JP6097760B2 - リパーゼ酵素を使用するハイドロゲルの調製方法 - Google Patents
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Description
1つの実施の形態によれば、R1、R2、及びR3は、独立して、同一又は異なって、直鎖、非置換のC1〜C3アルキルカルボニル鎖等の直鎖、非置換のC1〜C12アルキルカルボニル鎖を表す。
i)トリアシルグリセロールリパーゼを含む溶液で***を希釈することにより第1の溶液を形成する工程と、
ii)工程i)で得られた第1の溶液に、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物、及び下記式Iで示す化合物を含む第2の溶液を添加するとともに、ゲル化を開始する工程と、
iii)工程ii)で得られた溶液をアルギン酸ハイドロゲルのゲル化用容器に移す工程と、
iv)任意に、iii)のアルギン酸ハイドロゲルを凍結保存に供する工程と、を含む、方法が提供される。
i)下記式Iで示す化合物を含む溶液で***を希釈することによって第1の溶液を形成する工程と、
ii)工程i)で得られた溶液に、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物、及びトリアシルグリセロールリパーゼを含む第2の溶液を添加するとともに、ゲル化を開始する工程と、
iii)ii)で得られた溶液をアルギン酸ハイドロゲルのゲル化用容器に移す工程と、
iv)任意に、iii)のアルギン酸ハイドロゲルを凍結保存に供する工程と、
含む、方法が提供される。
a.アルギン酸塩と、
b.任意に、アルギン酸ハイドロゲルに包埋される目的物と、
c.アルギン酸ハイドロゲルの調製に使用されるヒドロラーゼと、
を含み得る。
本発明は、様々な領域の用途に有用なアルギン酸ハイドロゲルを調製するための新規な方法を提供する。特に、本発明は、生体材料を包埋し固定化するのに特に有用なハイドロゲルを調製する新規な方法を提供する。
材料及び方法
材料
以下の化学物質を使用した:Sigma(アメリカ、セントルイス)よりトリズマ塩酸塩及びEDTA、Riedel de Haeen(ドイツ、ゼールツェ)よりNaHCO3、NaCl、グリセロール(99%超)、クエン酸ナトリウム及びピルビン酸ナトリウム、Norsk Medisinaldepot(ノルウェー、オスロ)よりフルクトース及びグルコース一水和物、KSL staubtechnik gmbh(ドイツ、ラウインゲン)より炭酸カルシウム、並びにFMC Biopolymer A/S(ノルウェー、ドランメン)よりアルギン酸ナトリウム(PROTANAL LF 10/60)。
ノルウェー、トロンハイムのハルシュタインガード及びシュタンゲのストーレリーのGeno施設でウシ***を採取した。
以下のエクステンダー溶液を使用した:
ウシ***をGeno施設で採取し、以下に記載の通り希釈した:採取の直後、一次希釈用エクステンダー溶液中1ml当たり219×106細胞の濃度まで***を希釈した。その後、この溶液を直ちに等容量の更なる希釈用エクステンダーと混合した。ここでは上記エクステンダー溶液は、酵素又は基質のいずれかを含んでいた。その後、得られた希釈した***を含有する溶液を4℃まで冷却した。4℃まで冷却した後、溶液を等容量の三次希釈用エクステンダー溶液と混合した。ここでは上記エクステンダーは、前工程由来の希釈された***が酵素を含んでいた場合にはいずれかの基質(トリアセチン、トリプロピオニン又はトリブチリン)を含み、又は前工程由来の希釈された***が基質を含んでいた場合には酵素を含んでいた。さらに、上記エクステンダーは、この時、二価陽イオン放出化合物として炭酸カルシウムと、アルギン酸塩とを含んでいた。その後、得られた溶液を授精ストローに移し、4℃にておよそ3時間平衡化させた。その後、授精ストローをN2冷凍庫に移し、ウシ***用の標準的手順に従って凍結した。
***の運動性を顕微鏡的判定により評価した。凍結した***ストローを37℃のウォーターバスに30秒間保持することによって解凍した。測定前に改変IVT溶液でアルギン酸ゲルを液化した。授精ストローの内容物を0.9mlのIVT溶液に添加し、およそ10分間チューブタンブラー上で注意深く振盪した。運動性の評価の前に、チューブを37℃のヒートブロックにおいて最低15分間予熱した。およそ3μlの溶液を予熱した顕微鏡スライドに添加し、光学顕微鏡を使用して直ちに検査した。各試料中の運動性***の数を最近傍5%間隔と推定した。実質的に可能であれば、評価中、オペレータは試料の属性について知らされていなかった。
a)基質としてトリアセチンを使用するウシ***の固定化
上記手順に従って***を回収し、希釈した。二次希釈用エクステンダー溶液に、***を含有する最終溶液中6g/lの濃度まで酵素(Sigma L1754)を添加した。三次希釈用エクステンダー溶液は8g/lの炭酸カルシウムを含有し、そこに0.5g/100mlの濃度までトリアセチンを添加した。二次希釈のおよそ4時間後、***を固定化したゲルが形成された。4℃でのおよそ24時間の保存の後、ゲルを液化し、固定化した***の運動性を評価した。その際、およそ60%の***が運動性であった。
上記手順に従って***を回収し、希釈、固定化して凍結保存した。二次希釈用エクステンダー溶液に、希釈した***を含有する最終溶液中6g/lの濃度まで酵素(Sigma L1754)を添加した。三次希釈用エクステンダー溶液は4g/lの炭酸カルシウムを含有し、そこに0.30g/100mlの濃度までトリプロピオニンを添加した。二次希釈のおよそ3時間後、ゲルが形成され、固定化した***を含むストローを凍結した。***ストローを、解凍して運動性を評価するまで液体N2中で数日保存した。解凍及びゲルの液化後、およそ60%の***が運動性であった。
上記手順に従って***を回収し、希釈し、固定化して凍結保存した。二次希釈用エクステンダー溶液に、希釈した***を含有する最終溶液中0.30g/100mlの濃度までトリプロピオニンを添加した。三次希釈用エクステンダー溶液は4g/lの炭酸カルシウムを含有し、そこに6g/lの濃度まで酵素Sigma L1754を添加した。二次希釈のおよそ2時間後、ゲルが形成された。4℃でのおよそ24時間の保存の後、ゲルを液化し、固定化した***の運動性を評価した。その際、およそ60%の***が運動性であった。
上記手順に従い、***を回収し、希釈し、固定化して凍結保存した。二次希釈用エクステンダー溶液に、希釈した***を含有する最終溶液中6g/lの濃度まで酵素(Sigma L1754)を添加した。三次希釈用エクステンダー溶液は、4g/lの炭酸カルシウムを含有し、そこに0.35g/100mlの濃度までトリブチリンを添加した。二次希釈のおよそ3時間後、ゲルが形成され、固定化した***を含むストローを凍結した。***ストローを、解凍して運動性を評価するまで液体N2中で数日保存した。解凍及びゲルの液化後、およそ60%の***が運動性であった。
材料
FMC Biopolymer A/S(ノルウェー、ドランメン)よりアルギン酸ナトリウム(PROTANAL LF 10/60)、Sigma(アメリカ、セントルイス)より酵素L3001及びL1754、Sigma(アメリカ、セントルイス)よりトリアセチン及びトリオクタノエート、KSL staubtechnik gmbh(ドイツ、ラウインゲン)より炭酸カルシウム。
以下の溶液を使用した。溶液L1.1:蒸留水中のL3001酵素の10g/l溶液、溶液L1.2:蒸留水中0.2g/lのトリアセチン。溶液L2.1:蒸留水中4g/lの炭酸カルシウム、24g/lのLF10/60アルギン酸ナトリウム、及び0.1g/lのトリアセチン。溶液L2.2:蒸留水中4g/lの炭酸カルシウム、24g/lのLF10/60アルギン酸ナトリウム、及び0.2g/lのトリアセチン。溶液L2.3:蒸留水中4g/lの炭酸カルシウム、24g/lのLF10/60アルギン酸ナトリウム、及び0.3g/lのトリアセチン。溶液L2.4:蒸留水中4g/lの炭酸カルシウム、24g/lのLF10/60アルギン酸ナトリウム、及び10g/lのL3001酵素。溶液L2.5:蒸留水中4g/lの炭酸カルシウム、24g/lのL10/60アルギン酸ナトリウム及び0.3g/lのトリオクタノエート。
L1溶液のうちの1つと等容量のL2溶液のうちの1つとを混合することによってゲル化を開始した。溶液を表1に従って混合した。
酵素L3001(コムギ胚芽由来リパーゼ)及びL1754(カンジダ・ルゴサ由来リパーゼ)と、基質トリアセチン及びトリオクタノエートとを、アルギン酸ナトリウム溶液の制御されたゲル化に使用した。酵素及び基質の溶液を調製し、表1に従って混合した。酵素と基質との間の反応は、溶液中に懸濁した炭酸カルシウムと反応するH3O+イオンを産生する。この反応は、溶液中のアルギン酸塩高分子鎖と相互作用するカルシウムイオンを放出し、ゲルが形成される。実験においてゲルが形成される前の観察時間を表2に示す。酵素が添加されなかった実験5において、ゲルは形成されなかった。結果は、反応時間は、選択された基質及び酵素の種類、また使用した酵素及び基質の濃度の両方に依存することを示す。
Claims (29)
- ヒドロラーゼを含む溶液と、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液とを混合する工程を含み、前記ヒドロラーゼを含む溶液又は前記基質を含む溶液がアルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含むことを特徴とするアルギン酸ハイドロゲルを調製する方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記ヒドロラーゼを含む溶液が、二価陽イオン放出化合物及びアルギン酸塩を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記基質を含む溶液が、二価陽イオン放出化合物及びアルギン酸塩を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記ヒドロラーゼがエステラーゼであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記エステラーゼが、リパーゼであることを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記エステラーゼが、トリアシルグリセロールリパーゼであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法において、前記基質が有機酸のエステルであることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、R1、R2、及びR3が、メタノン、エタノン、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、ヘプタノン、オクタノン、ノナノン、デカノン、ドデカノンからなる群より選択されることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、R1、R2、及びR3が、独立して、同一又は異なって、C1〜C3アルキルカルボニル鎖を表すことを特徴とする方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法において、前記基質が、トリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリンからなる群より選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法において、前記二価陽イオン放出化合物が、Ca2+、Ba2+、及びSr2+からなる群より選択される二価陽イオンを放出することを特徴とする方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記二価カチオン放出化合物がカルシウム放出化合物であることを特徴とする方法。
- 請求項13に記載の方法において、前記カチオン放出化合物が炭酸カルシウムであることを特徴とする方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法において、第1の溶液がアルギン酸ハイドロゲル中に包埋される目的物を更に含むことを特徴とする方法。
- 請求項15に記載の方法において、アルギン酸ゲルに包埋される前記目的物が生体材料であることを特徴とする方法。
- 請求項16に記載の方法において、前記生体材料が***であることを特徴とする方法。
- 請求項17に記載の方法において、
i)トリアシルグリセロールリパーゼを含む溶液で***を希釈することにより第1の溶液を形成する工程と、
ii)工程i)で得られた第1の溶液に、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物、及び下記式Iで示す化合物を含む第2の溶液を添加するとともに、ゲル化を開始する工程と、
iii)工程ii)で得られた溶液をアルギン酸ハイドロゲルのゲル化用容器に移す工程と、
iv)任意に、iii)のアルギン酸ハイドロゲルを凍結保存に供する工程と、を含むことを特徴とする方法。
- 請求項17に記載の方法において、
i)下記式Iで示す化合物を含む溶液で***を希釈することによって第1の溶液を形成する工程と、
ii)工程i)で得られた溶液に、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物、及びトリアシルグリセロールリパーゼを含む第2の溶液を添加するとともに、ゲル化を開始する工程と、
iii)ii)で得られた溶液をアルギン酸ハイドロゲルのゲル化用容器に移す工程と、
iv)任意に、iii)のアルギン酸ハイドロゲルを凍結保存に供する工程と、を含むことを特徴とする方法。
- 請求項18又は19に記載の方法において、前記基質が、トリアセチン、トリプロピオニン及びトリブチリンからなる群より選択される方法。
- 請求項18又は19に記載の方法において、iii)で得られた溶液を凍結保存に供し、i)及びii)の第1の溶液及び第2の溶液のそれぞれが凍結保護物質を含むことを特徴とする方法。
- 請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法において、前記アルギン酸塩がグルロン酸に富むアルギン酸塩であることを特徴とする方法。
- アルギン酸ハイドロゲルであって、
a)アルギン酸塩と、
b)アルギン酸ハイドロゲルに包埋される目的物と、
c)アルギン酸ハイドロゲルの調製に使用されるヒドロラーゼと、
を含むことを特徴とするアルギン酸ハイドロゲル。 - 請求項23において、前記アルギン酸ハイドロゲルに包埋される前記目的物は生体材料であることを特徴とするアルギン酸ハイドロゲル。
- 請求項23において、前記アルギン酸ハイドロゲルに包埋される前記目的物は***であることを特徴とするアルギン酸ハイドロゲル。
- ヒドロラーゼの入った1つの容器と、該ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質の入った第2の容器とを含むアルギン酸ハイドロゲルキットであって、アルギン酸塩及び二価陽イオン放出化合物を更に含むことを特徴とするキット。
- 請求項26に記載のキットにおいて、ヒドロラーゼを含む溶液の入った1つの容器と、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物及び前記ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液の入った第2の容器とを含むことを特徴とするキット。
- 請求項26に記載のキットにおいて、ヒドロラーゼによって加水分解可能な基質を含む溶液の入った1つの容器と、アルギン酸塩、二価陽イオン放出化合物及びヒドロラーゼを含む溶液の入った第2の容器とを含むことを特徴とするキット。
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