CN102268089A - Agr2阻断抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种遗传免疫及分子生物技术领域的AGR2阻断抗体及其用途，该抗体为单克隆抗体，其重链和轻链的氨基酸序列如Seq ID No.1和2所示，通过杂交瘤细胞株18A4制备得到单克隆抗体，可用于阻断AGR2促进肿瘤生长和转移。

Description

AGR2阻断抗体及其用途
技术领域
本发明涉及一种遗传免疫及分子生物技术领域的单克隆抗体，具体涉及一种AGR2阻断抗体及其用途。 
背景技术
Anterior gradient-2(AGR2)最早在***受体表达的人乳腺癌细胞株中通过differential筛选发现(Kuang，W.W.，et al.，Nucleic Acids Res，1998.26(4)：p.1116-23.)，随后得到全长cDNA克隆，比较后发现与蟾蜍XA-2发育相关蛋白同源并命名为hAG-2(Thompson，D.A.and R.J.Weigel，hAG-2，Biochem Biophys Res Commun，1998.251(1)：p.111-6.)。AGR2与蛋白二硫化物异构酶(PDI)有较高的同源性(Persson，S.，et al..Mol Phylogenet Evol 200536(3)：p.734-40.)，并且具有PDI活性(Park，S.W.，et al.，PNAS，2009.106(17)：p.6950-5.)。AGR2有PDI的活性位点“CXXS”，这与正常PDI的位点“CXXC”有所区别，通过其他PDI蛋白的研究表明“CXXS”活性位点具有重拍二硫键的功能，但缺失二硫键的合成功能。这也就意味着AGR2有扰乱正常细胞生长的功能，而缺失回复其功能的能力(Anelli，T.，et al.，EMBO J，2002.21(4)：p.835-44.Anelli，T.，et al.，EMBO J，2003.22(19)：p.5015-22.)。 
AGR2是原发性和继发性肿瘤的标识蛋白，并且可在肿瘤患者循环***中检出，并且与肿瘤的发生和转移密切相关。AGR2具有促进乳腺癌细胞转化和迁移的作用(Liu D，et al.CancerRes，2005，65(9)：3796-3805.)。AGR2可以增加胰腺癌细胞的侵袭能力，从而促进肿瘤转移(Ramachandran V，et al.Cancer Res，2008，68(19)：7811-7818.)。AGR2在***癌的转移中起到重要作用(Zhang Y，et al.Cancer Res，2010，70(1)：240-248.)。直到2010年，Kathryn等提到了用AGR2多克隆抗体可抑制乳腺癌细胞的生长(Kathryn E Vanderlaag，et al.breast canser，2010，12.)。 
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种AGR2阻断抗体及其用途，通过杂交瘤细胞株18A4制备得到单克隆抗体，可特异结合AGR2活性结构域并能阻断AGR2功能。 
本发明是通过以下技术方案实现的： 
本发明涉及一种特异性结合AGR2蛋白二硫键异构酶活性结构域的抗体，该抗体为单克隆抗体，可阻断AGR2蛋白二硫键异构酶活性结构域的活性。 
所述的结合包括：离子键、非-离子键、氢键、范德华力以及疏水相互作用。 
所述的特异性结合AGR2蛋白二硫键异构酶活性结构域的抗体，其重链和轻链的氨基酸序列如Seq ID No.1和2所示，其中：阻断抗体的重链可变区氨基酸序列如Seq ID No.3所示，阻断抗体的轻链可变区氨基酸序列如Seq ID No.4所示，阻断抗体的重链CDR1区氨基酸序列如Seq ID No.5所示，阻断抗体的重链CDR2区氨基酸序列如Seq ID No.6所示，阻断抗体的重链CDR3区氨基酸序列如Seq ID No.7所示，阻断抗体的轻链CDR1区氨基酸序列如Seq IDNo.8所示，阻断抗体的轻链CDR2区氨基酸序列如Seq ID No.9所示，阻断抗体的轻链CDR3区氨基酸序列如Seq ID No.10所示。 
所述的特异性结合AGR2蛋白二硫键异构酶活性结构域的抗体，其对应抗原表位的活性位点结构域的氨基酸序列如Seq ID No.11所示，AGR2与阻断抗体的必要结合区氨基酸序列如Seq ID No.12所示。 
所述的抗体为鼠单克隆抗体，可特异结合AGR2蛋白二硫键异构酶活性结构域。 
本发明涉及上述抗体的制备方法，通过杂交瘤细胞株18A4制备得到。 
所述的杂交瘤细胞株18A4于2009年1月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-C200902，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。 
本发明通过上述方法制备得到的抗体与AGR2的结合可采用本领域常规技术，例如ELISA来测定。 
所述的制备具体包括以下步骤： 
步骤1：杂交瘤细胞培养液的收集。 
步骤2：单克隆抗体的纯化。 
本发明涉及上述方法制备得到的抗体，可用于阻断AGR2促进肿瘤生长和转移，具体为体外抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长速率(相对于正常组织来说为异常速率)和体外抑制肿瘤细胞转移，进一步为体外抑制乳腺癌肿瘤细胞T47D的生长、迁移和侵袭性转移；可体外抑制乳腺癌肿瘤细胞T47D的细胞周期。 
所述的乳腺癌肿瘤细胞包括：T47D、MCF7。 
所述的异常生长速率是指超过了正常体内稳态所需和超过了相同来源的正常组织生长速率的生长速率。 
所述的抑制或阻断是指：活性效力的减低或消失； 
所述的体外抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长速率是指：体外肿瘤细胞数目增或减。肿瘤细胞生长的体外调控可通过本领域已知的方法来确定，例如实施例2所示的MTT实验。 
所述的体外抑制肿瘤细胞转移是指：体外肿瘤细胞迁移和侵袭性转移减缓。肿瘤细胞转移的体外调控可通过本领域已知的方法来确定，例如实施例2中的划痕实验和实施例3的肿瘤侵 袭小室实验。 
本发明提供了AGR2特异性抗体，具体为鼠单克隆抗体。“特异性”用来描述发明所述抗体的结合时，意味着本发明所述的抗体的可变区能识别和结合AGR2。应该理解的是，本发明所述的特异性抗体还可与其它蛋白(例如，金黄色葡萄球菌(S.Aureus)蛋白A或链球菌蛋白G或ELISA技术中的其它抗体)相互作用，该作用借助于该抗体可变区以外的序列，尤其该分子的恒定区中的序列的相互作用。 
附图说明
图1为免疫印迹检测AGR2特异性。 
图2为免疫荧光检测AGR2特异性。 
图3为MTT法检测抗体可体外乳腺癌细胞T47D、MCF7的生长与迁移。 
图4为划痕实验检测抗体可体外乳腺癌细胞T47D的迁移。 
图5为肿瘤侵袭小室实验检测抗体可体外抑制乳腺癌细胞T47D侵袭性转移。 
图6为流式细胞术检测抗体可体外抑制乳腺癌细胞MCF-7和T47D的细胞周期。 
图7为Western blot检测确认抗体结合于AGR2活性位点结构域之一。 
图8为Western blot检测确认抗体结合于AGR2活性位点结构域之二。 
图9为实施例荧光检测对比图。 
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 
实施例1：单克隆抗体的制备和纯化 
A.杂交瘤细胞培养液的收集 
用RPMI-1640培养液(含10％牛血清，1％抗生素)连续培养细胞3天，使细胞量保持80％并确保细胞在对数生长期，用PBS洗涤，换为不含血清的RPMI-1640培养液培养48小时后收集上清。 
B.单克隆抗体的纯化 
采用Protein-G免疫亲和层析法按照Pierce Protein G Agarose(20399)说明书纯化抗体。简要步骤如下：从4℃冰箱取出柱材料及所有的试剂，在室温放置，使其温度达到室温；温和混匀柱材料，取2ml 50％柱材料混悬液装入柱子，注意不要有气泡；加入5ml binding buffer平衡柱子；样品先通过0.45μm滤膜过滤的方法去除杂质，然后用binding buffer：样品的比例为1∶9稀释样品，使样品的盐浓度及pH值符合结合要求；将稀释的样品上柱，上样总量在最大结合能力(5mg mouse IgG/ml柱材料)的80％以下可做到最大结合，否则流出液中会含有抗体，使用5ml Elution buffer洗脱所需的抗体，1ml/管收集，收集前在管中加入100μl 1M磷酸或Tris中和液，考马斯亮蓝G-250法测定各管蛋白浓度。混合蛋白浓度高的样品，使用PBS (磷酸盐缓冲液)进行透析改变溶液体系，使用12ml Elution buffer再生柱子。 
实施例2：单克隆抗体效价检测 
ELISA检测抗体效价步骤如下： 
材料： 
板：Costar高结合力易清洗96孔平板(07-200-642) 
二抗：Pierce山羊抗-鼠IgG(H+L)-HRP(P131430) 
底物：Pierce TMB底物试剂盒(34021) 
终止溶液：1N H2SO4
缓冲液： 
结合缓冲液：0.1M NaHPO4 pH 9.0 
封闭缓冲液：PBS+10％Calf Serum 
洗涤缓冲液：PBS+0.1％tween-20(PBST) 
包被酶表板100μl/孔(抗原浓度3ug/ml，若免疫原为融合蛋白，标签蛋白也需包被)，4℃过夜或37℃孵育2h，倒去液体、倒扣平板、拍干。封闭：加200μl/孔封闭液，4℃过夜或37℃2h，倒去液体、倒扣平板、拍干。加待测样品100μl/孔(稀释倍数：102、103、104、105、106。阳性、阴性对照稀释1000倍，100μl/孔)，37℃孵育半小时或4℃过夜，倒去液体、倒扣平板、拍干。洗涤缓冲液洗涤3×3min，拍干。加二抗：二抗用封闭缓冲液稀释1∶10000，100μl/孔，37℃ 20min，洗涤缓冲液洗涤3×3min，拍干。显色：加底物100μl/孔，显色至充分变暗。终止：加终止液100μl，然后读取该板在450nm处的吸光度。该板拍照记录。 
实施例3：单克隆抗体的特异性 
A.免疫印迹检测： 
细胞裂解前用1×PBS洗涤2次，加10ml PBS，将细胞刮下。1000rpm，离心5min，弃上清。加入细胞5倍体积的NP40裂解液(加蛋白酶抑制剂)，混匀，裂解20min。15000rpm，4℃，离心1min，收取上清，蛋白定量(以上裂解操作都是在冰上完成)。5×PAGE protein loadingbuffer(加β-巯基乙醇)悬浮沉淀，95℃加热5min。用15％SDS-PAGE琼脂糖凝胶分离蛋白，恒压80V，电泳2h，使蛋白分开。将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，400mA，45min，用5％牛血清白蛋白室温封闭1h。一抗室温杂交2h，1×PBST洗3×10min。一抗稀释倍数：兔源AGR2抗体1∶10000，β-actin 1∶2000。二抗室温杂交1h，1×PBST洗3×10min。曝光显影扫描结果。 
结果表明：单克隆抗体可检测到T47D细胞中有大量AGR2的表达，而MCF-7、MDA-MB-2311细胞中较少，与文献报道是一致。见图1：1.MCF7细胞裂解液；2.T47D细胞 裂解液；3.MDA-MB-231细胞裂解液。说明，该抗体特异性很强。 
B.免疫荧光检测： 
将圆形盖玻片放入24孔板中，PBS润洗一次。再用相应的培养基浸润，吸干培养基。将T47D细胞胰酶消化转入到24孔板。细胞贴壁后，吸掉培养液，PBS洗涤1次。4％甲醛室温固定10-20分钟，PBS洗涤1次。0.5％TritonX-100，0.3％羊血清室温40分钟。加一抗，4℃，过夜，PBS洗涤3×5min。加荧光二抗，室温，30min，PBS洗涤3×5min。DAPI染色2-5min，PBS洗涤2×5min。封片观察用荧光显微镜观察。 
结果表明：单克隆抗体可检测到乳腺癌细胞T47D细胞内的AGR2的表达，而对照抗体无法检测，见图)。进一步说明抗体的特异性。 
实施例4：体外抑制肿瘤细胞生长的实验 
MTT法检测方法如下： 
MCF-7、T47D细胞株用相应的细胞培养液传代培养至对数生长期(至少传两代，每代生长至80％满)，经胰酶-EDTA液消化，调整细胞终浓度为5×103-5×104/ml，接种于96孔板中，每孔200μl。查看每孔细胞是否均匀分布。待细胞贴壁后，每种细胞分别加入不含抗体、含有20μg/ml本发明抗体和20μg/ml对照抗体IgG的培养基。48h后，每孔加入浓度为5mg/ml的MTT溶液20μl。继续温孵4h后，弃去96孔板上各孔中原有液体，每孔再加入DMSO 150μl以溶解formazan沉淀。室温下放置0.5h后，在脱色摇床上振荡10分钟，用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光值。 
结果表明：单克隆抗体在体外抑制了T47D细胞和MCF-7细胞的生长。见图3：本发明抗体及对照抗体IgG浓度均为20μg/ml。 
实施例5：体外抑制肿瘤细胞迁移的实验 
划痕实验步骤如下： 
将T47D细胞铺入6孔板(细胞70％满)，待其长满后用窄的细胞刮板划掉中间的细胞，用1×PBS洗两次，洗掉刮下的细胞。照相，并做好记号。加入含有20μg/ml本发明抗体或20μg/ml对照抗体IgG的培养基。开始计时，分别在24、48小时拍照(注意要找到相应记号，拍摄同一区域)。 
结果表明：单克隆抗体可体外抑制乳腺癌细胞T47D的迁移。见图4：本发明抗体及对照抗体IgG浓度均为20μg/ml。 
实施例6：体外抑制肿瘤细胞侵袭性转移的实验 
肿瘤侵袭小室实验步骤如下： 
样品准备：将0.2ml protein G(50％slurry Protein G Agarose from Pierce)加入盛有10ml PBS的离心管中，混匀，RT，30min。1500rpm，离心2min，去上清10ml。加入含抗体(本发明抗体，同型IgG作为对照抗体)培养基10ml，混匀。摇床，RT＞2hr或4℃过夜。离心去上清。用10ml PBS洗两次。将与抗体结合的Protein G beads转入1.5ml离心管。加PBS至0.2ml.4℃备用。收集T47D细胞上清(24小时)20ml，分为两管，每管10ml。一管用结合有本发明抗体抗体的proteinG做免疫沉淀，去除AGR2，一管用结合有对照抗体的proteinG作为对照。RT＞2hr或4℃过夜，离心，收集上清再重复一次免疫沉淀。用PBS 1ml洗4次。5×PAGE protein loading buffer(加2-Mercaptoethanol)悬浮沉淀，95℃，5min。免疫印迹检测AGR2去除效果。 
肿瘤侵袭小室实验分为四组，记为A、B、C、D。四组不同之处在于，小室外部即细胞培养皿里培养基成分的不同。 
I组：对照组T47D上清800μl； 
II组：IP去除AGR2的T47D上清800μl； 
III组：对照组T47D上清并且含有20μg/ml IgG； 
IV组：对照组T47D上清并且含有20μg/ml本发明抗体。 
肿瘤侵袭小室内培养基都是RPMI-1640培养基+1％FBS。 
实验中先加好外孔培养基，胰酶消化T47D细胞，计数，离心去除上清。将细胞浓度用含1％FBS的RPMI-1640培养基调整为5×105个/ml。每个小室内加入200μl，放于细胞培养箱中培养(5％CO2，37℃)，开始计时。分别在24小时和48小时将小室取出，刮去内室的细胞，将小室置甲醇溶液室温固定15分钟。结晶紫染色液染色5分钟。乙醇脱色15分钟，放入PBS中，拍照，统计穿膜细胞数。 
结果表明：本发明抗体可体外抑制乳腺癌肿瘤细胞T47D的侵袭性转移(图5)。图5A.在首次AGR2免疫沉淀后，T47D上清中的大部分AGR2已被去除。图5B.tranwell检测，用二次免疫沉淀的T47D上清为AGR2(-)，未做AGR2免疫沉淀的T47D上清为AGR2(+)，加减本发明抗体后，发现外皿含有AGR2的孔有更多细胞发生迁移，并且48小时发生迁移的细胞比24小时明显增多。外皿加入本发明抗体后，迁移的细胞数量明显减少。图5C.24和48小时后迁移的细胞数量统计。 
实施例7：体外抑制肿瘤细胞侵周期的实验 
流式细胞仪检测细胞周期步骤如下： 
T47D细胞株用相应的细胞培养液传代培养至对数生长期(至少传两代，每代生长至80％confluence)，经胰酶-EDTA液消化，铺入6孔板中。待细胞贴壁后换成含有20μg/ml本发明抗体或20μg/ml对照抗体IgG的培养基。分别在加入抗体后的0、6、12、24、48小时，用1 ×Trypsin消化细胞，加10ml培养基将细胞吹散至单个细胞，并收集至15ml离心管，200×g离心5min收集细胞。弃上清，用5ml 1×PBS洗两次。弃上清后，用1ml预冷的1×PBS彻底悬浮细胞，将其滴加入含有9ml 70％预冷的乙醇中，混匀，冰上孵育1h。200×g离心5min收集细胞，弃上清，加15ml 1×PBS在冰上洗细胞3-4h。200×g离心5min收集细胞，弃上清，加500μl PI染色缓冲溶液，转移至1.5ml离心管中。将管子用铝箔纸包裹，37℃孵育30min。上机检测细胞周期。 
结果表明：单克隆抗体可体外抑制乳腺癌肿瘤细胞T47D的细胞周期(图6)。A.在本发明抗体处理48h后，检测到乳腺癌细胞T47D细胞周期受到抑制，T47D细胞G1/G0期较对照上升了8.56％，同时S期和G2/M期分别下降了8.56％。B.在本发明抗体处理48h后，检测到乳腺癌细胞MCF-7细胞周期受到抑制，MCF-7细胞G1/G0期较对照上升了5.37％，同时S期和G2/M期分别下降了5.37％。 
实施例8：单克隆抗体的可变区序列确定 
确定了阻断性单克隆抗体的抗原结合位点的基因序列。方法如下：从杂交瘤细胞中提取RNA，按照Marks等人的方法通过PCR扩增VL和VH，确定基因序列(Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.，222：589-597，1991)。实验所用引物为：轻链5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′，重链5‘-CCACAATCCCTGGGCACAA-3’，两者都是反向测序。 
实施例9：单克隆抗体对应抗原表位的序列确定 
确定了单克隆抗体对应抗原AGR2的抗原表位的氨基酸序列(见图7)。方法如下：从MCF7细胞中提取RNA，用PCR方法得到AGR2的mRNA，反转录得到cDNA，构建pcDNA3-AGR2-His真核表达质粒，然后对AGR2进行缺失突变，突变使用的上游引物：5′-GTTGCTTGTCTTGGATTTATATAGA-3′，下游引物：5′-GCTGAAAATAAAGAAATCCAGAAAT-3′。该突变使抗原表位PLMIIHHLDECPHSQALKKVFA缺失。western blot检测阻断性单克隆抗体不再与突变后的AGR2蛋白结合，从而确定了该抗体结合的AGR2抗原表位氨基酸序列。接着对AGR2进行点突变，突变使用的上游引物5′-ATGAATAATCATCAAGGGTTTGTTGC-3′，下游引物5′-CACTTGGATGAGTGCCCACACA-3′，将其中PDI活性位点“CXXS”的“C”突变成“S”，单克隆和抗体对这个突变蛋白的结合明显减弱。确定该单克隆抗体可特异性结合抗原表位“PLMIIHHLDECPHSQALKKVFA”，且可能对PDI活性进行抑制。 
Figure IDA0000073783580000011
Figure IDA0000073783580000021
Figure IDA0000073783580000031
Figure IDA0000073783580000041

Claims (10)

1.一种特异性结合AGR2蛋白二硫键异构酶活性结构域的抗体，其特征在于，该抗体为单克隆抗体，其重链和轻链的氨基酸序列如Seq ID No.1和2所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征是，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如Seq ID No.3所示，所述抗体的轻链可变区氨基酸序列如Seq ID No.4所示，所述抗体的重链CDR1区氨基酸序列如Seq ID No.5所示，所述抗体的重链CDR2区氨基酸序列如Seq ID No.6所示，所述抗体的重链CDR3区氨基酸序列如Seq ID No.7所示，所述抗体的轻链CDR1区氨基酸序列如Seq ID No.8所示，所述抗体的轻链CDR2区氨基酸序列如Seq ID No.9所示，所述抗体的轻链CDR3区氨基酸序列如Seq ID No.10所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征是，所述抗体的对应抗原表位的活性位点结构域的氨基酸序列如Seq ID No.11所示，AGR2与阻断抗体的必要结合区氨基酸序列如Seq IDNo.12所示。
4.根据上述任一权利要求所述的抗体，其特征是，所述的抗体为鼠单克隆抗体，可特异结合AGR2蛋白二硫键异构酶活性结构域。
5.根据上述任一权利要求所述的抗体的制备方法，其特征在于，通过杂交瘤细胞株18A4制备得到。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述的制备具体包括以下步骤：小鼠腹水的制备、单克隆抗体的纯化。
7.根据上述任一权利要求所述的抗体的应用，其特征在于，用于阻断AGR2促进肿瘤生长和转移。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的应用为体外抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长速率和体外抑制肿瘤细胞转移。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征是，所述的乳腺癌肿瘤细胞包括：T47D、MCF7。
10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征是，所述的应用为体外抑制乳腺癌肿瘤细胞T47D的生长、迁移和侵袭性转移；可体外抑制乳腺癌肿瘤细胞T47D的细胞周期。
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