方法で実施した。調製した抗体は参考例2に示した方法でTmを評価し、結果を表9に示した。
会合体は保存安定性や免疫原性に影響を与えるため、熱安定性を向上させる改変は、できる限り会合体含有量を増加させないことが望ましい。そこで、複数改変を組み合わせたTS20〜TS43、ならびに、TSm01とTSm02の会合体含有量を参考例4に示した方法で評価した。測定のクロマトグラムは図2に、会合体含有量は表11に示した。
CH2ドメインに変異を導入することにより、Tmが向上することが上記より明らかとなった。そこで、実施例1において改変導入の検討を実施していない領域に関しても、Tmが向上する変異があるかを検討し、表12に示したTS44〜TS67の改変体を新たに作製した(配列番号:69〜92)。各抗体の発現と精製は参考例1に記した方法で実施し、結果を表13に示した。さらに、hFcgRsに対する結合を参考例3に記した方法で測定した。G1の各hFcgRsに対する結合を100とした場合の各抗体の各hFcgRsに対する結合を算出して表14に示した。
アミノ酸置換の導入はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR、等またはIn fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA)等を用いて当業者公知の方法で行い、発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen)、またはFreeStyle293細胞(Invitrogen社)に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GEヘルスケア)を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
本検討では、Rotor-Gene Q(QIAGEN)を用いた示査走査型蛍光定量法を用いて抗体の熱変性中点(Tm)を測定することにより熱安定性を評価した。なお、本手法は、抗体の熱安定性評価法として広く知られている示査走査型熱量計を用いたTm評価と良好な相関を示すことが既に報告されている(Journal of Pharmaceutical Science 2010 ; 4 : 1707-1720)。
データはRotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)を用いて蛍光遷移が認められた温度を算出し、この値をTmとした。
Biacore T100(GE Healthcare)を用いて、抗体とhFcgRs(hFcgRIa, hFcgRIIa(R), hFcgRIIa(H), hFcgRIIb, hFcgRIIIa(F), hFcgRIIIa(V))との相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+ (GE Healthcare)を用い、測定温度は25℃とした。アミンカップリング法によりProtein A (Invitrogen) を固定化し、そこへ目的の抗体をキャプチャーさせた。抗体をキャプチャーさせたところへ、ランニングバッファーで希釈したhFcγRを流速30μL/minでhFcgRIaは5分間、それ以外のhFcγRは流速5μL/minで1分間相互作用させ、抗体に対する結合量を測定し、抗体間で比較した。ただし、hFcγRの結合量はキャプチャーした抗体の量に依存するため、各抗体のキャプチャー量がhFcgRIaは200 RU (resonance unit)、それ以外のhFcgRsは1000 RU (resonance unit)となるように、FcgRの結合量を補正した。また、10 mM glycine-HCl、pH1.5を流速30μL/minで30秒間反応させることで、チップにキャプチャーした抗体を洗浄し、チップを再生して繰り返し用いた。
Alliance system(Waters)を用いたSEC分析により、精製抗体中の会合体含有量を評価した。移動相には300 mMの塩化ナトリウムを含む50 mMリン酸緩衝液, pH7.0(伊勢久)を、分析カラムにはG3000SWXL(TOSOH)を用い、215 nmの波長で測定を行った。Empower2(Waters)を用いてデータ解析を実施し、単量体よりも高分子量側に溶出した成分を一括して会合体としてその含有量を算出した。
Claims (34)
- 抗体のFc領域を有するポリペプチドであって、該Fc領域が、EUナンバリング235番目及びEUナンバリング239番目におけるアミノ酸改変を含み、親ポリペプチドと比較して安定性が向上し、かつFcγRへの結合活性が減少したポリペプチド。
- 前記EUナンバリング235番目のアミノ酸改変がLysまたはArgへの置換であり、前記EUナンバリング239番目のアミノ酸改変がMet、Lys、Arg、Thr、HisまたはGlnへの置換である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記EUナンバリング235番目のアミノ酸改変がArgへの置換であり、前記EUナンバリング239番目のアミノ酸改変がLysへの置換である、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 前記安定性が熱変性中点(Tm)を指標として評価あるいは判断される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング236番目、EUナンバリング237番目、EUナンバリング238番目、EUナンバリング247番目、EUナンバリング250番目、EUナンバリング265番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング271番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング307番目、EUナンバリング309番目、EUナンバリング315番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング325番目、EUナンバリング326番目、EUナンバリング327番目、EUナンバリング329番目、EUナンバリング330番目、EUナンバリング333番目、EUナンバリング335番目、EUナンバリング337番目、EUナンバリング360番目、EUナンバリング385番目、EUナンバリング386番目、EUナンバリング387番目、EUナンバリング389番目、EUナンバリング428番目、及びEUナンバリング433番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異がさらに導入されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング325番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異がさらに導入されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異がさらに導入されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域においてさらに導入されているアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング267番目のアミノ酸のProへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のMet又はLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のGly、His又はMetのいずれかへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、請求項5〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異がさらに導入されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域においてさらに導入されているアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLys又はHisへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPhe又はAspへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、請求項5または9に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域においてさらに導入されているアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、請求項5、9、10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異がさらに導入されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記Fc領域においてさらに導入されているアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、請求項5または12に記載のポリペプチド。
- 抗体のFc領域を有するポリペプチドにおいて、該Fc領域に、EUナンバリング235番目及びEUナンバリング239番目を含む少なくとも二つのアミノ酸改変を加えることにより、親ポリペプチドと比較して安定性を向上させ、かつFcγRへの結合活性を減少させる方法。
- 前記安定性を熱変性中点(Tm)を指標として評価あるいは判断する、請求項14に記載の方法。
- 以下の工程を含む、抗体のFc領域を有し、該Fc領域における少なくとも二つのアミノ酸が改変され、親ポリペプチドと比較して安定性が向上し、かつFcγRへの結合活性が減少したポリペプチドの製造方法;
(a)抗体のFc領域を有するポリペプチドにおいて、該Fc領域のEUナンバリング235番目及びEUナンバリング239番目を含む少なくとも二つのアミノ酸改変を加える工程、
(b)前記工程(a)で改変されたポリペプチドの安定性及びFcγRへの結合活性を測定する工程、および
(c)親ポリペプチドと比較して、安定性が向上し、かつFcγRへの結合活性が減少したポリペプチドを選択する工程。 - 以下の工程を含む、抗体のFc領域を有し、該Fc領域における少なくとも二つのアミノ酸が改変され、親ポリペプチドと比較して安定性が向上し、かつFcγRへの結合活性が減少したポリペプチドの製造方法;
(a)親ポリペプチドのFc領域に、EUナンバリング235番目及びEUナンバリング239番目を含む少なくとも二つのアミノ酸改変が導入されたポリペプチドをコードする核酸を改変する工程、
(b)宿主細胞に当該改変された核酸を導入し発現するように培養する工程、
(c)宿主細胞培養物から当該ポリペプチドを回収する工程。 - 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング236番目、EUナンバリング237番目、EUナンバリング238番目、EUナンバリング247番目、EUナンバリング250番目、EUナンバリング265番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング271番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング307番目、EUナンバリング309番目、EUナンバリング315番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング325番目、EUナンバリング326番目、EUナンバリング327番目、EUナンバリング329番目、EUナンバリング330番目、EUナンバリング333番目、EUナンバリング335番目、EUナンバリング337番目、EUナンバリング360番目、EUナンバリング385番目、EUナンバリング386番目、EUナンバリング387番目、EUナンバリング389番目、EUナンバリング428番目、及びEUナンバリング433番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異をさらに導入する、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング266番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング269番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、EUナンバリング300番目、EUナンバリング324番目、EUナンバリング325番目、EUナンバリング326番目、及びEUナンバリング330番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異をさらに導入する、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング267番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異をさらに導入する、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域においてさらに導入するアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLys又はArgへの置換、EUナンバリング267番目のアミノ酸のProへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のMet又はLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のGly、His又はMetのいずれかへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング268番目、EUナンバリング270番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異をさらに導入する、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域においてさらに導入するアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLys又はHisへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPhe又はAspへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、請求項18または22に記載の方法。
- 前記Fc領域においてさらに導入するアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング268番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング270番目のアミノ酸のPheへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、請求項18、22、23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域の、EUナンバリング234番目、EUナンバリング295番目、EUナンバリング296番目、EUナンバリング298番目、及びEUナンバリング325番目からなる群より選択されるアミノ酸部位において、少なくとも一つ以上のアミノ酸変異をさらに導入する、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域においてさらに導入するアミノ酸改変が、EUナンバリング234番目のアミノ酸のLysへの置換、EUナンバリング295番目のアミノ酸のMetへの置換、EUナンバリング296番目のアミノ酸のGlyへの置換、EUナンバリング298番目のアミノ酸のGlyへの置換、及びEUナンバリング325番目のアミノ酸のHis又はGlyへの置換からなる群より選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸改変である、請求項18または25に記載の方法。
- 前記改変が、ヒトIgGのFc領域を有するポリペプチドにおける改変である、請求項14〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体のFc領域を有するポリペプチドであって、Fc領域が、EUナンバリング235番目及びEUナンバリング239番目におけるアミノ酸改変を含み、親ポリペプチドと比較して安定性が向上し、かつFcγRへの結合活性が減少したポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項28に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項29に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項1〜13のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項14〜27のいずれかに記載の方法により作製されたポリペプチドを含有する医薬組成物。
- 請求項31に記載の医薬組成物を含有する免疫炎症性疾患または癌の治療剤又は予防剤。
- 免疫炎症性疾患が関節リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、巨赤血球性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、慢性活動型肝炎、糸球体腎炎、間質性肺腺維症、多発性硬化症、パジュット症、オステオポローシス、多発性骨髄腫、ブドウ膜炎、急性及び慢性脊椎炎、痛風性関節炎、炎症性腸疾患、成人呼吸促進症候群(ARDS)、乾癬、クローン病、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、過敏症、ぜん息、筋肉変性、悪液質、全身性強皮症、限局性強皮症、シェーグレン症候群、ベーチェット病、ライター症候群、I型及びII型糖尿病、骨吸収疾患、移植片vs.宿主反応、虚血性再灌流外傷、アテローム硬化症、脳トラウマ、多発生硬化症、大脳マラリア、敗血症、敗血性ショック、トキシックショック症候群、発熱、及び染色によるマルギアス(malgias)、再生不良性貧血、溶血性貧血、突発性血小板減少症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本病、天疱瘡、IgA腎症、花粉症、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、ウェゲナー肉腫、結節性動脈炎、混合性結合組織病、または線維筋痛症である、請求項32に記載の治療剤又は予防剤。
- 癌が膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、その他の腺組織の癌、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、黄紋筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、線維肉腫、悪性末梢神経腫瘍、消化管間質系腫瘍、類腱腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、又はその他の実質臓器の腫瘍である、請求項32に記載の治療剤または予防剤。
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