JP6127043B2 - Ａｇｒ２遮断抗体及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は遺伝免疫及び分子生物学技術分野のモノクローナル抗体に係るものであり、具体的には、ＡＧＲ２遮断抗体（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びその使用に係るものである。

Ａｎｔｅｒｉｏｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ−２（ＡＧＲ２）は、最初は雌性ホルモン受容体が発現されるヒト乳がん細胞株中において、ディファレンシャルスクリーニングによって発見されたものである（Ｋｕａｎｇ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９８．２６（４）：ｐ．１１１６−２３．）。それから完全長ｃＤＮＡクローンを得て、比較により、ヒキガエルＸＡ−２発育関連タンパク質と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有することを発見され、且つｈＡＧ−２と命名された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｗｅｉｇｅｌ，ｈＡＧ−２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９８．２５１（１）：ｐ．１１１−６．）。ＡＧＲ２は蛋白質ジスルフィド結合イソメラーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＤＩ）と比較高い同一性を有し（Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．．Ｍｏｌ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌ ２００５ ３６（３）：ｐ．７３４−４０．）、さらにはＰＤＩ活性を有する（Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００９．１０６（１７）： ｐ．６９５０−５．）。ＡＧＲ２はＰＤＩの活性部位「ＣＸＸＳ」を有し、これは正常のＰＤＩ部位「ＣＸＸＣ」と区別があり、その他のＰＤＩタンパク質の研究より、「ＣＸＸＳ」活性部位にはジスルフィド結合を再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）する機能があるが、ジスルフィド結合の合成機能に欠けることが示された。これは、ＡＧＲ２が正常の細胞増殖を撹乱する機能を有し、その機能を回復する能力に欠けることを示している（Ａｎｅｌｌｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２００２．２１（４）：ｐ．８３５−４４．Ａｎｅｌｌｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２００３．２２（１９）：ｐ．５０１５−２２．）。

ＡＧＲ２は原発性及び続発性腫瘍の標識タンパク質であり、且つ腫瘍患者の循環システム中において検出でき、且つ腫瘍の発生及び転移と密接に関連している。ＡＧＲ２は乳がん細胞の転換及び移動を促進する作用を有する（Ｌｉｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５，６５（９）：３７９６−３８０５．）。ＡＧＲ２は膵臓がん細胞の侵襲能力を向上させ、これにより腫瘍の転移を促進する（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ Ｖ，ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００８，６８（１９）：７８１１−７８１８．）。ＡＧＲ２は前立腺がんの転移において重要な役割を果たしている（Ｚｈａｎｇ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１０，７０（１）：２４０−２４８．）。２０１０年には、ＫａｔｈｒｙｎらはＡＧＲ２ポリクローナル抗体を用いて乳がん細胞の増殖を抑制できることに言及している（Ｋａｔｈｒｙｎ Ｅ Ｖａｎｄｅｒｌａａｇ，ｅｔ ａｌ．ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｓｅｒ，２０１０，１２．）。

ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｉｊ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃａｎ ｂｅ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．５３（４）：ｐ．６７７−８５． Ｂｈｕｖａｎｅｓｗａｒｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＥＧＦＲ ｗｉｔｈ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｒｂｉｔｕｘ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｌａｄｄｅｒ ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ，２００９．８：ｐ．９４． Ｋｈａｌｉｌｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ ａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５．２４（４４）：ｐ．６６５７−６６． Ｊｅｒｏｍｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６．６６（１４）：ｐ．７２４５−５２． Ｇｕａｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔａｘｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｅｗｉｎｇ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００５．１１（５）：ｐ．２００８−１７．

本発明は以下の技術構成に係る。

１．特異的にＡＧＲ２タンパク質と結合する抗体であって、該抗体はマウス抗ヒトＡＧＲ２タンパク質モノクローナル抗体１８Ａ４と、基本的同じＡＧＲ２タンパク質エピトープと結合することを特徴とする、前記抗体。

２．該抗体はマウス抗ヒトＡＧＲ２モノクローナル抗体１８Ａ４、またはそのヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）した形、またはキメラ形であることを特徴とする、項目１に記載の抗体。

３．上記エピトープはＡＧＲ２タンパク質のジスルフィド結合イソメラーゼの活性ドメインに位置することを特徴とする、項目１または２に記載の抗体。

４．上記抗体と結合するＡＧＲ２活性ドメインはＣＰＨＳであり、好ましくは該抗体とＰＬＭＩＨＨＬＤＥ ＣＰＨＳＱＡＬＫＫＶ ＦＡ（配列番号１２）の示される必要結合領域と結合する、項目１〜４のいずれかに記載の抗体。

５．配列番号８に示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含むもの、
配列番号９に示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含むもの、
配列番号１０に示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むもの、
配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列を含むもの、
配列番号１２に示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を含むもの、及び、
配列番号１３に示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むもの、
以上の少なくとも一種類の配列を含むことを特徴とする、上記項目のいずれかに記載の抗体。

６．ＤＹＮＭＤ（配列番号８）に示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、
ＤＩＮＰＮＹＤＴＴＳＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号９）に示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、
ＳＭＭＧＹＧＳＰＭＤＹ（配列番号１０）に示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、
ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨ（配列番号１１）に示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１２）に示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、
ＱＨＩＲＥＬＰＲＴ（配列番号１３）に示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む、項目５に記載の抗体。

７．上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に示されるものであり、
上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１に示されるものである、
項目６に記載の抗体。

８．上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に示されるものであり、
上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３に示されるものである、
項目６に記載の抗体。

９．ヒト化抗体、好ましくはヒト化完全ＩｇＧ１抗体であることを特徴とする、項目１〜８のいずれかに記載の抗体。

１０．抗体フラグメントであり、好ましくはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、線形抗体、単鎖抗体であり、さらに好ましくはＦａｂフラグメントであることを特徴とする、項目１〜９のいずれかに記載の抗体。

１１．項目１〜１０のいずれかに記載の抗体及び医薬上許容し得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。

１２．項目１〜１０のいずれかに記載の抗体をコードする、分離された核酸。

１３．項目１２に記載の核酸を含むことを特徴とする、ベクター。
１４．項目１３に記載のベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。

１５．上記核酸を発現させ上記抗体を生成させるように、項目１４に記載の宿主細胞を培養することを含むこと特徴とする、ヒト化抗体を生産する方法。

１６．上記宿主細胞培養物中から、上記抗体を回収することをさらに含むことを特徴とする、項目１５に記載の方法。

１７．哺乳動物に上記抗体を投与するステップを含むことを特徴とする、項目１〜１０のいずれかに記載の抗体を哺乳動物中の病理性血管形成と関連する疾病の治療方法。

１８．上記疾病はがんであることを特徴とする、項目１７に記載の方法。

１９．上記がんは乳がん、卵巣がん、骨肉腫、肝臓がん、すい臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、非小細胞性肺がん、腎臓がん、頭頚部がん、黒色腫、及び多発性骨髄腫から選ばれることを特徴とする、項目１８に記載の方法。

２０．上記治療は、第二治療剤を上記抗体と同時または順番に投与するステップを含むことを特徴とする、項目１９に記載の方法。

２１．上記第二治療剤は、抗血管形成剤、化学療法薬及び細胞毒性薬剤から選ばれることを特徴とする、項目２０に記載の方法。

２２．項目１〜１０のいずれかの抗体の、哺乳動物中の病理性血管形成と関連する疾病の治療のための医薬品の製造における使用であって、好ましくは、該疾病はがんであり、より好ましくは、上記がんは乳がん、卵巣がん、骨肉腫、肝臓がん、すい臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、非小細胞性肺がん、腎臓がん、頭頚部がん、黒色腫、及び多発性骨髄腫から選ばれるものである、上記使用。

本発明はさらに、項目１〜１０のいずれかの抗体の、患者組織、細胞サンプル中でのＡＧＲ２発現の検出における使用に係る。

本発明はさらに、項１〜１０のいずれかの抗体の、患者組織、細胞サンプル中でのＡＧＲ２発現を検出するための試薬、キットまたは製品の製造中における使用に係る。

本発明はハイブリドーマ細胞株１８Ａ４に係る。該ハイブリドーマ細胞株は２００９年１月１９日に、中国典型培養物寄託センター（Ｃｈｉｎａ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＣＴＣＣ、住所：湖北省武漢市昌珞珈山武漢大学）に寄託されたである。

本発明の上記方法により製造された抗体とＡＧＲ２との結合は、本分野の常規的な技術、例えばＥＬＩＳＡによって測定である。

上記製造は具体的には以下のステップを含む。

ステップ１、ハイブリドーマ細胞培養液の収集。
ステップ２、モノクローナル抗体の精製。

本発明は、上記方法により製造された抗体に係り、ＡＧＲ２の腫瘍の増殖及び転移の促進の遮断に用いられ、具体的には、インビトロにおいて乳がん細胞の増殖速度（正常組織にとっては異常な速度）を抑制でき、及び生生体外において、腫瘍細胞の転移を抑制でき、さらには、生体外において、乳がん腫瘍細胞Ｔ４７Ｄの増殖、遊走及び進襲性転移を抑制でき、生体外において乳がん腫瘍細胞Ｔ４７Ｄの細胞周期を抑制できる。

上記の異常な増殖速度は、正常な体内定常状態に必要な程度を超え、及び同じ由来の正常組織の増殖速度を超えた増殖速度を指す。

上記の抑制または遮断とは、活性効力の低下または消失である。

上記の生体外において乳がん細胞の増殖速度を抑制するとは、体外腫瘍細胞の数が増加または減少することである。腫瘍細胞増殖の体外制御は、本分野において知られている方法、例えば実施例に示されるＭＴＴ実験によって確定できる。

上記の生体外において腫瘍細胞の転移を抑制するとは、体外腫瘍細胞の移動、及び侵襲性転移を遅らせることである。腫瘍細胞転移の体外制御は本分野で知られている方法、例えば実施例中に記載の腫瘍侵襲チャンバー実験によって確定できる。

図１はＥＬＩＳＡによるＡＧＲ２特異性の検出である。 図２は免疫ブロットによるＡＧＲ２特異性の検出である。Ａの１はＭＣＦ７細胞ライセート、２はＡＧＲ２−ｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトしたＭＢ−２３１ライセートである。３はｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトしたＭＢ−２３１ライセートである。４はＡＧＲ２−ｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３Ｔライセートである。５はｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３Ｔライセートである。Ｂはモノクローナル抗体はマウスＡＧＲ２と交差反応できることを示す。 図３は免疫沈降法によるＡＧＲ２特異性の検出である。 図４は免疫蛍光法によるＡＧＲ２特異性の検出である。 図５Ａ及び図５Ｂはマウスモノクローナル抗体１８Ａ４の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）（図５Ａ）及び重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）（図５Ｂ）（それぞれ配列番号１及び２）、ヒト化１８Ａ４Ｈｕ１形式のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメイン（それぞれ配列番号３及び４）、及びヒトＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ共通フレームワーク（ｈｕｍ κＩＩＩ、軽鎖κ亜型ＩＩＩ；ｈｕｍＩ、重鎖亜型Ｉ）（それぞれ配列番号５及び６）のアミノ酸配列の比較を記載している。星番号はヒト化１８Ａ４Ｈｕ１とマウスモノクローナル抗体１８Ａ４の間、またはヒト化１８Ａ４Ｈｕ１とヒト共通フレームワーク領域間の差異である。比較のために、相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付している。 図６Ａ及び図６Ｂはマウスモノクローナル抗体１８Ａ４の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）（図２Ａ）及び重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）（図２Ｂ）（それぞれ配列番号１及び２）、ヒト化１８Ａ４Ｈｕ１形式のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメイン（それぞれ配列番号３及び４）、及びヒト生殖系列Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ共通フレームワーク（ｈｕｍ κＩＩＩ、軽鎖κ亜型ＩＩＩ；ｈｕｍＩ，重鎖亜型Ｉ）（それぞれ配列番号５及び６）、および関連胚系_Ｌ及びＶ_Ｈをテンプレートとした市販薬の共有配列のアミノ酸配列比較を記載している。「−」番号は１８Ａ４と同じアミノ酸を有することを示し、「＊」は市販薬の変化の比較的大きいアミノ酸部位であり、この部位の変化が抗体の親和性及び特異性に対し比較的大きい影響を及ぼすことを示唆している。 図７は完全抗体発現プラスミドの構築模式図であり、図中において、フラグメント２はＩＲＥＳエレメントを有し、フラグメント１はプロモーター、終止コドン、ＰｏｌｙＡ部、耐性遺伝子など、常規真核発現プラスミドが有する関連エレメントを含む。 図８は精製された抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図であり、Ｍはマーカーであり、タンパク質のサイズを識別する。１、２、５、６レーンはマウス由来のサンプルであり、３、４、７、８はヒト由来のサンプルである。左図は非変性ゲル、右図は変性ゲルである。染色用試薬はクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）染料である。 図９は競合ＥＬＩＳＡ法による抗体親和性の測定実験の結果である。 図１０はヒト化抗体変異体の変異部位比較及び潜在Ｔ細胞抗原エピトープ数の変化状況である。赤色の標識は改変されたアミノ酸配列を示す。 図１１はヒト化抗体の変異体の抗原結合曲線である。 図１２はウェスタンプロット法によるヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂ種特性の鑑定である。左図はＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色結果であり、右図はＨＲＰと結合した抗人抗体を第二抗体としたウェスタンプロット結果であり、レーン１，２，３はそれぞれマウス１８Ａ４抗体、ヒトＩｇＧ対照抗体とヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂである。 図１３はウェスタンプロット法によるヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂ抗原結合特異性の測定である。左図はＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色結果であり、右図に使用される一次抗体は左から右へ、それぞれ対照空プラスミドをトランスフェクトした上澄み液、Ａｇｔｕｚｕｍａｂを発現した上澄み液、抗ＧＳＴ陰性対照上澄み液、マウス１８４Ａ抗体上澄み液、抗ＭＢＰ抗体上澄み液、抗ＭＢＰ抗体上澄み液、対照空プラスミドをトランスフェクトした上澄み液、Ａｇｔｕｚｕｍａｂを発現した上澄み液、抗ＧＳＴ陰性対照上澄み液である。 図１４はウェスタンプロット法によるヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂと細胞ライセート中の抗原との結合特異性の測定である。左図はＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色結果であり、右図のレーン１，２，３，４のサンプルはそれぞれＡＧＲ２プラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞であり、ＡＧＲ２プラスミドをトランスフェクトしていない２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ−７（天然ＡＧＲ２が発現されている）細胞ライセートと精製化したＡＧＲ２−ＭＢＰである。一次抗体はヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂである。２６ＫＤａのバンドはβ−ａｃｔｉｎのバンドであり、ライセート中のタンパク質の相対量を標識するためのものである。 図１５は免疫沈降（ＩＰ）法によるヒト化抗体ＡｇｔｕｚｕｍａｂとＭＣＦ７細胞中の天然ＡＧＲ２との結合能力の測定である。レーン１，２，３はそれぞれＭＣＦ７細胞ライセート、ヒトＩｇＧのｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＩＰと結合したタンパク質と、ヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂのｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＩＰと結合したタンパク質であり、一次抗体は抗ＡＧＲ２のウサギモノクローナル抗体であり、二次抗体はＨＲＰ複合ウサギポリクローナル抗体である。 図１６はＡＧＲ２の潜在的抗原エピトープによる、変異で生成したＡＧＲ２−ＭＢＰ変異体に対する分析である。赤色ＧＧＧは該エピトープが三つのグリシンに変異していることを示す。 図１７はウェスタンプロット法による、マウス１８Ａ４及びヒト化抗体ＡｇｔｕｚｕｍａｂとＡＧＲ２−ＭＢＰ変異体との結合に対する分析である。レーン１から１２はそれぞれＡＧＲ２−ＭＢＰ，ＡＧＲ２−ＭＢＰ変異体１〜１０，ＭＢＰである。 図１８は腫瘍侵襲チャンバー実験による、抗体の体外肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２の侵襲性転移に対する抑制の測定である。 図１８はＭＴＴ法による、抗体の体外乳がん細胞Ｔ４７Ｄ，ＭＣＦ７増殖と遊走に対する抑制の測定である。 図２０はスクラッチテストによる、抗体の体外乳がん細胞Ｔ５７Ｄの遊走に対する抑制の測定である。 図２１は腫瘍侵襲チャンバー実験による、抗体の体外肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２の侵襲性転移に対する抑制の測定である。 図２２はフローサイトメトリーによる、抗体の体外乳がん細胞ＮＣＦ−７及びＴ４７Ｄの細胞周期に対する抑制の測定である。図２２（Ａ）は本発明の抗体で４８時間処理した後、乳がん細胞Ｔ４７Ｄの細胞周期が抑制されていることが検出され、Ｔ４７Ｄ細胞Ｇ１／Ｇ０期が対照より８．５６％上昇し、同時にＳ期とＧ２／Ｍ期はそれぞれ８．５６％低下したことを示している。図２２（Ｂ）において、本発明は抗体で４８時間処理した後、乳がん細胞のＭＣＦ−７細胞周期が抑制されていることが検出され、ＭＣＦ−７細胞のＧ１／Ｇ０期は対照より５．３７％上昇している、同時にＳ期間とＧ２／Ｍ期はそれぞれ５．３７％低下したことを示している。 図２３はウェスタンプロットによる、抗体がＡＧＲ２活性部位ドメインに結合していることの検出及び確認である。 図２４はウェスタンプロットによる、抗体がＡＧＲ２活性部位ドメインに結合していることの検出及び確認である。 図２５はウェスタンプロットによる、抗体がＡＧＲ２活性部位ドメインに結合していることの検出及び確認である。 図２６の（Ａ）（Ｂ）は動物腫瘍増殖である。（Ｃ）（Ｄ）実験グループと対照グループは腫瘍サイズの比較である。（Ｅ）は血管の比較である。

Ｉ．定義
用語「ＡＧＲ２」及び「Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２」は本明細書中において交互に交換して使用でき、上記文中に記載されたヒト由来の任意のＡＧＲ２の完全長天然アミノ酸配列の分子ファミリー、及びＡＧＲ２が属するＰＤＩスーパーファミリーを指し、潜在的な形、及び前駆体と成熟したＡＧＲ２（「潜在ＡＧＲ２」）の結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、または未結合（ｕｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）の複合体である。本文に係るこのようなＡＧＲ２は、現在同定された及び将来同定される形式中にいずれか一種のヒトＡＧＲ２種類であり、いかなる既知のＡＧＲ２配列から誘導され、且つ該配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％であり、且つさらにより好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有するポリペプチドである。用語「ＡＧＲ２」はヒトＡＧＲ２をコードする遺伝子である。好ましいＡＧＲ２は天然配列のヒトＡＧＲ２である。

本文中において、用語「抗体」はその最も広い意味を用い、具体的には、完全モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二種類の完全抗体によって形成される多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体フラグメントをカバーし、これらが必要となる生物学的活性を示していれば良い。

目的抗原と「結合」することは、例えばＡＧＲ２抗原の抗体が、充分な親和性を持って抗原と結合する抗体であり、これにより該抗体を、該抗原をターゲット発現する細胞の治療剤とすることができる。抗体がＡＧＲ２と結合する抗体なら、通常はＡＧＲファミリーのその他のメンバーではなく、優先的にＡＧＲ２と結合し、且つこのタイプのファミリーのその他のタンパク質、例えばＢＭＰ、活性化タンパク質などと、顕著に交差反応（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）をしない抗体とすることができる。指定抗体、例えば１８Ａ４と命名されるモノクローナル抗体の「生物学特徴」を有する抗体とは、上記抗体の一種類または複数種類の生物学特性を有する抗細胞体であり、他の抗体との区別は、同じ抗原（例えばＡＧＲ２）と結合することにある。例えば、１８Ａ４の生物学特性を有する抗体は、ＡＧＲ２の活性化を遮断する、及び／または１８Ａ４と結合する、同じＡＧＲ２外部ドメインエピトープ（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）と結合できる。

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書においては、基本的に同質の抗体群により得られる抗体をいい、即ち群を構成する各抗体は同じであり、可能な天然的に存在する変異以外に、これらは通常は極小量で存在する。モノクローナル抗体は高度特異的なものであり、即ち単一抗原部位を対象にするものである。また、異なる抗原決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｇｒｏｕｐ）（エピトープ）に対する異なる抗体のモノクローナル抗体製品は異なり、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一抗原決定基に対するものである。これらの特異性以外に、モノクローナル抗体の優位性は、これらは合成でき、且つ他の抗体による汚染を受けないことである。修飾語「モノクローナル」とは、抗体が基本的に同質の抗体群から得られたと言う特徴であり、いかなる特定の方法により抗体を生産するか解釈するものではない。

別途説明する場合を除き、本明細書中の「モノクローナル抗体１８Ａ４」は、以下の実施例中のマウス１８Ａ４抗体の抗原結合残基または以下の実施例中のマウス１８Ａ４抗体から誘導される抗体を言う。例えば、モノクローナル抗体１８Ａ４は、マウスモノクローナル抗体１８Ａ４またはその変異体であり、例えば、マウスモノクローナル抗体１８Ａ４の抗原結合アミノ酸残基を有するヒト化抗体１８Ａ４である。以下の実施例２において、ヒト化１８Ａ４抗体の実例を提供している。

「エピトープ１８Ａ４」はＡＧＲ２外部ドメイン中のモノクローナル抗体１８Ａ４が結合する領域である。１８Ａ４部位を結合する抗体をスクリーニングするため、通常は常規的な交差遮断実験を行い、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ和Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるものである。

本文中のモノクローナル抗体は、明確に「キメラ」抗体を含み、そのうち重鎖及び／または軽鎖の一部は、特定の種または特定の抗体タイプまたはサブタイプの抗体中に属する対応配列と同一または相同であり、鎖の残りの部分と、他の種または他の抗体タイプまたはサブタイプの抗体中から誘導される対応する配列は同一または相同であり、及びこのような抗体のフラグメントであり、これらが必要とする生物学活性を示すものであれば良い。

「完全」な抗体とは、抗原結合可変領域及び軽鎖恒常領域（Ｃ_Ｌ）、及び重鎖恒常領域Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む抗体である。恒常領域は天然配列恒常領域（例えばヒト天然配列恒常領域）またはそのアミノ酸配列変異体である。好ましくは、完全な抗体は一種または複数種類のエフェクター機能を有する。

「抗体フラグメント」は完全な抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、線形抗体（Ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体を含む。

「Ｆ_ｖ」フラグメントは完全な抗原識別及び結合部位を含む抗体フラグメントであり、この領域は一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変領域が緊密に接続しているダイマーからなり、該接続（例えばｓｃＦｖ中）は共有結合とすることができる。このコンフォメーションにおいて、それぞれの可変領域の三つのＣＤＲ相互作用により、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌダイマー表面上の抗原結合部位を限定する。

「Ｆａｂ」フラグメントは軽鎖の可変領域及び定常領域及び重鎖の可変領域と第一定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは一対のＦａｂフラグメントを含み、通常はそれらのカルボキシル基末端付近で、それらの間のヒンジシステイン酸によって共有結合を形成する。抗体フラグメントのその他の化学結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）法は本分野で知られているものである。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単鎖ポリペプチド鎖中に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはさらにＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチド接続部を含み、該接続部はｓｃＦｖに抗原と結合する理想的な構造を形成させる。

用語「線形抗体」は、ペアとなっている直列Ｆｄフラグメント（Ｖ_Ｈ−ＣＨ_１−Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１）を含み、相補の軽鎖ポリペプチドと共に、ペアとなる抗原結合領域を形成する。線形抗体は二重特異性または単特異性のものである。

本明細書において使用される用語「抗体可変領域」は、抗体分子の軽鎖と重鎖の部分であり、相補決定領域（ＣＤＲｓ：即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及びフレームワーク領域（ＦＲｓ）のアミノ酸配列を含む。Ｖ_Ｈとは重鎖の可変領域である。Ｖ_Ｌは軽鎖の可変領域である。本発明に使用の方法によれば、ＣＤＲｓ及びＦＲｓの指定するアミノ酸部位は、Ｋａｂａｔ等（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載の番号システム）によって限定される。

本文において使用する用語「相補決定領域」（ＣＤＲｓ：即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、抗体可変領域のアミノ酸残基を指し、その存在は抗原の結合に必需である。それぞれの可変領域は通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と同定された三つのＣＤＲエリアである。それぞれの相補決定領域は、Ｋａｂａｔによって限定される「相補決定領域」のアミノ酸残基（即ちおおよそ軽鎖可変領域中の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）、及び重鎖可変領域中の３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）を含む。

フレーム領域（以下ではＦＲという）はＣＤＲ残基以外のそれらの可変領域残基である。それぞれの可変領域は通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と同定される４つのＦＲを有する。上記ＣＤＲはＫａｂａｔによって限定され、軽鎖ＦＲ残基はおおよそ残基１−２３（ＬＣＦＲ１）、３５−４９（ＬＣＦＲ２）、５７−８８（ＬＣＦＲ３）及び９８−１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、且つ重鎖ＦＲ残基はおおよそ、重鎖残基の残基１−３０ （ＨＣＦＲ１）、３６−４９（ＨＣＦＲ２）、６６−９４（ＨＣＦＲ３）及び１０３−１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。上記ＣＤＲは高度可変リングに由来のアミノ酸残基であり、軽鎖ＦＲ残基は大よそ軽鎖中の残基１−２５（ＬＣＦＲ１）、３３−４９（ＬＣＦＲ２）、５３−９０（ＬＣＦＲ３）及び９７−１０７（ＬＣＦＲ４）に位置するものであり、且つ重鎖ＦＲ残基はおおよそ、重鎖残基の残基１−２５（ＨＣＦＲ１）、３３−５２（ＨＣＦＲ２）、５６−９５（ＨＣＦＲ３）及び１０２−１１３（ＨＣＦＲ４）に位置するものである。一定の状況において、ＣＤＲはＫａｂａｔによって限定されたＣＤＲ及び高度可変リングのそれらのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基は対応するように調整できる。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含む場合、重鎖ＦＲ１残基は部位１−２５、且つＦＲ２残基は部位３６−４９にある。

「Ｔ細胞抗原エピトープ（Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）は、本明細書においては、モノクローナル抗体自身をタンパク質抗原とする場合、ＭＨＣ分子と結合及び提示されることを指し、さらに、Ｔ細胞抗原受容体が識別する可能性のあるペプチドフラグメントである。モノクローナル治療性抗体に含まれるこれらのペプチドフラグメントは、患者の治療抗体に対する免疫反応を増進させる。これらのペプチドフラグメントが多ければ多いほど、免疫反応を引き起こす確率が高い。

非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」した形とは、最低限度非ヒト免疫グロブリンの配列を含むキメラ抗体を指す。非常に大きな程度において、ヒト化抗体とは、ヒト免疫グロブリン（アクセプター抗体）中の高度可変領域残基が、必要とする特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の高度可変領域残基によって置換された免疫グロブリンである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレーム領域（ＦＲ）残基を、相応の非ヒト残基によって置換されたものである。且つ、ヒト化抗体は、アクセプター抗体またはドナー抗体中の発見されていない残基を含む。これらの修飾を行うのは、さらに抗体としての性能を改良するためである。通常、ヒト化抗体は、基本的に少なくとも一個、通常は二個の以下可変領域を含み、そのうちすべてまたは基本的にすべての高度可変リングは非ヒト免疫グロブリンに対応する高度可変リングを有し、且つすべてのまたは基本的にすべてのＦＲはヒト免疫グロブリン配列を有するＦＲである。任意として、ヒト化抗体はさらに少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含み、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域である。

「抗−血管形成剤」または「血管形成抑制物」とは、直接または間接的に血管の生成、脈管の生成、または非理想的な血管浸透性の小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、分離されたタンパク質、組み換えタンパク質、抗体、またはその結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または誘導タンパク質を指す。抗―血管形成剤はそれらの結合及び血管形成阻害因子またはその受容体血管形成活性を阻害するものである。文献Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）の表２中には、既知の抗血管形成因子が列挙されている。文献Ｓａｔｏ Ｉｎｔ．Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）中の表１は、臨床試験中において使用される抗−血管形成剤を列挙している。

用語の「異常血管形成」は、疾病状態の悪化または疾患状態をもたらし、過度の、不当の、または制御不能による血管形成が起こり、上記疾病状態は例えばがんであり、特に血管形成を有する固形腫瘍及び転移がんである。

本文に用いる用語「細胞毒性薬剤」は、細胞機能抑制または阻害、及び／または細胞破壊をもたらす物質である。該用語は、放射線同位体、化学療法剤及び毒素を含む。

「化学療法剤」とは、がんの治療において使用される化学合成物であり、抗腫瘍薬とも称される。抗腫瘍薬は一般的には、薬品の化学構造及び由来の違いにより、それぞれ、アルキル化剤、抗代謝薬、抗腫瘍抗生剤、アントラセン環環状抗生剤、抗腫瘍植物薬、ホルモンである。医薬品作用の周期または時間位相（ｔｉｍｅ ｐｈａｓｅ）の特異性の違いにより、腫瘍化学療法剤を、（１）細胞周期非特異性薬品（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｇｅｎｔｓ ，ＣＣＮＳＡ）アルキル化剤、抗腫瘍抗生剤及び白金類配合物など、（２）細胞周期特異性医薬品（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｇｅｎｔｓ，ＣＣＳＡ）抗代謝薬品、ビンカ（Ｖｉｎｃａ）類薬品等である。

ＩＩ．ヒト化抗ＡＧＲ２抗体の製作
本分野はすでに、非ヒト抗体のヒト化の方法について説明している。好ましくは、ヒト化抗体は非ヒト由来の、導入された一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は通常「インプット」残基と呼ばれ、これらは通常「インプット」可変領域から選ばれる。ヒト化は本質的にはＷｉｎｔｅｒ及びその仲間の方法によって行われる（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、高度可変領域においてヒト抗体の関連の配列を置換する。よって、これらの「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許４，８１６，５６７）であり、そのうちの基本的には、ヒト可変領域の全体より少ない部分が、非ヒト種の対応配列により置換される。実践において、ヒト化抗原は通常、そのうち高度可変領域残基、及び可能の一部のＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似サイトの残基によって置換されたヒト抗体である。

ヒト化抗体の製造に用いるヒト可変領域の選択において、軽鎖及び重鎖を有し、抗原性を低下させることが非常に重要である。上記の「最適（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）方法は、げっ歯類抗体可変領域配列を用いて、既知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。それからげっ歯類と最も接近するヒト化配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）とする（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。もう一種類の方法は、特定の軽鎖または重鎖のサブ群からなるすべてのヒト抗体の共有配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークは、何種類かの異なるヒト化抗体に用いることができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。

ヒト化抗体を製造するのに重要なことは、抗体はヒト化した後にも、抗原に対して高い親和性と、その他の有利な生物学特性を保持する。以下の実施例は、ＡＧＲ２と結合する例示性ヒト化抗ＡＧＲ２抗体の生産について記載している。

本文のヒト化抗体は、ヒト重鎖可変領域に導入する非ヒト高度可変領域の残基を含み、且つ第５７、５８、６０、６５、６７、６８及び／または７０位上に、フレームワーク領域（ＦＲ）置換を含み、そのうちＫａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載された番号付けシステムに記載の可変領域番号を使用した。一つの実施形態において、上記ヒト化抗体は、第５７、５８、６０、６５、６７、６８及び７０位から選ばれる二個または複数の位置上のＦＲ置換を含み、その他の実施形態において、上記ヒト化抗体は、第５７、５８、６０、６５、６７、６８及び７０位上にある三つまたは四つの位置上のＦＲ置換を含む。好ましい実施形態において、上記ヒト化抗体は第６５、６７、６８及び７０位置上の、または第６７、６８、７０位置上の、または第６８及び７０位置上のＦＲ置換を含む。他の好ましい実施形態において、上記ヒト化抗体は第５７、５８及び６０位上の、または第５７及び６０位上のＦＲ置換を含む。本発明のヒト化抗体は好ましくは、比較的多いフレームワーク置換ではなく、比較的少ないフレームワーク置換により、免疫原性を最低に低下させ、しかし機能も非常に重要な要素である。実際に置換されるアミノ酸は好ましくは保守的で、免疫原性または機能を改変されないアミノ酸である。５７位上のアスパラギン酸（Ｎ）は好ましくはセリン（Ｓ）に改変され、５８位上のロイシン（Ｌ）は好ましくはアルギニン（Ｒ）に改変され、６０位上のセリン（Ｓ）は好ましくはスレオニン（Ｔ）に改変され、６５位上のリジン（Ｋ）は好ましくはグルタミン（Ｑ）に改変され、６７位上のリジン（Ｋ）は好ましくはアルギニン（Ｒ）に改変され、６８位上のアラニン（Ａ）は好ましくはバリン（Ｖ）に改変され、７０位上のロイシンは好ましくはメチオニン（Ｍ）に改変される。

本発明が注目する例示性ヒト化抗体は、重鎖可変領域相補決定残基ＤＹＮＭＤ（配列番号８）；ＤＩＮＰＮＹＤＴＴＳ ＹＮＱＫＦＫＧまたはＤＩＮＰＮＹＤＴＴＳ ＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号９）；及び／またはＳＭＭＧＹＧＳＰＭＤ Ｙ（配列番号１０）を含み、任意に、これらのＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含み、例えば、これらの修飾は基本的に抗体の親和性を維持または改善する。例えば、上記注目の抗体変異体は上記重鎖可変領域のＣＤＲ配列中に、約１〜５個のアミノ酸、約１〜４個のアミノ酸、約１〜３個のアミノ酸、約１〜２個のアミノ酸が置換される。例えば、親和性の成熟により、これらの抗体変異体を製造できる。好ましくは、上記ヒト化抗体重鎖可変領域は、相補決定残基ＤＹＮＭＤ（配列番号８）；ＤＩＮＰＮＹＤＴＴＳ ＹＮＱＫＦＫＧまたはＤＩＮＰＮＹＤＴＴＳ ＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号９）及びＳＭＭＧＹＧＳＰＭＤＹ（配列番号１０）中の２種類、最も好ましくはすべての３種類のＣＤＲ配列を含む。最も好ましいヒト化抗体は配列番号配列番号４の重鎖可変領域アミノ酸配列含む。

本発明のヒト化抗体は軽鎖可変領域相補決定残基ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧ ＹＳＹＭＨ （配列番号１１）；ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１２）；及び／またはＱＨＩＲＥＬＰＲＴ （配列番号１３）を含むことができる。好ましい実施形態において、上記段落中のそれらの重鎖可変領域ＣＤＲ残基以外に、さらにここに記載の軽鎖可変領域相補決定残基を含む。これらのヒト化抗体は任意の上記軽鎖ＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を有し、例えばこれらの修飾は基本的抗体の親和性を維持または改善するものである。例えば、上記注目の抗体変異体は、上記軽鎖可変領域ＣＤＲ配列中に、約１〜５個のアミノ酸、約１〜４個のアミノ酸、約１〜３個のアミノ酸、約１〜２個のアミノ酸置換を有する。親和性の成熟によってこれらの抗体変異体を製造できる。好ましくは、本発明のヒト化抗体の軽鎖可変領域は相補決定残基ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧ ＹＳＹＭＨ（配列番号１１）；ＬＡＳＮＬＥＳ （配列番号１２）及びＱＨＩＲＥＬＰＲＴ（配列番号１３）中の二種類、最も好ましくは三種類のＣＤＲ配列を有する。最も好ましくは、ヒト化抗体は、配列番号３に示す軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する。

本願はさらに、ＡＧＲ２と結合する親和性成熟抗体に注目する。親抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であり、例えばそれぞれ軽鎖及び／または重鎖可変領域配列、配列番号３及び４を含む抗体である（即ちバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）５）。親和性成熟抗体は好ましくは、マウス抗ＡＧＲ２モノクローナル抗体１８Ａ４またはその変異体５より優れる親和性でＡＧＲ２と結合する（例えばＡＧＲ２外部ドメイン（ＥＣＤ）を用いたＥＬＩＳＡの評価によれば、親和性は例えば約２倍または約４倍〜約１００倍または約１０００倍に向上した）。

本発明はＡＧＲ２と結合するヒト化抗体またはその親和力成熟抗体の多種な形式を含む。例えば、ヒト化抗体または親和力成熟抗体は抗体フラグメントとすることができ、例えばＦａｂであり、任意に一種または複数種類の細胞毒性薬剤と結合し、免疫結合物を生成する。また、ヒト化抗体または親和力成熟抗体は完全抗体、例えば完全ＩｇＧ１抗体とすることができる。

ＩＩＩ．ベクター、宿主細胞及び組み換え方法
本発明はさらに、ヒト化抗ＡＧＲ２抗体をコードする分離した核酸、上記核酸を含むベクター、及び宿主細胞及び、上記抗体を生産するための組み換え技術を提供する。

組み換えにより抗体を生産するために、それをコードする核酸を分離し、さらに複製可能ベクターに挿入する。さらにクローン（ＤＮＡ増幅）または発現させる。これらは常規的なプロセスによりモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に分離、且つ配列決定できる（例えば抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用する）。このようにすることでたくさんのベクターを得ることができる。ベクターエレメントは通常は、シグナル配列、複製起点、一種または複数種類の、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終了配列から選ばれる一種または複数種類を含むが、限定されない。

（ｉ）シグナル配列部材
直接組み替えすることで本発明の抗ＡＧＲ２抗体を生産できるのみでなく、それを異種ポリペプチドの融合ポリペプチドとすることもでき、上記異種ポリペプチドは好ましくは成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ−末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列またはその他のポリペプチドである。好ましくは、宿主細胞に識別され、且つ加工される（即ち、シグナルペプチド酵素によって切断される）異種シグナル配列である。例えば、酵母に分泌させるために、例えば酵母添加酵素前駆配列、α―因子前駆配列を用いる。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列及びウイルス分泌前駆配列、例えば単純疱疹ｇＤシグナルを利用することができる。

このタイプの前駆領域のＤＮＡは、抗ＡＧＲ２抗体をコードするＤＮＡの読み取りフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）に接続する。

（ｉｉ）複製起点部材
発現及びクローンの用いる二種類のベクターはいずれも、ベクターを一種または複数種類の選択された宿主細胞において複製させる核酸配列を含む。一般的に、クローンベクターにおいて、このような配列は、ベクターを宿主染色体ＤＮＡに依存せずに複製できる配列であり、複製起点または自主複製配列を含む。多種類の細菌、酵母及びウイルスの本タイプの配列が知られている。

（ｉｉｉ）選択遺伝子部材
発現及びクローンベクターは選択遺伝子を含むことができ、選択マーカーとも呼ばれる。典型的な選択遺伝子は以下のタンパク質をコードする。（ａ）抗生剤またはその他の毒素に対する抗性を賦与する。例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対するもの。（ｂ）栄養的欠陥を補足する、または（ｃ）複合培地によって得られない重要な栄養物を提供する、例えばバシラセエＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。

（ｉｖ）プロモーター部材
発現及びクローンのベクターは、通常宿主生物体に識別されるプロモーターを有し、且つ抗ＡＧＲ２抗体をコードする核酸と連結可能に操作できる。

（ｖ）エンハンサーエレメント部材
通常はベクター中にエンハンサー配列を挿入することで、高等真核細胞の本発明の抗ＡＧＲ２抗体をコードするＤＮＡの転写を向上させる。哺乳動物遺伝子に由来する多くのエンハンサー配列が知られている。しかし、通常は真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用する。

（ｖｉ）転写終止部材
真核宿主細胞の発現ベクターはさらに転写を終止させ、及びｍＲＮＡを安定化させるのに必須な配列を含む。このような配列は通常、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域の５‘−末端及び時には３’−末端で得られるものである。これらのドメインは、抗ＡＧＲ２抗体のｍＲＮＡｗｐコードする非翻訳部分中に、ポリアデノシン化フラグメントに転写されるヌクレオチド領域を有する。

（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び転化
クローンまたは発現に適する本文記載のＤＮＡの宿主細胞は、上記文中に記載した原核生物、酵母または高等真核細胞である。この目的に適する原核生物は、真性細菌を含み、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物体である。上記原核生物以外に、真核微生物、例えば糸状菌または酵母も、抗ＡＧＲ２抗体をコードするベクターの適切なクローンまたは発現宿主である。

グリコシル化抗ＡＧＲ２抗体の発現に適した宿主細胞は多細胞生物体から誘導されるものである。無脊髄動物細胞の実例は、植物及び昆虫細胞を含む。例えばヨトウガＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａなどの宿主である。

しかし、脊髄動物細胞は人々が最も興味のある、且つ培養（組織培養）中の脊髄動物細胞の繁殖は常規的なプロセスである。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例はＳＶ４０により転化されたサル腎臓ＣＶ１系、ヒト胚胎腎臓系、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＤＧ４４細胞、ＤＰ１２細胞系等である。

抗ＡＧＲ２抗体を生産するために、上記文中に記載の発現またはクローンベクターにより宿主細胞を転化し、さらにはプロモーターを誘導し、コンバーターまたは期待配列を増幅させる遺伝子を選択し、適切な改変を加えた常規栄養培地中において培養を行う。

（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養及び抗ＡＧＲ２抗体の精製
複数種類の購入可能な培地、例えばＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ氏改良のＥａｇｌｅ氏培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）中において、本発明の抗ＡＧＲ２抗体の生産に用いる宿主細胞を培養する。さらに、必要によってこれらの培地中にホルモン及び／またはその他の増殖因子、塩、バッファー、抗生剤、痕跡元素及びブドウ糖などの当業者が知る必須補充物である。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは選択する宿主細胞によって適切に調整でき、これは当業者にとっては容易である。

組み換え技術を使用する際、細胞内またはペリプラズム空間中に抗体を生成し、または直接培地中に分泌する。例えば、細胞内に抗体を生成する場合、第一ステップとして、遠心または超ろ過により宿主細胞または***フラグメントの微粒子砕片を除去する。抗体を培地中に分泌する場合、通常はまずこのタイプの発現系の上澄み液を商品化のタンパク質濃縮ろ過器で濃縮する。いかなる上記ステップにおいて、プロテアーゼ抑制剤によりタンパク質加水分解を抑制し、さらに抗生剤を含むことで外部由来の汚染物の増殖を防止できる。

例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和クロマトグラフィー（好ましい精製技術は親和クロマトグラフィー）により、細胞によって製造された抗体組成物を精製する。タンパク質Ａを親和性リガントとする適宜性は、抗体中に存在するいかなる免疫グロブリンＦｃドメインの種類及び同種型である。回収待ちの抗体によっては、その他のタンパク質精製技術、例えば逆相ＨＰＬＣ、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿などである。

ＩＶ．薬用製剤
本発明が使用する抗体の治療用製剤を製造する。即ち、必要とする精製程度の抗体と任意の製薬学上許容し得る担体、賦形剤または安定剤と混合して、凍結乾燥製剤または水溶液の形で保存する。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、使用される製剤量及び濃度は、需要者にとって無毒であり、これは当業者にとっては自明である。

本文中の製剤は、さらに具体的な適応症状を治療するための、必要となる一種の活性化合物を含み、好ましくは活性相補であり且つ互いに不利な影響がない化合物である。上記活性化合物は例えば、化学療法薬、細胞毒性薬剤及び／または抗血管発生剤などである。

Ｖ．製品及びキット
本発明はもう一つの実施形態において、本発明の上記疾病を治療に用いる抗体またはその医薬組成物を有する製品及びキットを提供する。該製品は、容器、及び容器上、または単独に上記製品包装中に置かれるラベルまたは添付文書を含む。適切な容器は例えばビン、チューブ、注射器などを含む。上記容器は各種材質、例えばガラスまたはプラスチックにより形成される。該容器は有効的に本発明の上記疾病を治療できる医薬組成物を含む。上記ラベルまたは添付文書は、該組成物が上記疾患の治療に用いられるものであると示し、上記疾病は例えばがんは、例えば乳がん（例えば転移性乳がん）、前立腺がん、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、結腸直腸がんなどである。

また、上記製品は以下を含むことができる。（ａ）組成物が入っている第一容器、上記組成物は本文のモノクローナル抗体を含み、好ましくはヒト化のモノクローナル抗体である。及び（ｂ）組成物が入っている第二容器、上記組成物はヒト化抗体以外の治療製剤を含む。本発明の該実施形態の製品はさらに、上記第一及び第二組成物を連合してがんのような症状の治療に用いる添付文書包装を含む。または／また、上記製品はさらに第二（または第三の）容器を含むことができ、中には製薬学上許容し得るバッファーが入っており、例えば注射用抑菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩バッファー食塩水である。さらに、商業上、及び使用者の観点から見て必要となるその他の物質を含む。

ＶＩ． 抗ＡＧＲ２モノクローナル抗体を使用する治療
本発明が注目する抗ＡＧＲ２抗体は腫瘍の治療に用いることができ、例えば乳がん、すい臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、非小細胞性肺がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頚部がん、黒色腫、卵巣がん、及び多発性骨髄腫などである。

その他の治療プランと抗ＡＧＲ２抗体とを複合的に使用できる。複合投与はそれぞれの分かれている製剤をそれぞれ使用し、または単一薬品製剤の複合投与であり、任意の順番で投与でき、そのうち、好ましくは一定の時間中に２種類（または複数種類）の活性剤が同時にその生物学活性を発揮する。

一つの好ましい実施形態において、２種類の異なる抗ＡＧＲ２抗体で患者を治療する。もう一つの実施形態において、一種類または複数種類の抗ＡＧＲ２抗体の投与と、もう一種類の腫瘍関連の抗原に対する抗体と複合的に使用する。もう一つの実施形態において、ＡＧＲ２抗体は、血管発生作用を抑制する抗血管発生剤と複合的に使用する。

一つの実施形態において、本発明の治療は複合的に抗ＡＧＲ２抗体（一種または複数種類）と、一種または複数種類の哺乳動物の免疫機能調整剤をと使用し、例えばサイトカトン、及び化学療法剤または増殖抑制剤であり、異なる化学療法剤の混合物を共同で投与することを含む。好ましい化学治療薬は、タキサン類（タクソール及びドセタキセル）及び／またアントラセン類抗生剤である。製造メーカの説明、または当業者が経験によって決定した、この類の化学療法薬を使用する製剤及び投与プランに従う。

上記本発明の抗体と複合的に施用する薬品の適切製剤量は、常規治療において使用する製剤量であり、本発明の抗ＡＦＲ２抗体との複合的な使用により、その使用する製剤量を低減させることもできる。

本発明の抗体の適切な使用量は、疾病のタイプ及びその程度によって約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇで適切に調整でき、例えば一回または複数回分かれた形で投与でき、さらには連続的に輸液できる。典型的な日使用薬剤量は約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、これは治療の目的、以前の療法、患者の臨床病史及び抗体に対する反応、及び主治医の判断によって決める。

ＶＩＩ． 抗ＡＧＲ２モノクローナル抗体の検出における使用
本発明の抗体（例えばヒト化抗ＡＧＲ２抗体）は非治療性使用を有する。例えば、抗ＡＧＲ２モノクローナル抗体は、ＡＧＲ２タンパク質の、具体的な細胞、組織または血清中における発現の検出に使用できる。

診断上の使用について言えば、一般的には、検出部分を含み、例えば放射性同位体、蛍光マーカー、酵素―基質マーカーで抗体をマークする。当業者はこの目的を実現するための各種技術を知っている。例えば、抗体とビオチンを結合させ、または、抗体と小分子半抗原（例えばジゴキシン）と結合させる。

本発明の抗体は任意の既知の検出方法に用いることができ、例えば競合性結合測定、直接及び間接的なサンドイッチ式測定、及び免疫沈降測定法である。

便利のため、キット中に本発明の抗体を提供でき、即ち予定量の試薬と、診断試験に用いる説明書の包装の組み合わせである。酵素で抗体をマークした場合、キットは酵素が必要とする基質及びその他の補助因子（例えば検出できる発色団または蛍光団の基質前駆体）を含む。これ以外に、その他の添加剤を含むことができ、例えば安定剤、バッファー（例えばブロッキングバッファーまたは溶解バッファー）等を含む。各種製剤の相対量は広範に改変でき、実質性の最適化試験感度の製剤の溶液中における濃度を提供できる。具体的には、これらの製剤を乾燥粉末として提供し、通常は凍結乾燥したものであり、これらは溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液の賦形剤を含む。
＜実施例＞

＜モノクローナル抗体１８Ａ４の製作と同定＞
Ａ．ハイブリドーマ細胞培養液の収集
ＲＰＭＩ−１６４０培養液（１０％ウシ血清、１％抗生剤を含む）で連続的に細胞を３日間培養し、細胞量を８０％に維持させ、且つ細胞の指数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）にあるようにし、ＰＢＳで洗浄し、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培養液に変更し、４８時間培養してから上澄み液を収集する。

Ｂ．モノクローナル抗体の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ免疫アフィニテイ・クロマトグラフィーによって、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ａｇａｒｏｓｅ（２０３９９）説明書に従って抗体を精製する。簡潔に言えばステップは以下である。４℃冷蔵庫からカラム材料及びすべての試薬を取り出し、室温に放置し、温度が室温に達するようにする。カラム材料をやさしく混合し、２ｍｌの５０％カラム材料懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）をカラムに入れ、気泡がないように注意する。５ｍｌの結合バッファーでカラムにバランスを取らせる。サンプルは０．４５μｍのろ膜ろ過に方式により不純物を除去し、それから結合バッファーを使用して、サンプルは比１：９で希釈したサンプルであり、サンプルの塩濃度及びｐＨ値を結合の要求を満たすようにする。希釈したサンプルをカラムに注入し、サンプル注入量は最大結合能力（５ ｍｇ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ／ｍｌカラム材料）の８０％以下であれば最大結合に達することができ、でなければ流出液中には抗体が含まれ、５ｍｌ溶出液で必要とする抗体を溶出させ、１ｍｌ／チューブで収集し、収集前にチューブ中に１００μｌ １Ｍ燐酸またはＴｒｉｓ中和液を添加し、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０法で各チューブ中のタンパク質濃度を測定する。タンパク質濃度が高いサンプルを混合し、ＰＢＳ（燐酸塩バッファー）を用いて透析を行って溶液系を変化させ、１２ｍｌ溶出バッファーでカラムを再生させる。

＜モノクローナル抗体の力価測定＞
ＥＬＩＳＡにより抗体の力価を測定するステップは以下である。被覆酵素プレート１００μｌ／孔（抗原濃度３ｕｇ／ｍｌ、免疫原が融合タンパク質であれば、マーカータンパク質も被覆する必要がある）、４℃で終夜または３７℃で２時間インキュベーションする。液体を除去し、プレートを倒置、乾燥させる。ブロッキング。２００μｌ／ウェルでブロッキング液を添加し、４℃で終夜または３７℃で２時間処理し、液体を除去し、プレートを倒置、乾燥させる。測定対象サンプル１００μｌ／ウェルを添加し（希釈倍率は１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６。陽性、陰性対照は１０００倍希釈する。１００ μｌ／ウェル）、３７℃で０．５時間インキュベーションするまたは４℃で終夜放置する。液体を除去し、プレートを倒置、乾燥させる。洗浄バッファーで３×３ｍｉｎ洗浄し、乾燥させる。二次抗体の添加。二次抗体用ブロッキングバッファーで１：１００００に希釈する。１００ μｌ／ウェル、３７ ℃ ２０ ｍｉｎ、洗浄バッファーで３×３ｍｉｎ洗浄し、乾燥させる。発色。基質１００μｌ／ウェルを添加し、充分に暗くなるまで発色させる。停止。停止液１００μｌを添加し、それから該プレートの４５０ｎｍにおける吸光度を読み取る。該プレートに対して写真撮影して記録し、図１に示す通りである。該抗体の力価は１０^６以上であることが示されている。

＜モノクローナル抗体の特異性＞
Ａ．ウェスタンブロットアッセイ
細胞溶解前に１×ＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍｌＰＢＳを添加し、細胞をこすり取る。１０００ｒｐｍにて５ｍｉｎ遠心し、上澄みを除去する。細胞の５倍体積のＮＰ４０ライセート（プロテアーゼ添加）で均一に混合し、２０ｍｉｎ溶解させる。腫瘍組織を５倍体積のＮＰ４０ライセート（プロテアーゼ添加）で均一に混合し、２０ｍｉｎ溶解させる。１５０００ｒｐｍ、４℃にて１ｍｉｎ遠心し、上澄み液を収集し、タンパク質を定量する（以上の溶解操作はいずれもアイス上行う）。５×ＰＡＧＥタンパク質添加液（ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（β−メルカプトエタノールを添加する）沈殿を懸濁し、９５℃で５ｍｉｎ加熱する。１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥアガロースゲルでタンパク質分離、定圧８０Ｖにて、２時間電気泳動し、タンパク質を分離させる。タンパク質をニトロセルロース膜に電気移動させ、４００ｍＡ、４５ｍｉｎにて５％ウシ血清タンパク質で室温にて１時間ブロッキングする。一次抗体を室温にて２時間ハイブリダイズさせ、１×ＰＢＳＴで３×１０ｍｉｎ洗浄する。一次抗体の希釈倍数は以下である。ウサギ源ＡＧＲ２抗体 １：１００００、β−ａｃｔｉｎ １：２０００。二次抗体は室温において１時間ハイブリダイズさせ、１×ＰＢＳＴで３×１０ｍｉｎ洗浄する。露光現像し、結果をスキャンする。

結果は以下を示す。モノクローナル抗体はＴ４７Ｄ、ＡＧＲ２−ｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞中のＡＧＲ２の発現がみれれるが、ｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞にはＡＧＲ２の発現が検出されない。図２を参照すること。

Ｂ．免疫沈降
サンプルの準備：０．２ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎＧ（５０％ ｓｌｕｒｒｙ ＰｒｏｔｅｉｎＧ Ａｇａｒｏｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｉｅｒｃｅ）を、１０ｍｌ ＰＢＳが入っている遠心チューブ中に添加し、均一に混合させ、ＲＴ、３０ｍｉｎ。１５００ｒｐｍにて２ ｍｉｎ遠心し、上澄み液１０ｍｌを除去する。抗体（図３に示す抗体、同タイプＩｇＧを対照抗体とする）培地１０ｍｌを添加し、均一に混合する。振動させ、ＲＴ＞２ｈｒまたは４℃終夜放置する。遠心により上澄み液を除去する。１０ｍｌＰＢＳを使用して２回洗浄する。抗体と結合するタンパク質Ｇビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｂｅａｄｓ）を１．５ ｍｌ遠心チューブ中に移動させる。ＰＢＳを添加して０．２ｍｌにして、 ４℃で使用に供する。Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７細胞上澄み（２４時間）２０ｍｌ収集し、二つのチューブに分け、それぞれのチューブは１０ｍｌである。チューブ１本目は本発明の抗体と結合しているタンパク質Ｇで免疫沈降し、ＡＧＲ２を除去し、チューブ２本目は対照抗体と結合しているタンパク質Ｇで免疫沈降し、ＲＴ ＞２ｈｒまたは４℃で終夜放置し、遠心して、上澄み液を収集してもう一度免疫沈降を繰り返す。ＰＢＳ １ｍｌで４回洗浄する。５×ＰＡＧＥタンパク質（β−メルカプトエタノールを添加する）沈殿を懸濁し、９５℃で５ｍｉｎ加熱する。ウェスタンプロットで結果を測定する。

結果は以下を示す。モノクローナル抗体により、免疫沈降法において、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７上澄み中のＡＧＲ２を検出できる。図３に示す通りである。

Ｃ．免疫蛍光測定
円形カバーガラスを２４ウェルプレート中に添加し、ＰＢＳで一回洗浄する。相応の培地で浸漬し、培地を乾燥させる。Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７細胞膵臓消化酵素を２４ウェルプレート中に添加する。細胞が壁に貼り付いた後、栄養液を除去し、ＰＢＳで一回洗浄する。４％ホルムアルデヒドで室温にて１０〜２０分間固定し、ＰＢＳで一回洗浄する。０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３％ヒツジ血清で室温にて４０分間放置する。一次抗体を添加し、４℃で終夜放置し、ＰＢＳで３×５ｍｉｎ洗浄する。蛍光二次抗体を添加し、室温にて、３０ｍｉｎ放置し、ＰＢＳで３×５ｍｉｎ洗浄する。ＤＡＰＩで２〜５ｍｉｎ染色し、ＰＢＳで２×５ｍｉｎ洗浄する。マウントしてから蛍光顕微鏡で観察する。
結果は以下を示す。モノクローナル抗体により、乳がん細胞Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７細胞内のエピトープＡＧＲ２の発現が検出され、図４に示す通りである。

＜ヒト化１８Ａ４抗体の製造＞
まずマウスモノクローナル抗体１８Ａ４の可変領域を、マウス／ヒトキメラ抗体を生成し得るベクター中にクローンする。ＳＴＲＡＧＥＮＥ^ＴＭ ＲＮＡ抽出キットを使用し、製造者の案に従って、ハイブリドーマ細胞中から全ＲＮＡを分離する。ＲＴ−ＰＣＲによって可変領域を増幅させ、ゲルで精製し、前記のようにｐＵＣ１１９を挿入し、ヒトκ定常領域及びヒトＣＨ１ドメインを含むプラスミドの誘導体を得る。得られたプラスミドを大腸菌株ＤＨ５α中に形質転換して得られたプラスミドを抽出し、配列決定を行い、マウス１８Ａ４モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖の可変領域の配列を決定する（配列番号１及び配列番号２）。

得られた１８Ａ４抗体配列について比較分析を行い、相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）が最も高いヒト抗体生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ１−４６＊０３及びＩＧＫＶ３−２０＊０２をテンプレートとして、１８Ａ４三次元構造に対するシミュレーション分析及び、ＩＧＨＶ１−４６＊０３及びＩＧＫＶ３−２０＊０２をテンプレートとする市販医薬品配列に対する分析に基づき、理論抗体配列１８Ａ４Ｈｕ１の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を得て、配列の比較結果は図５及び図６に示す通りである。理論配列に基づいてＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲにより抗体Ｖ領域を合成し、且つＯｖｅｒｌａｐＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲにより、合成されたヒト化抗体重鎖可変領域と、ヒト化抗体軽鎖可変領域を、ｐＧｍａｘに基づくヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒト軽鎖Ｋａｐｐａ定常領域の抗体発現プラスミドに挿入し、完全抗体発現プラスミドの構造は図７に示す通りである（配列は配列番号７に示すものである）。

構築に成功した１８Ａ４Ｈｕ１抗体発現プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、真核発現させた。具体的には、２ｍｇ／ｍｌのＰＥＩと、発現プラスミドを３：１（ｗ：ｗ）の比例で混合した後に、トランスフェクト液として２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、６時間以後に１０％血清を含むＤＭＥＭ培地に変更して１２時間培養し、さらに無血清培地に変更し、４日間培養し、上澄み液を収集し、これにより抗体を得た。

得られた抗体上澄みに対して分離及び精製を行った。具体的には、タンパク質Ａにより、上澄み液に対して親和クロマトグラフィーを行い、分離した抗体を含む溶出液に対して透析を行い、これによって純抗体１８Ａ４Ｈｕ１を得て、Ａ２８０吸光法またはクーマシーブリリアントブルー法によって精製抗体の濃度を測定した。精製された抗体に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析を行い、さらにその純度について測定した（図８参照）。

生成されたヒト化抗体１８Ａ４Ｈｕ１に対してアフィニティアッセイを行い、さらにマウス１８Ａ４抗体と比較を行った。３ｎｇ／ｕｌ濃度の抗原ＡＧＲ２でプレート被覆を行い（９６ウェルＥＬＩＳＡプレート）、それぞれのウェルは１００μｌであり、ブロッキング液でブロッキングする。０．１ｎｇ／ｕｌ濃度の抗体と、様々な濃度の抗原を等体積で混合し、３７℃で終夜インキュベーションし、抗原濃度は１０００ｎＭから比例に従って希釈される。１００ｕｌインキュベーション後の混合液をそれぞれ異なるＥＬＩＳＡプレートウェル中に添加し、３７℃で１時間インキュベーションし、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄してから、抗ヒトまたは抗マウスのＨＰＲ標識の二次抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベーションし、発色液Ａ及びＢそれぞれ８０ｕｌを添加し、３７℃で３０ｍｉｎ発色させ、５０ｕｌ終止液を添加して終止させ、ＯＤ４５０において吸光度を測定し、アフィニティ曲線を製作し、抗体のアフィニティを計算する。マウス抗体１８Ａ４及びヒト化抗体１８Ａ４Ｈｕ１のアフィニティ曲線は図９に示す通りである。

ヒト化抗体１８Ａ４Ｈｕに対しＴ細胞抗原エピトープ分析を行うことで、個別アミノ酸に対してヒト化置換を行い、多種のヒト化変異体を生成する（変異体情報は図１０に示す通りである）、それからヒト化変異体の抗原結合能力について比較を行い、これにより抗原エピトープがより少なく、且つ親和力がより高いヒト化抗原を選出し、例えばＡｇｔｕｚｕｍａｂと称される抗体で、図１１に示す通りである。

生成したヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂに対して特性の鑑定を行う。抗ヒト二次抗体を用いてＡｇｔｕｚｕｍａｂ種特性について分析を行い、Ａｇｔｕｚｕｍａｂがヒト化抗体であることを確認した（図１２）。ウェスタンプロットアッセイにより、Ａｇｔｕｚｕｍａｂの抗原特異性を分析し、それが精製されたＡＧＲ２−ＭＢＰタンパク質と特異的に結合できることが示された（図１３）。それとＡＧＲ２を発現する細胞ＭＣＦ７ライセート中のＡＧＲ２と結合することが確認された（図１４に示す通り）、天然状態におけるＡＧＲ２と結合でき、且つ免疫沈降（ＩＰ）法によってＭＣＦ７上澄み中の天然分泌型ＡＧＲ２を検出できることが確認された（図１５に示す通り）。

ＡＧＲ２に対し抗原エピトープ分析を行い、潜在の複数の抗原エピトープアミノ酸部位に対してそれぞれ変異させる（変異情報は図１６に示す通りである）、ＡＧＲ２変異体を抗原として、１８Ａ４とＡｇｔｕｚｕｍａｂを一次抗体として、ウェスタンプロットにより抗原エピトープ分析を行い、図１７は１８４Ａ及びヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂが一致する抗原エピトープを有することが示されている。

競合性ＥＬＩＳＡ法により測定、及びＡｇｔｕｚｕｍａｂの親和力状況を比較することにより、図９に示すＡｇｔｕｚｕｍａｂの親和力はマウス１８Ａ４の親和力と近く、１８Ａ４Ｈｕ１より若干高く、より高い親和力とより低い潜在抗原性を有する。

腫瘍転移実験により、ヒト化抗体Ａｇｔｕｚｕｍａｂは１８Ａ４と同じく、ＨｅｐＧ２の転移を抑制できる生物学機能を有する。図１８に示す通りである。

＜インビトロで腫瘍細胞の増殖を抑制する実験＞
ＭＴＴ法の測定方法は以下である。ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ細胞株を対応の細胞培養液中で増殖培養し、指数増殖期に達するまで培養する（少なくとも二代繁殖し、それぞれの代の増殖は８０％集合に達した時点まで）、トリプシン−ＥＤＴＡ液で消化し、細胞の最終濃度が５×１０^３−５×１０^４／ｍｌとなるように調整する。９６ウェルプレート中に接種し、各ウェル２００μｌである。各ウェル中の細胞が均一に分布しているかを調べる。細胞が壁に貼り付いた後、各種細胞にそれぞれ、抗体を含まない、２０μｇ／ｍｌの本発明の抗体、及び２０μｇ／ｍｌの対照抗体を含むＩｇＧ培地を添加する。４８時間以後において、各ウェル中に濃度５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液２０μｌを添加する。継続的に４時間インキュベーションしてから、９６ウェルプレート中の各ウェル中の元の液体を除去し、それぞれのウェル中にＤＭＳＯ １５０μｌを添加し、ｆｏｒｍａｚａｎ沈殿を溶解させる。室温において０．５ｈ放置した後、脱色振動装置上で１０分間振動させ、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）で４９０ｎｍ波長において、各ウェルの吸光度を測定する。

結果は以下を示す。モノクローナル抗体は、インビトロで、Ｔ４７Ｄ細胞及びＭＣＦ−７細胞の増殖を抑制している。図１９に示すように、本発明の抗体及び対照抗体ＩｇＧの濃度はいずれも２０μｇ／ｍｌである。

＜生体外にて腫瘍の細胞移動を抑制する実験＞
スクラッチテストのステップは以下である。乳がん細胞Ｔ４７Ｄ、卵巣がん細胞ＳＫＯＶ３、骨肉腫細胞Ｕ２ＯＳ、マウス繊維芽細胞３Ｔ３を６ウェルプレート中に添加し（細胞７０％集合）、それがいっぱいになってから細いセルスクレーバー（ｃｅｌｌ ｓｃｒａｐｅｒ）で中間にある細胞を除去し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、削られた細胞を洗浄により除去する。写真を撮り、番号を付する。２０μｇ／ｍｌの本発明抗体または２０μｇ／ｍｌ対照抗体を有するＩｇＧ培地を添加する。時間を計測し、それぞれ２４、４８時間で写真撮影を行う（同じ記号があるように注意、同じエリアを撮影すること）。

結果は以下である。図２０に示すように、モノクローナル抗体は、生生体外において、Ｔ４７Ｄ、ＳＫＯＶ３、３Ｔ３細胞の移動を抑制できる。本発明の抗体及び対照抗体のＩｇＧ濃度はいずれも２０μｇ／ｍｌである。

＜インビトロにて腫瘍細胞の転移を抑制する実験＞
腫瘍侵襲チャンバー腫瘍侵襲チャンバー実験は６つのグループに分けられる。１：対照、２：ＭＢＰ（２５ｕｇ／ｍｌ）、３：ＡＧＲ２−ＭＢＰ融合タンパク質（２５ｕｇ／ｍｌ）、４：ＡＧＲ２−ＭＢＰ（２５ｕｇ／ｍｌ）＋ＩｇＧ（２５ｕｇ／ｍｌ）、５：ＡＧＲ２−ＭＢＰ（２５ｕｇ／ｍｌ）＋１８Ａ４（２５ｕｇ／ｍｌ）、６：１８Ａ４（２５ｕｇ／ｍｌ）。

腫瘍侵襲チャンバー内の培地はいずれもＲＰＭＩ−１６４０培地＋１％ＦＢＳである。

実験中において、まず外ウェル培地、トリプシンで消化したＨｅｐＧ２、ＳＫＯＶ３細胞を添加し、計数し、遠心してから上澄みを除去する。細胞濃度を、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、５×１０^５個／ｍｌとなるように調整する。それぞれのウェル中に２００μｌ添加し、細胞インキュベーター中において培養し（５％ＣＯ_２，
３７℃）、時間の計測を開始する。それぞれ２４時間後及び４８時間後にチャンバーを取り出し、内室の細胞を削り取り、チャンバーをメタノール溶液中において、室温にて１５分間固定する。クリスタルバイオレット染色液で５分間染色させる。エタノールで１５分間脱色させ、ＰＢＳ中に添加し、写真撮影し、膜を貫通した細胞数をカウントする。

結果は以下である。本発明の抗体は、インビトロにおいれ、肝臓がん細胞ＨｅｐＧ２、ＳＫＯＶ３の転位を抑制できる。図２１に示す通りである。

＜生生体外において腫瘍細胞周期を抑制する実験＞
フローサイトメトリーで細胞周期を測定するステップは以下である。Ｔ４７Ｄ細胞株を、対応の細胞培養液を増殖培養し、指数増殖期になるまで培養する（少なくとも２代繁殖し、それぞれは８０％集合まで増殖）、トリプシン―ＥＤＴＡ液で消化し、６ウェルプレート中に添加する。測定待ち細胞が壁に貼りついた後に、２０μｇ／ｍｌの本発明抗体を含む、または２０μｇ／ｍｌ対照抗体ＩｇＧを含む培地に変更する。それぞれ抗体を添加した後の０、６、１２、２４、４８時間後に、１×Ｔｒｙｐｓｉｎで細胞を消化し、１０ｍｌ培地で細胞をそれぞれ単一の細胞に吹き飛び分散させた後、さらに１５ｍｌ遠心チューブ中に収集する。２００×ｇで５ｍｉｎ遠心して細胞を収集する。上澄み液を廃棄する。５ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄する。上澄み液を廃棄した後、１ｍｌ予め冷やされた１×ＰＢＳで徹底的に細胞を懸濁し、それを９ｍｌ予め冷やされた７０％エタノール中に滴下し、均一に混合し、氷上において１時間インキュベーションする。２００×ｇで５ ｍｉｎ遠心して細胞を収集し、上澄み液を廃棄し、１５ｍｌの１×ＰＢＳを添加して氷上において細胞を３〜４時間洗浄する。２００×ｇで遠心５ｍｉｎにより細胞を収集し、上澄み液を除去し、５００μｌＰＩ染色バッファー液を添加し、１．５ｍｌ遠心チューブ中に移す。チューブをアルミホイルで包み、３７℃で３０ｍｉｎインキュベーションする。フローサイトメトリーに供し細胞周期を測定する。

結果は以下を示す。モノクローナル抗体は、細胞周期のＧ１／Ｇ０期を増大し、Ｓ及びＧ２／Ｍ期を減少することで、生生体外において、乳がん細胞Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７の増殖を抑制できる（図２２）。

＜モノクローナル抗体の可変領域の配列決定＞
モノクローナル抗体の抗原結合部位の遺伝子配列を配列決定した。方法は以下である。ハイブリドーマ細胞中からＲＮＡを抽出し、Ｍａｒｋｓらの方法によってＰＣＲ増幅によりＶＬとＶＨを増幅させ、遺伝子配列（Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８９−５９７，１９９１）を配列決定する。実験で使用したプライマーは、軽鎖５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ−３’、重鎖の５’−ＣＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡ−３’であり、両者ともに、リバース配列決定（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）である。

＜モノクローナル抗体の対応抗原エピトープの配列決定＞
モノクローナル抗体の対応抗原ＡＧＲ２の抗原エピトープのアミノ酸配列（図２３）を配列決定した。方法は以下である。ＭＣＦ７細胞中からＲＮＡを抽出し、ＰＣＲ方法によってＡＧＲ２のｍＲＮＡを得る、逆転写でｃＤＮＡを得る。ｐｃＤＮＡ３−ＡＧＲ２−Ｈｉｓ真核発現プラスミドを構築する。それからＡＧＲ２に対して欠損変異させ、変異に使用した上流プライマーは５’−ＧＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＡＴＡＴＡＧＡ−３’、下流プライマーは５’−ＧＣＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴ−３’である。

該変異は抗原エピトープＰＬＭＩＩＨＨＬＤＥＣＰＨＳＱＡＬＫＫＶＦＡを欠損させる。ウェスタンプロットにより、遮断性モノクローナル抗体と変異した後のＡＧＲ２タンパク質結合と結合しないことを検出し、これにより該抗体と結合するＡＧＲ２抗原エピトープのアミノ酸配列を配列決定する。それからＡＧＲ２に対して点変異を行い、変異において使用する上流プライマー５’−ＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＧＣ−３’、下流プライマーは５’−ＣＡＣＴＴＧＧＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡ−３’であり、そのうちＰＤＩ活性部位「ＣＸＸＳ」の「Ｃ」は「Ｓ」に変異し、モノクローナル抗体のこの変異タンパク質に対する結合は明らかに弱くなっている。該モノクローナル抗体が特異性結合する抗原エピトープは「ＰＬＭＩＩＨＨＬＤＥＣＰＨＳＱＡＬＫＫＶＦＡ」であると確定し、且つＰＤＩ活性を抑制できる可能性がある。図２４、２５を参照すること。

＜抗体の動物においての生体内実験＞
６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（１８０〜２２０ｇ）に、指数増殖期にあるＳＫＯＶ３細胞をＰＢＳ中に懸濁させ、マウス皮下に注射する（２×１０^６／匹）。細胞を注射後のマウスをランダムに２つのグループに分け（各８匹）、ＰＢＳグループと１８Ａ４グループとする。細胞注射４日間後から腹腔投与し、試薬投与量は以下である。１８Ａ４は８ｍｇ／ｋｇ［１，２］、等体積のＰＢＳを対照とする。毎週２回、試薬を注射すると同時に腫瘍サイズを測定する。薬品で１４週間処理した後、実験を終了させる。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ及びＡｖａｓｔｉｎの文献［３〜５］の公式：（Ｌ×Ｗ２）／２で腫瘍体積を計算する。

結果は以下を示している。モノクローナル抗体は、生体内において、腫瘍の増殖を抑制できる。図２６に示す通りである。

参考文献は［先行技術文献］に転記した。

Claims (18)

1. ＡＧＲ２タンパク質と特異的に結合するヒト化抗体であって、該抗体はモノクローナル抗体１８Ａ４によって結合されるＡＧＲ２タンパク質エピトープと同じＡＧＲ２タンパク質エピトープと結合することができ、
   該抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は、６５位、６７位、６８位及び７０位における４つの置換により変異した配列番号４で示されるものであり；
   該抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３に示されるものであり；
   前記置換は、
   ６５位におけるリジン（Ｋ）がグルタミン（Ｑ）に改変され、
   ６７位におけるリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に改変され、
   ６８位におけるアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）に改変され、及び
   ７０位におけるロイシン（Ｌ）がメチオニン（Ｍ）に改変され；ならびに、
   該位置の番号がＫａｂａｔの番号付けシステムに対応する
   ことを特徴とする、前記抗体。
2. 前記エピトープが、ＡＧＲ２タンパク質のジスルフィド結合イソメラーゼの活性ドメインにあることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
3. 前記抗体が結合するエピトープが、配列番号１５に示されるものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
4. 配列番号８に示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、
   配列番号９に示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、
   配列番号１０に示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、
   配列番号１１に示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、
   配列番号１２に示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、
   配列番号１３に示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
   からなる群より選択される少なくとも一つのＣＤＲ配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
5. ＤＹＮＭＤ（配列番号８）に示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、
   ＤＩＮＰＮＹＤＴＴＳＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号９）に示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、
   ＳＭＭＧＹＧＳＰＭＤＹ（配列番号１０）に示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、
   ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨ（配列番号１１）に示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、
   ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１２）に示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、
   ＱＨＩＲＥＬＰＲＴ（配列番号１３）に示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
   を含む、請求項４に記載の抗体。
6. ヒト化完全ＩｇＧ１抗体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
7. 前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、線形抗体及び単鎖抗体からなる群より好ましくは選択される機能的抗体フラグメントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体と、医薬上許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
9. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
10. 請求項９に記載の核酸を含む、ベクター。
11. 請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
12. 前記核酸を発現させ前記抗体を生成させるに十分な条件下の培養において請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒト化抗体を製造する方法。
13. 前記宿主細胞培養物中から、前記抗体を回収することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体を含む、哺乳動物における病理性血管形成と関連する疾病の治療のための医薬組成物。
15. 前記疾病ががんである、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記がんが乳がん、卵巣がん、骨肉腫、肝臓がん、すい臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、非小細胞性肺がん、腎臓がん、頭頚部がん、黒色腫、及び多発性骨髄腫から選ばれる、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記治療が、第二治療薬剤と前記抗体とを、同時にまたは順次投与するステップを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 前記第二治療剤が、抗血管形成剤、化学療法薬及び細胞毒性薬剤から選ばれることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。

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