ES2713528T3

ES2713528T3 - Métodos para la preparación de hidrogeles mediante el uso de enzimas lipasas

Info

Publication number: ES2713528T3
Application number: ES12788575T
Authority: ES
Inventors: Geir Klinkenberg; Josefsen Kjell Domaas; Elisabeth Kommisrud
Original assignee: SPERMVITAL AS
Current assignee: SPERMVITAL AS
Priority date: 2011-11-24
Filing date: 2012-11-23
Publication date: 2019-05-22
Anticipated expiration: 2032-11-23
Also published as: US20140302484A1; AU2012342435B2; RU2014122489A; NZ625119A; AU2012342435A1; WO2013076232A1; RU2631003C2; JP6097760B2; CN104126015A; JP2014533958A; CY1121438T1; AR090038A1; MX2014006192A; PT2783008T; GB201120368D0; US20170121700A1; CA2856337A1; CL2014001338A1; KR20140109898A; SI2783008T1

Abstract

Uso de una lipasa y un sustrato que es hidrolizable por la lipasa y un agente que libera cationes divalentes en la preparación de un hidrogel de alginato, en donde el sustrato es un compuesto de la Fórmula I:**Fórmula** en donde R1, R2 y R3 independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C1-C12 lineal o ramificada, sustituida o no sustituida, y en donde el agente que libera cationes divalentes es un carbonato.

Description

DESCRIPCION

Metodos para la preparacion de hidrogeles mediante el uso de enzimas lipasas.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo mejorado para preparar hidrogeles, particularmente hidrogeles de alginato. Los hidrogeles de la presente invencion tienen una amplia area de aplicacion y son particularmente utiles para la inmovilizacion de material biologico, mas particularmente para la inmovilizacion y conservacion de material celular, tal como, por ejemplo, espermatozoides.

Antecedentes de la invencion

Los hidrogeles consisten en cadenas de polfmeros que forman una red hidrofila que contiene agua que tiene una amplia area de aplicacion en diversos campos industriales, particularmente en las industrias biotecnologica y farmaceutica. Por ejemplo, los hidrogeles se usan para inmovilizar material biologico tales como las celulas para el trasplante o como sistema de administracion para, por ejemplo, ingredientes farmaceuticos activos o nutrientes. Los hidrogeles pueden ser utiles ademas como apositos para heridas. Ademas, los hidrogeles, particularmente los hidrogeles de alginato, se usan ampliamente como agentes espesantes.

Un polfmero ampliamente usado para la formacion de hidrogeles es el alginato. Los alginatos son polisacaridos anionicos naturales que constan de acido p-D-manuronico con enlace 1,4 (M) y acido a-L-glucuronico (G). (Smidsr0d y Skjak-Brak, 1990, Trends in biotechnology, vol. 8, no. 3, pags. 71-78). Los alginatos comerciales se extraen de algas marinas, tales como Ascophyllum nodosum, Macrocystis pyrifera y Laminaria hyperborea,y ademas hasta cierto punto de Laminaria digitata, Laminaria japonica, Eclonia maxima, Lesonia negrescens y Sargassum sp.

Los alginatos pueden prepararse ademas a partir de algunas bacterias productoras de alginato, por ejemplo, de algunas especies de Pseudomonas y de Azotobacter vinelandii (Smidsr0d y Skjak-Brak, 1990, supra).

Los alginatos se usan comunmente, entre otros, en la industria alimentaria, por ejemplo, como estabilizadores para el control de la viscosidad, o como agentes espesantes. Los alginatos se usan ademas ampliamente en la industria farmaceutica y cosmetica, tambien como estabilizadores, agentes espesantes o desintegrantes. Para los diversos fines, los alginatos que son ricos en acido guluronico o acido manuronico, respectivamente, estan disponibles (Mancini y otros (1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378, WO8603781, US 4,990,601, US 5,639,467).

Debido a la biocompatibilidad de los alginatos y la capacidad de gelificar en presencia de cationes divalentes tales como, por ejemplo, los iones de calcio, el alginato se usa ademas comunmente para la encapsulacion de celulas (Nebel, RL, Balme, J., Saacke, RG y Lim. F. (1985), J. Anim. Sci. 60:1631-1639, Lim, F y Sun, A.M., (1980) Science 210: 908-9100, WO 2006/106400, EP0922451, US6596310, Torre y otros (1998), STP Pharma Sciences, 8 (4), pags. 233-236, Torre y otros, (2000), Biomaterials, 21, pags. 1493-1498, Torre y otros (2002), Journal of Controlled Release, 85, pags. 83-89, Faustini y otros, (2004), Theriogenology, 61, 173-184., Weber y otros (2006), Journal of Biotechnology, 123, pags. 155 163.

Los geles de alginato son utiles ademas para inmovilizar diversos materiales. Por ejemplo, el documento W02008/004890 describe partfculas de biopolfmero utiles para la conservacion de espermatozoides, y en donde el material biologico se incrusta en una partfcula de polfmero que es solida en todo el diametro de la partfcula. Al incrustar los espermatozoides en los hidrogeles de alginato en lugar de encapsular los espermatozoides, lo que deja a los espermatozoides en el nucleo fluido de las capsulas, las celulas se inmovilizan dentro de la red de gel de alginato, lo que restringe la motilidad de las celulas durante el almacenamiento.

Los hidrogeles de alginato, por ejemplo, los geles de alginato usados para la encapsulacion o el atrapamiento de diversos materiales, pueden prepararse mediante mezclado de una solucion del material a entrampar con una solucion de alginato de sodio, y adicion de esta solucion a una solucion que contenga cationes multivalentes, usualmente cationes divalentes, tales como iones de calcio (por ejemplo, una solucion de CaCh) (Smidsrad y Skjak-Br^k, 1990, supra).

El documento US 6,497,902 describe otro metodo para preparar hidrogeles biocompatibles, tales como hidrogeles de alginato, que comprenden mezclar las celulas a incrustar, sal de alginato y un agente que libera calcio, y despues adicionar un compuesto que libera calcio a dicha mezcla para formar un gel reticulado. De acuerdo con la patente de Estados Unidos 6,497,902, el agente que libera calcio puede ser D-glucono-8-lactona (GDL).

El metodo descrito en la patente de Estados Unidos 6,497,902 puede usarse para inmovilizar espermatozoides utiles para la inseminacion artificial (por ejemplo, para la preparacion de los hidrogeles de alginato descritos en el documento WO 2008/004890). Por ejemplo, pueden adicionarse espermatozoides diluidos y enfriados (4 °C) a una solucion que comprende alginato de sodio disuelto y carbonato de calcio suspendido, y opcionalmente un crioprotectortal como glicerol, y despues iniciar la gelificacion y obtencion del hidrogel de alginato deseado mediante adicion de una solucion que comprende GDL. La adicion de GDL resulta en la formacion de acido gluconico que a su vez reaccionara con el agua y formara H³O⁺. El aumento de H³O⁺, y la presencia de carbonato de calcio, resulta en la liberacion de CO²y Ca²⁺. El suministro de Ca²⁺mediante adicion de GDL resulta en la formacion del hidrogel de alginato con espermatozoides incrustados.

Despues de producirse la gelificacion, los recipientes llenos de espermatozoides incrustados en alginato pueden crioconservarse en nitrogeno lfquido, lo que proporciona asf la crioconservacion de espermatozoides que tienen una vida util excepcionalmente larga.

Sin embargo, los presentes inventores tienen experiencia que el uso de GDL en la preparacion de hidrogeles de alginato de acuerdo con el metodo descrito en la patente de Estados Unidos 6,497,902 implica varios inconvenientes. Cuando se prepara un gel de alginato que comprende espermatozoides inmovilizados de acuerdo con el metodo descrito anteriormente, es vital que se adicione GDL a la solucion inmediatamente despues de que se prepare la solucion de GDL para evitar la gelificacion espontanea. GDL debe adicionarse en forma disuelta en lugar de en polvo para evitar areas/zonas locales con altas concentraciones de acido gluconico inicialmente, lo que sena perjudicial para los espermatozoides. Ademas, despues de la adicion de GDL, seguira un penodo de aumento de la viscosidad como resultado del inicio de la reaccion de gelificacion. Debido al aumento de la viscosidad, el recipiente usado para formar el hidrogel debe llenarse con bastante rapidez. Durante el tiempo acumulado para transformar la GDL disuelta en acido glucuronico, la solucion se transfiere, por lo tanto, a recipientes adecuados (tal como por ejemplo, mini pajuelas suministradas por IMV, L'Aigle, Francia) para la posterior gelificacion e inmovilizacion del material biologico deseado. El metodo descrito en la tecnica anterior resulta, por lo tanto, en un programa de tiempo bastante corto e inflexible para preparar los hidrogeles que comprenden el material biologico deseado y son una desventaja sustancial desde un punto de vista industrial.

Debido a los inconvenientes del metodo descrito anteriormente, existe la necesidad de un metodo mejorado para preparar hidrogeles, particularmente un metodo que sea adecuado para preparar hidrogeles a escala industrial.

Otros diversos metodos para preparar hidrogeles se han descrito en la tecnica anterior. Diversos informes describen la utilizacion de enzimas que, al someterse a un sustrato espedfico, proporcionan diversas reacciones que al final resulta en la union cruzada de varios tipos de polfmeros.

Por ejemplo, el documento CN 101439206 describe, entre otras cosas, el uso de polfmeros que comprenden una unidad de hidroxilo fenolico y dioxigenasa en un proceso catalizado por enzimas para la preparacion de geles de polfmeros.

Johnsen y otros (2010), ACS Applied Materials & Interfaces, 2 (7), pags. 1963-1972, informan la preparacion de hidrogel a base de PEG que se polimeriza con el uso de glucosa oxidasa. La glucosa oxidasa cataliza la oxidacion de la p-D-glucosa, y el uso posterior de oxfgeno para generar el cofactor de la enzima dinucleotido de flavina y adenina, resulta en la formacion de H²O². Mediante la combinacion de iones ferrosos con esta produccion enzimatica de H²O², se producen especies de radicales hidroxilo primarios que reaccionan aun mas con los monomeros acrilados.

El uso de H²O²y la peroxidasa de rabano picante en la preparacion de hidrogeles se ha informado ademas, consultar, por ejemplo Kurisawa y otros, (2010), J. of Materials Chemistry, 20 (26), pags. 5371-5375, Sakai y otros, (2009), Biomaterials, 30 (20), pags. 3371-3377, Sakai y Kawakami (2006), Acta Biomaterialia, 20017, 3, pags. 495-501, Lee y otros (2009), J. of Controlled Release, 134, pags. 186-193, Wang y otros (2010), Biomaterials, 31, pags. 1148-1157.

Los hidrogeles preparados mediante el uso de oxidasas y H²O²son inapropiados para algunas aplicaciones ya que H²O²es un oxidante fuerte.

Por lo tanto, todavfa existe la necesidad de un proceso mejorado y simplificado para la preparacion de hidrogeles de alginato, particularmente hidrogeles adecuados para inmovilizar material biologico.

Resumen de la invencion

El objeto de la presente invencion es proporcionar un proceso mejorado para preparar hidrogeles de alginato que no ocasione los inconvenientes de los procesos de la tecnica anterior.

Otro objeto de la presente invencion es proporcionar un proceso simplificado para la preparacion de hidrogeles de alginato adecuados para inmovilizar material biologico.

Por lo tanto, la invencion se refiere a un hidrogel de alginato en donde su gelificacion se inicia mediante la utilizacion de una lipasa y un sustrato hidrolizable por la lipasa lo que resulta en la formacion de H³O⁺y subsecuentemente la liberacion de un cation divalente debido a la presencia de un agente que libera cationes divalentes.

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona un proceso para la preparacion de un hidrogel de alginato, dicho proceso que comprende la mezcla de una solucion que comprende una lipasa con una solucion que comprende un sustrato hidrolizable por la lipasa, y en donde la solucion comprende la lipasa o la solucion que comprende el sustrato que es hidrolizable por la lipasa adicionalmente comprende alginato, y un compuesto que libera cationes divalentes, en donde el sustrato es un compuesto de la Formula I:

en donde Rⁱ, R²y R³independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C¹²lineal o ramificada, sustituida o no sustituida, y en donde el agente que libera cationes es un carbonato. Al mezclar las dos soluciones, la union del sustrato a la lipasa resulta en la hidrolisis de dicho sustrato y la subsecuente formacion de H³O⁺. La produccion de H³O⁺ademas, resulta en la liberacion de cationes divalentes que, de este modo, inicia la formacion del hidrogel.

De acuerdo con una modalidad, el compuesto que libera cationes divalentes y el alginato estan presentes en la solucion que comprende la lipasa. De acuerdo con una modalidad, el compuesto que libera cationes divalentes y el alginato estan presentes en la solucion que comprende dicho sustrato.

De acuerdo con una modalidad de la invencion, la lipasa usada en el proceso de acuerdo con la invencion es una triacilglicerol lipasa.

De acuerdo con aun otra modalidad de la invencion, el compuesto que libera cationes divalentes, es decir, el carbonato, libera cationes divalentes seleccionados del grupo que consiste en Ca²⁺, Ba²⁺, y Sr²⁺.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invencion, el compuesto que libera cationes divalentes es carbonato de calcio.

De acuerdo con aun una modalidad de la presente invencion, Rⁱ, R²y R³de la Formula I son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C⁴.

De acuerdo con una modalidad de la presente invencion, Rⁱ, R²y R³de la Formula I se selecciona del grupo que consiste en metanona, etanona, acetona, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona, nonanona, decanona, o dodecanona.

Particularmente, por ejemplo, cuando los espermatozoides deben incrustarse en el hidrogel de alginato, el compuesto de la Formula I puede seleccionarse del grupo que consiste en triacetina, tripropionina y tributirina, preferentemente tripropionina y tributirina.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invencion, la solucion que comprende la lipasa o la solucion que comprende el compuesto de la Formula I que es hidrolizable por la lipasa puede comprender adicionalmente un objeto para incrustarse en el hidrogel de alginato.

El objeto a incrustar en el gel de alginato puede, de acuerdo con un aspecto de la invencion, representar material biologico, por ejemplo, material celulartal como espermatozoides.

De acuerdo con aun otra modalidad, se proporciona un proceso para preparar un hidrogel de alginato, que comprende la etapa de mezclar una solucion que comprende una lipasa con una solucion que comprende un sustrato hidrolizable por la lipasa, y en donde la solucion comprende dicha lipasa o la solucion que comprende dicho sustrato adicionalmente comprende alginato, y un compuesto que libera cationes divalentes, en donde el sustrato es un compuesto de la Formula

en donde Ri, R2y R3 independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C1-C12 lineal o ramificada, sustituida o no sustituida, y en donde el agente que libera cationes es un carbonato

Un hidrogel de acuerdo con la presente invencion puede prepararse mediante un proceso que comprende las etapas de

i) formar una primera solucion mediante dilucion de espermatozoides con una solucion que comprende una triacilglicerol lipasa;

ii) adicionar a la primera solucion obtenida en la etapa i), una segunda solucion que comprende alginato, un compuesto que libera cationes divalentes y un compuesto de la Formula I:

en donde Ri, R2y R3 independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C1-C12 lineal o ramificada, sustituida o no sustituida, iniciar la gelificacion;

iii) transferir la solucion obtenida en la etapa ii) a un recipiente para gelificar el hidrogel de alginato;

iv) opcionalmente someter el hidrogel de alginato de iii) a crioconservacion.

Un hidrogel de acuerdo con la presente invention puede prepararse mediante un proceso que comprende las etapas de i) formar una primera solucion mediante dilution de espermatozoides con una solucion que comprende un compuesto de la Formula I:

en donde Ri, R2y R3 independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C1-C12 lineal o ramificada, sustituida o no sustituida;

ii) adicionar a la solucion obtenida en la etapa i), una segunda solucion que comprende alginato, un compuesto que libera cationes divalentes y una triacilglicerol lipasa que inicia la gelificacion;

iii) transferir la solucion obtenida en ii) a un recipiente para la gelificacion del hidrogel de alginato;

iv) opcionalmente someter el hidrogel de alginato de iii) a crioconservacion.

La primera y segunda solucion de i) y ii) pueden comprender adicionalmente un crioprotector, y la solucion obtenida en iii) se somete ademas a crioconservacion. Ademas, cuando se preparan hidrogeles de alginato que comprenden espermatozoides de acuerdo con la presente invencion como se describe anteriormente, los recipientes obtenidos en iii) pueden ademas someterse a crioconservacion, y en donde la solucion de la etapa i) y/o de la etapa ii) comprende un crioprotector.

El crioprotector presente en la solucion de la etapa i) y/o de la etapa ii) puede seleccionarse del grupo que consiste en glicerol, etilenglicol, metanol, DMA, DMSO, propilenglicol, trehalosa, glucosa.

Cuando se preparan hidrogeles de alginato que comprenden espermatozoides de acuerdo con la presente invencion, el compuesto que libera cationes divalentes puede ser preferentemente carbonato de calcio, y el compuesto de la Formula I puede seleccionarse preferentemente del grupo que consiste en triacetina, tripropionina y tributirina.

De acuerdo con una modalidad de la presente invencion, el alginato es alginato que es rico en acido guluronico.

El hidrogel de alginato de acuerdo con la presente invencion puede comprender en una modalidad de la invencion: a. alginato;

b. un objeto a incrustar en el hidrogel de alginato;

c. una lipasa usada en la preparation del hidrogel de alginato.

El hidrogel de alginato de acuerdo con la presente invencion se forma mediante la gelificacion del alginato, y en donde la gelificacion se logra mediante la liberation de cationes divalentes de un carbonato que libera cationes divalentes como resultado de la hidrolisis de un sustrato de lipasa. El hidrogel formado comprendera asi la lipasa usada en la formation del gel. La presencia de lipasa en el hidrogel de acuerdo con la presente invencion indica, asi, que se ha aplicado el proceso de la invencion.

El hidrogel de alginato de acuerdo con la invencion comprende un objeto incrustado. De acuerdo con otra modalidad, dicho objeto a incrustar es un material biologico, tal como material celular, por ejemplo, espermatozoides.

De acuerdo con aun otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un kit de hidrogel de alginato que comprende un recipiente que comprende una lipasa y un segundo recipiente que comprende un sustrato hidrolizable por la lipasa, en donde el sustrato que se hidroliza por la lipasa es un compuesto de la Formula I:

en donde Rⁱ, R²y R³independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C¹², y en donde dicho kit comprende adicionalmente alginato y un carbonato que libera cationes divalentes.

Una modalidad de acuerdo con este aspecto de la presente invencion considera un kit de hidrogel de alginato que comprende un recipiente que comprende una solucion que comprende una lipasa, y un segundo recipiente que comprende una solucion que comprende alginato, un carbonato que libera cationes divalentes y un sustrato hidrolizable por la lipasa.

Aun otra modalidad de este aspecto considera un kit de hidrogel de alginato que comprende un recipiente que comprende una solucion que comprende un sustrato hidrolizable por una lipasa, y un segundo recipiente que comprende una solucion que comprende alginato, un carbonato que libera cationes divalentes y una lipasa.

Descripcion detallada de la invencion.

La presente invencion proporciona un nuevo metodo para preparar hidrogeles de alginato utiles para diversas areas de aplicaciones. Particularmente, la presente invencion proporciona un nuevo metodo para preparar hidrogeles que, particularmente, es util para incrustar e inmovilizar materiales biologicos.

Pueden usarse diversos tipos de alginato para preparar hidrogeles de acuerdo con la presente invencion. La proporcion de acido guluronico: acido manuronico no es cntica, es decir, el tipo de alginato y el contenido de acido guluronico frente el acido manuronico pueden seleccionarse en dependencia de la resistencia, estabilidad, capacidad de hinchamiento, caractensticas de erosion, etc. deseadas. El uso de alginatos ricos en G proporcionara, por ejemplo, hidrogeles mas fuertes, mas estables.

De acuerdo con una modalidad, el alginato usado para formar los hidrogeles es un alginato rico en acido guluronico. El termino "alginato que es rico en acido guluronico" o "alginato rico en G" como se usa en la presente descripcion denota al alginato que comprende mayores cantidades de acido guluronico en comparacion con acido manuronico en la cadena polimerica de polisacarido del alginato usado. Opuesto, el termino "alginato rico en M" o "alginato que es rico en acido manuronico" como se usa en la presente descripcion denota al alginato que comprende mayores cantidades de acido manuronico en comparacion con acido guluronico. El termino "rico" usado en relacion con alginatos que comprenden cantidades mayores de acido manuronico o de acido guluronico, respectivamente, es bien conocido y se usa comunmente por el experto en la tecnica, consultar, por ejemplo, Britt Iren Glaerum Svanem y otros, Journal of Biological Chemistry Vol 276, No 34, 24 de agosto de 2001 pags. 31542-31550, Sumita Jain y otros Molecular Microbiology (2003) 47 (4), pags.

1123-1133, Marco Mancini y otros Journal of Food Engineering 39 (1999) pp369-378, Microbiologfa Aplicada y Ambiental, septiembre de 1982, Vol. 44 No.3 pags.754-756, patente de Estados Unidos 5,639,467, solicitud de patente de Estados Unidos 2006/0159823, Ji Minghou (MH Chi) y otros Hydrobiologia 116/117 (1984), pags. 554-556.

Ejemplos no limitantes de tipos de alginatos adecuados para usar de acuerdo con la presente invencion son los alginatos de f Mc LF 10/40, FMC LF 10/60 y FMC LF 20/60 disponibles de FMC Biopolymer AS, Drammen, Noruega, A2033 de Sigma, Oslo, Noruega, o Pronova UP MYG, Pronova UP LVG disponibles de, por ejemplo, NovaMatrix, Sandvika, Noruega.

La funcion del hidrogel de alginato de acuerdo con la presente invencion es independiente de la forma tridimensional del hidrogel formado, es decir, el hidrogel de alginato puede tener diferentes formas, tales como, por ejemplo, una forma esferica o cilmdrica. Pueden obtenerse varias formas del gel de alginato en dependencia del recipiente usado para la gelificacion.

Ademas, de acuerdo con la presente invencion, pueden usarse otros polfmeros que, al someterse a una enzima y un sustrato resultan en la liberacion de hidrogeles en forma de cationes divalentes.

De acuerdo con la presente invencion, una lipasa, junto con un sustrato adecuado para la misma, se usa para iniciar la gelificacion del alginato. El termino "hidrolasa", como se usa en la presente descripcion, pretende abarcar una lipasa que permite la produccion de H³O⁺cuando se mezcla una solucion que comprende sustrato(s) con otra solucion que comprende la lipasa. De acuerdo con aun otra modalidad de la presente invencion, la lipasa es una acil hidrolasa, con mayor preferencia una triaciigMceroi lipasa, tal como, por ejemplo, la triacilglicerol lipasa aislada de la levadura Candida rugosa. Una lipasa adecuada esta disponible de Sigma-Aldrich Co. LLC (L1754 - Tipo VII o L3001 Tipo I, numero CAS 9001-62-1).

Debe entenderse que puede usarse cualquier hidrolasa que resulte en una produccion neta de H³O⁺tras la hidrolisis de su sustrato. Por lo tanto, una hidrolasa puede seleccionarse del grupo que consiste en hidrolasas de esteres carboxflicos, glicosidasas y enzimas que actuan sobre enlaces carbono-carbono en sustancias cetonicas.

Ejemplos no limitantes de hidrolasas de esteres carboxflicos son la carboxilesterasa, triglicerol lipasas, acetil esterasa, esterol esterasa, L-arabinonolactonasa, gluconolactonasa, acilglicerol lipasa, g-acetilglucosa deacetilasa, lipoprotema lipasa, acil etil ester graso sintasa, y diacilglicerol acil hidrolasa.

Ejemplos no limitantes de hidrolasas que actuan sobre los enlaces carbono-carbono en sustancias cetonicas son acilpiruvato hidrolasa y acetil piruvato hidrolasa.

Un ejemplo no limitante de una glicosidasa es la a-galacturonidasa.

Cuando se forma el gel de alginato de acuerdo con la presente invencion, la lipasa y el sustrato de esta estan presentes en diferentes soluciones, que al mezclar resultan en el inicio del proceso de gelificacion, y en donde una de dichas dos soluciones comprende adicionalmente alginato y un compuesto que libera cationes divalentes. La secuencia de la mezcla, es decir, si la solucion que comprende la enzima se adiciona a una solucion que comprende el sustrato, o viceversa, o si es la solucion que comprende la enzima, que ademas comprende alginato y el compuesto que libera cationes divalentes, o viceversa, no es critica.

El sustrato usado en la formacion de un hidrogel de alginato de acuerdo con la presente invencion es un sustrato que al unirse a la enzima resulta en la produccion de H³O⁺. Por lo tanto, el sustrato puede variar en dependencia del tipo de lipasa usada de acuerdo con la presente invencion.

De acuerdo con la presente invencion, el sustrato es un compuesto de la Formula I:

en donde R¹, R²y R³independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C¹²lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, tal como, por ejemplo, metanona, etanona, acetona, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona, nonanona, decanona, dodecanona, etc. De acuerdo con una modalidad, R¹, R², y R³cada uno son metanona. De acuerdo con otra modalidad, R¹, R², y R³cada uno son etanona. De acuerdo con aun otra modalidad, R¹, R², y R³son acetona. Los sustratos de la Formula I son particularmente utiles cuando se forman hidrogeles de alginato con el uso de una triacilglicerol lipasa.

Al unirse a la enzima presente en el primer diluyente, dicho ester de la Formula I se divide en glicerol y un acido carboxflico, es decir, proporciona asf H³O⁺.

La cadena de alquil carbonilo puede ser ramificada o no ramificada. La cadena de alquil carbonilo puede estar ademas sustituida o no sustituida. El experto en la tecnica reconocera, en base a las ensenanzas en la presente descripcion, que pueden usarse diversos sustratos cubiertos por la formula I y pueden seleccionar en base a las ensenanzas en la presente descripcion, el sustrato apropiado para usar de acuerdo con la presente invencion. El experto en la tecnica reconocera que la longitud de la cadena de alquilo puede variar sin afectar la capacidad de la enzima para producir glicerol y un acido carboxflico del sustrato, lo que resulta asf en la liberacion de iones de H³O⁺.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invencion, el sustrato se selecciona del grupo de triacetina, tripropionina y tributirina, de las formulas:

Asf, de acuerdo con una modalidad, Rⁱ, R²y R³representan alquil carbonilo C¹-C⁴.

De acuerdo con aun otra modalidad de la presente invencion, el sustrato presente se selecciona del grupo que consiste en tripropionina y tributirina.

De acuerdo con la presente invencion, la mezcla de la lipasa y el sustrato definido anteriormente resulta en la produccion de H³O⁺. Dicho H³O⁺ademas resulta en la liberacion de cationes divalentes a partir del agente que libera cationes divalentes. El termino agente que libera cationes divalentes pretende abarcar compuestos que resultan en la liberacion de, por ejemplo, Ca²⁺, Br²⁺o Sr²⁺.

El agente que libera cationes divalentes es una sal de carbonato, tales como CaCO³, BrCO³o SrCO³. De acuerdo con una modalidad preferida, el agente que libera cationes divalentes es un agente que libera calcio, tal como, por ejemplo, carbonato de calcio.

De acuerdo con una modalidad de la presente invencion, el metodo de la presente invencion proporciona la incrustacion de diversos materiales en la matriz polimerica del hidrogel. El termino "incrustar" o "incrustacion" como se usa en la presente descripcion debe entenderse como inmovilizacion de un material en los hidrogeles de alginato de la presente invencion, y en donde la red de alginato esta presente en todo el diametro del hidrogel (en contraste con la encapsulacion en donde el hidrogel forma una pared alrededor de un nucleo lfquido que no comprende una red de polfmeros).

Debe entenderse que el termino material biologico abarca cualquiertipo de material biologico adecuado para inmovilizarse o encapsularse en hidrogeles biocompatibles. Una lista no limitante de material biologico es, por ejemplo, celulas para trasplante, tales como, por ejemplo, celulas productoras de insulina, celulas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales o espermatozoides para utilizacion en inseminacion artificial y otras tecnologfas de reproduccion.

En caso de que el material a incrustar sean espermatozoides, la incrustacion resulta en que se previene que los espermatozoides tengan su posibilidad natural de movimiento. El grado de inmovilizacion puede variar en dependencia de las caractensticas del hidrogel de alginato, tal como la resistencia mecanica y la capacidad de desintegrarse, por ejemplo, despues de la inseminacion en un animal receptor.

De acuerdo con una modalidad preferida, el material biologico a inmovilizar de acuerdo con el presente proceso es espermatozoide. Los espermatozoides inmovilizados en un hidrogel de alginato preparado de acuerdo con la presente invencion pueden opcionalmente crioconservarse para su almacenamiento en nitrogeno lfquido. El hidrogel de alginato que comprende espermatozoides inmovilizados preparados de acuerdo con la presente invencion puede prepararse en dosis de inseminacion listas para usar mediante inmovilizacion de una cantidad adecuada de espermatozoides en el hidrogel de alginato, y llevar a cabo la gelificacion en un recipiente, tal como una pajuela comunmente usada en procedimientos de inseminacion artificial con el tamano, forma y volumen deseados.

Para incrustar (inmovilizar) espermatozoides en un hidrogel de acuerdo con una modalidad de la presente invencion, los espermatozoides se diluyen despues de la recoleccion en un diluyente que comprende la enzima o el sustrato. Dicha solucion diluida de espermatozoides se enfna opcionalmente a aprox. 4 °C. La solucion usada para diluir los espermatozoides se denomina ademas en la presente descripcion solucion diluyente (consultar, por ejemplo, el Ejemplo 1).

De acuerdo con una modalidad preferida de la invencion, los espermatozoides se diluyen primero en una solucion diluyente que no comprende el sustrato o la enzima. El sustrato o la enzima se adicionan despues en una segunda etapa de dilucion en donde la solucion diluyente entonces usada adicionalmente comprende la enzima o el sustrato.

De acuerdo con una modalidad, los espermatozoides se diluyen por segunda vez en una solucion diluyente que comprende la lipasa. La solucion asf obtenida se mezcla despues con una segunda solucion que comprende alginato, carbonato de calcio y opcionalmente un crioprotector, tal como glicerol, y un sustrato para la enzima presente en la primera solucion que comprende los espermatozoides diluidos y la enzima. Al adicionar y mezclar las dos soluciones, la enzima se unira al sustrato lo que resulta en la formacion de un acido y, asf, en un aumento en el nivel de H³O⁺. El carbonato de calcio que actua como un tampon evitara un aumento del pH lo que resulta en la liberacion de Ca²⁺y la produccion de CO². La liberacion de Ca²⁺resulta en la union cruzada de las cadenas de polisacaridos del alginato y, asf en la formacion del hidrogel de alginato.

Debe entenderse que los espermatozoides pueden diluirse ademas en una solucion diluyente que comprende el sustrato hidrolizable por la enzima a usar de acuerdo con la presente invencion, que despues se mezclan con una segunda solucion que comprende la enzima, carbonato de calcio y opcionalmente crioprotector.

Asf, los espermatozoides pueden diluirse primero en una solucion diluyente, y despues de eso someterse a una segunda dilucion mediante adicion de mas solucion diluyente que ademas comprende el sustrato. La solucion asf obtenida se mezcla despues con una solucion que comprende la enzima, alginato, carbonato de calcio y opcionalmente un crioprotector, tal como glicerol. Al mezclar las dos soluciones, se inicia la gelificacion.

La temperatura del disolvente usado para diluir los espermatozoides y la temperatura de las etapas adicionales de formacion del gel pueden variar en dependencia, por ejemplo, del tipo y la fuente de los espermatozoides. Asf, el proceso de la presente invencion puede llevarse a cabo en condiciones de refrigeracion o a temperatura ambiente (por ejemplo, 20- 24 °C) o incluso a una temperatura mas alta, como por ejemplo 30 - 35 °C.

El proceso de la presente invencion hace posible controlar la velocidad del proceso de gelificacion mediante la variacion de la cantidad de enzima usada. Adicionalmente, la concentracion del alginato usado influye en las caractensticas mecanicas del hidrogel formado y, por lo tanto, ademas en las caractensticas de disolucion del hidrogel. La concentracion de alginato asf puede variar en dependencia de las caractensticas deseadas del hidrogel, en dependencia de la rama de aplicacion del hidrogel. El experto en la tecnica en base a las ensenanzas en la presente descripcion, sera capaz de seleccionar la cantidad adecuada de enzima, sustrato y alginato a usar para obtener la resistencia deseada del gel y el tiempo deseado de gelificacion.

Por ejemplo, el uso de 3 g de triacilglicerol lipasa por litro y 0,3 - 1 g de sustrato por 100 ml en la solucion de espermatozoides/alginato obtenida despues de mezclar las dos soluciones de acuerdo con la presente invencion resulta en un tiempo de gelificacion de aproximadamente 2-3 horas cuando la solucion se mantiene aproximadamente a 4°C. La cantidad de sustrato puede variar adicionalmente de acuerdo con el tipo de enzima usada.

Adicionalmente, la cantidad de acido y asf la cantidad de H3O+ a producirse cuando la mezcla de las dos soluciones puede controlarse por la cantidad de sustrato presente en el segundo diluyente. Asf, es posible controlar tanto la velocidad de gelificacion como el pH final del proceso, lo que es una ventaja desde el punto de vista industrial. Esto proporciona un proceso de produccion mejorado y mas facil, ya que uno puede realizar la gelificacion siempre que sea adecuado desde el punto de vista de la produccion a medida que la gelificacion comienza cuando se mezclan los espermatozoides diluidos en una solucion diluyente que comprende lo mismo la enzima como el sustrato.

Para incrustar material biologico, debe entenderse que la solucion a mezclar puede comprender adicionalmente compuestos utiles, por ejemplo, para fines de conservacion, tales como, por ejemplo, antibioticos, diluyentes, antioxidantes, tampones, etc., ver documento WO 2008/004890.

La concentracion de material biologico, por ejemplo, celulas vivas, incrustadas en los hidrogeles de alginato de acuerdo con la presente invencion puede variar en dependencia del tipo/fuente del material. En el caso de incrustar espermatozoides, la concentracion puede variar aun mas en dependencia de la raza, el animal receptor, las tecnicas de inseminacion, la presencia de compuestos adicionales (por ejemplo, para fines de conservacion), etc., ver por ejemplo documento WO 2008/004890.

Aunque la presente invencion es espedficamente util para incrustar material biologico en forma de celulas o tejidos en un gel de alginato, debe entenderse que los geles de alginato preparados de acuerdo con la presente invencion tienen ademas una gama de otras aplicaciones, que incluyen la incrustacion o inmovilizacion de objetos aparte de material biologico, y ademas aplicaciones que implican a los hidrogeles per se. La presente invencion asf no debe interpretarse como limitada a las aplicaciones espedficamente descritas en los ejemplos de la descripcion.

Asf, otros objetos de interes pueden incrustarse ademas en un hidrogel de alginato preparado de acuerdo con la presente invencion. El termino "objeto a incrustar en el hidrogel de alginato" usado en la presente descripcion pretende abarcar cualquier material que sea adecuado para inmovilizarse en un hidrogel. Por ejemplo, en caso de que el hidrogel de alginato de acuerdo con la presente invencion se use como un sistema de liberacion controlada, el objeto a incrustar puede ser un ingrediente farmaceutico activo. Por ejemplo, los geles de alginato preparados de acuerdo con la presente invencion pueden usarse como un sistema de administracion de liberacion controlada o de liberacion sostenida para una gama de compuestos, tales como compuestos farmaceuticamente activos, ver, por ejemplo, los documentos WO98/46211, US 4,695,463, US 6,656,508. Un grupo no limitante de ingredientes farmaceuticamente activos para incrustarse en un hidrogel de alginato de acuerdo con la presente invencion son, por ejemplo, protemas o polipeptidos recombinantes o naturales, compuestos naturales o sinteticos o semisinteticos, tales como factores de crecimiento, hormonas, anticuerpos, interferones, interleucinas, etc. Los hidrogeles de alginato de acuerdo con la presente invencion pueden ademas tener utilidad dentro de la industria alimentaria, por ejemplo, para la incrustacion de nutrientes.

Los hidrogeles preparados de acuerdo con la presente invencion pueden ademas usarse como tales para otros fines industriales, tanto en la industria farmaceutica como en la cosmetica (por ejemplo, como agente espesante, en vendajes para heridas, en productos y metodos de salud dental), o en la industria de alimentos para humanos y animales (por ejemplo, en la preparacion de alimentos reestructurados, como agente espesante, etc.).

La presente invencion proporciona ventajas en comparacion con la tecnica anterior. Por ejemplo, cuando se usa la tecnica descrita en el documento US 6,497,902, la velocidad de reaccion, asf como la cantidad de acido producido, pueden estar influenciados al cambiar la concentracion de GDL. Sin embargo, los cambios en la concentracion de GDL ademas afectaran simultaneamente la cantidad de acido producido y, asf el pH final en el gel. La preparacion de un hidrogel de alginato con el uso de una enzima y un sustrato hidrolizable por dicha enzima para iniciar la gelificacion permite un control significativamente mejor de las velocidades de reaccion y de la cantidad de acido producido (el pH en el gel) en tanto la velocidad de reaccion y el pH final pueden controlarse individualmente mediante el cambio de la concentracion de enzima y sustrato, respectivamente.

De acuerdo con aun otro aspecto de la presente invencion, la presente invencion proporciona un kit de hidrogel de alginato que comprende un recipiente que comprende una lipasa y otro recipiente que comprende un sustrato hidrolizable por la lipasa, en donde el sustrato que se hidroliza por la lipasa es un compuesto de la Formula I:

en donde Ri, R2y R3 independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C1-C12, y en donde dicho kit comprende adicionalmente alginato y un compuesto que libera cationes divalentes.

El kit de acuerdo con la presente invencion puede contener ademas otros compuestos necesarios para moldear un hidrogel de alginato de acuerdo con la presente invencion. Asf, el kit puede comprender ademas alginato y un compuesto que libera cationes divalentes. Dichos compuestos pueden estar contenidos en el recipiente que comprende la lipasa, en el recipiente que comprende el sustrato hidrolizable por dicha lipasa, o pueden estar contenidos en recipiente(s) separado(s).

Los recipientes pueden comprender ademas otros compuestos de particular interes en dependencia del uso del hidrogel de alginato a moldear con el uso del kit de la presente invencion.

Por ejemplo, en caso de que el kit se use para moldear geles que contengan material biologico, como material celular, por ejemplo, espermatozoides, y en donde el hidrogel de alginato resultante se someta ademas a la crioconservacion, el kit puede contener ademas un crioprotector tal como, por ejemplo, glicerol, etilenglicol, metanol, DMA, DMSO, propilenglicol, trehalosa, glucosa. Dicho(s) crioprotectores pueden estar contenidos en el recipiente que comprende la lipasa, en el recipiente que comprende el sustrato hidrolizable por dicha lipasa, o pueden estar contenidos en recipiente(s) separado(s).

El kit puede comprender ademas otros compuestos utiles para fines de conservacion, tales como, por ejemplo, antibioticos, diluyentes, antioxidantes, tampones, etc., conocidos por los expertos en la tecnica, ver, por ejemplo, el documento WO 2008/004890.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion. Debe entenderse que los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invencion.

Ejemplo 1: Inmovilizacion de espermatozoides bovinos

Materiales y metodos

Materiales

Se usaron los siguientes productos qmmicos: trizma clorhidrato y EDTA de Sigma (St. Luis, Estados Unidos), NaHCO3, NaCl, glicerol (>99 %), citrato de sodio y piruvato de sodio de Riedel de Haen (Seelze, Alemania), fructosa y glucosa monohidratado de Norsk Medisinaldepot (Oslo, Noruega), carbonato de calcio de KSL staubtechnik gmbh (Lauingen, Alemania) y alginato de sodio (PROTANa L LF 10/60) de FMC Biopolymer A/S (Drammen, Noruega).

Fuente de espermatozoides

Se recolectaron espermatozoides bovinos en las instalaciones de Geno en Hallsteingard en Trondheim y en Store Ree en Stange, Noruega.

Soluciones tampon

Se usaron las siguientes soluciones diluyentes:

Diluyente para primera dilucion de espermatozoides: 1,45 g l-1 de Trizma clorhidrato glucosa, 0,4 g l-1 de citrato de sodio, 1 g l-1 de fructosa, 0,22 g l-1 de piruvato de sodio y 200 ml l-1 de yema de huevo. El pH de la solucion se ajusto a 6,4 por adicion de NaOH.

Solucion diluyente para dilucion secundaria de espermatozoides: 4 g l-1 de carbonato de calcio (a menos que se indique lo contrario), 54 g l-1 de fructosa, 170 g l-1de glicerol y 24 g l-1 de alginato de sodio LF10/60. Ambos diluyentes contienen un coctel antibiotico estandar que proporciona al menos la concentracion final requerida en dir UE 88/407. IVT modificada: 3 g l-1 de glucosa, 20 g l-1 de citrato de sodio, 2,1 g l-1 de NaHCOa, 1,16 g l-1 de NaCI, 3 g l-1 de EDTA, pH 7,35. Las soluciones diluyentes se adicionaron a la enzima (Sigma L1754) o al sustrato como se especifica mas abajo.

Dilucion, inmovilizacion y crioconservacion de espermatozoides de toro

Los espermatozoides bovinos se recolectaron en las instalaciones de Geno y se diluyeron como se describe mas abajo: Inmediatamente despues de la recoleccion, los espermatozoides se diluyeron a una concentracion de 219 x 106 celulas por ml en la solucion diluyente para una primera dilucion. Despues, esta solucion se mezclo inmediatamente con un volumen igual de diluyente para una dilucion adicional, donde dicho diluyente esta vez comprendfa enzima o sustrato. La solucion resultante que contema espermatozoides diluidos se enfrio despues a 4 °C.

Despues de enfriar a 4 °C, la solucion se mezclo con un volumen igual de la solucion diluyente para una tercera dilucion donde dicho diluyente esta vez comprendfa ya sea sustrato (triacetina, tripropionina o tributirina) si los espermatozoides diluidos de la etapa anterior comprendfan la enzima o enzima si los espermatozoides diluidos de la etapa anterior comprendfan el sustrato. Ademas, el diluyente esta vez comprendfa carbonato de calcio como un compuesto que libera cationes divalentes y alginato. Las soluciones resultantes se transfirieron despues a pajuelas de inseminacion y se equilibraron a 4 °C durante aproximadamente 3 horas. Las pajuelas de inseminacion se transfirieron despues a una nevera de N2 y se congelaron de acuerdo con procedimientos estandar para semen de toro.

Evaluacion de la movilidad

La movilidad de los espermatozoides se evaluo a traves de una evaluacion microscopica. Las pajuelas de semen congeladas se descongelaron mediante mantenimiento de las pajuelas en un bano de agua a 37 °C durante 30 segundos. Antes de la medicion, el gel de alginato se licuo en solucion de IVT modificada. El contenido de una pajuela de inseminacion se adiciono a 0,9 ml de solucion de IVT y se agito cuidadosamente en un tambor de tubos durante aproximadamente 10 minutos. Antes de evaluarla motilidad, los tubos se precalentaron durante un mmimo de 15 minutos en un bloque termico a 37 °C. Aproximadamente 3 pl de la solucion se adicionaron a un portaobjetos de microscopio precalentado e inmediatamente se inspecciono con el uso de un microscopio optico. El numero de espermatozoides moviles en cada muestra se estimo en el intervalo mas cercano de 5 %. Aunque fue practicamente posible, el operador estuvo desinformado de la identidad de la muestra durante la evaluacion.

Resultados

a) Inmovilizacion de espermatozoides bovinos con el uso de triacetina como sustrato

Los espermatozoides se recogieron y se diluyeron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. A la solucion diluyente para la segunda dilucion se adiciono enzima (Sigma L1754) a una concentracion de 6 g l-1 en la solucion final que contema espermatozoides. La solucion diluyente para la tercera dilucion contema 8 g l-1 de carbonato de calcio y se adiciono triacetina a una concentracion de 0,5 g/100 ml. Aproximadamente 4 horas despues de la dilucion secundaria, se formo un gel que inmovilizo a los espermatozoides. Despues de aproximadamente 24 horas de almacenamiento a 4 °C, el gel se licuo y se evaluo la motilidad de los espermatozoides inmovilizados. Aproximadamente 60 % de los espermatozoides eran moviles en ese momento.

b) Inmovilizacion de espermatozoides bovinos con el uso de tripropionina como sustrato

Los espermatozoides se recolectaron, se diluyeron, se inmovilizaron y se crioconservaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. A la solucion diluyente para la segunda dilucion se adiciono enzima (Sigma L1754) a una concentracion de 6 g l-1 en la solucion final que contema espermatozoides diluidos. La solucion diluyente para la tercera dilucion contema 4 g l-1 de carbonato de calcio y se adiciono tripropionina a una concentracion de 0,30 g/100 ml. Aproximadamente 3 horas despues de la dilucion secundaria, se formo un gel y se congelaron las pajuelas que conteman los espermatozoides inmovilizados. Las pajuelas de semen se almacenaron en N2 lfquido durante varios dfas hasta la descongelacion y valoracion de la motilidad. Aproximadamente 60 % de los espermatozoides eran moviles despues de descongelar y licuar el gel.

c) Inmovilizacion de espermatozoides bovinos con el uso de tripropionina como sustrato

Los espermatozoides se recolectaron, se diluyeron, se inmovilizaron y se crioconservaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. A la solucion diluyente para la segunda dilucion se adiciono tripropionina a una concentracion de 0,30 g/100 ml en la solucion final que contema espermatozoides diluidos. La solucion diluyente para la tercera dilucion contema 4 g l-1 de carbonato de calcio y se adiciono enzima Sigma L1754 a una concentracion de 6 g l-1. Aproximadamente 2 horas despues de la dilucion secundaria, se formo un gel. Despues de aproximadamente 24 horas de almacenamiento a 4 °C, el gel se licuo y se evaluo la motilidad de los espermatozoides inmovilizados. Aproximadamente 60 % de los espermatozoides eran moviles en ese momento.

d) Inmovilizacion de espermatozoides bovinos con el uso de tributirina como sustrato

Los espermatozoides se recolectaron, se diluyeron, se inmovilizaron y se crioconservaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. A la solucion diluyente para la segunda dilucion se adiciono enzima (Sigma L1754) a una concentracion de 6 g l-1 en la solucion final que contema espermatozoides diluidos. La solucion diluyente para la tercera dilucion contema 4 g l-1 de carbonato de calcio y se adiciono tributirina a una concentracion de 0,35 g/100 ml. Aproximadamente 3 horas despues de la dilucion secundaria, se formo un gel y se congelaron las pajuelas que conteman los espermatozoides inmovilizados. Las pajuelas de semen se almacenaron en N2 lfquido durante varios dfas hasta la descongelacion y valoracion de la motilidad. Aproximadamente 60 % de los espermatozoides eran moviles despues de descongelar y licuar el gel.

Ejemplo 2 Preparacion controlada de gel de alginato de calcio con el uso de enzimas de lipasa y sustratos de triacetina o trioctanoato

Materiales y metodos

Materiales

Alginato de sodio (PROTANAL LF 10/60) de FMC Biopolymer A/S (Drammen, Noruega), enzimas L3001 y L1754 de Sigma (St. Luis, Estados Unidos), Triacetina y trioctanoato de Sigma (St. Luis, Estados Unidos), carbonato de calcio de KSL staubtechnik gmbh (Lauingen, Alemania)

Soluciones

Se usaron las siguientes soluciones. Solucion L1.1: 10 g l-1 de solucion de enzima L3001 en agua destilada, solucion L1.2: 0,2 g l-1 de triacetina en agua destilada. Solucion L2.1: 4 g l-1 de carbonato de calcio, 24 g l-1 de alginato de sodio LF10/60 y 0,1 g l-1 de triacetina en agua destilada. Solucion L2.2: 4 g l-1 de carbonato de calcio, 24 g l-1 de alginato de sodio LF10/60 y 0,2 g l-1 de triacetina en agua destilada. Solucion L2.3: 4 g l-1 de carbonato de calcio, 24 g l-1 de alginato de sodio LF10/60 y 0,3 g l-1 de triacetina en agua destilada. Solucion L2.4: 4 g l-1 de carbonato de calcio, 24 g l-1 de alginato de sodio LF 10/60 y 10 g l-1 de enzima L3001 en agua destilada. Solucion L2.5: 4 g l-1 de carbonato de calcio, 24 g l-1 de alginato de sodio LF10/60 y 0,3 g l-1 de trioctanoato en agua destilada.

Iniciacion de la gelificacion

La gelificacion se inicio mediante la mezcla de una de las soluciones L1 con un volumen igual de una de las soluciones L2. Las soluciones se mezclaron de acuerdo con la Tabla 1.

Tabla 1: Ensayos experimentales con gelificacion mediante el uso de enzima L3001 y sustrato de triacetina. Las combinaciones de soluciones investigadas se muestran en la tabla, asf como tambien las concentraciones de enzima y sustrato de triacetina usadas.

Prueba Soluciones Concentraciones

1 L1.1 L2.1 10 g l-1 de enzima L3001, 0,1 g l-1 de triacetina

2 L1.1 L2.2 10 g l-1 de enzima L3001, 0,2 g l-1 de triacetina

3 L1.1 L2.3 10 g l-1 de enzima L3001, 0,3 g l-1 de triacetina

4 L1.2 L2.4 0,2 g l-1 de triacetina, 10 g l-1 de enzima L3001

5 L1.2 L2.2 0,2 g l-1 de triacetina, 0,2 g l-1de triacetina (sin enzima anadida)

6 L1.3 L2.5 10 g l-1 de enzima L1754, 0,4 g l-1 de trioctanoato

Todas las soluciones estaban a temperatura ambiente antes de mezclarse, y las soluciones se dejaron a temperatura ambiente para su gelificacion. El curso de tiempo de la reaccion de gelificacion se seguio por inspeccion visual de las soluciones.

Resultados

Las enzimas L3001 (lipasa del germen detrigo) y L1754 (lipasa de Candida rugosa) y los sustratos triacetina y trioctanoato se usaron para la gelificacion controlada de las soluciones de alginato de sodio. Las soluciones de enzima y sustrato se prepararon y mezclaron de acuerdo con la Tabla 1. La reaccion entre enzima y sustrato produce iones H³O⁺que reaccionan con el carbonato de calcio suspendido en las soluciones. Esta reaccion libera iones de calcio que interaction con las cadenas de polfmeros de alginato en la solucion y se forma un gel. Los tiempos observados antes de que se formara un gel en los ensayos experimentales se muestran en la Tabla 2. No se formo ningun gel en el ensayo experimental 5 en el que no se adicionaron enzimas. Los resultados muestran que el tiempo de reaccion esta en dependencia tanto del tipo de sustrato como de la enzima seleccionada as ^ como tambien de las concentraciones de enzima y sustrato usadas.

Tabla 2: El tiempo observado antes de la gelificacion transcurre despues de mezclar soluciones que contienen enzimas (Sigma L3001 o L1754) y/o sustrato (triacetina o trioctanoato).

Prueba Soluciones Tiempo para la formacion de gel (h:m)

1 L1.1 L2.1 2:00

2 L1.1 L2.2 1:50

3 L1.1 L2.3 1:30

4 L1.2 L2.4 1:50

5 L1.2 L2.2 No se formo gel

6 L1.3 L2.5 0:30

Claims

Reivindicaciones

1. Uso de una lipasa y un sustrato que es hidrolizable por la lipasa y un agente que libera cationes divalentes en la preparacion de un hidrogel de alginato, en donde el sustrato es un compuesto de la Formula I:

en donde Rⁱ, R²y R³independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C¹²lineal o ramificada, sustituida o no sustituida, y en donde el agente que libera cationes divalentes es un carbonato.

2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la lipasa es una triacilglicerol lipasa.

3. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la hidrolisis del compuesto de la Formula I por la lipasa resulta en la produccion de H³O⁺.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R¹, R², y R³se seleccionan del grupo que consiste en metanona, etanona, acetona, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona, nonanona, decanona, o dodecanona.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R¹, R²y R³independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C⁴.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto de la Formula I se selecciona del grupo que consiste en triacetina, tripropionina y tributirina, preferiblemente tripropionina y tributirina.

7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la lipasa y el compuesto de la Formula I se usan en la preparacion de un hidrogel de alginato que incrusta material biologico, preferentemente espermatozoides.

8. Un proceso para preparar un hidrogel de alginato, que comprende la etapa de mezclar una solucion que comprende una lipasa con una solucion que comprende un sustrato hidrolizable por la lipasa, y en donde la solucion que comprende dicha lipasa o la solucion que comprende dicho sustrato adicionalmente comprende alginato, y un compuesto que libera cationes divalentes, en donde el sustrato es un compuesto de la Formula I:

en donde R¹, R²y R³independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C¹²lineal o ramificada, sustituida o no sustituida, y en donde el agente que libera cationes divalentes es un carbonato.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde la solucion que comprende la lipasa comprende un carbonato que libera cationes divalentes y alginato.

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde la solucion que comprende el compuesto de la Formula I comprende un carbonato que libera cationes divalentes y alginato.

11. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde R¹, R², y R³se selecciona del grupo que consiste en metanona, etanona, acetona, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona, nonanona, decanona, o dodecanona.

12. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde R¹, R²y R³independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C⁴.

13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde el compuesto de la Formula I se selecciona del grupo que consiste en triacetina, tripropionina y tributirina, preferentemente tripropionina y tributirina.

14. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-13, en donde el carbonato que libera cationes divalentes es carbonato de calcio.

15. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 - 13 , en donde la solucion que comprende la lipasa o la solucion que comprende el compuesto de la Formula I comprende adicionalmente un objeto a incrustar en el hidrogel de alginato.

16. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde el objeto a incrustar en el gel de alginato es material biologico, tal como espermatozoides.

17. Un hidrogel de alginato que comprende

a) alginato;

b) un objeto a incrustar en el hidrogel de alginato; y

c) una lipasa usada en la preparacion del hidrogel de alginato.

18. Un hidrogel de alginato de acuerdo con la reivindicacion 17, en donde el objeto a incrustar en el gel de alginato es material biologico, preferentemente espermatozoides.

19. Un kit de hidrogel de alginato que comprende un recipiente que comprende una lipasa y un segundo recipiente que comprende un sustrato hidrolizable por la lipasa, en donde el sustrato que se hidroliza por la lipasa es un compuesto de la Formula I:

en donde R¹, R²y R³independientemente son iguales o diferentes y representan una cadena de alquil carbonilo C¹-C¹², y en donde dicho kit comprende adicionalmente alginato y un carbonato que libera cationes divalentes.