JP6199360B2 - 自動灌流培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養（細胞及び生体組織の培養などを含む）に使用され、培養容器内に培地(培養液)を自動的に灌流して細胞培養を行う自動灌流培養装置に関する。

近年、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などの実用化に向けた研究が推進されており、その際、細胞や生体組織を培養し、その培養物を人に移植して再生医療を行う研究が盛んに行われている。

この種の研究における細胞培養を行う培養工程では、培養容器内に、培地とともに、培養する細胞を播種して収容し、培養容器内の培地を定期的に交換し、或いは培養容器内に培地を略連続して供給し排出する処理が行われる。

細胞を播種した培養容器内に、培地を略連続して灌流しながら細胞培養を行う培地灌流方式の細胞培養装置は、従来、下記特許文献１で提案されている。この培養装置は、古い培地を培養容器から略連続して排出しながら、新しい培地を略連続して培養容器内に供給して細胞培養を行うように構成される。

特開２００８−８６２６４号公報

上記細胞培養装置は、培養容器を気密構造とし、ポンプにより古い培地を培養容器内から排出し、培養容器内の内圧の低下に応じて、新しい培地を培養容器内に供給する。このようなポンプの一定時間の駆動によって、上記細胞培養装置は、培養容器内に培地を灌流させ、或いは古い培地を新しい培地と交換するように動作する。

しかしながら、この細胞培養装置は、培養容器内の培地の圧力変化や流速の変化を小さくして、培地灌流方式による細胞培養を行うことができるものの、ポンプの動作に伴い、培養容器内で培地が供給ポート側から排出ポート側にある程度の流速で流れる。このため、ポンプの作動による培地の流れが直接的に細胞に印加されやすく、これにより、細胞への培地の刺激が過度に発生し、細胞培養に悪影響を生じやすい課題があった。

また、上記細胞培養装置は、培地貯留タンク内の培地をポンプにより培養容器内に供給し、培養容器の排出ポートを通して排出した古い培地を、再び培地貯留タンクに戻すように、循環させる構造のため、灌流培養工程の途中で、培地に新たな培地、別の成分培地、或いは薬剤などを加えることが難しいという課題があった。

本発明は、上述の課題を解決するものであり、培養容器内に培地を極めて低流速且つ低流量で灌流させ、細胞に緩やかな培地の流れを付与して、良好に細胞培養を行うことができる自動灌流培養装置を提供することを目的とする。

本発明に係る自動灌流培養装置は
培地を収容する外側容器と、
該外側容器内に挿入され、細胞を播種する多孔質の膜を底部に有した培養容器と、
該外側容器内に培地を供給するように配設された供給流路と、
該供給流路を通して該外側容器内に培地を供給する供給ポンプと、
該培養容器内から培地を排出するように配設された排出流路と、
該排出流路を通して該培養容器内から培地を排出する排出ポンプと、
該外側容器内の培地の液面レベルを検出して液面検出信号を発生する液面検出手段と、
該液面検出手段の液面検出信号に基づき、該供給ポンプを制御して、該外側容器への培地の供給量を制御する制御手段と、
を備え、
該外側容器内の培地液面レベルと該培養容器内の培地液面レベルとの差に応じて、該外側容器内の培地が前記多孔質の膜を通して該培養容器内に灌流することを特徴とする。

この発明によれば、外側容器内に培地を供給し、外側容器内の培地液面レベルと培養容器内の培地液面レベルとの間にレベル差、つまり外側容器内の培地液面レベルが培養容器内より高くなることにより、培養容器の底部の膜を通して培地が外側容器から培養容器内に灌流するので、培地の灌流は、極めて低流速で且つ低流量で行われる。

このため、例えば生体細胞が血液やリンパ液の流れに接して成長或いは生存するように、膜上に播種した細胞には、緩やかな培地の流れを付与して、培地の柔らかな接触と刺激を細胞に生じさせることができる。このため、培地の供給に伴う細胞への悪影響は防止され、生体環境下に極めて近い状態で、良好に細胞培養を行うことができる。さらに、細胞培養の途中で、培地に新たな培地を加え、または別の成分培地を加え、或いは培地に薬剤などを加えて細胞培養を行うことができる。

また、古い培地を培養容器から排出しつつ、外側容器内の培地の液面レベルを検出し、その液面レベルに基づき供給ポンプを制御して、新しい培地を外側容器内に供給することができるため、適正量の培地を略連続的に、極めて低流量で培養容器の底部に灌流し、培養容器の膜に播種した細胞を良好に培養することができる。

またここで、上記供給流路は、上記供給ポンプに接続される供給チューブと、該供給チューブに接続され、上記外側容器内に配置される供給ノズルと、を備え、上記排出流路は、上記排出ポンプに接続される排出チューブと、該排出チューブに接続され、上記培養容器内に配置される排出ノズルと、を備えた構成とすることができる。これによれば、灌流培養装置の供給流路及び排出流路を、小型で簡単に形成することができ、簡単に取り扱うことができる。

またここで、上記供給ポンプは、培地の流路となる供給接液部と、駆動部を駆動して該供給接液部内に培地を送るように動作する供給ポンプ駆動部とが、分離可能に連結され、上記排出ポンプは、培地の流路となる排出接液部と、駆動部を駆動して該排出接液部内から培地を排出するように動作する排出ポンプ駆動部とが、分離可能に連結される構成とすることができる。これによれば、培地の接液部分の洗浄や交換を容易に行うことができる。

またここで、上記外側容器、上記培養容器、上記供給ポンプの供給接液部、上記供給チューブ、供給ノズル、排出ノズル、排出チューブ、及び上記排出接液部は、取り外し交換可能に配設された構成とすることができる。これによれば、培地の接液部分を容易に取り外して、その洗浄や交換を簡便に行うことができる。

またここで、上記外側容器は、複数のウエルを有したウエルプレートから構成し、各ウエル内に上記培養容器を挿入することができる。これによれば、複数の培養容器を使用して一度に多くの細胞培養を行うことができる。

またここで、上記ウエルプレートを取出可能に収納する収納室と該収納室を開閉する開閉蓋とを備えたケースが設けられ、該ケースには、少なくとも、ウエルプレート、培養容器、供給ノズル、供給チューブ、排出ノズル、排出チューブを、収納するように構成することができる。これによれば、ウエルを有したウエルプレートをケース内に収納し、当該ケース内に、少なくとも供給チューブ、供給ノズル、排出チューブ、及び排出ノズルを収納し、且つケースはコンパクトに形成することができるので、自動灌流培養装置を小型化し、構造を簡単化することができる。

また、使用者は、自動灌流培養装置を小型のケースごとそのままインキュベータ内に出し入れして、簡便に使用することができる。さらに、使用後、ウエルプレート、培養容器、供給ポンプの供給接液部、供給チューブ、供給ノズル、排出ノズル、排出チューブ、排出接液部は、装置から取り出し、洗浄し或いは使い捨てするように使用することができるので、細胞のコンタミネーションを防止しつつ、安価なコストで繰り返し細胞培養に使用することができる。

ここで、上記液面検出手段として、１対の電極部を有した液面検出器を配設することができ、液面検出器は、外側容器内に１対の電極部を挿入し、電極部間にパルス電圧を印加して外側容器内の液面を検出するように構成することができる。これによれば、培地の液面レベルを比較的簡単に電気的に検出することができ、また、検出時、電極部間にはシングルパルスを印加すればよく、培地に与える電流の影響を最少にすることができる。

またここで、上記供給接液部及び上記排出接液部に接続される流路が各々流路マニホールドとして一体化され、流路マニホールドは取り出し交換可能に形成された構成とすることができる。これによれば、流路を簡単に取り外して洗浄し、或いは交換することができる。

またここで、流路マニホールド内における、供給ポンプの供給接液部と前記供給ノズル間の各流路に、開閉バルブを接続することができる。これによれば、１台の供給ポンプを使用して、複数の外側容器内に適正量の培地を順に供給することができ、各外側容器について各々供給ノズルを設ける場合に比して、構成を簡単化することができる。

またここで、上記供給ポンプは圧電ダイヤフラム式ポンプから構成され、上記供給接液部はダイヤフラムを含むポンプ室を有して構成することができる。これによれば、培地を脈動なく連続して外側容器に供給し、使用後には供給接液部を駆動部から簡単に外して洗浄し或いは交換することができる。

また、上記液面検出手段として、参照電極と検出電極を有し、液面レベルに応じて変化する該参照電極と該検出電極間の静電容量の変化に基づき、外側容器内の液面レベルを非接触で検出する静電容量式液面センサを、配設することができる。これによれば、培地液面に電極を接触させないため、電流による培地への悪影響をなくすことができる。

またここで、上記液面検出手段として、光センサを有し、該光センサの受光信号に基づき、光学的に外側容器内の液面レベルを検出する光学式液面センサを、配設することができる。これによれば、電流や電界による培地への悪影響なしに、培地液面の検出を行うことができる。

この発明の自動灌流培養装置によれば、培養容器内に培地を極めて低流速且つ低流量で灌流させ、細胞に緩やかな培地の流れを付与して、細胞を良好に培養することができる。

本発明の一実施形態を示す自動灌流培養装置の概略全体構成図である。 同自動灌流培養装置の斜視図である。 同自動灌流培養装置の斜視図である。 同自動灌流培養装置の右側面図である。 同自動灌流培養装置の背面側から見た斜視図である。 自動灌流培養装置の平面図である。 自動灌流培養装置の分解斜視図である。 ケースの蓋と支持板を外した状態の斜視図である。 供給ポンプの分解斜視図である。 供給ポンプの概略断面図である。 供給流路マニホールドの平面図である。 供給流路マニホールドの斜視図である。 供給流路マニホールドの右側面図である。 排出ポンプの分解斜視図である。 排出ポンプの下側から見た分解斜視図である。 排出ポンプの概略断面図である。 排出流路マニホールドの平面図である。 排出流路マニホールドの斜視図である。 排出流路マニホールドの同右側面図である。 自動灌流培養装置の動作を示すフローチャートである。

以下、本発明の一実施形態を図面に基づいて説明する。この自動灌流培養装置は、図１に示すように、上記外側容器となるウエル４を有したウエルプレート３がケース１の収納室２内に配設され、ウエルプレート３の各ウエル４内に、細胞を播種する多孔質の膜６を底部に有した培養容器５が上から挿入され、各ウエル４内に培地を供給し、各ウエル内に挿入された、培養容器底部の膜６上の細胞に対し、略連続して培地を灌流し、細胞培養を行うように構成される。ここで使用されるウエルプレート３は、６個のウエルを有して構成されが、ウエルの数は６個未満、７個以上とすることもできる。

具体的には、図２〜図６に示す如く、自動灌流培養装置は、ウエルプレート３を取出可能に収納する収納室２を備えたケース１と、ケース１の収納室２を覆い開閉可能に設けられた開閉蓋１ａと、ウエルプレート３の各ウエル４内に培地を供給する供給ポンプ４０と、ウエル４内の培養容器５から培地を排出する排出ポンプ６０と、供給ポンプ４０から供給チューブ１３を通して送られた培地を各ウエル４内に供給する供給ノズル１４と、排出ポンプ６０の運転により各ウエル４内の培養容器５から培地を排出する排出ノズル２４と、ウエル４内の培地の液面レベルを検出して液面検出信号を発生する、上記液面検出手段としての液面検出器７と、を備える。また、上記供給流路は、この供給チューブ１３と供給ノズル１４を備え、上記排出流路は、この排出チューブ２３と排出ノズル２４を備えて構成される。

ウエルプレート３を収納するケース１は、図２等に示す如く、薄型の直方体形状の箱状に、透明合成樹脂により成形され、ベース板１ｂ上に固定される。ケース１の開口した上部には、開閉蓋１ａが開閉可能に取り付けられる。ケース１、開閉蓋１ａ、及びウエルプレート３は、透明合成樹脂により形成され、細部培養時、蓋を閉じた状態で、顕微鏡下などにおいて、各培養容器５内の細胞を、容易に観察できるようになっている。

さらに、ケース１に隣接したベース板１ｂ上に取付台１ｄが固定され、取付台１ｄ上に、培地を供給する供給ポンプ４０、培地の供給先を各ウエル４において切り換える開閉バルブ１７、各培養容器５内から古い培地を排出する排出ポンプ６０が取り付けられる。さらに、そこに隣接して、新しい培地を入れる培地供給容器８、及び古い培地を入れる廃液容器９が、ベース板１ｂ上に取り付けられる。培地供給容器８には蓋８ａが、廃液容器９には蓋９ａが被せられる。

図８に示すように、ケース１の収納室２内に、６個のウエル４を有するウエルプレート３が収納され、６個のウエル４内には、図１のように、培養容器５が上から挿入される。各ウエル４内に培地供給用の供給ノズル１４が挿入され、各培養容器５内には排出ノズル２４が挿入される。ウエルプレート３がケース１の収納室２内に収納されることに伴い、各ウエル４内に挿入される供給ノズル１４、各培養容器５内に挿入される排出ノズル２４、及びそれらに接続される供給チューブ１３及び排出チューブ２３はケース１内に収納される。図７に示すように、各供給ノズル１４及び各排出ノズル２４は、ケース１内の支持板１ｃに取り付けられ、定位置に保持される。

図１、図８に示すように、各ウエル４に挿入される培養容器５は、カップ状容器状に形成され、その底部には、培養する細胞を播種するために、多孔質の膜６が取り付けられる。膜６は、例えば、直径約０．３〜５μｍの多数の微細孔を有したメンブレンフィルターなどから形成され、培養しようとする細胞が膜６上に播種され、保持されるようになっている。培養容器５は、各ウエル４内に上から挿入されるが、培養容器５の底部に設けた膜６とウエル４の底面との間に、間隔をあけるように、保持される。なお、細胞の培養時、膜６の目詰まりを防止するために、細胞はゲルと混合し、細胞懸濁液として膜上に播種される。

上記のように、図７に示す如く、ケース１の収納室２内には、各ウエル４内に培地供給用の供給ノズル１４が挿入され、各培養容器５内には排出ノズル２４が挿入される。それらの供給ノズル１４及び排出ノズル２４を支持するために、ケース１内上部に支持板１ｃがウエルプレート３の上方を覆うように配設され、図７に示すごとく、支持板１ｃ上には供給ノズル１４及び排出ノズル２４を保持する部材が設けられる。

細胞培養時、この自動灌流培養装置は、使用時、温度、湿度、炭酸ガス濃度などを管理されたインキュベータ内に入れられ、細胞培養が行われるが、図２〜図５に示すように、自動灌流培養装置は、ベース板１ｂ上にケース１、供給ポンプ４０、排出ポンプ６０等を搭載した、小型で簡単な構造となっているので、使用者は、容易にインキュベータ内に装置を出し入れすることができる。

さらに、図１に示す如く、各ウエル４内の培地の液面を、電気的に検出するために、液面検出手段として液面検出器７が、ケース１内に設けられる。この液面検出器７は、１対の電極部を有し、ウエルプレート３の各ウエル４内に１対の電極部を挿入し、電極部間にパルス電圧を印加してウエル内の液面を検出するように構成される。検出時に印加するパルス幅は、例えば数ｍ秒というように短く設定され、液面が１対の電極部に達したとき、電極部間の電位の低下を検出して、液面を検出する。このため、比較的簡単な構成の検出器により、培地液面を検出することができ、液面検出時に、培地に与える電流の影響を最少にすることができる。

液面検出器としては、上記の電極式の液面検出器に代えて、非接触式の静電容量式液面センサを設けることもできる。この静電容量式液面センサは、参照電極と検出電極を有し、液面レベルに応じて変化する参照電極と検出電極間の静電容量の変化に基づき、各ウエル４内の培地の液面レベルを非接触で検出することができる。これによれば、電流による培地への悪影響を防止することができる。

また、液面検出器として、光学式液面センサを使用することもできる。光学式液面センサは、光センサを有し、光センサの受光信号に基づき、光学的に各ウエル４内の液面レベルを検出するように構成される。このため、電流や電界を培地に印加せずに、液面レベルを検出するため、電界や電流による培地への悪影響をなくすことができる。

図８等に示すように、取付台１ｄ内に１台の圧電ダイヤフラム式の供給ポンプ４０が、培地供給容器８内の培地を各ウエル４に供給するために配設される。供給ポンプ４０は、図９、図１０に示すように、小型で薄型の圧電ダイヤフラム式ポンプから構成され、ピエゾ素子等の圧電素子５０とその振動駆動により振動するダイヤフラム４５とを備える。培地供給容器８は、取付台１ｄに隣接したベース板１ｂ上に配設され、容器には新しい培地が入れられ、蓋８ａが被せられる。

圧電ダイヤフラム式の供給ポンプ４０は、図９、図１０に示す如く、圧電素子５０を設けた供給ポンプ駆動部４１と、ダイヤフラム４５、ポンプ室４６、入口ポート５４、及び出口ポート５３を設けた供給接液部４２と、が分離可能に結合される。供給ポンプ駆動部４１は、薄い方形の駆動ケース４３を外殻として形成され、駆動ケース４３内に、金属板４９が取り付けられ、金属板４９の内側に圧電素子５０が取り付けられる。さらに、金属板４９の外側に、吸着用のゴム磁石シート４８が取り付けられる。

一方、供給接液部４２は、薄い方形板状の接液ケース４４を外殻として形成され、接液ケース４４内に、ポンプ室４６が形成される。ポンプ室４６の前面にダイヤフラム４５が張設され、ダイヤフラム４５の外側に磁性体ダイヤフラム４７が取り付けられる。接液ケース４４内のポンプ室４６に連通して出口ポート５３と入口ポート５４が設けられ、出口ポート５３に吐出弁５２が設けられ、入口ポート５４に吸入弁５１が設けられる。これにより、圧電素子５０の動作によりダイヤフラム４５が振動すると、入口ポート５４から吸入弁５１を通して培地がポンプ室４６に吸引され、出口ポート５３から吐出弁５２を通して培地が送出される。

供給ポンプ４０は、使用時、図１０に示すように、供給ポンプ駆動部４１と供給接液部４２が重ね合わせて組み付けられるが、供給ポンプ駆動部４１と供給接液部４２を重ね合わせたとき、供給ポンプ駆動部４１のゴム磁石シート４８と供給接液部４２側の金属板４９が吸着し、両者が正確な位置に簡単に組み付けられるようになっている。このため、供給ポンプ４０の使用後、供給接液部４２を洗浄し或いは使い捨てとする場合、供給ポンプ駆動部４１と供給接液部４２を剥がすように操作すれば、ゴム磁石シート４８と金属板４９が分離し、供給接液部４２を供給ポンプ駆動部４１から簡単に取り外して、洗浄し或いは廃棄することができる。

供給ポンプ４０は、図７等に示すように、供給流路マニホールド１５の下側であって、取付台１ｄ上の凹部内に配設され、その供給接液部４２の入口ポート５４には供給チューブ１３、供給流路マニホールド１５を介して培地供給容器８が接続される。また、供給接液部４２の出口ポート５３は、供給流路マニホールド１５により６チャンネルに分岐されて、６台の開閉バルブ１７に接続される。６台の開閉バルブ１７は、図７に示すように、取付台１ｄ内の凹部で、供給ポンプ４０に隣接した位置に収納され、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６に接続される。

供給流路マニホールド１５は、図１１〜図１３に示すように、合成樹脂製の直方体ブロック状に形成され、その内部に、新しい培地を流すための供給用流路１６が形成される。また、図１１の右側の側面に、供給用流路１６に繋がる入口ポート１５ｂが設けられ、この右側面の入口ポート１５ｂには、上記培地供給容器８に接続される供給チューブ１３が接続される。さらに、供給流路マニホールド１５の底部には、上記供給ポンプ４０の供給接液部４２が接続される凹部とポートが形成され、且つ６台の開閉バルブ１７が接続される凹部とポートが設けられる。供給流路マニホールド１５の正面側に、６本の出口ポート１５ａが設けられ、６台の開閉バルブ１７の吐出側は流路を介してこの６本の出口ポート１５ａに接続される。

これにより、供給流路マニホールド１５内に形成された供給用流路１６は、培地供給容器８側の供給チューブ１３と入口ポート１５ｂを通して、培地を供給ポンプ４０の供給接液部４２の入口ポート５４に吸引し、その出口ポート５３から流路を通して６台の開閉バルブ１７に送り、各開閉バルブ１７の吐出側から出口ポート１５ａを通して培地を送出するように、流路が設けられる。

開閉バルブ１７には、例えば形状記憶合金を駆動部に使用した小型バルブを使用することができる。この小型バルブは、例えば消費電力０．３Ｗ以下、オリフィス０．４ｍｍ程度の、非常に小型のバルブであり、安価に製造することができ、使い捨てとして使用することができる。

上記のように、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６は、図１１〜図１３に示す如く、開閉バルブ１７を通して、各ウエル４の供給ノズル１４に、供給チューブ１３を介して接続され、供給ポンプ４０の動作によって、培地供給容器８内の培地が、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６に送られ、開閉バルブ１７を通して、順に供給ノズル１４に供給される。つまり、６台の開閉バルブ１７が順に開放されると、培地は、６チャンネルの供給チューブ１３を通り、６本の供給ノズル１４に順に送られ、各供給ノズル１４から各ウエル４内に供給されるようになっている。

さらに、図７等に示す如く、取付台１ｄ上の後部に、排出ポンプ６０が取り付けられる。排出ポンプ６０は、図１４、図１５に示すように、６チャンネルの蠕動式のペリスタポンプから構成され、図１に示す如く、各ウエル４内に挿入された培養容器５内の培地を、排出チューブ２３を介して、廃液容器９に排出する。廃液容器９はベース板１ｂ上の取付台１ｄの隣接位置に配設され、廃液容器９には、蓋９ａが被せられる。

排出ポンプ６０の吐出側には、排出流路マニホールド２５が排出チューブ２３を介して接続される。排出流路マニホールド２５は、図１７〜図１９に示すように、その平面凹部内に、６本の入口ポート２５ａが設けられ、その右側面に、１本の出口ポート２５ｂが設けられ、内部に、入口ポート２５ａと出口ポート２５ｂを接続するように、排出用流路２６が形成される。

排出ポンプ６０は、培地の流路となる排出接液部６２と、駆動部を駆動して排出接液部６２内から培地を排出するように動作する排出ポンプ駆動部６１とが、分離可能に結合して構成される。排出接液部６２は、図１４に示す如く、ポンプチューブ６３から構成され、ポンプケーシングの下ケース６４ｂ内及びロータ６６上に挿入され、ロータ６６の回転に応じて、ロータ６６の各ローラ６７により押圧され、送液を行う。

排出ポンプ駆動部６１は、図１４、図１５に示す如く、減速機付きの小型モータ６５と、小型モータ６５により低速で回転駆動されるロータ６６とを備える。ロータ６６には複数本（ここでは３本）のローラ６７が、小型モータ６５の回転軸と平行な軸により回転自在に軸支される。ロータ６６の３本のローラ６７には、各々、６チャンネルのローラ部が軸方向に並設され、小型モータ６５の回転軸は、ロータ６６の中心軸に設けた軸穴に、挿入されて連結される。

図１４、図１５に示すように、排出ポンプ６０のポンプケーシングは、上ケース６４ａと下ケース６４ｂとからなり、内部にロータ６６を収納する、略円柱空間状のポンプ室が形成される。排出ポンプ６０のポンプ室内には、内部に挿入されるロータ６６の３本のローラ６７の一部周りに接するように、ポンプチューブ６３がロータ６６上に挿入される。ポンプチューブ６３は、排出ポンプ６０の排出接液部６２を構成し、上ケース６４ａを取り外した状態の、下ケース６４ｂ及びロータ６６上に載置してセットされる。

これにより、排出ポンプ６０から排出接液部６２を分離する場合、上ケース６４ａを下ケース６４ｂ及びロータ６６から取り外せば、ポンプチューブ６３がロータ６６上に露出し、ポンプチューブ６３をポンプケーシングから簡単に取り外して分離することができる。排出ポンプ６０の作動時、小型モータ６５の駆動によりロータ６６が低速回転すると、３本のローラ６７が旋回しながら自転し、ローラ６７の各チャンネルのローラ部が、６チャンネル分のポンプチューブ６３を押し潰しながら回転し、ポンプチューブ６３内の培地を排出側に送ることとなる。

排出ポンプ６０を組み立てる場合、図１４、図１５に示す如く、ポンプチューブ６３を下ケース６４ｂ及びロータ６６上にセットした状態で、上ケース６４ａを下ケース６４ｂの上に被せ、取付板６９を押し付けるように、固定板６８のスリットに取付板６９を挿入する。そして、カバー７０とともに取付板６９を摺動させるのみで、比較的簡単に、排出ポンプ６０を組み立てることができる。カバー７０上にはツマミが突設されている。

排出ポンプ６０の使用後には、カバー７０及び取付板６９を持って摺動させ、上ケース６４ａを下ケース６４ｂ上から取り外せば、ポンプケーシングを容易に分解することができる。そしてこの状態で、排出接液部６２のポンプチューブ６３を、ポンプケーシングから取り外し、その洗浄や交換を簡単に行うことができる。

図１に示すように、上記構成の自動灌流培養装置は、上記制御手段となるコントローラ３０により制御される。コントローラ３０は、例えばマイクロコンピュータを備えて構成され、ウエルプレート３の各ウエル４に対し自動的に培地の灌流を行い、細胞培養を実施する。

上記供給ポンプ４０の圧電素子５０、開閉バルブ１７、排出ポンプ６０の小型モータ６５は、コントローラ３０の制御用出力ポートに接続されて制御され、コントローラ３０の制御用入力ポートには、上記液面検出器７が接続され、液面の検出信号が入力される。コントローラ３０のマイクロプロセッサは、予め記憶されたプログラムデータに基づき、下記のような細胞培養のための灌流処理を実施するように構成される。コントローラ３０とその電源（電池等）は、上記構成の自動灌流培養装置とは別置きで設置され、接続されるが、上記ベース板１ｂと一体に構成することもできる。

次に、上記自動灌流培養装置の動作を、図２０のフローチャートを参照して説明する。細胞培養を行う場合、先ず、ウエルプレート３の各ウエル４の培養容器５内に、培養しようとする細胞を、その底部の膜６に播種する。

このとき、培養しようとする細胞は懸濁液とされ、さらにゲルと混合し、培養容器５の膜６上に播種される。細胞懸濁液をゲルと混合することにより、膜６の目詰まりを防止することができる。ウエルプレート３の各ウエル４内には、所定量の培地（培養液）が入れられ、ケース１の開閉蓋１ａが閉じられる。

この状態で、コントローラ３０が起動され、自動灌流培養装置は、所定の温度、湿度、炭酸ガス濃度に管理されたインキュベータ内に入れられ、培地灌流による細胞培養が行われる。

コントローラ３０が起動し、培地灌流処理を開始すると、先ず、ステップ１００で、排出ポンプ６０が起動し、各ウエル４内の培養容器５内から培地が排出される。つまり、排出ポンプ６０が作動すると、各培養容器５の排出ノズル２４から培地が吸引され、吸引された培地は、排出チューブ２３から排出流路マニホールド２５内の排出用流路２６を通り、廃液容器９内に排出される。この培地の排出は、所定時間（例えば３０秒間）行われ、所定時間経過後に、ステップ１１０に進み、ステップ１２０で、排出ポンプ６０は停止する。このとき、略一定量の古い培地が各培養容器５から排出される。

ペリスタルポンプからなる排出ポンプ６０は、各培養容器５内の古い培地を、各チャンネルのポンプチューブ６３を通して、脈動を生じさせながら排出するが、培養容器５の底部の膜６に播種された細胞の近傍を灌流する培地は、ウエル４内の液面レベルと培養容器５内の液面レベルとのレベル差に応じて、徐々に非常に低流速且つ低流量で、移動することとなり、培地の灌流に排出ポンプ６０の動作の影響が加わることは皆無である。

次に、ステップ１３０で、供給ポンプ４０が起動し、ステップ１４０で、各培養容器５の番号を示す「ｎ」を１とする。供給ポンプ４０が起動すると、供給ポンプ４０によって培地供給容器８から新しい培地が吸引され、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６内に吸引される。

次に、ステップ１５０で、ｎ番目のウエル４の液面検出器７に、検出用のパルス信号を印加し、次のステップ１６０で、液面検出器７から培地液面の検出信号が入力されたか否かを判定する。

ここで、ｎ番目のウエル４の液面レベルが低い場合、検出信号が入力されないと判定され、次に、ステップ１７０に進み、ｎ番目の開閉バルブ１７を開放する。これにより、供給ポンプ４０によって吸引された新しい培地は、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６からｎ番目の開閉バルブ１７を通り、供給チューブ１３から供給ノズル１４を通して、ｎ番目のウエル４内に供給される。

そして、次のステップ１８０で、所定時間（例えば１０秒間）経過したか否かを判定し、所定時間が経過するまで、ｎ番目の開閉バルブ１７を開放して、ｎ番目のウエル４内に培地を供給する。この間、ｎ番目のウエル４内に培地が供給され、その液面レベルが上昇していく。

このとき、図１に示すように、通常、ウエル４内の培地の液面レベルは、培養容器５内の液面レベルに比して高くなっているため、重力によりウエル４内の下部の培地は、液面レベルの低い培養容器５側に緩やかに移動し、その底部の膜６を下側から上側に通り、培養容器５の上部へと徐々に緩やかに灌流する。これにより、膜６に播種されている細胞の周囲に、新たな培地が略連続的に緩やかに付与され、細胞培養が行われる。

一方、ステップ１８０で、所定時間（例えば１０秒間）が経過したと判定すると、次に、ステップ１５０に戻り、再び、ｎ番目のウエル４の液面検出器７に、検出用のパルス信号を印加し、次のステップ１６０で、液面検出器７から培地液面の検出信号が入力されたか否かを判定する。ここで、培地液面の検出信号が入力されない場合、上記ステップ１７０、ステップ１８０が繰り返され、ｎ番目のウエル４内に培地が供給される。

そして、ｎ番目のウエル４の液面レベルが上昇し、その液面検出器７が液面を検出し、検出信号が出力されると、ステップ１６０からステップ１９０に進み、ｎ番目の開閉バルブ１７を閉鎖する。これにより、ｎ番目のウエル４内への培地の供給は停止する。

そして、次に、ステップ２００に進み、各培養容器５の番号を示す「ｎ」を「ｎ＋１」とし、次のステップ２１０を経て、再びステップ１５０に戻り、ｎ＋１番目のウエル４の液面検出器７に、検出用のパルス信号を印加し、次のステップ１６０で、上記のように、液面検出器７から培地液面の検出信号が入力されたか否かを判定する。

そして、ｎ＋１番目のウエル４の液面レベルが低い場合、上記と同様に、検出信号が入力されないと判定され、次に、ステップ１７０に進み、ｎ＋１番目の開閉バルブ１７を開放する。これにより、供給ポンプ４０によって吸引された新しい培地は、供給流路マニホールド１５内の供給用流路１６からｎ＋１番目の開閉バルブ１７を通り、供給チューブ１３から供給ノズル１４を通して、ｎ＋１番目のウエル４内に供給される。

そして、次のステップ１８０で、上記と同様、所定時間（例えば１０秒間）経過したか否かを判定し、所定時間が経過するまで、ｎ＋１番目の開閉バルブ１７を開放して、ｎ＋１番目のウエル４内に培地を供給する。この間、上記と同様に、ｎ＋１番目のウエル４内に培地が供給され、その液面レベルが上昇していくこととなる。

そして、ｎ＋１番目のウエル４の液面レベルが上昇し、その液面検出器７が液面を検出し、検出信号が出力されると、上記と同様、ステップ１６０からステップ１９０に進み、ｎ＋１番目の開閉バルブ１７を閉鎖する。これにより、ｎ＋１番目のウエル４内への培地の供給は停止する。

このようにして、ウエルプレート３の全て（６個）のウエル４について、上記ステップ１５０〜ステップ２１０が繰り返され、これにより、全てのウエル４内に適正量の培地が徐々に略連続して供給され、各ウエル４の液面レベルが所定レベルまで上昇した状態となる。これにより、各ウエル４内の液面レベルは、培養容器５内の液面レベルに比して高くなるため、ウエル４内の下部の培地は、重力によって、培養容器５側に移動し、その底部の膜６を下から上に通り、培養容器５内の上部へと移動する。これにより、膜６に播種されている細胞の周囲に、培地が非常に低速且つ低流量で緩やかに流れることとなる。

このような図２０の培地灌流処理は、所定のルーティン時間で繰り返し実行され、その間、ウエルプレート３の各ウエル４内の培養容器５からは、古い培地が徐々に排出され、各ウエル４内には新しい培地が徐々に供給される。それに伴い、各ウエル４内の培地は、培養容器５の底部の膜６を通して、徐々に緩やかに低速、低流量で培養容器５内に灌流され、そのような動作が所定時間、所定の環境下で行われ、培養容器５内の細胞が培養される。

なお、上記灌流処理は、培養容器５の１回の排出時間を例えば３０秒とし、各ウエル４への供給時間を例えば１０秒とし、１回の灌流処理を約１分３０秒で実施した。このような灌流処理は、時間間隔を略ゼロとして、連続的に繰り返すことができるが、数十秒から数分間の時間間隔をおいて上記灌流処理を繰り返すこともでき、培養する細胞に応じて、任意に決めることができる。また、培養容器５の排出時間、及びウエル４への供給時間は、容器の大きさ、供給ポンプ４０や排出ポンプ６０の送液能力つまり単位時間当たりの送液量に応じて、任意に変えることができる。

上記自動灌流培養装置は、細胞培養の処理が終了した時点で、培養装置がインキュベータから取り出され、各培養容器５内の細胞が顕微鏡下などで観察され検査などが行われる。このような細胞培養の後、培養装置は分解され、次回の使用にそなえて、ケース１内のウエルプレート３、培養容器５、培地供給容器８、廃液容器９、流路マニホールドなどが、洗浄され、或いは使い捨てとして廃棄され、次回の細胞培養時のコンタミネーションを防止する。

使用後の自動灌流培養装置の分解は、ケース１の開閉蓋１ａを開き、ケース１内のウエルプレート３、培養容器５、供給ノズル１４、排出ノズル２４、液面検出器７、供給チューブ１３、及び排出チューブ２３を取り外し、それらを洗浄し、或いは廃棄する。さらに、ベース板１ｂ上の培地供給容器８、廃液容器９を外して洗浄或いは廃棄する。

上記のように、供給ポンプ４０の供給接液部４２は、その供給ポンプ駆動部４１から簡単に取り外し可能な構造であり、排出ポンプ６０はその排出接液部６２を排出ポンプ駆動部６１から簡単に取り外し可能な構造である。このため、取付台１ｄ上の供給ポンプ４０、開閉バルブ１７及び排出ポンプ６０を取り外し、簡単に、供給ポンプ４０から供給接液部４２を外し、排出ポンプ６０から排出接液部６２を取り外し、それらを洗浄し或いは廃棄することができる。さらに、ベース板１ｂ上の取付台１ｄ上から、供給流路マニホールド１５、排出流路マニホールド２５を、供給チューブ１３、排出チューブ２３などとともに取り外して洗浄し、或いは使い捨てとして廃棄する。

このように、上記自動灌流培養装置は、各ウエル４内に培地を供給し、各ウエル４内に挿入された培養容器５の底部の膜６を通して培地を培養容器５内に、徐々に低速、低流量で灌流させ、膜６上に播種した細胞を良好に培養することができる。つまり、ウエル４内の培地液面レベルが培養容器５内より高くなると、培養容器５の底部の膜６を通して培地がウエル４から培養容器５内に灌流し、これにより、培地の灌流は、極めて緩やかに低流速で且つ低流量で行われる。このため、膜６上に播種した細胞には、緩やかな培地の流れが付与される。このため、膜６上の細胞には、緩やかな培地の流れによる適度な刺激が生じて、極めて良好に細胞培養を行うことができる。

また、各ウエル内に挿入された培養容器５から古い培地を排出しつつ、各ウエル４内の培地の液面レベルを検出し、その液面レベルに基づき新しい培地を各ウエル４に供給するため、適正量の培地を低速、低流量で培養容器５の底部に灌流して、培養容器５の膜６に播種した細胞を良好に培養することができる。

さらに、ウエル４を有したウエルプレート３をケース１内に収納し、ケース１内に、供給チューブ１３、供給ノズル１４、排出チューブ２３、及び排出ノズル２４を収納し、且つケース１はコンパクトに形成することができる。これにより、使用者は、自動灌流培養装置を小型のケース１ごとそのままインキュベータ内に出し入れして、簡便に使用することができる。

また、自動灌流培養装置は、構造を簡単化して小型化し、安価に製造することができるので、小規模の研究機関などでも、自動灌流培養装置による細胞培養を、簡便に行うことができる。

さらに、使用後、ウエルプレート３、培養容器５、供給ポンプ４０の供給接液部４２、供給チューブ１３、供給ノズル１４、排出ノズル２４、排出チューブ２３、排出ポンプ６０の排出接液部６２等は、供給ポンプ駆動部４１や排出ポンプ駆動部６１を除いて、灌流培養装置から簡単に取り外すことができ、取り出した部品は、洗浄し或いは廃棄して使い捨てするように使用されることができる。これにより、本自動灌流培養装置を繰り返し使用する場合、細胞のコンタミネーションを防止しつつ、安価なコストで繰り返し細胞培養に使用することができる。

１ ケース
１ａ 開閉蓋
１ｂ ベース板
１ｃ 支持板
１ｄ 取付台
２ 収納室
３ ウエルプレート
４ ウエル
５ 培養容器
６ 膜
７ 液面検出器
８ 培地供給容器
８ａ 蓋
９ 廃液容器
９ａ 蓋
１３ 供給チューブ
１４ 供給ノズル
１５ 供給流路マニホールド
１５ａ 出口ポート
１５ｂ 入口ポート
１６ 供給用流路
１７ 開閉バルブ
２３ 排出チューブ
２４ 排出ノズル
２５ 排出流路マニホールド
２５ａ 入口ポート
２５ｂ 出口ポート
２６ 排出用流路
３０ コントローラ
４０ 供給ポンプ
４１ 供給ポンプ駆動部
４２ 供給接液部
４３ 駆動ケース
４４ 接液ケース
４５ ダイヤフラム
４６ ポンプ室
４７ 磁性体ダイヤフラム
４８ ゴム磁石シート
４９ 金属板
５０ 圧電素子
５１ 吸入弁
５２ 吐出弁
５３ 出口ポート
５４ 入口ポート
６０ 排出ポンプ
６１ 排出ポンプ駆動部
６２ 排出接液部
６３ ポンプチューブ
６４ａ 上ケース
６４ｂ 下ケース
６５ 小型モータ
６６ ロータ
６７ ローラ
６８ 固定板
６９ 取付板
７０ カバー

Claims (13)

1. 培地を収容する外側容器と、
   該外側容器内に挿入され、細胞を播種する多孔質の膜を底部に有した培養容器と、
   該外側容器内に培地を供給するように配設された供給流路と、
   該供給流路を通して該外側容器内に培地を供給する供給ポンプと、
   該培養容器内から培地を排出するように配設された排出流路と、
   該排出流路を通して該培養容器内から培地を排出する排出ポンプと、
   該外側容器内の培地の液面レベルを検出して液面検出信号を発生する液面検出手段と、
   該液面検出手段の液面検出信号に基づき、該供給ポンプを制御して、該外側容器への培地の供給量を制御する制御手段と、
   を備え、
   該外側容器内の培地液面レベルと該培養容器内の培地液面レベルとの差に応じて、該外側容器内の培地が前記多孔質の膜を通して該培養容器内に灌流することを特徴とする自動灌流培養装置。
2. 前記供給流路は、前記供給ポンプに接続される供給チューブと、該供給チューブに接続され、前記外側容器内に配置される供給ノズルと、を備え、
   前記排出流路は、前記排出ポンプに接続される排出チューブと、該排出チューブに接続され、前記培養容器内に配置される排出ノズルと、を備えたことを特徴とする請求項１記載の自動灌流培養装置。
3. 前記供給ポンプは、培地の流路となる供給接液部と、駆動部を駆動して該供給接液部内に培地を送るように動作する供給ポンプ駆動部とが、分離可能に連結され、前記排出ポンプは、培地の流路となる排出接液部と、駆動部を駆動して該排出接液部内から培地を排出するように動作する排出ポンプ駆動部とが、分離可能に連結されたことを特徴とする請求項２記載の自動灌流培養装置。
4. 前記外側容器、前記培養容器、前記供給ポンプの供給接液部、前記供給チューブ、供給ノズル、排出ノズル、排出チューブ、及び前記排出ポンプの排出接液部は、取り外し交換可能に配設されたことを特徴とする請求項３記載の自動灌流培養装置。
5. 前記外側容器は、複数のウエルを有したウエルプレートからなり、各ウエル内に前記培養容器が挿入されたことを特徴とする請求項２記載の自動灌流培養装置。
6. 前記ウエルプレートを取出可能に収納する収納室と該収納室を開閉する開閉蓋とを備えたケースが設けられ、該ケースには、少なくとも、該ウエルプレート、前記培養容器、供給ノズル、供給チューブ、排出ノズル、排出チューブが、収納されたことを特徴とする請求項５記載の自動灌流培養装置。
7. 前記供給接液部に接続される流路が供給流路マニホールドとして一体化され、該供給流路マニホールドは取り出し交換可能に形成されたことを特徴とする請求項３記載の自動灌流培養装置。
8. 前記排出接液部に接続される流路が排出流路マニホールドとして一体化され、該排出流路マニホールドは取り出し交換可能に形成されたことを特徴とする請求項３記載の自動灌流培養装置。
9. 前記供給流路マニホールド内における、供給ポンプの供給接液部と前記供給ノズル間の各流路に、開閉バルブが接続されたことを特徴とする請求項７記載の自動灌流培養装置。
10. 前記供給ポンプは圧電ダイヤフラム式ポンプから構成され、前記供給接液部はダイヤフラムを含むポンプ室を有していることを特徴とする請求項３記載の自動灌流培養装置。
11. 前記液面検出手段として、１対の電極部が前記外側容器内に挿入され、該電極部間にパルス電圧を印加して該外側容器内の液面を検出する液面検出器が配設されることを特徴とする請求項１記載の自動灌流培養装置。
12. 前記液面検出手段として、光センサを有し、該光センサの受光信号に基づき、光学的に前記外側容器内の液面レベルを検出する光学式液面センサが、配設されたことを特徴とする請求項１記載の自動灌流培養装置。
13. 前記液面検出手段として、参照電極と検出電極を有し、液面レベルに応じて変化する該参照電極と該検出電極間の静電容量の変化に基づき、前記外側容器内の液面レベルを非接触で検出する静電容量式液面センサが、配設されたことを特徴とする請求項１記載の自動灌流培養装置。
    
    
    

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