JP6141728B2 - アンチセンス核酸 - Google Patents
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Description
本発明者らは、ジストロフィン遺伝子の構造を詳細に研究した結果、ジストロフィン遺伝子のmRNA前駆体(以下、「pre-mRNA」という)のうちエクソン53の5’末端から第32〜56番目周辺のヌクレオチドからなる配列をアンチセンスオリゴマーでターゲッティングすることにより、高効率にエクソン53のスキッピングを誘導できることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。
[1] ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンの5’末端から第31〜53番目、第31〜54番目、第31〜55番目、第31〜56番目、第31〜57番目、第31〜58番目、第32〜53番目、第32〜54番目、第32〜55番目、第32〜56番目、第32〜57番目、第32〜58番目、第33〜53番目、第33〜54番目、第33〜55番目、第33〜56番目、第33〜57番目、第33〜58番目、第34〜53番目、第34〜54番目、第34〜55番目、第34〜56番目、第34〜57番目、第34〜58番目、第35〜53番目、第35〜54番目、第35〜55番目、第35〜56番目、第35〜57番目、第35〜58番目、第36〜53番目、第36〜54番目、第36〜55番目、第36〜56番目、第36〜57番目又は第36〜58番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか1つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
[2] オリゴヌクレオチドである、前記[1]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[3] 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、前記[2]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[4] 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記[3]に記載のアンチセンスオリゴマー。
(上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。)
[5] 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合のからなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記[3]又は[4]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[6] モルホリノオリゴマーである、前記[1]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[7] ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記[6]に記載のアンチセンスオリゴマー。
[8] 5’末端が、下記化学式(1)〜(3)のいずれかの基である、前記[1]〜[7]のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
[10] 配列番号2〜37からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列からなる、前記[1]〜[8]のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
[11] 配列番号11、17、23、29及び35からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列からなる、前記[1]〜[8]のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
[12] 配列番号11又は35のいずれか1つの塩基配列からなる、前記[1]〜[8]のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
[13] 前記[1]〜[12]のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2010年9月1日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2010-196032号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンの5’末端から第31〜53番目、第31〜54番目、第31〜55番目、第31〜56番目、第31〜57番目、第31〜58番目、第32〜53番目、第32〜54番目、第32〜55番目、第32〜56番目、第32〜57番目、第32〜58番目、第33〜53番目、第33〜54番目、第33〜55番目、第33〜56番目、第33〜57番目、第33〜58番目、第34〜53番目、第34〜54番目、第34〜55番目、第34〜56番目、第34〜57番目、第34〜58番目、第35〜53番目、第35〜54番目、第35〜55番目、第35〜56番目、第35〜57番目、第35〜58番目、第36〜53番目、第36〜54番目、第36〜55番目、第36〜56番目、第36〜57番目又は第36〜58番目のヌクレオチドからなる配列(以下、「標的配列」ともいう。)のいずれか1つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー(以下、「本発明のオリゴマー」という)を提供する。
本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、cDNA、mRNA前駆体及びmRNAも含まれる。好ましくは、遺伝子は、mRNA前駆体、即ち、pre-mRNAである。
ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Xp21.2に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、3.0 Mbpのサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか14kbに過ぎず、該コード領域は79個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している(Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993))。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるpre-mRNAは、スプライシングを受けて14kbの成熟mRNAを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である(GenBank Accession No. NM_004006)。
ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン53の塩基配列を配列番号1に示す。
変異型のヒトジストロフィン遺伝子のエクソン53は、具体的には、以下の(a)又は(b)に記載のポリヌクレオチドである。
(a)配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
(b)配列番号1の塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
好ましくは、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンの5’末端から第32〜56番目又は第36〜56番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか1つに相補的な塩基配列(例えば、配列番号11又は配列番号35)からなるものである。
従って、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン53のスキッピングを可能にする限り、ターゲット配列に対して100%相補的な塩基配列を有していなくてもよい。例えば、本発明のオリゴマーには、ターゲット配列に対して、1〜3個、1〜2個又は1個の非相補的塩基が含まれていてもよい。
ここで、前記「結合」は、本発明のオリゴマーとヒトジストロフィン遺伝子の転写物とを混合した場合に、生理的条件下で両者がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意味する。上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のpH、塩組成、温度に調節された条件を意味する。例えば、25〜40℃、好ましくは37℃、pH 5〜8、好ましくは、pH 7.4であって、塩化ナトリウム濃度が150 mMの条件が挙げられる。
スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAを被検細胞から回収し、該mRNAのうち、エクソン53がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン53がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定し、これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。
糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの4’位のOをSに置換したもの、糖の 2' 位と 4' 位を架橋したもの、例えば、LNA(Locked Nucleic Acid)又はENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
(式中、Baseは、核酸塩基を表す。)
(式中、Baseは、前記と同義であり;
Wは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
(式中、Xは、-CH2R1、-O-CH2R1、-S-CH2R1、-NR2R3又はFを表し;
R1は、H、アルキルを表し;
R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し;
Y1は、0、S、CH2又はNR1を表し;
Y2は、0、S又はNR1を表し;
Zは、0又はSを表す。))
(式中、Base、R2、R3は、前記と同義である。)
PMOの1つの態様として、例えば、次の一般式(I)で表される化合物(以下、PMO(I)という)を挙げることができる。
[式中、各Base、R2、R3は、前記と同義であり;
nは、1〜99の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、18〜28の範囲内にある任意の整数である。]
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、PMOの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
次の一般式(II)で表される化合物(以下、化合物(II)という)に酸を作用させることによって、次の一般式(III)で表される化合物(以下、化合物(III)という。)を製造する工程。
[式中、n、R2、R3は、前記と同義であり;
各BPは,独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し;
Tは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し;
Lは、水素、アシル、又は次の一般式(IV)で表される基(以下、基(IV)という。)を表す。]
かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、4-メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、4-tert-ブチルフェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル、(ジメチルアミノ)メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、2-シアノエチル、4−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で1〜5個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、1-ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、4-(tert-ブチルカルボキシ)ベンジル、4-[(ジメチルアミノ)カルボキシ]ベンジル、4-(フェニルカルボキシ)ベンジルを挙げることができる(例えば、国際公開公報第2009/064471号公報参照)。
本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、化合物(II)1モルに対して0.1モル当量〜1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量〜100モル当量の範囲内である。
また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸1モルに対して、0.01モル当量〜10モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、0.1モル当量〜2モル当量の範囲内である。
本工程に使用しうる酸は、0.1%〜30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類(エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど)、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当である。好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。
本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類(エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど)、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。
[式中、BP、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。]
次の一般式(V)で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式(VI)で表される化合物(以下、化合物(VI)という。)を製造する工程。
[式中、BP、T、リンカーは、前記と同義であり;
R4は、水酸基、ハロゲン、又は、アミノを表す。]
特に、次の一般式(VIa)で表される化合物は、化合物(V)と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
[式中、BP、Tは、前記と同義である。]
化合物(VI)に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物(IIa)を製造する工程。
[式中、BP、R4、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。]
[式中、BP、R2、R3、T、リンカー、固相担体は、前記と同義であり;
n’は、1〜98を表す。]
[式中、BP、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、n’、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、Tは、前記と同義であり;
R5は、アシルを表す。]
[式中、BP、n’、R2、R3、R5、Tは、前記と同義である。]
化合物(III)に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式(VII)で表される化合物(以下、化合物(VII)という。)を製造する工程。
[式中、各BP、L、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、R2、R3、Tは前記と同義である。]
本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、0.1%〜30%の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、N,N-ジメチルイミダゾリドン、N-メチルピペリドン、DMF、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げることができる。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常1分〜48時間の範囲内が適当であり、好ましくは、30分〜24時間の範囲内である。
また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、0.1モル当量〜10000モル当量の範囲内が好ましく、1モル当量〜1000モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤1モルに対して、0.1モル当量〜100モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量〜10モル当量の範囲内である。
工程Bにおいて製造される化合物(VII)において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式(IX)で表される化合物を製造する工程。
[式中、Base、BP、L、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
工程Cにおいて製造される化合物(IX)に酸を作用させることによって、PMO(I)を製造する工程。
[式中、Base、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
逆相クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば20mMのトリエチルアミン/酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、例えば、1Mの食塩水と10mMの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
(式中、Baseは、前記と同義である。)
1)P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt,Science, 254, 1497 (1991)
2)M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg,Jacs., 114, 1895 (1992)
3)K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt,J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
4)L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm,O. Buchardt, P. E. Nielsen, J.
Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
5)T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
以下、上記(1)、(2)及び(3)で示される基を、それぞれ「基(1)」、「基(2)」及び「基(3)」と呼ぶ。
本発明のオリゴマーは、従来技術に係るアンチセンスオリゴマーと比較して、高効率にエクソン53のスキッピングを可能にする。従って、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物をDMD患者に投与することにより、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。例えば、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物を用いる場合、従来技術に係るオリゴマーと比べて少量の投与量でも同程度の治療効果を得られるため、副作用を軽減することができ、かつ経済的である。
そこで、別の実施態様として、本発明のオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物(以下、「本発明の組成物」という)を提供する。
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
工程1:4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、N−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミド22.0gと4−ジメチルアミノピリジン(4−DMAP)7.04gをジクロロメタン269mLに懸濁し、無水コハク酸5.76gを加え、室温で3時間撹拌した。反応液にメタノール40mLを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、25.9gの目的物を得た。
4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸23.5gをピリジン(脱水)336mLに溶解し、4−DMAP4.28g、1−エチル−3‐(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩40.3gを加えた。次いで、アミノメチルポリスチレン樹脂 1%DVB架橋(東京化成工業社製、A1543)25.0g、トリエチルアミン24mLを加え、室温で4日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン(脱水)150mL、無水酢酸15mL、2,6−ルチジン15mLを加え、室温で2時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、33.7gの目的物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、397.4μmol/gであった。
機器:U-2910(日立製作所)
溶媒:メタンスルホン酸
波長:265 nm
ε値:45000
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された4−オキソ−4−{[(2S,6R)−6−(6−オキソ−2−[2−フェノキシアセタミド]−1H−プリン−9−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}ブタン酸
工程1:N2−(フェノキシアセチル)グアノシンの製造
グアノシン100gを80℃で減圧下、24時間乾燥した。ピリジン(脱水)500mL、ジクロロメタン(脱水)500mLを加え、アルゴン雰囲気下、0℃にてクロロトリメチルシラン401mLを滴下し室温で3時間撹拌した。再度氷冷し、フェノキシアセチルクロライド66.3gを滴下し、氷冷下、更に3時間撹拌した。反応液にメタノール500mlを加え、室温で終夜撹拌後、減圧下溶媒を留去した。残渣にメタノール500mLを加え、減圧下濃縮することを3回行った。残渣に水4Lを加え氷冷下1時間撹拌し、析出物をろ取した。このものを、水、次いで、冷メタノールで洗浄し、乾燥して目的化合物を150.2g得た(収率:102%)(参考:Org.Lett.(2004),Vol.6,No.15,2555−2557)。
工程1で得られた化合物30gをメタノール480mLに懸濁し、氷冷下、2N塩酸130mLを加えた。次いで、四ほう酸アンモニウム4水和物56.8g、過ヨウ素酸ナトリウム16.2gをこの順で加え、室温で3時間撹拌した。反応液を氷冷し、不溶物をろ過して除き、これをメタノール100mLで洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせて氷冷し、2−ピコリンボラン11.52gを加えて20分間撹拌後、p−トルエンスルホン酸・1水和物54.6gをゆっくり加えて、4℃で終夜撹拌した。析出物をろ取し、冷メタノール500mLで洗浄後、乾燥して目的化合物を17.7g得た(収率:43.3%)。
1H NMR(δ,DMSO−d6):9.9−9.2(2H,br)、8.35(1H,s)、7.55(2H,m)、7.35(2H,m)、7.10(2H,d, J=7.82Hz)、7.00(3H,m)、5.95(1H,dd, J=10.64,2.42Hz)、4.85(2H,s)、4.00(1H,m)、3.90−3.60(2H,m)、3.50−3.20(5H,m)、2.90(1H,m)、2.25(3H,s)
工程2で得られた化合物2.0gをジクロロメタン30mLに懸濁し、氷冷下、トリエチルアミン13.9g、トリチルクロリド18.3gを加えて、室温で1時間撹拌した。反応液を飽和重曹水、次いで水で洗浄後乾燥し、有機層を減圧濃縮した。残渣に0.2Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH3)/メタノール(1:4(v/v))40mLを加えて撹拌し、次いで水40mLを加えて氷冷下1時間撹拌した。これをろ取し、冷メタノールで洗浄、乾燥して目的化合物を1.84g得た(収率:82.0%)。
参考例1と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、N−{9−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−6−オキソ−6,9−ジヒドロ−1H−プリン−2−イル}−2−フェノキシアセタミドを使用した。
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(5−メチル−2,4−ジオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
参考例1と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−5−メチルピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオンを使用した。
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された1,12−ジオキソ−1−(4−トリチルピペラジン−1−イル)−2,5,8,11−テトラオキサ−15−ペンタデカン酸
参考例1と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、2−[2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エチル 4−トリチルピペラジン−1−カルボン酸(国際公開公報第2009/064471号に記載の化合物)を使用した。
PMO No.8
アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例1)2g(800μmol)を反応槽に移し入れ、ジクロロメタン30mLを添加し、30分間静置した。さらに、ジクロロメタン30mLで2回洗浄した後、下記合成サイクルを開始した。標記化合物の塩基配列になるよう、各サイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した。
各フラクションを分析して、アセトニトリル−水(1/1)100mLで目的物を回収し、エタノール200mLを添加し、減圧濃縮した。さらに、減圧乾燥し、白色固体を得た。得られた固体に10mMのリン酸水溶液300mLを加え、懸濁させた。2Mのリン酸水溶液10mLを加え、15分間攪拌した。さらに、2Mの水酸化ナトリウム水溶液15mLを加えて中和した。さらに、2Mの水酸化ナトリウム水溶液15mLを加えてアルカリ性とし、メンブレンフィルター(0.45μm)でろ過した。10mMの水酸化ナトリウム水溶液100mLで洗いこみ、水溶液として目的物を得た。
得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記の通りである。
各フラクションを分析(HPLC)し、目的物を水溶液として得た。得られた水溶液に0.1Mのリン酸緩衝液(pH 6.0)225mLを添加し中和した。メンブレンフィルター(0.45μm)でろ過した。次いで、下記条件で限外ろ過を行い脱塩した。
ESI−TOF−MS 計算値:6924.82
測定値:6923.54
PMO.No.1
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
MALDI−TOF−MS 計算値:8291.96
測定値:8296.24
PMO.No.2
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:7310.13
測定値:7309.23
PMO.No.3
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:8270.94
測定値:8270.55
PMO.No.4
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された4−(((2S,6R)−6−(5−メチル−2,4−ジオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル)メトキシ)−4−オキソブタン酸(参考例3)を使用した。
ESI−TOF−MS 計算値:7310.13
測定値:7310.17
PMO.No.5
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された4−(((2S,6R)−6−(5−メチル−2,4−ジオキソ−3,4−ジヒドロピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル)メトキシ)−4−オキソブタン酸(参考例3)を使用した。
ESI−TOF−MS 計算値:8270.94
測定値:8270.20
PMO.No.6
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:5964.01
測定値:5963.68
PMO.No.7
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:6609.55
測定値:6608.85
PMO.No.9
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された4−オキソ−4−(((2S,6R)−6−(6−オキソ−2−(2−フェノキシアセタミド)−1H−プリン−9(6H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル)メトキシ)ブタン酸(参考例2)を使用した。
ESI−TOF−MS 計算値:7280.11
測定値:7279.42
PMO.No.10
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された4−オキソ−4−(((2S,6R)−6−(6−オキソ−2−(2−フェノキシアセタミド)−1H−プリン−9(6H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル)メトキシ)ブタン酸(参考例2)を使用した。
ESI−TOF−MS 計算値:8295.95
測定値:8295.91
PMO.No.13
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料としてアミノメチルポリスチレン樹脂に担持された1,12−ジオキソ−1−(4−トリチルピペラジン−1−イル)−2,5,8,11−テトラオキサ−15−ペンタデカン酸(参考例4)を使用した。
ESI−TOF−MS 計算値:7276.15
測定値:7276.69
PMO.No.14
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料としてアミノメチルポリスチレン樹脂に担持された1,12−ジオキソ−1−(4−トリチルピペラジン−1−イル)−2,5,8,11−テトラオキサ−15−ペンタデカン酸(参考例4)を使用した。
ESI−TOF−MS 計算値:8622.27
測定値:8622.29
PMO.No.11
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:10274.63
測定値:10273.71
PMO.No.15
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:9941.33
測定値:9940.77
PMO.No.16
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ESI−TOF−MS 計算値:8238.94
測定値:8238.69
In vitroアッセイ
RD細胞(ヒト横紋筋肉腫細胞株)4×105個に対して、PMO No. 1〜8の本発明のオリゴマー及びPMO No. 11のアンチセンスオリゴマー10 μMをAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II(Lonza)により導入した。プログラムはT-030を用いた。
50℃、30分間:逆転写反応
94℃、2分間:熱変性
[94℃、10秒間;58℃、30秒間;68 ℃、45秒間]x 30サイクル:PCR増幅
68℃、7分間:ポリメラーゼの熱失活
フォワードプライマー:5’-AGGATTTGGAACAGAGGCGTC-3’ (配列番号40)
リバースプライマー:5’-GTCTGCCACTGGCGGAGGTC-3’ (配列番号41)
94℃、2分間:熱変性
[94℃、15秒間;58℃、30秒間;68 ℃、45秒間]x 30サイクル:PCR増幅
68℃、7分間:ポリメラーゼの熱失活
フォワードプライマー:5’-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3’ (配列番号42)
リバースプライマー:5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’ (配列番号43)
エクソン53 がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン53がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
結果を図1に示す。本実験により、PMO No. 1〜8の本発明のオリゴマーは、いずれもPMO No. 11のアンチセンスオリゴマーと比べて、著しく高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した。特に、PMO No. 3及び8の本発明のオリゴマーは、PMO No. 11のアンチセンスオリゴマーと比べて、4倍以上高いエクソンスキッピング効率を示す。
ヒト線維芽細胞を用いたIn vitroアッセイ
ZsGreen1共発現レトロウイルスベクターによりTIG-119細胞(ヒト正常組織由来線維芽細胞、医薬基盤研究所)又は5017細胞(ヒトDMD患者由来線維芽細胞、Coriell Institute for Medical Research)にヒトmyoD遺伝子(配列番号44)を導入した。
4から5日間インキュベートした後に、FACSによりZsGreen陽性のMyoD転換線維芽細胞を回収し、5×104個/cm2になるように12穴プレートに播種した。増殖培地は10%FCS及び1%Penicillin/Streptomycin(P/S)(シグマ アルドリッチ社)を含むDulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12(DMEM・F-12)(インビトロジェン社)を1 mL使用した。
24時間後に分化培地(2%ウマ血清(インビトロジェン社)、1%P/S及びITS Liquid Media Supplement(シグマ社)含有DMEM/F-12)に交換した。2、3日ごとに培地交換を行い12から14日間インキュベートし、筋管細胞に分化させた。
その後、分化培地を6 μMのEndo-Porter(ジーンツール社)含有分化培地に交換し、終濃度10μMになるようにモルホリノオリゴマーを添加した。48時間インキュベート後に、TRIzol (インビトロジェン社製)により、細胞からtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 50 ngに対し、QIAGEN OneStep RT-PCR Kitを用いてRT-PCRを行った。添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはiCycler(Bio-Rad社製)を用いた。用いたRT-PCRのプログラムは、以下の通りである。
50℃、30分間:逆転写反応
95℃、15分間:熱変性
[94℃、1分間;60℃、1分間;72 ℃、1分間]x 35サイクル:PCR増幅
72℃、7分間:ポリメラーゼの熱失活
hEX51F:5’-CGGGCTTGGACAGAACTTAC-3’ (配列番号45)
hEx55R:5’-TCCTTACGGGTAGCATCCTG-3’ (配列番号46)
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
結果を図2及び図3に示す。本実験により、PMO No. 3、8及び9の本発明のオリゴマー(図2)は、TIG-119細胞において、いずれもPMO No. 12のアンチセンスオリゴマーと比べて、高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した(図2)。特に、PMO No. 3及び8の本発明のオリゴマーは、PMO No. 12のアンチセンスオリゴマーと比べて、2倍以上高いエクソンスキッピング効率を示す(図2)。
また、本実験により、PMO No. 3及び8〜10の本発明のオリゴマー(図3)は、5017細胞において、いずれもPMO No. 12のアンチセンスオリゴマーと比べて、高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した(図3)。特に、PMO No. 3及び8の本発明のオリゴマーは、PMO No. 12のアンチセンスオリゴマーと比べて、7倍以上高いエクソンスキッピング効率を示す(図3)。
ヒト線維芽細胞を用いたIn vitroアッセイ
エクソン45から52が欠失したDMD患者またはエクソン48から52が欠失したDMD患者の左上腕内側より生検し、皮膚線維芽細胞株(ヒトDMD患者(エクソン45-52またはエクソン48-52)由来線維芽細胞)を樹立した。ZsGreen1共発現レトロウイルスベクターにより線維芽細胞にヒトmyoD遺伝子(配列番号44)を導入した。
4から5日間インキュベートした後に、FACSによりZsGreen陽性のMyoD転換線維芽細胞を回収し、5×104個/cm2になるように12穴プレートに播種した。増殖培地は10%FCS及び1%Penicillin/Streptomycin(P/S)(シグマ アルドリッチ社)を含むDulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)(インビトロジェン社)を1 mL使用した。
24時間後に分化培地(2%ウマ血清(インビトロジェン社)、1%P/S及びITS Liquid Media Supplement(シグマ社)含有DMEM/F-12)に交換した。2、3日ごとに培地交換を行い12、14または20日間インキュベートし、筋管細胞に分化させた。
その後、分化培地を6 μMのEndo-Porter(ジーンツール社)含有分化培地に交換し、終濃度10μMになるようにモルホリノオリゴマーを添加した。48時間インキュベート後に、TRIzol (インビトロジェン社製)により、細胞からtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 50 ngに対し、QIAGEN OneStep RT-PCR Kitを用いてRT-PCRを行った。添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはiCycler(Bio-Rad社製)を用いた。用いたRT-PCRのプログラムは、以下の通りである。
50℃、30分間:逆転写反応
95℃、15分間:熱変性
[94℃、1分間;60℃、1分間;72 ℃、1分間]x 35サイクル:PCR増幅
72℃、7分間:ポリメラーゼの熱失活
hEx44F:5’- TGTTGAGAAATGGCGGCGT-3’ (配列番号48)
hEx55R:5’- TCCTTACGGGTAGCATCCTG-3’ (配列番号46)
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
結果を図4及び図5に示す。本実験により、PMO No. 3及び8の本発明のオリゴマーは、エクソン45-52欠失(図4)またはエクソン48-52欠失(図5)DMD患者由来細胞において、80%以上の高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した。また、PMO No. 3及び8の本発明のオリゴマーは、エクソン45-52欠失DMD患者由来細胞において、PMO No.15のアンチセンスオリゴマーと比較して高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した(図4)。
ウェスタンブロッティング
PMO No.8の本発明のオリゴマーを10μMの濃度で細胞に添加し、72時間後の細胞からComplete Mini (Roche Applied Science社製)含有RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific社製) でタンパク質を抽出し、BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific社製)でタンパク質を定量した。NuPAGE Novex Tris-Acetate Gel 3-8% (Invitrogen社製) で150 V、75分間電気泳動、セミドライブロッターでPVDF膜 (Millipore社製)へ転写した。PVDF膜を5% ECL Blocking agent(GE Healthcare社製) でブロッキング後、抗ジストロフィン抗体 (NCL-Dys1, Novocastra社製)溶液中で膜をインキュベートした。さらに、peroxidase-conjugated goat-antimouse IgG (型番、Bio-Rad)溶液中でインキュベートした後、 ECL Plus Western blotting system (GE Healthcare社製)により発色した。
PMO No.3またはNo.8の本発明のオリゴマーを細胞に添加し、72時間後の細胞を3% paraformaldehyde、10分間で固定化した。10% Triton-Xで10分間インキュベートした。10%ヤギ血清含有PBSでブロッキング、抗ジストロフィン抗体(NCL-Dys1, Novocastra)溶液中で膜をインキュベート、さらに抗マウスIgG抗体(Invitrogen社製)溶液中で膜をインキュベートした。Pro Long Gold Antifade reagent (Invitrogen社製)でマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図6及び図7に示す。本実験により、PMO No.3及び8の本発明のオリゴマーはジストロフィンタンパク質の発現を誘導することがウェスタンブロッティング(図6)及び免疫染色(図7)により確認できた。
ヒト線維芽細胞を用いたIn vitroアッセイ
試験例3と同様の方法で実験を行った。
結果を図8に示す。本実験により、PMO No. 3及び8の本発明のオリゴマーは、エクソン45-52欠失DMD患者由来細胞において、PMO No. 13及び14の本発明のオリゴマーよりも高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した(図8)。
In vitroアッセイ
配列番号49〜123に記載の2’-O-メトキシ-ホスホロチオエート体(2’-OMe-S-RNA)のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。アッセイに用いた各種アンチセンスオリゴマーは日本バイオサービス社より購入した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下に示す。
添加後、一晩培養した。細胞をPBS(ニッスイ社製、以下同じ)で2回洗浄した後、ISOGEN (ニッポンジーン社製)500 μl を細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をEppendorfチューブに回収した。ISOGENに添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度はNanoDrop ND-1000(エル・エム・エス社製)を用いて測定した。
抽出したtotal RNA 400 ngに対し、Titan One Tube RT-PCR Kit(ロシュ社製)を用いてOne-Step RT-PCRを行った。キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはPTC-100(MJ Research社製)を用いた。用いたRT-PCRのプログラムは、以下の通りである。
50℃、30分間:逆転写反応
94℃、2分間:熱変性
[94℃、10秒間;58℃、30秒間;68 ℃、45秒間]x 30サイクル:PCR増幅
68℃、7分間:ポリメラーゼの熱失活
フォワードプライマー:5’-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3’ (配列番号42)
リバースプライマー:5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’ (配列番号43)
次に、上記RT-PCRの増幅産物に対し、Taq DNA Polymerase(ロシュ社製)を用いてnested PCRを行った。用いたPCRプログラムは、以下の通りである。
94℃、2分間:熱変性
[94℃、15秒間;58℃、30秒間;68 ℃、45秒間]x 30サイクル:PCR増幅
68℃、7分間:ポリメラーゼの熱失活
フォワードプライマー:5’-AGGATTTGGAACAGAGGCGTC-3’ (配列番号40)
リバースプライマー:5’-GTCTGCCACTGGCGGAGGTC-3’ (配列番号41)
エクソン53 がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン53がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
結果を図9から図17に示す。本実験により、ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンの5’末端から第31〜61番目にアンチセンスオリゴマーを設計した場合、高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した。
RD細胞(ヒト横紋筋肉腫細胞株)3.5×105個に対して、アンチセンスオリゴマー0.3〜30 μMをAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II(Lonza)により導入した。プログラムはT-030を用いた。
導入後、細胞を、10%ウシ胎児血清(FCS)(インビトロジェン社製)を含むEagle's minimal essential medium(EMEM)培地(シグマ社製、以下同じ) 2mL中、37℃、5%CO2条件下で一晩培養した。細胞をPBS(ニッスイ社製、以下同じ)で2回洗浄した後、ISOGEN (ニッポンジーン社製)500 μl を細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をEppendorfチューブに回収した。ISOGENに添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度はNanoDrop ND-1000(エル・エム・エス社製)を用いて測定した。
抽出したtotal RNA 400 ngに対し、QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(キアゲン社製)を用いてOne-Step RT-PCRを行った。キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはPTC-100(MJ Research社製)を用いた。用いたRT-PCRのプログラムは、以下の通りである。
50℃、30分間:逆転写反応
95℃、15分間:熱変性
[94℃、30秒間;60℃、30秒間;72 ℃、1分間]x 35サイクル:PCR増幅
72℃、10分間:ポリメラーゼの熱失活
フォワードプライマー:5’-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3’ (配列番号42)
リバースプライマー:5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’ (配列番号43)
エクソン53 がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン53がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
結果を図18及び19に示す。本実験により、PMO No.8の本発明のオリゴマーは、PMO No. 15及び16のアンチセンスオリゴマーと比べて、著しく高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した(図18)。また、PMO No. 3及び8の本発明のオリゴマーは、PMO No. 13及び14の本発明のオリゴマーよりも著しく高い効率でエクソン53をスキッピングさせることが判明した(図19)。この結果から、同一配列であっても、5’末端が-OH基である方が、スキッピング効率が高いことが示される。
従って、本発明のオリゴマーは、DMDの治療において、非常に有用である。
配列番号3:合成核酸
配列番号4:合成核酸
配列番号5:合成核酸
配列番号6:合成核酸
配列番号7:合成核酸
配列番号8:合成核酸
配列番号9:合成核酸
配列番号10:合成核酸
配列番号11:合成核酸
配列番号12:合成核酸
配列番号13:合成核酸
配列番号14:合成核酸
配列番号15:合成核酸
配列番号16:合成核酸
配列番号17:合成核酸
配列番号18:合成核酸
配列番号19:合成核酸
配列番号20:合成核酸
配列番号21:合成核酸
配列番号22:合成核酸
配列番号23:合成核酸
配列番号24:合成核酸
配列番号25:合成核酸
配列番号26:合成核酸
配列番号27:合成核酸
配列番号28:合成核酸
配列番号29:合成核酸
配列番号30:合成核酸
配列番号31:合成核酸
配列番号32:合成核酸
配列番号33:合成核酸
配列番号34:合成核酸
配列番号35:合成核酸
配列番号36:合成核酸
配列番号37:合成核酸
配列番号38:合成核酸
配列番号39:合成核酸
配列番号40:合成核酸
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Claims (10)
- ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第53番目のエクソンの5’末端から第33〜54番目、第36〜55番目、第32〜53番目、第36〜53番目又は第36〜57番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか1つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
- オリゴヌクレオチドである、請求項1に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項2に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項3に記載のアンチセンスオリゴマー。
(上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。) - 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項3又は4に記載のアンチセンスオリゴマー。
- モルホリノオリゴマーである、請求項1に記載のアンチセンスオリゴマー。
- ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項6に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 5’末端が、下記化学式(1)〜(3)のいずれかの基である、請求項6又は7に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 配列番号15、34、8、32及び36からなる群より選択されるいずれか1つに示す塩基配列からなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
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