JP6606488B2

JP6606488B2 - アンチセンス核酸

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Publication number: JP6606488B2
Application number: JP2016507800A
Authority: JP
Inventors: 達志若山; 春奈瀬尾; 洋平佐藤; 伸一武田; 哲也永田
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd; National Center of Neurology and Psychiatry
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd; National Center of Neurology and Psychiatry
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2019-11-13
Anticipated expiration: 2035-03-11
Also published as: RU2702424C2; NZ724836A; TW201945383A; BR112016020618B1; CN110951732A; AU2015227733B2; US20200149040A1; DK3118311T3; IL247663A0; RS58573B1; IL247663B; KR102335801B1; ZA201605864B; TWI672314B; TW201540724A; US20180179538A1; EP3514234A1; JPWO2015137409A1; PH12016501761A1; WO2015137409A1

Description

本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマー及び該オリゴマーを含む医薬組成物に関する。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は出生男子約3,500人に1人が発症する最も頻度の高い遺伝性進行性筋萎縮症である。乳幼児期には正常のヒトとほとんど変わらない運動機能を示すが、4〜5歳頃から筋力低下がみられる。その後筋力低下は進行し12歳頃までに歩行不能になり、20歳代で心不全または呼吸器不全により死に至る重篤な疾患である。現在、DMDに対する有効な治療法はなく、新たな治療薬の開発が強く求められている。

DMDはジストロフィン遺伝子の変異が原因であることが知られている。ジストロフィン遺伝子はX染色体に存在し、220万塩基のDNAから成る巨大な遺伝子である。DNAからmRNA前駆体に転写され、さらにスプライシングによりイントロンが除かれ79のエクソンが結合したmRNAは11,058塩基になる。このmRNAから3,685のアミノ酸に翻訳され、ジストロフィンタンパク質が生成される。ジストロフィンタンパク質は筋細胞の膜安定性の維持に関与しており、筋細胞を壊れにくくするために必要である。DMD患者のジストロフィン遺伝子は変異を有するため、筋細胞において機能を持つジストロフィンタンパク質が殆ど発現されない。そのため、DMD患者体内では、筋細胞の構造を維持できなくなり、多量のカルシウムイオンが筋細胞内に流れ込む。その結果、炎症に似た反応が生じ、線維化が進むために筋細胞が再生されにくくなる。

ベッカー型筋ジストロフィー（BMD）もジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、その症状は筋萎縮による筋力低下を呈するものの一般にDMDと比較して軽く、筋力低下の進行も遅く、多くの場合、成人期に発症する。DMDとBMDとの臨床症状の違いは、変異によりジストロフィンのmRNAがジストロフィンタンパク質へと翻訳される際のアミノ酸読み取り枠が破壊されるか、あるいは維持されるかによるものと考えられている（非特許文献1）。つまり、DMDでは、アミノ酸読み取り枠がずれる変異を有することにより、機能を持つジストロフィンタンパク質がほとんど発現しないが、BMDでは変異によりエクソンの一部は欠失しているが、アミノ酸読み取り枠は維持されているために不完全ながらも機能を有するジストロフィンタンパク質が産生される。

DMDの治療法として、エクソンスキッピング法が期待されている。この方法は、スプライシングを改変することでジストロフィンのmRNAのアミノ酸読み取り枠を修復し、部分的に機能を回復したジストロフィンタンパク質の発現を誘導する方法である（非特許文献2）。エクソンスキッピングの対象となるアミノ酸配列部分は失われることになる。そのためこの治療で発現されるジストロフィンタンパク質は正常のものより短くなるが、アミノ酸読み取り枠が維持されるために筋細胞を安定化する機能が部分的に保持される。従って、エクソンスキッピングにより、DMDは、より軽症のBMDと同じような症状を呈するようになると期待されている。エクソンスキッピング法は、マウスやイヌによる動物実験を経て、ヒトDMD患者に対する臨床試験が行われている。

エクソンスキッピングは、5’又は3’スプライス部位のいずれか若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とするアンチセンス核酸の結合により誘導することができる。エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみmRNAに包含される。従って、スプライス部位をアンチセンス核酸でターゲッティングすることにより、エクソンスキッピングを誘導することができる。また、エクソンがスプライシングの機構に認識されるためにはエクソンスプライシングエンハンサー（ESE）へのSRタンパク質の結合が必要であると考えられており、ESEをターゲッティングすることでもエクソンのスキッピングを誘導することができる。

ジストロフィン遺伝子の変異はDMD患者によって異なるため、遺伝子変異の場所や種類に応じたアンチセンス核酸が必要になる。これまでに、西オーストラリア大学のSteve Wiltonらによって79個全てのエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作製されており（非特許文献3）、オランダのAnnemieke Aartsma-Rusらによって39種類のエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作られている（非特許文献4）。

全DMD患者の13％程度は、第51番目のエクソン（以下、「エクソン51」という）をスキッピングすることで治療可能と考えられている。近年では、ジストロフィン遺伝子のエクソン51をエクソンスキッピングのターゲットとした研究について、複数の研究機関から報告がなされている（特許文献1〜6及び非特許文献5〜6）。しかしながら、エクソン51を高効率にスキッピングさせる技術は、いまだに確立されていない。

国際公開公報第2004/048570号国際公開公報第2002/024906号国際公開公報第2010/048586号国際公開公報第2010/050801号米国特許公開公報第2010/0168212号

Monaco A. P. et al., Genomics 1988; 2: p. 90-95 Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: p. 167-172 Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96 Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77 Aoki Y., et al., Molecular therapy 2010: 18: p. 1995-2005 Nakano S., et al., Pediatr Int. 2011: 53: 524-529

上記のような状況において、ジストロフィン遺伝子のエクソン51 のスキッピングを高効率に誘導するアンチセンスオリゴマー及びそのオリゴマーを含む筋ジストロフィー治療薬が望まれている。

本発明者らは、上記文献に記載の技術内容及びジストロフィン遺伝子の構造などを詳細に研究した結果、配列番号1及び2に示す塩基配列を有するアンチセンスオリゴマーを投与することにより、高効率にヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングを誘導できることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
以下の（a）〜（d）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
（a）配列番号1又は2の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
（b）配列番号1又は2の塩基配列において1〜5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（c）配列番号1又は2の塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（d）配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
［２］
以下の（e）〜（h）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー。
（e）配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（f）配列番号1又は2の塩基配列において1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（g）配列番号1又は2の塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（h）配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
［３］
以下の（i）及び（j）より選ばれるアンチセンスオリゴマー。
（i）配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（j）配列番号1又は2の塩基配列に対して、90％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
［４］
オリゴヌクレオチドである、前記［1］〜［3］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［５］
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、前記［4］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［６］
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記［４］または［５］に記載のアンチセンスオリゴマー。
（上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。）
［７］
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記［４］〜［６］のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［８］
モルホリノオリゴマーである、前記［1］〜［3］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［９］
前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのモルホリノ環部分、リン酸結合部分、３’末端及び/又は５’末端が修飾されている、前記［8］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１０］
前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのリン酸結合部分が、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記［9］又は［10］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１１］
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記［10］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１２］
5’末端が、下記化学式（1）〜（3）のいずれかの基である、前記［9］〜［11］のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［１３］
前記［1］〜［12］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を含む、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
［１４］
さらに医薬的に許容可能な担体を含む、前記［13］に記載の医薬組成物。
［１５］
前記［1］〜［12］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー又は前記［13］もしくは［14］に記載の前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
［１６］
前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、前記［15］に記載の治療方法。
［１７］
前記患者がヒトである、前記［15］又は前記［16］に記載の治療方法。
［１８］
筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における前記［1］〜［12］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマーの使用。
［１９］
筋ジストロフィー治療に使用するための前記［1］〜［12］のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［２０］
前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、前記［19］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［２１］
前記患者がヒトである、前記［19］又は［20］に記載のアンチセンスオリゴマー。

本発明のアンチセンスオリゴマーにより、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングを高効率に誘導することが可能である。また、本発明の医薬組成物を投与することにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状を、効果的に軽減することができる。

ヒト横紋筋肉腫（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子エクソン51のスキッピング効率を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。

1．アンチセンスオリゴマー
本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンを高効率にスキッピングするアンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のアンチセンスオリゴマー」という）を提供する。

[ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソン]
本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、cDNA、mRNA前駆体及びmRNAも含まれる。好ましくは、遺伝子は、mRNA前駆体、即ち、pre-mRNAである。
ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Xp21.2に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、220万塩基対のサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか14kbに過ぎず、該コード領域は79個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している（Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)）。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるpre-mRNAは、スプライシングを受けて14kbの成熟mRNAを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である（GenBank Accession No. NM_004006）。
ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン51の塩基配列を配列番号3に示す。

［アンチセンスオリゴマー］
本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングにより、DMD型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、BMD型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。従って、アンチセンスオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエクソン51には、野生型だけではなく、変異型も含まれる。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、具体的には以下の（a）〜（d）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
（a）配列番号1又は2の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
（b）配列番号1又は2の塩基配列において1〜5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（c）配列番号1又は2の塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
（d）配列番号1又は2の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー

（b）〜（d）のアンチセンスオリゴマーは、具体的には（a）のアンチセンスオリゴマーの変異体であり、患者のジストロフィン遺伝子の変異（例えば、多型）などに対応することを念頭に置いたものである。
別の態様としては、本発明のアンチセンスオリゴマーは、具体的には以下の（k）〜（n）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
（k）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列を含むアンチセンスオリゴマー；
（l）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列において1〜5個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（m）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；および
（n）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
（l）〜（n）のアンチセンスオリゴマーは、具体的には（k）のアンチセンスオリゴマーの変異体であり、患者のジストロフィン遺伝子の変異（例えば、多型）などに対応することを念頭に置いたものである。
また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、以下の（o）〜（r）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のアンチセンスオリゴマーである。
（o）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（p）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列において1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（q）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列に対して、80％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー；
（r）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
さらにまた、本発明のアンチセンスオリゴマーは、以下の（i）及び（j）より選ばれるアンチセンスオリゴマーである。
（i）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；
（j）配列番号６〜３３のいずれか１つの塩基配列に対して、90％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー

本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴマー」とは、例えば、配列番号1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるアンチセンスオリゴマーをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell， Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。

本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」とは、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」とは、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃又は5×SSC、1％ SDS、50 mM Tris−HCl（pH7.5）、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、（1）5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃、（2）0.2 x SSC、0.1％ SDS、60℃、（3）0.2 x SSC、0.1％ SDS、62℃、（4）0.2 x SSC、0.1％ SDS、65℃、又は（5）0.1 x SSC、0.1％ SDS、65℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたアンチセンスオリゴマーを検出することができる。あるいは、配列番号3の塩基配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。

上記以外にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1又は2の塩基配列と90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するアンチセンスオリゴマーをあげることができる。

なお、塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたblastn、blastx、tblastnやtblastxと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。blastnを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。

「ヒトジストロフィン遺伝子の第51番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、pre-mRNA）のエクソン51に相当する部位に本発明のアンチセンスオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、例えばエクソン52が欠失したDMD患者の場合、エクソン50の3’末端に相当する塩基配列にエクソン53の5’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟mRNAが形成されることを意味する。

ここで、前記「結合」は、本発明のアンチセンスオリゴマーとヒトジストロフィン遺伝子の転写物とを混合した場合に、生理的条件下で両者がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意味する。上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のpH、塩組成、温度に調節された条件を意味する。例えば、25〜40℃、好ましくは37℃、pH 5〜8、好ましくは、pH 7.4であって、塩化ナトリウム濃度が150 mMの条件が挙げられる。

ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51のスキッピングが生じたか否かは、ジストロフィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のアンチセンスオリゴマーを導入し、前記ジストロフィン発現細胞のtotal RNAから、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAのエクソン51の周辺領域をRT-PCR増幅し、該PCR増幅産物に対してnested PCR又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。
スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAを被検細胞から回収し、該mRNAのうち、エクソン51がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン51がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定し、これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。

スキッピング効率（％）= A /（ A ＋ B ）x 100

好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上の効率でエクソン51をスキッピングする。
スキッピング効率の計算については、国際公開公報第2012/029986号を参照することができる。

本発明のアンチセンスオリゴマーとしては、例えば、16〜35 塩基の長さを有する、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid:PNA）オリゴマーを挙げることができる。19〜32塩基、20〜31塩基、21塩基又は30塩基の長さが好ましく、モルホリノオリゴマーが好ましい。

前記オリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という）は、ヌクレオチドを構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。

修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。

本発明において、核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、3-メチルウラシル,ジヒドロウラシル、5-アルキルシトシン（例えば、5-メチルシトシン）、5-アルキルウラシル（例えば、5-エチルウラシル）、5-ハロウラシル（5-ブロモウラシル）、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン（6-メチルウラシル）、2-チオウラシル、4-チオウラシル、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル) ウラシル、5'-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、1-メチルアデニン、1-メチルヒポキサンチン、2,2-ジメチルグアニン、3-メチルシトシン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メチルカルボニルメチルウラシル、5-メチルオキシウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、2-チオシトシン、プリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

糖部分の修飾としては、例えば、リボースの2’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの2’位の修飾としては、例えば、リボースの2’位の-OH基をOR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、Iに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Rはアルキル又はアリールを表す。R’はアルキレンを表す。
糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの4’位のOをSに置換したもの、糖の 2' 位と 4' 位を架橋したもの、例えば、LNA（Locked Nucleic Acid）又はENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008, 18, 9154-9160 ）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第2006/129594号及び第2006/038608号を参照）。

本発明において、アルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数1〜6のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、n-ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが1〜3個置換されていてもよい。
本発明において、シクロアルキルとしては、炭素数5〜12のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
本発明において、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
アルコキシとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数1〜6のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、n-ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数1〜3のアルコキシが好ましい。

本発明において、アリールとしては、炭素数6〜10のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α-ナフチル、β-ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが1〜3個置換されていてもよい。
本発明において、アルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数1〜6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、2-（エチル）トリメチレン、1-（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
本発明において、アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、２−メチルアセチル、２，２−ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、リボースの2’位の-OH基がメトキシで置換され、リン酸結合部分がホスホロチオエート結合である、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーである。
（式中、Baseは、核酸塩基を表す。）

本発明のオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、AKTA oligopilot plus 10 / 100（GE Healthcare））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Promega社、Takara社、又は日本バイオサービス社）等に委託して作製することもできる。

本発明のモルホリノオリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーである。
（式中、Baseは、前記と同義であり；
Wは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。

(式中、Xは、-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³又はFを表し；
R¹は、H、アルキルを表し；
R²及びR³は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し；
Y₁は、0、S、CH₂又はNR¹を表し；
Y₂は、0、S又はNR¹を表し；
Zは、0又はSを表す。))

モルホリノオリゴマーは、好ましくは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「PMO」という））である。
（式中、Base、R²、R³は、前記と同義である。）

本発明モルホリノオリゴマーは、かかるオリゴマーを構成する核酸塩基、モルホリノ環部分、リン酸結合部分、３‘末端及び／又は５’末端の全部又は一部が修飾されているものを含む。

リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008, 18, 9154-9160 ）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第2006/129594号及び第2006/038608号を参照）。
モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開公報第1991/009033号、又は国際公開公報第2009/064471号に従って製造することができる。特に、PMOは、国際公開公報第2009/064471号に記載の方法に従って製造するか、又は以下に示す方法に従って製造することができる。

[PMOの製法]
PMOの１つの態様として、例えば、次の一般式(I)で表される化合物（以下、PMO(I)という。）を挙げることができる。

［式中、各Base、R²、R³は、前記と同義であり；
nは、1〜99の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、24〜34 、27〜31又は28〜30の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、29である。］

PMO（I）は、公知の方法に従い製造することができるが、例えば、下記工程の操作を実施することにより製造することができる。
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、PMOの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
また、下記のすべての工程は、液相法又は固相法（マニュアル又は市販の固相自動合成機を用いる）で実施することができる。固相法でPMOを製造する場合、操作手順の簡便化及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。

（１）工程A：
次の一般式（II）で表される化合物（以下、化合物（II）という。）に酸を作用させることによって、次の一般式（III）で表される化合物（以下、化合物（III）という。）を製造する工程。
［式中、n、R²、R³は、前記と同義であり；
各B^Pは，独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；
Tは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し；
Lは、水素、アシル、又は次の一般式（IV）で表される基（以下、基（IV）という。）を表す。］

B^Pに係る「核酸塩基」としては、Baseと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し、B^Pに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、4-メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、4-tert-ブチルフェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル、(ジメチルアミノ)メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、2-シアノエチル、４−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で1〜5個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、1-ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、4-（tert-ブチルカルボキシ）ベンジル、4-[(ジメチルアミノ)カルボキシ]ベンジル、4-(フェニルカルボキシ)ベンジルを挙げることができる（例えば、国際公開公報第2009/064471号公報参照）。

「固相担体」としては、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが、例えば、（i）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラゾール、N-メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸）にほとんど溶解せず、（ii）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬に対して化学的に安定であり、（iii）化学修飾ができ、（iv）望ましいモルホリノ核酸誘導体の装填ができ、（v）処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち、（vi）一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。具体的には、膨潤性ポリスチレン（例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂 1%ジビニルベンゼン架橋（200〜400メッシュ）（2.4〜3.0mmol/g）（東京化成社製）、Aminomethylated Polystyrene Resin・HCl［ジビニルベンゼン1%，100〜200メッシュ］（ペプチド研究所社製））、非膨潤性ポリスチレン（例えば、Primer Support(GE Healthcare社製））、PEG鎖結合型ポリスチレン（例えば、NH₂-PEG resin（渡辺化学社製）、TentaGel resin）、定孔ガラス（controlled pore glass;CPG）（例えば、CPG社製）、オキサリル化−定孔ガラス（例えば、Alulら，Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991)を参照）、TentaGel支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Wrightら，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993)を参照）、Poros-ポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、3-アミノプロピル、スクシニル、2,2’-ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（LCAA）を挙げることができる。

本工程は、化合物（II）に酸を作用させることにより実施することができる。

本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、化合物（II）1モルに対して0.1モル当量〜1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量〜100モル当量の範囲内である。
また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸1モルに対して、0.01モル当量〜10モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、0.1モル当量〜2モル当量の範囲内である。
本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、トリフルオロ酢酸2当量に対してトリエチルアミン1当量を混合したものを挙げることができる。
本工程に使用しうる酸は、0.1%〜30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。

上記反応における反応温度は、例えば、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。
反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当である。好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。

また、本工程が終了した後、必要に応じて、系中に存在する酸を中和するために塩基を添加することができる。「塩基」としては、特に限定されないが、例えば、ジイソプロピルアミンが挙げられる。塩基は、0.1%（v/v）〜30%（v/v）の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。
本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。

なお、化合物（II）において、n=1であって、Lが基（IV）である、次の一般式（IIa）で表される化合物（以下、化合物（IIa）という。）は、以下の方法に従って製造することができる。
［式中、B^P、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］

工程１：
次の一般式（V）で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式（VI）で表される化合物（以下、化合物（VI）という。）を製造する工程。
［式中、B^P、T、リンカーは、前記と同義であり；
R⁴は、水酸基、ハロゲン、カルボキシル基、又は、アミノを表す。］

本工程は、化合物（V）を出発原料として、公知のリンカーの導入反応により実施することができる。
特に、次の一般式（VIa）で表される化合物は、化合物（V）と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
［式中、B^P、Tは、前記と同義である。］

工程２：
化合物（VI）に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物（IIa）を製造する工程。
［式中、B^P、R⁴、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
本工程は、化合物(VI)と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
化合物(II)において、n=2〜99（好ましくは25〜35 、28〜32又は29〜31の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、30である）であって、Lが基(IV)である、次の一般式(IIa2)で表される化合物は、化合物(IIa)を出発原料とし、本明細書に記載のPMOの製法にかかる工程A及び工程Bを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
［式中、B^P、R²、R³、T、リンカー、固相担体は、前記と同義であり；
n’は、1〜98（特定の態様ではn’は、1〜34、1〜33、1〜32、1〜31、1〜30、1〜29、1〜28、1〜27、1〜26、1〜25、1〜24）を表す。］

（２）工程B：
化合物（III）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式（VII）で表される化合物（以下、化合物（VII）という。）を製造する工程。
［式中、各B^P、L、n、R²、R³、Tは、前記と同義である。］

本工程は、化合物（III）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることにより実施することができる。

モルホリノモノマー化合物としては、例えば、次の一般式（VIII）で表される化合物を挙げることができる。
［式中、B^P、R²、R³、Tは前記と同義である。］
本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、又は、N-エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物（III）1モルに対して、1モル当量〜1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは10モル当量〜100モル当量の範囲内である。
本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、0.1%〜30%の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、N,N-ジメチルイミダゾリドン、N-メチルピペリドン、DMF、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げることができる。

反応温度は、例えば、0℃〜100℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃〜50℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常1分〜48時間の範囲内が適当であり、好ましくは、30分〜24時間の範囲内である。

さらに本工程の終了後、必要に応じて、アシル化剤を添加することができる。「アシル化剤」としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロライド、フェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。アシル化剤は、例えば、0.1%〜30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、0.1モル当量〜10000モル当量の範囲内が好ましく、1モル当量〜1000モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤１モルに対して、0.1モル当量〜100モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量〜10モル当量の範囲内である。
本反応の反応温度は、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分から5時間の範囲内である。

（３）工程C：
工程Bにおいて製造される化合物（VII）において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式（IX）で表される化合物を製造する工程。
［式中、Base、B^P、L、n、R²、R³、Tは、前記と同義である。］

本工程は、化合物（VII）に脱保護剤を作用させることにより実施することができる。

「脱保護剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用しうる「脱保護剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、DMF、N,N-ジメチルイミダゾリドン、N-メチルピペリドン又はこれらの混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。脱保護剤の使用量としては、例えば、化合物（VII）1モルに対して、例えば、1モル当量〜100000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは10モル当量〜1000モル当量の範囲内である。

反応温度は、例えば、15℃〜75℃の範囲内が適当であり、好ましくは40℃〜70℃の範囲内であり、より好ましくは50℃〜60℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（VII）の種類、反応温度等によって異なるが、10分〜30時間の範囲内が適当であり、好ましくは30分〜24時間の範囲内であり、より好ましくは5時間〜20時間の範囲内である。

（４）工程D：
工程Cにおいて製造される化合物（IX）に酸を作用させることによって、PMO（I）を製造する工程。
［式中、Base、n、R²、R³、Tは、前記と同義である。］

本工程は、化合物（IX）に酸を加えることによって実施することができる。

本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸、リン酸及び塩酸等を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、溶液のpHが0.1〜4.0の範囲内になるように使用するのが適当であり、より好ましくは1.0〜3.0の範囲内になるように使用する。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。

反応温度は、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（IX）の種類、反応温度等によって異なるが、0.1分〜5時間の範囲内が適当であり、好ましくは1分〜1時間の範囲内であり、より好ましくは1分〜30分の範囲内である。

PMO(I)は、本工程で得られた反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、C₈からC₁₈の逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより得ることができ、所望のPMO(I)を単離精製することができる（例えば、国際公開公報WO1991/09033を参照）。
逆相クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば20mMのトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、例えば、1Mの食塩水と10mMの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。

ペプチド核酸は、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のアンチセンスオリゴマーである。
（式中、Baseは、前記と同義である。）

ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
１）P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt，Science, 254, 1497 (1991)
２）M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg，Jacs., 114, 1895 (1992)
３）K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt，J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
４）L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm，O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
５）T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、5’末端が、下記化学式（1）〜（3）のいずれかの基であってもよい。好ましくは(3)-OHである。
以下、上記(1)、(2)及び(3)で示される基を、それぞれ「基(1)」、「基(2)」及び「基(3)」と呼ぶ。

2．医薬組成物
本発明のアンチセンスオリゴマーは、従来技術に係るアンチセンスオリゴマーと比較して、高効率にエクソン51のスキッピングを可能にする。従って、本発明のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物をDMD患者（エクソン51スキッピングでin-frame化する変異を有する患者、例えば、エクソン29-50欠失患者、エクソン50欠失患者、エクソン45-50欠失患者、エクソン48-50欠失患者、エクソン49-50欠失患者、エクソン52欠失患者、エクソン52-63欠失患者、13-50欠失患者、19-50欠失患者、43-50欠失患者、又は47-50欠失患者）に投与することにより、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。例えば、本発明のアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物を用いる場合、従来技術に係るオリゴマーと比べて少量の投与量でも同程度の治療効果を得られるため、副作用を軽減することができ、かつ経済的
である。
そこで、別の実施態様として、本発明のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物（以下、「本発明の組成物」という）を提供する。
また、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴマーを、DMD患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法を提供する。
当該治療方法において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、前記筋ジストロフィー治療用医薬組成物として投与してもよい。
さらに、本発明は、筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における本発明のアンチセンスオリゴマーの使用、及び筋ジストロフィー治療に使用するための本発明のアンチセンスオリゴマーを提供する。

本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーの医薬的に許容可能な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩;アンモニウム塩；t-オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、N-メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン
塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N， N' -ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、N-ベンジル-フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩のような有機アミン塩;弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩;メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩;グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーは、その水和物の形態にあってもよい。

本発明の組成物の投与形態は、医薬的に許容可能な投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができるが、筋組織への送達容易性の観点から、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与等が好ましい。また、本発明の組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等を挙げることができる。

本発明のアンチセンスオリゴマーを筋ジストロフィー患者に投与する場合、本発明の組成物は、該オリゴマーの筋組織への送達を促進する担体を含むことができる。このような担体は、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、その例として、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リポソームとしては、例えば、2-O-（2-ジエチルアミノエチル）カルバモイル-1,3-O-ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリポソーム（以下、「リポソームA」という）、オリゴフェクトアミン（登録商標）（Invitrogen社製）、リポフェクチン（登録商標）（Invitrogen社製）、リポフェクトアミン（登録商標）（Invitrogen社製）、Lipofectamine 2000（登録商標）（Invitrogen社製）、DMRIE-C（登録商標）（Invitrogen社製）、GeneSilencer（登録商標）（Gene Therapy Systems社製）、TransMessenger（登録商標）（QIAGEN社製）、TransIT TKO（登録商標）（Mirus社製）、Nucleofector II（Lonza）を挙げることができる。それらの中で、リポソームAが好ましい。カチオン性ポリマーとしては、例えば、JetSI（登録商標）（Qbiogene社製）、Jet-PEI（登録商標）（ポリエチレンイミン、Qbiogene社製）を挙げることができる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えば、GenomeOne（登録商標）（HVJ-Eリポソーム、石原産業社製）を挙げることができる。あるいは、特許2924179号に記載の医薬デバイス、特許再公表公報第2006/129594号及び特許再公表公報第2008/096690号に記載のカチオン性担体を用いることもできる。
詳細については米国特許第4,235,871号、同第4,737,323号、国際公開公報第96/14057号、”New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pages 33-104”等を参照することができる。

本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーの濃度は、担体の種類等によって異なるが、0.1 nM〜100 μMの範囲内が適当であり、100 nM〜10 μMの範囲内が好ましい。また、本発明の組成物に含まれる本発明のアンチセンスオリゴマーと担体との重量比（担体/本発明のアンチセンスオリ
ゴマー）は、該オリゴマーの性質及び該担体の種類等によって異なるが、0.1〜100の範囲内が適当であり、0.1〜10の範囲内が好ましい。

本発明の組成物には、本発明のアンチセンスオリゴマーと上述した担体以外に、任意に医薬的に許容可能な添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数6〜22の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、pH調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、90重量％以下が適当であり、70重量％以下が好ましく、50重量％以下がより好ましい。

本発明の組成物は、担体の分散液に本発明のアンチセンスオリゴマーを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明のアンチセンスオリゴマーの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明のアンチセンスオリゴマーを添加させる際に用い得る水性溶媒としては、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のpH及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することがで
きる。

本発明の組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明の組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明の組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−40〜−20℃の条件で予備凍結を2時間程度行い、約0〜10℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約15〜25℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明の組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。

本発明の組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の0.5〜2倍量、又は500 mL以下が適当である。

本発明の組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明のアンチセンスオリゴマーの種類、剤形、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明のアンチセンスオリゴマーの量として、1日当たり0.1mg〜10g/ヒトの範囲内が、好ましくは1 mg〜1 g/ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また1日1回から数回の投与又は1日から数日間の間隔で投与することができる。

本発明の組成物の別の態様として、本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るベクターと上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは、複数の本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るものであってもよい。当該組成物には、本発明のオリゴマーを含有する本発明の組成物と同様に、医薬的に許容可能な添加剤を添加することができる。当該組成物中に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって異なるが、0.1 nM〜100 μMの範囲内が適当であり、100 nM〜10 μMの範囲内が好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との重量比（担体/発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが、0.1〜100の範囲内が適当であり、0.1〜10の範囲内が好ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明のアンチセンスオリゴマーを含有する本発明の組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発明の組成物の場合と同様である。

以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。

［参考例1］
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−｛［（2S，6R）−6−（4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1−イル）−4−トリチルモルホリン−2−イル］メトキシ｝−4−オキソブタン酸
工程1：4−｛［（2S，6R）−6−（4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1（2H）−イル）−4−トリチルモルホリン−2−イル］メトキシ｝−4−オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、N−｛1−［（2R，6S）−6−（ヒドロキシメチル）−4−トリチルモルホリン−2−イル］−2−オキソ−1，2−ジヒドロピリミジン−4−イル｝ベンズアミド3.44gと4−ジメチルアミノピリジン（4−DMAP）1.1gをジクロロメタン50mLに懸濁し、無水コハク酸0.90gを加え、室温で3時間撹拌した。反応液にメタノール10mLを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、4.0gの目的物を得た。

工程2：アミノポリスチレン樹脂に担持された4−｛［（2S，6R）−6−（4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1−イル）−4−トリチルモルホリン−2−イル］メトキシ｝−4−オキソブタン酸の製造
4−｛［（2S，6R）−6−（4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1（2H）−イル）−4−トリチルモルホリン−2−イル］メトキシ｝−4−オキソブタン酸4.0gをピリジン（脱水）200mLに溶解し、4−DMAP0.73g、1−エチル−3‐（3−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩11.5gを加えた。次いで、アミノポリスチレン樹脂 Primer support 200 amino（GE Healthcare Japan社製、17-5214-97）25.0g、トリエチルアミン8.5mLを加え、室温で4日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン（脱水）200mL、無水酢酸15mL、2，6−ルチジン15mLを加え、室温で2時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、26.7gの目的物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、129.2μmol/gであった。

UV測定条件
機器：U-2910（日立製作所）
溶媒：メタンスルホン酸
波長：265 nm
ε値：45000

以下の実施例1、2及び比較例1の記載に従い、表1 のPMO No.1〜3に示すPMOを合成した。合成したPMOを注射用水（大塚製薬工場社製）で溶解した。

［実施例1］
PMO No．1
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−｛［（2S，6R）−6−（4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1（2H）−イル）−4−トリチルモルホリン−2−イル］メトキシ｝−4−オキソブタン酸（参考例1）0.2g（26μmol）をフィルター付きカラムに充填し、核酸合成機（AKTA Oligopilot 10 plus）を使用して、下記合成サイクルを開始した。標記化合物の塩基配列になるよう、各カップリングサイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した(下記表2を参照)。

なお、デブロック溶液としては、3％（w/v）トリフルオロ酢酸を含有するジクロロメタン溶液を用いた。中和・洗浄溶液としては、N，N−ジイソプロピルエチルアミンを10％（v/v）になるように、かつテトラヒドロフランを5％（v/v）になるように、35％（v/v）のアセトニトリル含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。カップリング溶液Aとしては、モルホリノモノマー化合物を0.10Mになるように、テトラヒドロフランで溶解したものを用いた。カップリング溶液Bとしては、N，N−ジイソプロピルエチルアミンを2
0％（v/v）になるように、かつテトラヒドロフランを10％（v/v）になるように、アセトニトリルで溶解したものを用いた。キャッピング溶液としては、アセトニトリルに対して20％（v/v）の無水酢酸と30％（v/v）の2，6−ルチジンを溶解したものを使用した。

上記で合成したPMOが担持されたアミノポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、2時間以上室温で減圧乾燥した。乾燥したアミノポリスチレン樹脂に担持されたPMOを反応容器に入れ、28％アンモニア水−エタノール（1/4）5mLを加え、55℃で15時間撹拌した。アミノポリスチレン樹脂をろ別し、水−エタノール（1/4）1mLで洗浄した。得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を20mMの酢酸−トリエチルアミン緩衝液（TEAA緩衝液）とアセトニトリルの混合溶媒（4/1）10mLに溶解し、メンブレンフィルターでろ過した。得られたろ液を逆相HPLCにて精製した。使用した条件は、以下の表3に示す通りである。

各フラクションを分析して、目的物を回収し、減圧濃縮した。濃縮残渣に2Mのリン酸水溶液0.5mLを加え、15分間攪拌した。さらに、2Mの水酸化ナトリウム水溶液2mLを加えてアルカリ性とし、メンブレンフィルター（0.45μm）でろ過した。
得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記表4に示す通りである。

各フラクションを分析（HPLC）し、目的物を水溶液として得た。得られた水溶液に0.1Mのリン酸緩衝液（pH 6.0）を添加し中和した。次いで、下記表5に示す条件で逆相HPLCにて脱塩した。

目的物を回収し、減圧濃縮した。得られた残渣を水に溶かし、凍結乾燥して、白色綿状固体として目的化合物を得た。

ESI−TOF−MS 計算値：10021.46
測定値：10021.91

［実施例2］
PMO No．２
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。

ESI−TOF−MS 計算値：9916.71
測定値：9916.43

［比較例１］
PMO No．３
実施例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。

ESI−TOF−MS 計算値：9949.46
測定値：9949.41

[試験例1]
In vitro アッセイ
PMO No.1、2の本発明のアンチセンスオリゴマー及びPMO No.3のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下の表6に示す。

RD細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）3.5×10⁵個に対して、PMO No. 1及び2の本発明のアンチセンスオリゴマー並びにPMO. No. 3のアンチセンスオリゴマーを0.3, 1, 3, 10 μMずつAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II（Lonza）により導入した。プログラムはT-030を用いた。
導入後、細胞を、10％ウシ胎児仔血清（FCS）（インビトロジェン社製）を含むEagle's minimal essential medium(EMEM)培地（シグマ社製、以下同じ。） 2mL中、37℃、5％CO₂条件下で3日間培養した。細胞をPBS（ニッスイ社製、以下同じ。）で洗浄した後、ISOGEN II（ニッポンジーン社製）500 μl を細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をEppendorfチューブに回収した。ISOGENに添付のプロトコルに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度はNanoDrop ND-1000（エル・エム・エス社製）を用いて測定した。
抽出したtotal RNA 400 ngに対し、Qiagen One Step RT-PCR Kit（Qiagen社製）を用いてOne-Step RT-PCRを行った。キットに添付のプロトコルに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはPTC-100（MJ Research社製）を用いた。用いたRT-PCRのプログラムは、以下の通りである。

50℃、30分間：逆転写反応
95℃、15分間：熱変性
[94℃、30秒間；60℃、30秒間；72 ℃、60秒間]x 35サイクル：PCR増幅
72℃、10分間：最後の伸長反応

RT-PCRに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。

フォワードプライマー：5’-CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3’ （配列番号5）
リバースプライマー：5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’ （配列番号6）

上記RT-PCRの反応産物1 μlをBioanalyzer（アジレント社製）を用いて解析した。エクソン51 がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン51がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。

スキッピング効率（％）= A /（ A ＋ B ）x 100

実験結果
結果を図１に示す。本実験により、本発明のアンチセンスオリゴマーは、PMO No.3と比較して、著しく高い効率でエクソン 51 をスキッピングさせることが判明した。

［実施例３］
PMO No．４−６
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。各種アンチセ
ンスオリゴマーの配列を表７に示す。

［実施例４］
配列番号9−33に記載の2’-O-メトキシ-ホスホロチオエート体
標記の各種アンチセンスオリゴマーを日本バイオサービス社に委託して製造した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を表８に示す。

試験例に示す実験結果から、本発明のアンチセンスオリゴマーは、RD細胞において、著しく高い効率でエクソン51をスキッピングさせることが示された。従って、本発明のアンチセンスオリゴマーは、DMDの治療において、非常に有用である。

Claims

以下の（i）及び（j）より選ばれるアンチセンスオリゴマー。
（i）配列番号1又は2の塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー；および
（j）配列番号1又は2の塩基配列に対して、90％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、かつヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51をスキッピングする活性を有するアンチセンスオリゴマー
オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項２に記載のアンチセンスオリゴマー。
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項２又は３に記載のアンチセンスオリゴマー。
（上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。）
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項２〜４のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
モルホリノオリゴマーである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのモルホリノ環部分、リン酸結合部分、３’末端及び/又は５’末端が修飾されている、請求項６に記載のアンチセンスオリゴマー。
前記モルホリノオリゴマーを構成する少なくとも1つのモルホリノのリン酸結合部分が、ホスホロジアミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項６又は７に記載のアンチセンスオリゴマー。
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項８に記載のアンチセンスオリゴマー。
5’末端が、下記化学式（1）〜（3）のいずれかの基である、請求項７〜９のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
請求項１〜１０のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を含む、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
投与対象の患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する筋ジストロフィー患者である、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
前記患者がヒトである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における請求項１〜１０のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマーの使用。
筋ジストロフィー治療に使用するための請求項１〜１０のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー。
前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子のエクソン29-50、50、45-50、48-50、49-50、52、52-63、13-50、19-50、43-50、又は47-50にヌクレオチドの欠失を有する患者である、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴマー。
前記患者がヒトである、請求項１６又は１７に記載のアンチセンスオリゴマー。