JP6158252B2 - 差異荷電粒子移動度によるリポ蛋白質の分析 - Google Patents
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Description
National Cholesterol Education Programおよびthe National Heart,Lung and Blood Instituteから発行)には包含されていないためである。
LDLC=TC−(HDLC+VLDLC)
フリードワルド法は一般的に有用であるが,場合によっては正確性が限定される。例えば,3段階のいずれかにおいて誤差が生じうる。これは,部分的には,この方法が各段階において異なる手順を用いることを必要とするためである。さらに,フリードワルド法は,VLDLC濃度が血漿トリグリセリドの濃度の5分の1であると仮定するため,ある程度間接的である。したがって,ある患者のVLDLがこの比率から外れている場合,さらなる誤差が生ずる。
ができる。
用する。
ルおよび他の脂質との非共有結合によりパッケージされて生物学的に組み立てられているアポリポ蛋白質を含む。リポ蛋白質は,好ましくは,約7−120nmのサイズ範囲を有する生物学的粒子を表し,本明細書に定義されるVLDL(超低密度リポ蛋白質),IDL(中間密度リポ蛋白質),LDL(低密度リポ蛋白質),Lp(a)[リポ蛋白質(a)],HDL(高密度リポ蛋白質)およびカイロミクロンを含む。
からなる群より選択される。ある態様においては,リポ蛋白質捕捉リガンドは,アプタマーおよび抗体の群より選択される。ある態様においては,リポ蛋白質捕捉リガンドは抗体である。
0.86xゲル直径=IM 直径
により概算される。
えられる。サイズの相違はまた,粒子密度(分析用超遠心分離による分離から得られた)を電子顕微鏡から得られた粒子サイズに変換するために用いた歴史的データによるものであるかもしれない。
粒子直径は次式から得られる:
したがって,dについて解くと,以下の関係が得られる:
遠心分離を表す。驚くべきことに,本明細書に記載される遠心分離平衡に到達しないような短縮化した遠心分離プロトコルが,それにもかかわらずリポ蛋白質の有意な精製を与えうることが見いだされた。
イズ(直径)の関数として計数することに依存している。したがって,粒子の体積および密度を用いて,特定のサイズをもつ粒子の数を質量の値に変換することが可能である。リポ蛋白質の密度は,よく知られるように粒子サイズの関数であり,例えば,文献から入手可能である。図に示される質量の値は,相対値を示すよう単純に拡大/縮小されているが,希釈係数ならびにイオン移動度分光光度計を通過するサンプルおよび空気の流速を用いて,血漿中のリポ蛋白質の実際の質量に変換することができる。したがって,ある態様においては,非平衡遠心分離の前に,リポ蛋白質含有溶液の密度をより高い密度のリポ蛋白質(例えばHDL)を分離することが予測されるよりも低い値に調節することにより,実際にHDLおよびLDLを分離することができる。有益なことに,リポ蛋白質含有サンプルの密度を低下させる方法は,アルブミンからの分離も増加させる。
プル溶液を遠心チューブ中の第2の溶液の下に導入してもよい。リポ蛋白質含有サンプルの密度調節は,表1の密度にしたがって1.00−約1.21g/mLの範囲内で選択して,同じまたはより低い密度を有するリポ蛋白質のクラスを分離することができる。第2の溶液の密度は,1.00g/mLからリポ蛋白質含有サンプル溶液の密度のちょうど下までの範囲で,好ましくは1.00から約1.15g/mLの範囲で,より好ましくは1.00g/mLとして選択することができる。このようにして,リポ蛋白質含有サンプル溶液より低い密度を有するHDL,IDL,LDL,Lp(a)およびVLDLリポ蛋白質を同時に抽出することができる。驚くべきことに,遠心チューブ中のリポ蛋白質含有溶液に,リポ蛋白質含有溶液の上に隣接して低い密度を有する溶液を提供することにより,遠心分離による分離を用いるリポ蛋白質の回収が増加することが見いだされた。好ましい態様においては,リポ蛋白質含有画分は,チューブの最も上部のメニスカスから下方向にほぼ所望の容量で取り出す。
れる。芳香族性アルブミン結合染料としては,ジアゾ染料;前記ジアゾ染料のアルカリ金属塩,アルカリ土類金属塩,またはアミン塩;スルホン酸染料;前記スルホン酸染料の生理学的に許容しうるアルカリ金属塩,アルカリ土類金属塩,またはアミン塩;またはこれらの混合物が挙げられる。本発明において特に有用な芳香族性アルブミン結合染料としては,Reactive Blue2,Evans Blue,Trypan Blue,Bromcresol Green,Bromcresol Purple,Methyl Orange,Procionred HE3B等が挙げられる。ある態様においては,アルブミン結合化合物は,ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)の類似体である。アルブミン結合化合物として用いるのに適した代表的なNAD類似体としては,限定されないが,RG19,およびCibacrom Blue 3GA(CB3GA)が挙げられる。
ウム(AA)を使用することにより,差異荷電粒子移動度分析により判定して,LDLおよびHDL画分の回収を調節することができる。実施例4および図5を参照すると,図5に示されるプロファイルのHDL領域には類似性があり,抽出中にDSが存在すると,HDLの回収が増加する。さらに,低いアルブミンピーク高さが観察された。HDL2a(図5)中の1つの調製物中のピークの増加は典型的には再現性がないと考えられる。また,顕著なことは,LDLの回収の増加である。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが,ここに示される結果は,抽出および希釈剤中に存在するDSが最良の回収および再現性を与えることを示唆する。
離を可能とするのに十分に安定な複合体を生ずる相互作用または複合体形成を表す。ある態様においては,アプタマーはApoA1,ApoB,またはApo(a)に特異的に結合する。本発明に有用なアプタマーを製造しスクリーニングする方法は,当該技術分野においてよく知られている。例えば,Griffin et al.,米国特許5,756,291(その全体はすべての目的のために本明細書に参照として組み込まれる)を参照。
分野においてよく知られるように,一対でのまたは多数のアラインメント実験を行うことにより,“ヌクレオチド配列または任意に連続したヌクレオチドの領域が同定され,その存在がアプタマーの標的への結合と相関しているコンセンサス配列”を解明することができる。コンセンサス配列が同定されれば,慣用の合成または組換え手段によりコンセンサス配列を含むオリゴヌクレオチドを作製することができる。
めることにより,HDLの回収にはほとんど影響を与えることなく,LDLの回収が有意に増加することがわかった。DSは,約0.1から50mg/mLの範囲の濃度でリポ蛋白質含有サンプルと混合することができる。ある態様においては,DSの濃度は,約0.1,0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,40.0mg/mLであり,50.0mg/mLであってもよい。
かなる理論にも拘束されることを望むものではないが,不活性遠心分離マトリクスは,例えば,減速の間に,および/またはリポ蛋白質または他の画分をチューブからピペッティングする際に導入されるアルチファクトを最小限にするように,遠心分離の後に遠心分離チューブの内容物を安定化するよう作用すると考えられる。例示的不活性遠心分離マトリクスとしては,限定されないが,ゲルスラリーまたは不活性ビーズが挙げられる。ある態様においては,ゲルスラリーはSephadex(登録商標)ゲルマトリクスである。ある態様においては,不活性遠心分離マトリクスは不活性ビーズを含む。例示的不活性ビーズとしては,限定されないが,遠心チューブ中の第1の溶液の底に沈むよう適合されたガラスビーズ,ポリスチレンビーズ等が挙げられる。不活性ビーズは,慣用のサイズのいずれであってもよく,例えば,限定されないが,約0.1,0.2,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.21.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,2.0,2.2,2.4,2.6,2.8,3.0,3.3,3.6,3.9,4.0mmであることができ,あるいはこれより小さくても大きくてもよい。
床医,他のヘルスケア提供者,疫学者等に対して提供される報告書を表し,この報告書は,生物学的標本,例えば個体からの血漿標本の分析の結果を含む。分析報告書は,当該技術分野において知られるように,印刷された形態で,電子的な形態で,あるいは,その中のデータの分析,検討および/またはアーカイブに便利な任意の形態で表示することができる。分析報告書は,報告書の対象である個体に関する識別情報,例えば,限定されないが,氏名,住所,性別,識別情報(例えば,社会保障番号)等を含んでいてもよい。分析報告書は,当該技術分野において知られるか,および/または本明細書に記載されるように,サンプル中の脂質の生化学的特徴付け,例えば,限定されないが,トリグリセリド,総コレステロール,LDLコレステロール,および/またはHDLコレステロール等の特徴付けを含んでいてもよい。分析報告書は,さらに,本明細書に記載される方法により調製されたサンプルについて行われたリポ蛋白質の特徴付け,およびその参照範囲を含んでいてもよい。“参照範囲”との用語および同様の用語は,個体の集団において通常典型的に観察される範囲を反映するものとして知られている生物学的サンプルの成分の濃度を表す。分析報告書におけるリポ蛋白質の特徴付けの例としては,差異荷電粒子移動度により決定した非HDLリポ蛋白質およびLp(a)の濃度が挙げられる。例えば,本発明の方法により調製したサンプルについて行った差異荷電粒子移動度分析により測定されたリポ蛋白質の特徴付けのさらに別の例としては,VLDL,IDL,Lp(a),LDLおよびHDL,およびこれらのサブクラスの濃度および参照範囲が挙げられる。分析報告書はさらに,例えば,本発明の方法により調整されたサンプルの差異荷電粒子移動度分析により得られるリポ蛋白質サイズ分布を含んでいてもよい。例示的分析報告書に含まれる項目は実施例7に示される。
血清サンプル(25uL)を,低密度塩溶液(1.151g/mL)(すなわち,“低密度塩サンプル”)またはD2O(各200uL)のいずれかを用いて加工処理した。サンプルを,223,000xGで3.7時間(低密度塩サンプル),または2時間(D2O)遠心分離した。遠心分離後に最上部100uLを取り出して,低密度塩サンプルを酢酸アンモニウム溶液に対して透析し,1:200に希釈した後,差異荷電粒子移動度分析を行った。D2Oサンプルは,遠心分離の直後に酢酸アンモニウムで1:200に希釈した後,差異荷電粒子移動度分析を行った。差異荷電粒子移動度分析の結果を図2に示す。
D2Oを用いる手順の間にHDL(ApoA1)が優先的に減少するか否かを評価するため,図3に示す3つのサンプル(すなわち,749,1043,14:任意の固有の患者識別番号)について,D2Oをアルブミンを除去するためのRGD/DS溶液(それぞれ7.5/2.5mg/mL)とともに用いて,リポ蛋白質を単離した。サンプルはそれぞれ6重に用意した。単離したそれぞれの最上部100uLを,ApoA1(HDL),ApoB(LDL,IDL,VLDL)および総コレステロール(TC)についてそれぞれ分析した。血漿または血清アポリポ蛋白質AIおよびBは,標準化ELISAにより,市販のモノクローナル捕捉抗体(Biodesign International,Saco,MN)および精製しビオチン化した抗ヒトヤギポリクローナル検出抗体(International Immunology Corp.,Murrieta,CA)を用いる非競合的サンドウィッチイムノアッセイで測定した。濃度は,ストレプトアビジンコンジュゲート化ペルオキシダーゼを加え,オルトフェニリンジアミンを用いて発色させることにより測定した。リポ蛋白質較正器は,CDC#1883血清参照材料(Center for Disease Control,Atlanta,GA)およびプールした参照血清(Northwest Lipid Research Clinic,Seattle,WA)を用いて標準化した。総コレステロールは,市販のアッセイキット試薬(Bayer Health Care,Tarrytown,NY)を用いて,
製造元の指針にしたがって,マイクロタイタープレートのウエルあたり25μlの血清または血漿プラス200μlのコレステロール試薬の分析用に改変して測定した。発色後,標準,対照,サンプルおよび試薬バックグラウンドをマイクロタイタープレートリーダーを用いて測定した。結果(図3)は,各血清中に存在する総量と比較した各サンプルの平均回収率を示す。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが,ApoA1とApoBの回収が同等であったことからみて,精製手順によってHDLは優先的に減少しなかった。
血清サンプルを,種々の量のRGD(10,15,20,25mg/mL)と混合し,氷上で15分間インキュベーションした後,D2Oのクッションの上に重層した。223,000xGで120分間遠心分離した後,最上部の100μLを取り出し,酢酸アンモニウム溶液で1:200に希釈した。次に,サンプルを差異荷電粒子移動度分析により分析した。結果を図4に示す。
図5を参照すると,抽出/精製物および希釈物の両方において,アルブミンの除去およびリポ蛋白質の回収に及ぼすDSの影響を評価するために,血清サンプル(5uL)を,20μLの7.5mg/mL RGD単独(図5中“C/D”)または20μLの7.5mg/mL RGDと2.5mg/mL DSとの組み合わせ(図5中“A/B”)で抽出した。抽出および希釈の両方について,用いたDSの分子量は10Kである。氷上で15分間インキュベーションした後,各サンプルを223,000xG,10℃で,2時間15分間遠心分離した。最上部の100μLを取り出し,25mM酢酸アンモニウム溶液(図5中“B/D”)または5ug/mL DS(図5中“A/C”)を含む25mM酢酸アンモニウムのいずれかで1:200に希釈した。
図6を参照すると,当該技術分野においてよく知られる方法を用いて,18時間の密度分離により調製したリポ蛋白質含有血清サンプルを透析後に用いて,希釈剤中のDSがLDLの回収に及ぼす効果を評価した。遠心分離した血清サンプルのアリコートを25mM酢酸アンモニウムでDSなしで1:200に希釈し,差異荷電粒子移動度分析を行った。別のアリコートを25mM酢酸アンモニウムで5μg/mLのDSの存在下で1:200に希釈した。各サンプルについて二重に行った試験の結果を図6に示す。
血漿から得たリポ蛋白質含有サンプルをボルテックスにより軽く混合した。5μLのサンプルまたは任意に対照を,7.5mg/mLのRGD(Sigma),2.5mg/mLのDS(Sigma)および0.5mg/mLのEDTA(Spectrum Chemicals)を含む20μLのアルブミン除去試薬と混合し,氷上で15分間インキュベーションした。インキュベーションの後,サンプル混合物をTi42.2超遠心チューブ(Beckmann)中の200μLのD2O(Medical Isotopes)の上に重層した。次にサンプルを10℃で223,000xG(42,000rpm)で135分間超遠心分離した。超遠心分離後,脂質画分(85μL)を遠心チューブの最上部から取り出した。差異荷電粒子移動度による分析の前に,HDL分析用に,サンプルを25mM酢酸アンモニウム,0.5mM水酸化アンモニウム(pH7.4)で最終希釈1:800に希釈した。LDL分析用には,サンプルを5μg/mLのDSを含む同じ希釈剤で1:200に希釈した。最終希釈物はディープウエル96ウエルプレート中に作製し,6℃に維持した冷却板付きオートサンプラーに置いた後,差異荷電粒子移動度分析を行った。
静脈穿刺により採取した全血から血清を分離した。分離後,血清を3つに分けた。1つのアリコートは,当該技術分野においてよく知られる伝統的な方法を用いて,HDL,トリグリセリド,および総コレステロールの含有量について分析した。LDLはこれらの結果から計算した。好ましい態様においては,トリグリセリドが400mg/dLより高い場合,LDLは直接測定した。第2のアリコートは,当該技術分野においてよく知られるイムノアッセイを用いて,そのLp(a)含有量について分析した。第3のアリコートについて,差異荷電粒子移動度分析を用いてリポ蛋白質を分画した。
,他のタイプのリポ蛋白質に適用することができる。順次浮遊により血漿からHDLを単離して,密度区間1.063−1.20g/mLのリポ蛋白質を得た。次に総HDL画分をバックグラウンド塩密度1.184g/mLに対して透析し,固定角50.3のBeckmanローターで40,000rpm,10℃で28時間遠心分離した。次に6mlの遠心チューブからピペットにより,主として大,中,および小HDLサブ画分(それぞれ,T[0−1],T[1−3]およびT[3−6])を得た。次にサブ画分を100mMNaHCO3(pH8.5)に対して4℃で一晩透析した。各サブ画分の蛋白質濃度をローリー法を用いて測定した。
,選択された領域において式4:
の関数にフィットする。上述の式4は,2nmより大きい粒子直径について有効である。ある態様においては,フィットの領域は,3−6,3−4,3−5,3−6,4−6,または5−6nm(粒子直径)であり,好ましくは3−4nmである。ある態様においては,差異荷電粒子移動度データ全体を,等式4へのあてはめから得られる関数により補正する。
y’=y * ((d-lowerlimit) * 2 * dimer+(upperlimit-d) * 2) (7)
(yはアルブミン補正曲線であり,y’はアルブミンダイマーの存在の段階的抑制後のアルブミン補正曲線であり,dは粒子直径であり,lowerlimitおよびupperlimitは,それぞれ補正用のサイズの下限および上限であり,dimerは選択されたパーセントダイマー濃度
である。ある態様においては,ダイマーの存在が抑制されている領域は,7.9nm(lowerlimit)と8.4nm(upperlimit)との間である。
の関数で表される。ある態様においては,kaは0.1−10,1−5,2−4または2−3の範囲である。ある態様においては,kaは2.56である。ある態様においては,この特定の領域は,0−15,5−10,6−9,7−8,好ましくは7.3−7.5nmである。ある態様においては,アルブミンモノマーの寄与を判定して等式8にベストフィットさせた後,ここから同じ寄与のスケールで等式7を減算することにより差異荷電粒子移動度粒子サイズ分布データを補正する。ある態様においては,等式7を減算することによる補正は,特定の領域,例えば,限定されないが,0−15,2−12,4−10,好ましくは6−10nm中で行う。補正が10−11nmの範囲を意図しないある態様においては,領域10−11nm中の対応する補正は,等式7を(11−直径)倍し,その結果を差異荷電粒子移動度粒子サイズ分布データから減算することにより行う。
きる。イオン移動度分析装置20には,例えば上述したアルゴリズムにしたがってデータをプロセシングすることができる電子装置(図に示さず),例えばコンピュータが備えられていてもよい。
からなる"との用語は,互いに他の2つの用語のいずれかと置き換えることができる。本
明細書において用いた用語および表現は,説明の用語として用いるものであり,限定ではなく,そのような用語および表現の使用においては,示されかつ記載されている特徴またはその一部の同等物を排除することを意図するものではなく,特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち,好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが,当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり,そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
Claims (8)
- リポ蛋白質のサイズ分布を分析する方法であって、前記方法は遠心分離を含まず、前記方法は、
(a)リポ蛋白質および非リポ蛋白質を含む溶液を1またはそれ以上のポリアニオン化合物および1またはそれ以上の二価カチオンと混合し;
(b)前記混合溶液中でリポ蛋白質を含む沈殿物を形成させ;
(c)工程(b)の後に、沈殿したリポ蛋白質を回収し;そして
(d)前記1またはそれ以上のリポ蛋白質を差異荷電粒子移動度分析に供する、
ここで、前記分析は、
(i)粒子サイズの1またはそれ以上の領域における粒子サイズ分布を決定し;
(ii)非リポ蛋白質試薬または非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布に対する寄与を減算して、リポ蛋白質粒子サイズ分布を求め;そして
(iii)リポ蛋白質粒子サイズ分布を、ディスプレイ、プリンタ、またはメモリに出力する、
の各工程を含み、
これによって前記リポ蛋白質のサイズ分布を決定するものであり、
前記粒子サイズ分布の決定は、前記1またはそれ以上の領域についてベストフィットを決定することを含み、
ベストフィットは次式:
で表され、前記ベストフィットの決定はk1の値を計算することを含む、
方法。 - 前記ポリアニオン化合物は、硫酸デキストラン、およびポリビニル硫酸からなる群より選択され、前記二価カチオンはMg2+およびCa2+からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記1またはそれ以上のリポ蛋白質は、個体から得た血漿サンプルに由来する、請求項1または2記載の方法。
- 前記1またはそれ以上のリポ蛋白質は、HDL、LDL、Lp(a)、IDLおよびVLDLからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- (e)前記決定されたリポ蛋白質サイズ分布を用いて前記個体の評価を行い、前記評価は、脂質に関連する健康上のリスク、心臓血管疾患、心臓血管疾患のリスク、および治療的介入に対する応答性からなる群より選択される、
の工程をさらに含む、請求項3記載の方法。 - 前記減算は、非リポ蛋白質試薬または非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布を表す理論的曲線を適用することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- リポ蛋白質のサイズ分布を分析する方法であって、前記方法は、
(a)リポ蛋白質および非リポ蛋白質を含む溶液を1またはそれ以上のポリアニオン化合物および1またはそれ以上の二価カチオンと混合し;
(b)前記混合溶液中でリポ蛋白質を含む沈殿物を形成させ;
(c)沈殿したリポ蛋白質を回収し;
(d)前記1またはそれ以上のリポ蛋白質を差異荷電粒子移動度分析に供する、
ここで、前記分析は、
(i)粒子サイズの1またはそれ以上の領域における粒子サイズ分布を決定し;
(ii)非リポ蛋白質試薬または非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布に対する寄与を減算して、リポ蛋白質粒子サイズ分布を求め;そして
(iii)リポ蛋白質粒子サイズ分布を、ディスプレイ、プリンタ、またはメモリに出力する、
の各工程を含み、
これによって前記リポ蛋白質のサイズ分布を決定するものであり、
前記粒子サイズ分布の決定は、前記1またはそれ以上の領域についてベストフィットを決定することを含み、
ベストフィットは次式:
で表され、前記ベストフィットの決定はk 1 の値を計算することを含み、
前記方法は遠心分離を含まず、前記非リポ蛋白質試薬はデキストランとコンジュゲート化したReactive Green 19(RG19)(商標)である、方法。 - 前記非リポ蛋白質サンプル材料はアルブミンである、請求項1記載の方法。
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