JP6110846B2 - C型肝炎ウイルス阻害剤としての重水素が導入されたトリペプチド - Google Patents
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Description
本出願は、2011年5月27日に出願された米国仮特許出願第61/490,665号の利益を主張する。
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10は、独立して、水素または重水素から選択されるが;ただし、少なくとも1つは水素以外である)
の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。
表1
工程1
ベンゼン(100 mL)中の(E)-3-(4-クロロフェニル)アクリル酸(18.3 g, 0.1 mol)およびEt3N(20.2 g, 0.2 mol)の溶液に、DPPA(27.5 g, 0.1 mol)を滴下した。2時間撹拌した後、該溶液を濃縮し、クロマトグラフィー(Biotage, 移動相 20/80 EtOAc/ヘキサン)により精製して、16 gの中間体アジドを固形物として得た。この中間体を100 mLのPh2CH2中に溶解させ、得られた混合液を、30分かけて90℃までゆっくりと加熱した。該反応混合液を還流加熱し、この温度で3時間維持した。室温まで冷却した後、沈殿した固形物を濾過により集め、トルエンで洗浄して、9.5 gの7-クロロイソキノリン-1(2H)-オン(53%)を得た。 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 6.66 (d, J=7.05 Hz, 1 H), 7.18 (d, J=7.05 Hz, 1 H), 7.66 (s, 1 H) 7.67 (d, J=2.01 Hz, 1 H), 8.24 (d, J=2.27 Hz, 1 H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm 104.05, 125.62, 127.21, 128.54, 129.52, 130.77, 132.43, 136.55, 160.72; LC/MS, MS m/z (M+H)+ 180.
無水CH3CN(500 mL)中の工程1(実施例1001)の生成物, 7-クロロイソキノリン-1(2H)-オン(36.33 g, 203 mmol)およびN-ブロモスクシンイミド(39.74 g, 223.3 mmol)のスラリーを、約2時間かけてゆっくりと穏やかに還流加熱し、穏やかな還流で1.5時間維持した。該反応液をLC/MSによりモニターし、完了後、該スラリーを3時間かけて室温までゆっくりと冷却した。沈殿した固形物を濾過により集め、CH3CN(100 mL x 3)で洗浄して、47 g(90%)の4-ブロモ-7-クロロイソキノリン-1(2H)-オンを得た。この物質をさらなる精製は行わずに次の工程に用いた。 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.46(s, 1H), 7.81 (dd, J=8.40, 2.00 Hz, 1 H), 7.88 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 8.27(d, J=2.00 Hz, 1 H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm 96.68, 126.34, 127.58, 127.71, 130.73, 132.20, 133.47, 134.46, 159.88; LC/MS, MS m/z (M+H)+ 258.
POCl3(200 mL, 2.15 mol)中の工程2(実施例1001)生成物, 4-ブロモ-7-クロロイソキノリン-1(2H)-オン(47 g, 182 mmol)の不均一な溶液を、1時間かけてゆっくりと還流加熱した。この加熱プロセスの間に、該反応混合液は均一になったことに留意すべきである。該反応混合液を、還流で4時間維持した後、室温まで冷却し、減圧濃縮して過剰量のPOCl3を除去した。残留したPOCl3の完全な除去を確実なものとするために、該残渣をCH2Cl2または別法としてトルエン中に溶解させ、減圧濃縮した。このプロセスを必要に応じて繰り返した。(注記:POCl3は、ガラス容器中において適切に処分した(その旨をラベルで表示した)。)該残渣を600 mLのCH2Cl2に溶解させ、-35℃まで冷却し、中和した後、該混合液がわずかに塩基性(pH = 8)になるまで、1N NaOH(400 mL)を用いて慎重に塩基性化させた。有機層を分離し、H2Oで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧濃縮した。残った固形物を、EtOAc(約50 mL)から結晶化させて、32 gの4-ブロモ-1,7-ジクロロイソキノリンを得た。結晶化プロセスからの母液を濃縮し、Biotage(16% EtOAc/ヘキサン)により精製して、さらなる4 gの4-ブロモ-1,7-ジクロロイソキノリンを固形物として得た。合計で、36 g(73%)の4-ブロモ-1,7-ジクロロイソキノリンを得た。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.80 (dd, J=8.81, 2.01 Hz, 1 H), 8.14 (d, J=9.06 Hz, 1 H), 8.34 (d, J=1.76 Hz, 1 H), 8.48 (s, 1 H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm 118.39, 125.06, 127.59, 128.71, 133.89, 134.14, 134.93, 143.18, 148.98; LC/MS, MS m/z (M+H)+ 275.
THF(500 ml)中の工程3(実施例1001)の生成物, 4-ブロモ-1,7-ジクロロイソキノリン(22.16 g, 80 mmol)のスラリーの溶液(-78℃で維持)に、1.6 M n-BuLi/ヘキサン(100 mL, 160 mmol)をカニューレによって15分かけて滴下した(内部温度を<-65℃に維持した)。該溶液を0.5時間撹拌し、(i-PrO)3B(37 ml, 160 mmol)をシリンジによって10分かけて滴下した(内部温度を<-65℃に維持した)。該反応混合液を0.5時間撹拌し、30% H2O2(80 ml, 776 mmol)を滴下漏斗によって10分かけて滴下した(この添加の間に内部温度は-60℃まで上昇した)後、1N NaOH溶液(80 ml, 80 mmol)を加えた。冷却浴を取り外し、該反応混合液を室温まで昇温させ、さらに1時間撹拌した。LC/MSによって該反応の完了を確認した後、該反応混合液を-40℃まで冷却し、400 mLのH2O中の100 gのNa2SO3(0.793 mol)の溶液を30分かけて滴下した(内部温度を5〜10℃に維持した)。得られたスラリーを、6 N HCl(約50 ml)で0℃にて中和して、pH 〜6にした。該混合液を500 mlのEtOAcで希釈し、2 Lの分液漏斗にデカントした。該反応容器中に残った固形物に、500 mLのH2Oおよび300 mlのEtOAcを加え、該混合液を6 N HCl(約20 ml)で中和した。分液漏斗中で有機層を合わせて、食塩水(300 ml x 3)およびH2O(200 ml x 3)で洗浄した。有機相を、MgSO4で乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濃縮し、粗生成物を得て、それを50 mlのEtOAcを用いてトリチュレートした。得られた固形物を濾過により集め、EtOAc(3 x 25 ml)ですすぎ、乾燥させて、1,7-ジクロロイソキノリン-4-オールを得た(2回操作: 12.0 g, 70%および13.8 g, 81%)。濾液を合わせて、濃縮し、Biotage(35% EtOAc/ヘキサン)により精製して、さらなる2.1 gのBMS-796007を得た。合計で、27.9 g(82%)の1,7-ジクロロイソキノリン-4-オールを得た。 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 4.05 (s, 3 H), 7.4 (s, 1 H), 7.76 (dd, J=8.8, 2, Hz, 1 H), 8.16 (d, J=2 Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8.8 Hz, 1 H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm 123.78, 124.66, 125.62, 127.03, 127.71, 130.72, 133.80, 137.63; 148.88; LC/MS, MS (m/z) (M+H)+ 213.
1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリンの製造:
MeOH/CH3CN(30 mL/300 mL)中の工程4(実施例1001)の生成物, 1,7-ジクロロイソキノリン-4-オール(16 g, 75.5 mmol)のスラリー(0℃で維持)に、ヘキサン中のTMSCHN2の2 M溶液(60 ml , 120 mmol)を滴下した。該反応混合液を室温まで昇温させ、14時間撹拌した。該溶液を濃縮し、残留固形物をEtOAc(約50 mL)から再結晶化させて8.1 gの1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリンを得て、それを25% EtOAc/ヘキサンで洗浄した。該母液を濃縮し、Biotage(16% EtOAc/ヘキサン)により精製して、さらなる3.2 gの1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリンを固形物として得た。合計で、11.3 g(66%)の1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリンを得た。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 4.05 (s, 3 H), 7.67 (dd, J=9.06, 2.01 Hz, 1 H), 7.80 (s, 1 H), 8.16 (d, J=8.81 Hz, 1 H), 8.23 (d, J=2.01 Hz, 1 H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ ppm 56.68, 122.70, 123.99, 124.14, 126.67, 127.83, 131.43, 134.10, 139.75, 149.94; LC/MS, MS m/z (M+H)+ 228.
アセトン(10 mL)中の工程4(実施例1001), 1,7-ジクロロイソキノリン-4-オール(321 mg, 1.5 mmol)、ICD3(217 mg, 1.500 mmol)、およびK2CO3(622 mg, 4.50 mmol)の混合液を20時間還流した。濾過後、該濾液を濃縮し、Biotage(10% 酢酸エチル/ヘキサンで溶出)により精製して、250 mgの目的の生成物を固形物として得た。 LC/MS, MS (m/z) (M+H)+ 231.09.
工程5(実施例1001)の生成物, 1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリン(4.52 g, 20 mmol)、(2S,4R)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-ヒドロキシピロリジン-2-カルボン酸(5.08 g, 22 mmol)およびt-BuOK(6.72 g, 60 mmol)の混合物に、10℃で撹拌しながら、DMSO(200 mL)を加えた。得られたスラリーを30分間超音波処理して、均一な溶液を得て、それを室温で3時間撹拌した。該反応混合液を0℃まで冷却し、H2O(50 ml)を加えることによってクエンチした。該混合液を、1 N HCl水溶液を慎重に加えることによって、中和した後、最終的にpH 5まで酸性化した。該混合液をEtOAc(400 mL)で抽出し、有機層を食塩水(200 mL)、H2O(200 mLx2)で洗浄した後、MgSO4で乾燥させ、減圧濃縮して、8.36 gのクルードな固形物 (2S,4R)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)ピロリジン-2-カルボン酸を得た。この物質をさらなる精製は行わずに次の工程に用いた。 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 2.34 - 2.47 (m, 1 H), 2.62 - 2.77 (m, 1 H), 3.70 - 3.92 (m, 2 H), 4.42 - 4.59 (m, 1 H), 5.65 (brs, 1 H), 7.54 (s, 1 H), 7.68 (dd, J=8.81, 2.01 Hz, 1 H), 8.02 - 8.13 (m, 2 H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-D6) δ ppm 13.90, 14.04, 20.71, 22.02, 27.84, 27.98, 30.91, 35.00, 35.87, 51.84, 52.08, 56.21, 57.49, 57.80, 59.70, 73.32, 73.87, 79.14, 79.19, 119.11, 119.77, 122.38, 123.35, 128.50, 130.95, 132.25, 145.70, 151.94, 153.25, 153.71, 173.51, 173.98; MS (M+H)+ 423.
CH2Cl2(200 mL)中の工程6(実施例1001)の生成物, (2S,4R)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)ピロリジン-2-カルボン酸(8.36 g, 19.8 mmol)、(1R,2S)-1-アミノ-N-(シクロプロピルスルホニル)-2-ビニルシクロプロパンカルボキサミド TsOH塩(9.64g, 24 mmol)、およびiPr2EtN(17.4 mL, 100 mmol)の溶液に、HATU(11.4 g, 31 mmol)を加えた。該反応混合液を16時間撹拌し、減圧濃縮し、残渣をEtOAc(300 mL)中に溶解させ、1 N HCl(50 mL x 3)、水(30 mL x 2)、および食塩水(50 ml x 2)で連続的に洗浄した。有機性物質をMgSO4で乾燥させ、濃縮し、Biotage(25% アセトン/ヘキサン)を用いて精製して、11.5 gの粗生成物 (2S,4R)-tert-ブチル 4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-2-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピルカルバモイル)ピロリジン-1-カルボキシレートを得た。この化合物を、MeOH(40 mL)から結晶化させることによって精製し、11 g(88%)の結晶性の固形物を得た。 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 1.03 - 1.31 (m, 8 H), 1.43 (s, 9H), 1.88 (dd, J=8.06, 5.54 Hz, 1 H), 2.17 - 2.36 (m, 2 H), 2.53 (dd, J=13.72, 6.42 Hz, 1 H), 2.90 - 3.03 (m, 1 H), 3.72 - 3.93 (m, 2 H), 4.40 (dd, J=9.69, 6.92 Hz, 1 H), 5.13 (d, J=10.32 Hz, 1 H), 5.31 (d, J=17.12 Hz, 1 H), 5.65 - 5.93 (m, 2 H), 7.55 (s, 1 H), 7.70 (dd, J=8.94, 2.14 Hz, 1 H), 8.06 (d, J=2.01 Hz, 1 H), 8.09 (d, J=8.81 Hz, 1 H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-D6) δ ppm 5.47, 5.57, 5.75, 19.85, 22.38, 27.90, 27.99, 30.65, 30.72, 32.11, 33.81, 35.11, 36.30, 40.86, 41.59, 48.56, 52.39, 52.76, 56.24, 58.76, 59.21, 73.57, 74.06, 79.28, 80.06, 117.80, 119.16, 119.81, 119.88, 122.14, 123.48, 128.52, 131.00, 132.28, 133.38, 145.72, 151.77, 151.86, 154.06, 168.38, 169.13, 172.46, 173.27; MS: (M+H)+ 635.
50 mLのMeOH(3 mlの濃HClを含む)中の工程7(実施例1001)の生成物, (2S,4R)-tert-ブチル 4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-2-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピルカルバモイル)ピロリジン-1-カルボキシレート(6.34 g, 10 mmol)のスラリーを、2時間還流した。該溶液を室温まで冷却し、減圧濃縮した。固体の残渣を乾燥Et2O(50 ml)に溶解させ、該溶液を減圧濃縮した。このプロセスを5回繰り返すことにより、水および溶解したHClの完全な除去を確実なものとし、6.07 gの(2S,4R)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-N-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピル)ピロリジン-2-カルボキサミドをHCl塩として得た(100%)。 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 0.96 - 1.21 (m, 3 H), 1.22 - 1.30 (m, 1 H), 1.38 (dd, J=9.57, 5.54 Hz, 1 H), 1.95 (dd, J=8.06, 5.79 Hz, 1 H), 2.25 - 2.46 (m, 2 H), 2.83 - 3.08 (m, 2 H), 3.75 - 3.90 (m, 2 H), 4.01 (s, 3 H), 4.70 (dd, J=10.32, 7.81 Hz, 1 H), 5.10 - 5.20 (m, 1 H), 5.33 (d, J=17.12 Hz, 1 H), 5.58 - 5.76 (m, 1 H), 5.88 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 7.74 (dd, J=8.81, 2.01 Hz, 1 H), 8.12 (d, J=9.06 Hz, 1 H), 8.28 (d, J=2.01 Hz, 1 H); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ ppm 6.52, 6.65, 22.60, 31.99, 34.63, 37.04, 43.18, 52.95, 56.85, 60.56, 76.08, 119.06, 119.10, 121.65, 123.93, 124.63, 130.72, 132.37, 133.78, 134.76, 148.49, 153.02, 170.08, 170.67; LC/MS MS m/z (M+H)+ 535.
100 mLのCH2Cl2中の工程8(実施例1001)の生成物, HCl塩としての(2S,4R)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-N-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピル)ピロリジン-2-カルボキサミド(6.07 g, 10 mmol)の溶液(0℃に維持)に、8.7 mLのiPr2EtN(50 mmol)、続いてBoc-L-tert-ロイシン(2.772 g, 12 mmol)およびHATU(5.7 g, 15 mmol)を加えた。該反応混合液を室温まで昇温させ、16時間撹拌した後、減圧濃縮し、残渣をEtOAc(300 mL)に溶解させた。該EtOAc溶液を1N HCl(50 mL x 3)、H2O(30 mL x 2)、および食塩水(50 ml x 2)で連続的に洗浄した。有機相を、MgSO4で乾燥させ、減圧濃縮し、Biotage(33% アセトン/ヘキサン)を用いて精製して粗生成物を得て、7 g(94%)の目的の生成物を得た。 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 1.00-1.06 (m, 11 H), 1.16 (s, 9 H), 1.14-1.24 (m, 2 H), 1.44 (dd, J=9.32, 5.29 Hz, 1 H), 1.88 (dd, J=8.06, 5.54 Hz, 1 H), 2.17 - 2.39 (m, 2 H), 2.59 (dd, J=13.85, 6.80 Hz, 1 H), 2.87 - 3.02 (m, 1 H), 4.00 (s, 3 H), 4.01 - 4.14 (m, 1 H), 4.17 - 4.24 (m, 1 H), 4.43 (d, J=12.09 Hz, 1 H), 4.52 - 4.65 (m, 1 H), 5.12 (d, J=10.07 Hz, 1 H), 5.30 (d, J=16.87 Hz, 1 H), 5.65 - 5.91 (m, 2 H), 7.56 (s, 1H), 7.68 (d, J=9.06 Hz, 1 H), 8.05 (s, 1 H), 8.09 (d, J=9.06 Hz, 1 H);MS: (M+H)+ 748.
工程9(実施例1001)の生成物, tert-ブチル (S)-1-((2S,4R)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-2-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピルカルバモイル)ピロリジン-1-イル)-3,3-ジメチル-1-オキソブタン-2-イルカルバメート(2.469 g, 3.3 mmol)に、4M HCl(8.25 mL, 33.0 mmol)/1,4-ジオキサンを加えた。得られた溶液を25℃で3時間撹拌した。減圧下で濃縮した後、残渣に、エーテル(20mL)を加え、次いで再び濃縮し、該手順を3回繰り返した。一般的な減圧装置で乾燥させて、2.36 g(100%)の粗生成物を固形物として得て、それをさらなる精製は行わずに次の工程に用いた。 MS: (M+H)+ 648.50.
CH2Cl2(体積:3 mL)中の工程10(実施例1001)の生成物, (2S,4R)-1-((S)-2-アミノ-3,3-ジメチルブタノイル)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-N-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピル)ピロリジン-2-カルボキサミド, HCl(30 mg, 0.044 mmol)、反応物2(9.56 mg, 0.048 mmol)、およびN-エチル-N-イソプロピルプロパン-2-アミン(0.038 mL, 0.219 mmol)の溶液を、16時間撹拌した。濃縮後、残渣をプレパラティブHPLCにより精製して、21 mg(64%)の目的の生成物である化合物1001を固形物として得た。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.99 - 1.13 (m, 11 H), 1.17 (s, 6 H), 1.21 - 1.32 (m, 2 H), 1.45 (dd, J=9.4, 5.4 Hz, 1 H), 1.89 (dd, J=8.2, 5.4 Hz, 1 H), 2.20 - 2.35 (m, 2 H), 2.61 (dd, J=13.7, 6.9 Hz, 1 H), 2.91 - 3.01 (m, 1 H), 4.01 (s, 3 H), 4.03 - 4.12 (m, 1 H), 4.18 - 4.23 (m, 1 H), 4.43 (s, 1 H), 4.57 (dd, J=10.2, 7.2 Hz, 1 H), 5.14 (dd, J=10.3, 1.5 Hz, 1 H), 5.32 (d, J=17.1 Hz, 1 H), 5.71 - 5.85 (m, 2 H), 7.58 (s, 1 H), 7.69 (dd, J=8.5, 1.8 Hz, 1 H), 8.06 (d, J=1.8 Hz, 1 H), 8.10 (d, J=8.8 Hz, 1 H); MS: (M+H)+ 751.31.
HCV NS3/4Aプロテアーゼ複合体酵素アッセイおよび細胞ベースのHCVレプリコンアッセイを、下記の通り当業者に公知の情報を用いて調製し、実施し、検証した。
BMS株、H77株またはJ4L6S株由来のHCV NS3プロテアーゼ複合体を、下記のとおり産生した。これらの精製した組換えタンパク質を、均一アッセイ(下記参照)において使用するために産生し、HCV NS3タンパク質分解活性の阻害において本発明の化合物がいかに有効であるかを示した。
このin vitroアッセイは、本発明の化合物による、上記のBMS株、H77株もしくはJ4L6S株由来のHCV NS3プロテアーゼ複合体の阻害を測定することを目的とした。このアッセイにより、HCV NS3タンパク質分解活性の阻害において本発明の化合物がいかに有効であるかが示された。
100-[(δFinh/δFcon)x100]
(式中、δFは曲線の線形範囲にわたる蛍光の変化である)を用いて阻害率を算出した。非線形曲線の当てはめを阻害-濃度データに適用し、Excel XLfit ソフトウェアの使用により、式、y=A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))を用いて、50%有効濃度(IC50)を算出した。
HCV NS3/4Aプロテアーゼ複合体の阻害における本発明の化合物のin vitro選択性を示すために、他のセリンもしくはシステインプロテアーゼと比較した、特異性アッセイを実施した。
50 mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(トリス-HCl) pH 8、0.5 M 硫酸ナトリウム(Na2SO4)、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、3% DMSO、0.01% Tween-20、ならびに5 μM LLVY-AMCおよび1 nM キモトリプシン。
50 M トリス-HCl, pH 8.0、50 mM NaCl、0.1mM EDTA、3% DMSO、0.02% Tween-20、5 μM succ-AAPV-AMC、および20 nM HNEもしくは8 nM PPE;
100 mM NaOAC(酢酸ナトリウム) pH 5.5、3% DMSO、1 mM TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)、5 nM カテプシンB(酵素ストックは使用の前に20 mM TCEPを含有するバッファー中で活性化させた)、およびH2O中に希釈した2 μM Z-FR-AMC。
[1-((UVinh-UVblank)/(UVctl-UVblank))] x 100
を用いて算出した。
HCVレプリコン全細胞系(whole cell system)を、Lohmann V, Korner F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartenschlager R., Science 285(5424):110-3 (1999)による記載のとおり確立した。この系により、本発明者は、HCV RNA複製における本発明のHCVプロテアーゼ化合物の効果を評価することができた。簡単に述べると、Lohmannの論文に記載されたHCV 株1b配列(受託番号:AJ238799)を用いて、HCV cDNAをOperon Technologies, Inc. (Alameda, CA)が合成し、次いで、完全長レプリコンを標準的な分子生物学的技法を用いてプラスミドpGem9zf(+)(Promega, Madison, WI)中に構築した。該レプリコンは、(i)カプシドタンパク質の最初の12個のアミノ酸に融合したHCV 5' UTR、(ii)ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)、(iii)脳心筋炎ウイルス(EMCV)からのIRES、ならびに(iv)HCV NS3からNS5B遺伝子およびHCV 3' UTRから成る。プラスミドDNAをScaIで直線化し、RNA転写物を、メーカーの説明書に従ってT7 MegaScript転写キット(Ambion, Austin, TX)を用いて、in vitroで合成した。cDNAのin vitro転写物を、ヒト肝癌細胞株であるHUH-7にトランスフェクトした。HCVレプリコンを恒常的に発現している細胞の選択を、選択マーカーであるネオマイシン(G418)の存在下において行った。得られた細胞株を、経時的な、プラス鎖およびマイナス鎖RNA生成ならびにタンパク質生成についてキャラクタライズした。
HCVレプリコンFRETアッセイを、HCVウイルス複製における本発明に記載の化合物の阻害効果をモニターするために開発した。HCVレプリコンを恒常的に発現するHUH-7細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)(Sigma)および1 mg/ml G418(Gibco-BRL)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco-BRL)中で増殖させた。細胞を、前夜に、96-ウェル組織培養無菌プレート中に播種した(1.5 x 104細胞/ウェル)。化合物、および化合物を含有しない対照を、希釈プレートにおいて、4% FCS、1:100 ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco-BRL)、1:100 L-グルタミンおよび5% DMSOを含有するDMEM中で調製した(アッセイにおいて0.5% DMSO 最終濃度)。化合物/DMSO混合物を細胞に加え、37℃で4日間インキュベートした。4日後、CC50読み取りのためにアラマーブルー(Trek Diagnotstic Systems)を用いて、初めに細胞毒性について細胞を評価した。細胞をインキュベートしている培地に1/10の容積のアラマーブルーを加えることにより、化合物の毒性(CC50)を決定した。4時間後、Cytofluor Series 4000(Perspective Biosystems)を用いて、530 nmの励起波長および580 nmの発光波長で、各ウェルからの蛍光シグナルを読み取った。次いで、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(3回、150 μl)で完全にすすいだ。該細胞を、HCVプロテアーゼ基質、蒸留水で1倍に希釈した5X細胞ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬(Promega #E153A)、150 mMの最終濃度まで加えたNaCl、100% DMSO中の2 mMストックから10 μMの最終濃度まで希釈したFRETペプチド基質(上記の酵素アッセイにおいて説明した通り)を含む、25 μlの溶解アッセイ試薬で溶解した。その後、該プレートを、340 nm励起/490 nm発光、21サイクルの自動モードに設定されたCytofluor 4000装置に設置し、プレートを運動モードで読み取った。IC50決定について記載の通り、EC50決定を行った。
二次アッセイとして、レプリコンFRETアッセイからのEC50決定を、レプリコンルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて確認した。レプリコンルシフェラーゼレポーターアッセイの利用は、Kriegerらによって最初に記載された(Krieger N, Lohmann V, and Bartenschlager R, J. Virol. 75(10):4614-4624 (2001))。本発明者らのFRETアッセイに記載のレプリコンコンストラクトを、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のヒト化形態およびルシフェラーゼ遺伝子の3'-末端に直接融合しているリンカー配列をコードするcDNAを挿入することによって改変した。この挿入物は、ネオマイシンマーカー遺伝子の直接上流のコア中に位置するAsc1制限部位を用いて、レプリコンコンストラクトに導入された。1179位での適応的変異(セリンからイソロイシン)も導入した(Blight KJ, Kolykhalov, AA, Rice, CM, Science 290(5498):1972-1974)。このHCVレプリコンコンストラクトを恒常的に発現している安定な細胞株を、上記の通り産生した。ルシフェラーゼレポーターアッセイを、以下のとおり改変してHCVレプリコンFRETアッセイについての記載の通り設定した。37℃/5% CO2インキュベーター中で4日間の後、Promega Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ウミシイタケルシフェラーゼ活性について細胞を分析した。細胞を含有する各ウェルから培地(100 μl)を除去した。残った50 μlの培地に、50 μlのDual-Gloルシフェラーゼ試薬を加え、プレートを室温で10分〜2時間揺動させた。次いで、Dual-Glo Stop & Glo試薬(50 μl)を各ウェルに加え、プレートを室温でさらに10分〜2時間再び揺動させた。発光プログラムを用いて、Packard TopCount NXTにおいて、プレートを読み取った。
%対照= 実験ウェル(+化合物)における平均ルシフェラーゼシグナル
DMSO対照ウェル(−化合物)における平均ルシフェラーゼシグナル
を用いて算出した。
XLfitを用いて値をグラフ化し、分析して、EC50値を得た。
Claims (16)
- 各R2が重水素である、請求項1に記載の化合物。
- 各R3が重水素である、請求項2に記載の化合物。
- 請求項1に記載の化合物もしくはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体を含有する組成物。
- 抗HCV活性を有する少なくとも1つのさらなる化合物をさらに含有する、請求項5に記載の組成物。
- 該さらなる化合物のうちの少なくとも1つがインターフェロンまたはリバビリンである、請求項6に記載の組成物。
- 該インターフェロンが、インターフェロンα2B、ペグインターフェロンα、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンα2A、またはリンパ芽球様インターフェロンタウから選択される請求項7に記載の組成物。
- 該さらなる化合物のうちの少なくとも1つが、インターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、1型ヘルパーT細胞応答の発生を増強する化合物、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド、リバビリン、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素阻害剤、アマンタジン、またはリマンタジンから選択される、請求項6に記載の組成物。
- 該さらなる化合物のうちの少なくとも1つが、HCV感染症の処置のために、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCVエントリー、HCVアセンブリ、HCVイグレス、HCV NS5Aタンパク質、またはIMPDHから選択される標的の機能を阻害するのに有効である、請求項6に記載の組成物。
- 治療上有効な量の請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を含有する、HCV感染症の治療剤。
- 請求項1に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩より前、後、または同時に、抗HCV活性を有する少なくとも1つのさらなる化合物を投与することを特徴とする、請求項11に記載の治療剤。
- 該さらなる化合物のうちの少なくとも1つがインターフェロンまたはリバビリンである、請求項12に記載の治療剤。
- 該インターフェロンがインターフェロンα2B、ペグインターフェロンα、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンα2A、またはリンパ芽球様インターフェロンタウから選択される、請求項13に記載の治療剤。
- 該さらなる化合物のうちの少なくとも1つがインターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、1型ヘルパーT細胞応答の発生を増強する化合物、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド、リバビリン、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素阻害剤、アマンタジン、またはリマンタジンから選択される、請求項12に記載の治療剤。
- 該さらなる化合物のうちの少なくとも1つが、HCV感染症の処置のために、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCVエントリー、HCVアセンブリ、HCVイグレス、HCV NS5Aタンパク質、またはIMPDHから選択される標的の機能を阻害するのに有効である、請求項12に記載の治療剤。
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