CN104126015A - 使用脂肪酶制备水凝胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种改进的用于制备水凝胶,例如藻酸盐水凝胶的方法。本发明的水凝胶特别用于生物材料,例如细胞材料,如***的固定和保存。
Description
发明领域
本发明涉及一种改进的用于制备水凝胶,特别是藻酸盐水凝胶的方法。本发明的水凝胶具有广泛的应用领域,并且特别用于生物材料的固定化,更具体而言,用于细胞物质例如***的固定化和保存。
发明背景
水凝胶由形成亲水性的含水网络的聚合物链构成,其在多个工业领域,特别是生物技术和制药业中具有广泛的应用。例如,水凝胶被用于固定生物材料(例如细胞)以用于移植或作为例如药物活性成分或营养成分的递送***。水凝胶也可以用作伤口敷料。此外,水凝胶,特别是藻酸盐水凝胶,被广泛地用作增稠剂。
广泛使用的用于形成水凝胶的聚合物为藻酸盐。藻酸盐为天然存在的阴离子多糖,其由1,4-联-β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-葡萄糖醛酸(G)构成(and1990,Trends in biotechnology,第8卷,第3期,第71-78页)。市售的藻酸盐提取自海藻,例如褐藻(Ascophyllumnodosum)、巨藻(Macrocystis pyrifera)和北极海带(Laminariahyperborea),部分提取自扎掌状海带(Laminaria digitata)、福建种海带(Laminaria japonica)、Eclonia maxima、Lesonia negrescens和马尾藻(Sargassum sp)。
藻酸盐还可由一些藻酸盐产生菌制备,例如由一些假单胞菌属(Pseudomonas species)以及由棕色固氮菌制备(Azotobacter vinelandii)(and1990,supra)。
藻酸盐通常尤其用于食品工业,例如作为用于粘度控制的稳定剂,或作为增稠剂。藻酸盐还可广泛地用于制药业和化妆品业,同样作为稳定剂、增稠剂或分解剂。基于不同目的,可分别获得富含古罗糖醛酸(guluronicacid)或甘露糖醛酸的藻酸盐(Mancini等(1999),Journal of FoodEngineering39,369-378、WO8603781、US 4,990,601、US 5,639,467)。
由于在二价阳离子例如钙离子的存在下藻酸盐的生物相容性和凝胶能力,藻酸盐通常还可用于细胞的胶囊化(Nebel,R.L.,Balme,J.,Saacke,R.G.和Lim.F.(1985),J.Anim.Sci.60:1631-1639;Lim,F和Sun,A.M.,(1980)Science210:908-9100;WO 2006/106400;EP0922451;US6596310;Torre等(1998),S.T.P.Pharma Sciences,8(4),第233-236页;Torre等,(2000),Biomaterials,21,第1493-1498页;Torre等(2002),Journal of Controlled Release,85,第83-89页;Faustini等,(2004),Theriogenology,61,第173-184页;Weber等(2006),Journal of Biotechnology,123,第155-163页。
藻酸盐凝胶还用于固定各种材料。例如,WO2008/004890记载用于保存***的生物聚合物颗粒,并且其中生物材料被包埋在呈固态的聚合物颗粒中,并贯穿在整个颗粒的直径中。通过将***包埋在藻酸盐水凝胶中而不是将***胶囊化,使得***保存于胶囊的流体芯中,细胞被固定在藻酸盐凝胶网络中,因此限制了细胞在存储过程中的运动性。
藻酸盐水凝胶,例如用于各种材料的胶囊化或圈闭(entrapment)的藻酸盐凝胶,可以通过以下方法制备:将待圈闭的材料的溶液与海藻酸钠的溶液混合,然后将该溶液加入到含有多价阳离子的溶液中,所述多价阳离子通常为二价阳离子例如钙离子(例如CaCl2的溶液)(and 1990,supra)。
US6,497,902公开了另一种制备生物相容性水凝胶(例如藻酸盐水凝胶)的方法,其包含将待包埋的细胞、藻酸盐和钙释放剂彼此混合,之后将钙释放化合物加入到所述混合物中形成交联凝胶。根据US专利6,497,902,所述钙释放剂可以是D-葡萄糖-δ-内酯(GDL)。
在US专利6,497,902中公开的方法可用来固定用于人工授精的***(例如,用于制备公开于WO 2008/004890的藻酸盐水凝胶)。例如,稀释并冷却(4℃)的***可被加入到包含溶解的海藻酸钠和悬浮的碳酸钙以及任选地冷冻保护剂(例如甘油)的溶液中,然后通过加入包含GDL的溶液引发胶凝并获得所需的藻酸盐水凝胶。GDL的加入导致葡萄糖酸的形成,葡萄糖酸将与水反应而形成H3O+。H3O+的增加,以及碳酸钙的存在导致了CO2和Ca2+的释放。通过加入GDL而提供的Ca2+导致含有包埋的***的藻酸盐水凝胶的形成。
在凝胶已发生之后,充满包埋在藻酸盐中的***的容器可冷藏保存在液氮中,由此提供了具有特别长的保质期的***的冷藏保存。
然而,本发明人已体验到在根据US专利6,497,902中公开的方法制备藻酸盐水凝胶中使用GDL包括一些缺陷。当根据上述方法制备包含固定的***的藻酸盐凝胶时,在制备GDL溶液后立即将其加入溶液以避免自发的胶凝是关键的。GDL必须以溶解的形式加入而不是粉末的形式,从而避免最初局部区域/层区具有高浓度的葡萄糖酸,这将对***不利。此外,在GDL加入之后,胶凝反应开始后将伴随一段粘度升高的时期。由于粘度的增加,用于形成水凝胶的容器必须相当快地被充满。在将溶解的GDL转化葡萄糖醛酸的累积时间中,溶液因此被转移到适合的容器(例如,IMV,L’Aigle,France提供的微型吸管)以使所需的生物材料进一步胶凝和固定化。因此,现有技术中公开的方法确实导致制备包含所需生物材料的水凝胶的时间安排相当短且不灵活并且从工业的角度来看是主要的缺点。
由于上述方法的缺点,需要改进水凝胶的制备方法,特别是适合在工业规模上制备水凝胶的方法。
在现有技术中,已经记载制备水凝胶的各种其他方法。各种报道公开了一种酶的利用,所述酶在接触特定底物时提供了不同的反应,所述反应最终导致各种类型聚合物的交叉联(crossbinding)。
例如,CN 101439206公开了尤其是在酶催化方法中使用包含酚羟基单元和二氧化酶的聚合物以制备聚合物凝胶。
Johnsen等(2010)在ACS Applied Materials & Interfaces,2(7),第1963-1972页中报道了使用葡萄糖氧化酶进行聚合的基于PEG的水凝胶的制备。葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖的氧化,随后使用氧气来产生黄素腺嘌呤二核苷酸酶辅助因子,导致H2O2的生成。通过亚铁离子与这些酶催化的H2O2产物的结合,产生伯羟基基团物质,其进一步与丙烯酸酯单体反应。
还已报道了H2O2和辣根过氧化物酶在水凝胶制备中的用途,参见例如Kurisawa等,(2010),J.of Materials Chemistry,20(26),第5371-5375页;Sakai等,(2009),Biomaterials,30(20),第3371-3377页;Sakai and Kawakami(2006),Acta Biomaterialia,20017,3,第495-501页;Lee等(2009),J.of Controlled Release,134,第186-193页;Wang等(2010),Biomaterials,31,第1148-1157页。
由于H2O2是强氧化剂,通过使用氧化酶和H2O2制备的水凝胶并不适合某些应用。
因此,仍需要改进且简化的用于制备藻酸盐水凝胶,特别是适合于固定化生物材料的水凝胶的方法。
发明概述
本发明的目的是提供一种改进的用于制备藻酸盐水凝胶的方法,其不具有现有技术的方法的缺点。
本发明的另一个目的是提供一种简化的用于制备藻酸盐水凝胶的方法,该藻酸盐水凝胶适合于固定生物材料。
因此,本发明涉及一种藻酸盐水凝胶,其中其胶凝是通过以下方法进行引发:利用水解酶和可被水解酶水解的底物来形成H3O+、并随后由于二价阳离子释放剂的存在而释放二价阳离子。
根据本发明的一个方面,提供了一种制备藻酸盐水凝胶的方法,所述方法包括将含有水解酶的溶液与含有可被水解酶水解的底物的溶液混合,其中所述含有水解酶的溶液或含有可被水解酶水解的底物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。在两种溶液混合时,底物与水解酶结合导致所述底物的水解并随后形成H3O+。此外,H3O+的产生导致二价阳离子的释放,由此引发了水凝胶的形成。
根据一个实施方案,二价阳离子释放化合物和藻酸盐存在于包含水凝胶的溶液中。根据另一个实施方案,二价阳离子释放化合物和藻酸盐存在于包含所述底物的溶液中。
所述水解酶可以是酯酶,例如脂肪酶。根据本发明的一个实施方案,本发明的方法中使用水解酶为三酰基甘油脂肪酶。
根据本发明的又一个实施方案,二价阳离子释放化合物释放选自Ca2+、Ba2+、和Sr2+的二价阳离子。
根据本发明的另一个实施方案,二价阳离子释放化合物为钙释放化合物,例如碳酸钙。
根据本发明的又一个实施方案,底物为有机酸的酯。
根据本发明的又一个实施方案,提供一种方法,其包含以下步骤:将含有三酰基甘油脂肪酶的溶液与包含可被所述水解酶水解的底物的溶液进行混合,其中底物为式I的化合物:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12-烷基羰基链,并且其中包含所述脂肪酶的溶液或包含式I化合物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。根据一个实施方案,R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链、未取代的C1-C12-烷基羰基链,例如直链、未取代的C1-C3-烷基羰基链。
根据本发明的又一个实施方案,式I的R1、R2和R3相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C3-烷基羰基链。
根据本发明的一个实施方案,式I的R1、R2和R3选自甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮或十二烷酮。
特别是,例如当***被包埋于藻酸盐水凝胶中时,底物可选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯,优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
根据本发明的另一个实施方案,含有水解酶的溶液或含有可被水解酶水解的底物的溶液可另外包含待包埋在藻酸盐水凝胶中的目标物(object)。
根据本发明的一个方面,待包埋在藻酸盐凝胶中的目标物代表生物材料,例如细胞材料,如***。
根据本发明的一个实施方案,提供了一种制备包含***的藻酸盐水凝胶的方法,其中所述方法包含以下步骤:
i)通过用包含三酰基甘油脂肪酶的溶液稀释***而形成第一溶液;
ii)将包含藻酸盐、二价阳离子释放化合物和式I化合物的第二溶液加入到在步骤i)中获得的第一溶液中,引发胶凝:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12-烷基羰基链;
iii)将在步骤ii)中获得的溶液转移到用于胶凝藻酸盐水凝胶的容器中;
iv)任选地使iii)的藻酸盐水凝胶冷藏保存。
根据本发明的另一个实施方案,提供一种制备包含***的藻酸盐水凝胶的方法,其中所述方法包含以下步骤:
i)通过用包含式I化合物的溶液稀释***而形成第一溶液:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12-烷基羰基链;
ii)将包含藻酸盐、二价阳离子释放化合物和三酰基甘油脂肪酶的第二溶液加入到在步骤i)中获得的溶液中,引发胶凝;
iii)将在ii)中获得的溶液转移到用于胶凝藻酸盐水凝胶的容器中;
iv)任选地使iii)的藻酸盐水凝胶冷藏保存。
根据一个实施方案,i)和ii)的第一溶液和第二溶液另外地包含冷冻保护剂,并且使在iii)中获得的溶液进一步冷藏保存。此外,当根据本发明如上所述制备包含***的藻酸盐水凝胶时,iii)中获得的容器可进一步冷藏保存,并且其中步骤i)和/或步骤ii)的溶液包含冷冻保护剂。
根据本发明的这个实施方案,存在于步骤i)和/或步骤ii)的溶液中的冷冻保护剂可选自甘油、乙二醇、甲醇、DMA、DMSO、丙二醇、海藻糖、葡萄糖。
当根据本发明制备包含***的藻酸盐水凝胶时,二价阳离子释放化合物可优选为碳酸钙,并且可被水解酶水解的底物可优选选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
根据本发明的一个实施方案,藻酸盐为富含古罗糖醛酸的藻酸盐。
根据本发明的另一个方面,提供根据本发明制备的藻酸盐水凝胶。
在本发明的一个实施方案中,本发明的藻酸盐水凝胶可包含:
a.藻酸盐;
b.任选地包埋在藻酸盐水凝胶中的目标物;
c.藻酸盐水凝胶制备中使用的水解酶。
本发明的藻酸盐水凝胶通过藻酸盐的胶凝而形成,并且其中胶凝是通过水解酶底物水解而导致的从二价阳离子释放化合物释放二价阳离子而实现。因此,所形成的水凝胶将包含在凝胶形成中使用的水解酶。因此,在本发明的水凝胶中存在水解酶表明本发明的方法已被实施。
根据另一个实施方案,本发明的藻酸盐水凝胶包含被包埋的目标物。根据另一个实施方案,所述待包埋的目标物为生物材料,例如细胞材料,如***。
根据本发明的又一个实施方案,提供一种藻酸盐水凝胶试剂盒,其包含含有水解酶的第一容器和含有可被水解酶水解的底物的第二容器。
本发明该方面的一个实施方案涉及一种藻酸盐水凝胶试剂盒,包含第一容器,其包括含有水解酶的溶液;和第二容器,其包括含有藻酸盐、二价阳离子释放化合物和可被水解酶水解的底物的溶液。
这方面的又一个实施方案涉及一种藻酸盐水凝胶试剂盒,包含第一容器,其包括含有可被水解酶水解的底物的溶液;和第二容器,其包括含有藻酸盐、二价阳离子释放化合物和水解酶的溶液。
最后,本发明提供了水解酶和可被水解酶水解的底物在制备藻酸盐水凝胶中的用途。根据一个实施方案,该方面使用的酶为酯酶,例如脂肪酶,如三酰基甘油脂肪酶。
根据该方面的一个实施方案,本发明提供了水解酶和底物在制备包埋生物材料(优选***)的藻酸盐水凝胶中的用途。
发明详述
本发明提供了一种新的制备用于各种应用领域的藻酸盐水凝胶的方法。具体而言,本发明提供了一种新的制备特别是用于包埋和固定生物材料的水凝胶的方法。
各种类型的藻酸盐可用于制备本发明的水凝胶。古罗糖醛酸与甘露糖醛酸的比值并不是关键的,即藻酸盐的类型和古罗糖醛酸相对于甘露糖醛酸的含量可根据想要的强度、稳定性、溶胀性、侵蚀性等而选择。富含G的藻酸盐的使用例如将提供更强、更稳定的水凝胶。
根据一个实施方案,用于形成水凝胶的藻酸盐为富含古罗糖醛酸的藻酸盐。在本文中使用的术语“富含古罗糖醛酸的藻酸盐”或“富含G的藻酸盐”意指,在所使用的藻酸盐的多糖聚合物链中,与甘露糖醛酸相比,藻酸盐含有更高含量的古罗糖醛酸。相反,在本文中使用的术语“富含M的藻酸盐”或“富含甘露糖醛酸的藻酸盐”意指,与古罗糖醛酸相比,藻酸盐含有更高含量的甘露糖醛酸。与分别包含更高含量的甘露糖醛酸或古罗糖醛酸的藻酸盐相关所使用的术语“富含”是众所周知的并通常被本领域技术人员所使用,参见例如Britt IrenGlaerum Svanem等,Journal of Biological Chemistry,卷276,34期,2001年8月24日,第31542-31550页;Sumita Jain等,MolecularMicrobiology(2003)47(4),第1123-1133页;Marco Mancini等,Journalof Food Engineering,39(1999),第369-378页,Applied andEnvironmental Microbiology,1982年9月,卷44,3期,第754-756页;US专利5,639,467;US申请2006/0159823;Ji Minghou(M.H.Chi)等,Hydrobiologia,116/117(1984),第554-556页。
根据本发明使用的适合类型的藻酸盐的非限制性实例为购自FMC Biopolymer AS,Drammen,Norway的FMC LF10/40、FMC LF10/60和FMC LF20/60;购自Sigma,Oslo,Norway的A2033;或购自例如NovaMatrix,Sandvika,Norway的Pronova UP MYG、PronovaUP LVG藻酸盐。
本发明的藻酸盐水凝胶的功能与形成的水凝胶的三维形状无关,即藻酸盐水凝胶可具有不同的形状,例如球形或圆柱形。根据用于胶凝的容器可获得各种形状的藻酸盐凝胶。
根据本发明还可使用接触酶和底物导致二价阳离子释放而形成水凝胶的其他聚合物。
根据本发明,酶,即水解酶,与对其适合的底物一起被用于引发藻酸盐的胶凝。本文中使用的术语“水解酶”意在包含当含有底物的溶液与含有水解酶的另一溶液混合时能够产生H3O+的水解酶。根据本发明的一个实施方案,所述水解酶为脂肪酶。根据本发明的又一个实施方案,所述脂肪酶为酰基水解酶,更优选为三酰基甘油脂肪酶,例如由酵母皱褶念珠菌(Candida rugosa)分离出的三酰基甘油脂肪酶。适合的脂肪酶可购自Sigma-Aldrich Co.LLC(L1754-VII型号或L3001 I型号,CAS号9001-62-1)。
应理解根据本发明可使用在其底物的水解时可导致净产生H3O+的任何水解酶。可使用的水解酶因此可选自羧酸酯水解酶、糖苷酶、和作用于酮物质中的碳-碳键的酶。
羧酸酯水解酶的非限制性实例为羧酸酯酶、三甘油脂肪酶、乙酸酯酶、固醇酯酶、L-***糖酸内酯酶(L-arabinonolactonase)、葡萄糖酸内酯酶、酰基甘油脂肪酶、g-乙酰基葡萄糖脱乙酰基酶、脂蛋白脂肪酶、脂肪酰基乙酯合酶,以及二酰基甘油酰基水解酶。
作用于酮物质中的碳-碳键的水解酶的非限制性实例为酰基丙酮酸水解酶而且为乙酰丙酮酸水解酶。
糖苷酶的非限制性实例为a-半乳糖醛酸苷酶。
当根据本发明形成藻酸盐凝胶时,水解酶和其底物存在于不同溶液中,这两种溶液一经混合导致胶凝过程的引发,并且其中所述两种溶液中的一种另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。混合的顺序,即含有酶的溶液加入到含有底物的溶液中或与之相反,或是包含酶的溶液另外地含有藻酸盐和二价阳离子释放化合物或与之相反,并不是关键的。
在本发明的藻酸盐水凝胶的形成中使用的底物为一经结合至酶上即导致H3O+产生的底物。因此底物可根据本发明所使用的水解酶的类型而变化。
本发明适合的水解酶为例如羧酸的有机酸的酯。
根据本发明的一个实施方案,底物为式I的化合物:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12-烷基羰基链,例如甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十二烷酮等。根据一个实施方案,R1、R2和R3各自为甲酮。根据另一个实施方案,R1、R2和R3各自为乙酮。根据又一个实施方案,R1、R2和R3各自为丙酮。当根据本发明使用三酰基甘油脂肪酶作为水解酶形成藻酸盐水凝胶时,式I的底物是特别有用的。
所述式I的酯一经结合至存在于第一稀释剂中的酶上时,其***成甘油和羧酸,即由此提供H3O+。
烷基羰基链可以是支链或直链。此外,烷基羰基链可以被取代或未取代。技术人员应理解,基于本文的教导,可使用由式I所覆盖的各种底物并且可基于本文的教导来选择本发明适当的待用底物。因此技术人员将理解烷基链的长度可以变化而并不影响酶生产底物的甘油和羧酸、从而导致H3O+离子的释放的能力。
根据本发明的一个优选实施方案,底物选自下式的三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯:
因此,根据一个实施方案,R1、R2和R3代表C1-C4烷基羰基。
根据本发明的又一个实施方案,存在的底物选自三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
根据本发明,如上限定的水解酶与底物的混合导致H3O+的产生。所述H3O+进而导致二价阳离子从二价阳离子释放剂中释放。术语二价阳离子释放剂意在包含导致例如Ca2+、Br2+或Sr2+释放的化合物。
根据本发明的一个实施方案,二价阳离子释放剂为碳酸盐,例如CaCO3、BrCO3或SrCO3。根据一个优选的实施方案,二价阳离子释放剂为钙释放剂,例如碳酸钙。
根据本发明的一个实施方案,本发明的方法提供在水凝胶的聚合物基质中包埋各种材料。本文中使用的术语“被包埋”或“包埋”应理解为将材料固定在本发明的藻酸盐水凝胶中,并且其中藻酸盐网络贯穿水凝胶的整个直径存在(与其中水凝胶形成环绕液体芯的壁而不包含聚合物网络的胶囊化相反)。
术语生物材料可理解为包括适合于在生物相容性水凝胶中被固定或胶囊化的任何类型的生物材料。生物材料的非限制性列表为例如用于移植的细胞,如胰岛素分泌细胞、产生单克隆抗体的杂交瘤细胞,或者在人工授精和其他生殖技术中利用的***。
在待包埋的材料为***的情况下,包埋使得可防止***具有其天然的移动可能性。固定程度的变化取决于在藻酸盐水凝胶的特性,例如在受体动物中授精之后的例如机械强度和***能力。
根据一个优选的实施方案,根据本发明方法待固定的生物材料为***。在根据本发明制备的藻酸盐水凝胶中固定的***可任选地在液氮中冷藏保存而用于存储。根据本发明制备的包含固定的***的藻酸盐水凝胶可通过在藻酸盐水凝胶中固定适合量***并且在容器中进行胶凝而以即用的授精药剂的形式制备,所述容器例如在人工授精过程中通常使用的具有所需的尺寸、形状和体积的吸管。
根据本发明的一个实施方案,为了在水凝胶中包埋(固定)***,将***在收集之后在包含酶或底物的稀释剂中进行稀释。所述***的稀释溶液任选地被冷却到约4℃。在本文中用来稀释***的溶液还可称为填充剂溶液(extender solution)(参见,例如实施例1)。
根据本发明的一个优选实施方案,***首先在不含有底物或酶的填充剂溶液中稀释。然后将底物或者酶加入到第二个稀释步骤,在第二个稀释步骤中随后所使用的填充剂溶液另外地包含底物或者酶。
根据一个实施方案,***在包含酶水解酶的填充剂溶液中被第二次稀释。如此获得的溶液然后与第二溶液混合,该第二溶液包含藻酸盐、碳酸钙和任选地冷冻保护剂(例如甘油)和用于存在于包含稀释的***和酶的第一溶液的酶的底物。一经加入并混合这两种溶液,酶将结合至底物上并导致酸的形成,由此导致H3O+水平的增加。充当缓冲的碳酸钙可防止pH的增加,从而导致Ca2+的释放和CO2的产生。Ca2+的释放导致藻酸盐的多糖链的交叉联并因此形成藻酸盐水凝胶。
应理解***还可在填充剂溶液中被稀释,所述填充剂溶液包含可被本发明使用的酶水解的底物,然后将该溶液与包含酶、碳酸钙和任选冷冻保护剂的第二溶液混合。
因此,***可首先在填充剂溶液中稀释,然后通过加入另外包含底物的更多的填充剂溶液而进行第二次稀释。如此获得的溶液然后可与包含酶、藻酸盐、碳酸钙和任选地冷冻保护剂(例如甘油)的溶液混合。两种溶液一经混合,引发胶凝。
用于稀释***的溶剂的温度和形成凝胶的另一步骤的温度可取决于例如***的类型和来源而变化。因此,本发明的方法可在冷藏条件或室温(例如20-24℃)或甚至更高的温度(例如30-35℃)下进行。
本发明的方法使得可以通过改变酶的用量而对胶凝过程的速率进行控制。此外,所使用的藻酸盐的浓度影响所形成的水凝胶的机械特性,并因此还影响水凝胶的溶解特性。因此,藻酸盐的浓度根据水凝胶所需的特性、根据水凝胶的应用领域而变化。基于本文的教导,技术人员能够选择适合量的待用的酶、底物和藻酸盐以获得所需的凝胶强度和所需的胶凝时间。
例如,当溶液保持在约4℃时,在混合本发明的两种溶液之后获得的***/藻酸盐溶液中使用3g三酰基甘油脂肪酶/升和0.3-1g底物/100ml,可以使胶凝时间为约2-3小时。底物的量还可根据使用的酶的类型而变化。
此外,当混合两种溶液时产生的酸的量和由此导致的H3O+的量可通过第二稀释剂中存在的底物的量来控制。因此,可以控制本方法的胶凝速率和最终的pH值,这从工业角度上来看是有利的。这提供了一种改进的且更简单的生产方法,只要从生产的角度适合就可进行胶凝,当将在包含酶或底物的填充剂溶液中稀释的***混合时,胶凝即开始。
对于包埋生物材料,应理解待混合的溶液可另外地包含例如用于防腐目的的化合物,例如抗生素、填充剂、抗氧化剂、缓冲剂等,参见WO 2008/004890。
包埋在本发明的藻酸盐水凝胶中的生物材料(例如活细胞)的浓度可根据材料的类型/来源而变化。在包埋***的情况下,该浓度可进一步根据品种、受体动物、人工授精技术、存在的另外化合物(例如用于防腐目的)等而变化,参见WO 2008/004890。
尽管本发明尤其用于在藻酸盐凝胶中包埋呈细胞或组织形式的生物材料,但应理解根据本发明制备的藻酸盐凝胶还具有其他的应用范围,包括包埋或固定除生物材料外的其他目标物,以及还包括涉及水凝胶本身的应用。因此本发明不应被解释为限制于本说明书的实施例中所具体公开的应用。
因此,其他感兴趣的目标物还可被包埋在本发明制备的藻酸盐水凝胶中。本文所使用的术语“包埋在藻酸盐水凝胶中的目标物”意在包括任何适合固定在水凝胶中的材料。例如,在使用本发明的藻酸盐水凝胶作为受控释放体系的情况下,待包埋的目标物可以为药学活性成分。例如,本发明制备的藻酸盐凝胶可用作针对一系列化合物例如药学活性化合物的受控释放或持续释放递送体系,参见例如WO98/46211、US 4,695,463和US 6,656,508,其以引用的方式纳入本文。待包埋入本发明的藻酸盐水凝胶中的非限制性的药学活性成分为例如重组或天然存在的蛋白质或多肽,天然或合成或半合成的化合物,例如生长因子、激素类、抗体类、干扰素、白细胞介素等。本发明的藻酸盐水凝胶还可在食品工业中利用,例如用于营养成分的包埋。
本发明制备的水凝胶还可以其本身用于其他的工业目的,用于制药业或化妆品业(例如增稠剂、伤口敷料、牙齿保健产品和方法),或用于人类和动物食品工业(例如用于重组食品,如增稠剂等的制备)。
本发明提供了相对于现有技术的优势,例如,当使用US 6,497,902中所记载的技术时,可通过改变GDL的浓度来影响反应速率以及酸的生成量。然而,GDL浓度的变化还将同时影响酸的生成量并因此影响凝胶的最终pH。使用酶和可被该酶水解的底物以引发胶凝的藻酸盐水凝胶的制备能够显著更好的控制反应速率和酸的生成量(凝胶中的pH),这是因为反应速率和最终的pH可分别通过改变酶和底物的浓度而单独控制。
根据本发明的又一方面,本发明提供了一种藻酸盐水凝胶试剂盒,其包含一个含有水解酶的容器,和另一个包含可被水解酶水解的底物的容器。
本发明的试剂盒还可包含对于铸造本发明的藻酸盐水凝胶所必需的其他化合物。因此,该试剂盒还可包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。所述化合物可被包含于含有水解酶的容器中,包含于含有可被所述水解酶水解的底物的容器中,或它们可被包含于另外单独的容器中。
所述容器还可包含其他特别感兴趣的化合物,这取决于使用本发明的试剂盒而待铸造的藻酸盐水凝胶的用途。
例如,假使试剂盒被用于铸造包含生物材料,例如细胞材料,如***的凝胶,并且其中所形成的藻酸盐水凝胶将进一步进行冷藏保存,则该试剂盒可另外包含冷冻保护剂,例如甘油、乙二醇、甲醇、DMA、DMSO、丙二醇、海藻糖、葡萄糖。所述冷冻保护剂可包含在含有水解酶的容器中,包含在含有可被所述水解酶水解的底物的容器中,或它们可被包含于另外单独的容器中。
试剂盒还可包含用于防腐目的的其他化合物,例如本领域技术人员已知的抗生素、填充剂、抗氧化剂、缓冲剂等,参见WO 2008/004890。
为便于说明,给出以下的实施例。应理解以下实施例并不应解释为对本发明范围的限制。上文对本发明的各个实施方案的描述显示了本发明的一般本质,技术人员通过应用水凝胶领域的常识,无需大量实验且不偏离本发明的一般概念和所附权利要求的范围的前提下,可容易地修饰和/或改变本发明的方法。因此,基于本文存在的教导和指导,这些修饰和/或改变意在所公开的实施方案的等价方案的含义范围内。应理解本文使用的术语是为了描述而不是限制的目的。因此,本说明书的术语应由技术人员在结合其知识的基础上依据本文给出的教导和启示进行解释。
实施例1:牛***的固定
材料和方法
材料
使用以下化学试剂:购自Sigma(St.Luis,USA)的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(trizma hydrochloride)和EDTA、NaHCO3、NaCl、甘油(>99%)、购自Riedel de(Seelze,Germany)的柠檬酸钠和丙酮酸钠、购自Norsk Medisinaldepot(Oslo,Norway)的果糖和一水合葡萄糖、购自KSL staubtechnik gmbh(Lauingen,Germany)的碳酸钙和购自FMC Biopolymer A/S(Drammen,Norway)的海藻酸钠(PROTANAL LF10/60)。
***来源
牛***在Trondheim,挪威和Store Ree,Stange,挪威的Geno实验场(Geno facility)中采集。
缓冲溶液
使用以下填充剂溶液:
用于***的第一次稀释的填充剂溶液:1.45g l-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐葡萄糖、0.4g l-1柠檬酸钠、1g l-1果糖、0.22g l-1丙酮酸钠和200ml l-1蛋黄。通过加入NaOH调节溶液的pH至6.4。
用于***的第二次稀释的填充剂溶液:4g l-1碳酸钙(除非另有说明)、54g l-1果糖、170g l-1甘油和24g l-1LF10/60海藻酸钠。两种填充剂均包含标准的抗生素混合剂(antibiotic cocktail)给出至少EUdir88/407所需的最终浓度。改性的IVT:3g l-1果糖、20g l-1柠檬酸钠、2.1g l-1NaHCO3、1.16g l-1NaCl、3g l-1EDTA、pH7.35。如下文指明,填充剂溶液加入酶(Sigma L1754)或底物。
公牛***的稀释、固定和冷藏保存
在Geno实验场上采集牛***并如下所述进行稀释:采集之后立即将在用于第一次稀释的填充剂溶液中的***稀释至219x106细胞/ml的浓度。然后该溶液立即与等体积的用于进一步稀释的填充剂混合,其中该填充剂包含酶或者包含底物。然后将所得的包含稀释的***的溶液冷却至4℃。在冷却至4℃之后,将该溶液与等体积的用于第三次稀释的填充剂溶液混合,其中如果来自之前步骤的稀释的***包含酶则所述填充剂包含底物(三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯或三丁酸甘油酯),或者如果来自之前步骤的稀释的***包含底物则所述填充剂包含酶。此外,所述填充剂包含碳酸钙作为二价阳离子释放化合物以及藻酸盐。然后,将所得溶液转移至授精吸管中并在4℃下平衡约3小时。然后,将授精吸管转移至N2-冷冻箱并根据用于公牛***的标准程序冷冻。
评估运动性
通过显微估计来评估***的运动性。通过将冷冻的***吸管置于37℃的水浴中30秒而将该吸管融化。在测量之前,将藻酸盐凝胶在所述改性的IVT溶液中液化。将授精吸管中的内容物加入至0.9ml IVT溶液中并在试管旋转器(tube-tumbler)上小心振荡约10分钟。在运动性评估之前,将试管在加热块(heat-block)上在37℃下预热至少15分钟。将约3μl溶液加入至经预热的显微镜载片上,并立即使用光学显微镜检查。以最接近的5%的区间来评估各个样品中的运动***的数量。如果实际上可行,在评估过程中不会让操作者知道样品标识。
结果
a)使用三乙酸甘油酯作为底物固定牛***
根据上述程序采集并稀释***。向用于第二次稀释的填充剂溶液中加入酶(Sigma L1754)至其在含有***的最终溶液中的浓度为6gl-1。用于第三次稀释的填充剂溶液含有8g l-1碳酸钙并向其加入三乙酸甘油酯至浓度为0.5g/100ml。在第二次稀释后约4小时,凝胶形成并固定***。在4℃存储约24小时之后,使凝胶液化并评估被固定的***的运动性。此时约60%的***具有运动性。
b)使用三丙酸甘油酯作为底物固定牛***
根据上述程序采集、稀释、固定并冷冻保藏***。向用于第二次稀释的填充剂溶液中加入酶(Sigma L1754)至其在含有稀释的***的最终溶液中的浓度为6g l-1。用于第三次稀释的填充剂溶液含有4g l-1碳酸钙并向其加入三丙酸甘油酯至浓度为0.3g/100ml。在第二次稀释之后约3小时,凝胶形成并且冷冻含有经固定***的吸管。***吸管在液氮中存储数天直至融化,评估运动性。在凝胶融化和液化之后约60%的***具有运动性。
c)使用三丙酸甘油酯作为底物固定牛***
根据上述程序采集、稀释、固定并冷冻保藏***。向用于第二次稀释的填充剂溶液中加入三丙酸甘油酯至其在含有经稀释的***的最终溶液中的浓度为0.3g/100ml。用于第三次稀释的填充剂溶液含有4gl-1碳酸钙并向其加入酶Sigma L1754至浓度为6g l-1。在第二次稀释之后约2小时,凝胶形成。在4℃存储约24小时之后,使凝胶液化并评估被固定的***的运动性。此时约60%的***具有运动性。
d)使用三丁酸甘油酯作为底物固定牛***
根据上述程序采集、稀释、固定并冷冻保藏***。向用于第二次稀释的填充剂溶液中加入酶(Sigma L1754)至其在含有经稀释的***的最终溶液中的浓度为6g l-1。用于第三次稀释的填充剂溶液含有4gl-1碳酸钙并向其加入三丁酸甘油酯至浓度为0.35g/100ml。在第二次稀释之后约3小时,凝胶形成并且冷冻含有经固定***的吸管。***吸管在液氮中存储数天直至融化,评估运动性。在凝胶融化和液化之后约60%的***具有运动性。
实施例2使用脂肪酶和三乙酸甘油酯或三辛酸酯底物受控制备藻酸钙凝胶
材料和方法
材料
购自FMC Biopolymer A/S(Drammen,Norway)的海藻酸钠(PROTANAL LF10/60)、购自Sigma(St.Luis,USA)的酶L3001和L1754、购自Sigma(St.Luis,USA)的三乙酸甘油酯和三辛酸酯、购自KSL staubtechnik gmbh(Lauingen,Germany)的碳酸钙。
溶液
使用以下溶液。溶液L1.1:10g l-1的L3001酶在蒸馏水中的溶液;溶液L1.2:0.2g l-1三乙酸甘油酯的蒸馏水溶液。溶液L2.1:4g l-1的碳酸钙、24g l-1LF10/60海藻酸钠和0.1g l-1三乙酸甘油酯的蒸馏水溶液。溶液L2.2:4g l-1碳酸钙、24g l-1LF10/60海藻酸钠和0.2g l-1三乙酸甘油酯的蒸馏水溶液。溶液L2.3:4g l-1碳酸钙、24g l-1LF10/60海藻酸钠和0.3g l-1三乙酸甘油酯的蒸馏水溶液。溶液L2.4:4g l-1碳酸钙、24g l-1LF10/60海藻酸钠和10g l-1L3001酶的蒸馏水溶液。溶液L2.5:4g l-1碳酸钙、24g l-1LF10/60海藻酸钠和0.3g l-1三辛酸酯的蒸馏水溶液。
引发胶凝
通过将L1-溶液中的一种与L2-溶液中的一种等体积混合引发胶凝。根据表1混合所述溶液。
表1:使用酶L3001和三乙酸甘油酯底物的胶凝实验。表中示出了所研究溶液的组合以及所使用的酶和三乙酸甘油酯底物的浓度。
在混合之前所有溶液为室温,且溶液置于室温下进行胶凝。胶凝反应的结束后接着进行溶液的目测检查。
结果
使用酶L3001(源自小麦胚芽的脂肪酶)和L1754(源自皱褶念珠菌的脂肪酶)以及底物三乙酸甘油酯和三辛酸酯进行海藻酸钠溶液的受控胶凝。根据表1制备并混合酶和底物的溶液。酶和底物之间的反应产生出H3O+离子,其与溶液中的悬浮的碳酸钙反应。该反应释放出钙离子,其与溶液中的藻酸盐聚合物链相互作用,形成凝胶。表2示出了在实验性试验中凝胶形成之前观测的时间。在不加入酶的实验性试验5中没有凝胶形成。结果示出反应时间取决于所选择的底物和酶的类型以及所使用的酶和底物的浓度。
表2:在含有酶(Sigma L3001或L1754)和/或底物(三乙酸甘油酯或三辛酸酯)的溶液混合之后发生胶凝之前观测的时间。
Claims (38)
1.水解酶和可被该水解酶水解的底物在制备藻酸盐水凝胶中的用途。
2.权利要求1的用途,其中所述酶为酯酶。
3.权利要求2的用途,其中所述酯酶为脂肪酶。
4.权利要求3的用途,其中所述脂肪酶为三酰基甘油脂肪酶。
5.前述权利要求中任一项的用途,其中所述水解酶的底物的水解导致H3O+的产生。
6.权利要求5的用途,其中所述酶为脂肪酶并且所述底物为式I的化合物:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12-烷基羰基链。
7.权利要求2的用途,其中R1、R2和R3选自甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十二烷酮。
8.权利要求6的用途,其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表C1-C3-烷基羰基链。
9.前述权利要求中任一项的用途,其中所述底物选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯,优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
10.前述权利要求中任一项的用途,其中所述酶和底物用于制备包埋生物材料、优选***的藻酸盐水凝胶。
11.一种制备藻酸盐水凝胶的方法,包含以下步骤:
将含有水解酶的溶液与含有可被该水解酶水解的底物的溶液混合,并且其中含有所述水解酶的溶液或含有所述底物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。
12.权利要求11的方法,其中包含水解酶的溶液含有二价阳离子释放化合物和藻酸盐。
13.权利要求11的方法,其中包含底物的溶液含有二价阳离子释放化合物和藻酸盐。
14.权利要求11的方法,其中所述水解酶为酯酶。
15.权利要求11的方法,其中所述酯酶为脂肪酶,优选三酰基甘油脂肪酶。
16.权利要求11-13中任一项的方法,其中所述底物为有机酸的酯。
17.权利要求11-13中任一项的方法,用于制备藻酸盐水凝胶,包含以下步骤:将含有三酰基甘油脂肪酶的溶液与包含可被该水解酶水解的底物的溶液混合,其中所述底物为式I的化合物:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12-烷基羰基链,并且其中包含所述脂肪酶的溶液或包含式I化合物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。
18.权利要求14的方法,其中R1、R2和R3选自甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十二烷酮。
19.权利要求14的方法,其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表C1-C3-烷基羰基链。
20.权利要求14-16中任一项的方法,其中所述底物选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯,优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
21.权利要求11-17中任一项的方法,其中所述二价阳离子释放化合物释放选自Ca2+、Ba2+、和Sr2+的二价阳离子。
22.权利要求18的方法,其中所述二价阳离子释放化合物为钙释放化合物。
23.权利要求19的方法,其中所述阳离子释放化合物为碳酸钙。
24.权利要求11-21中任一项的方法,其中第一溶液还包含待包埋在藻酸盐水凝胶中的目标物。
25.权利要求22的方法,其中待包埋在藻酸盐凝胶中的目标物为生物材料。
26.权利要求23的方法,其中所述生物材料为***。
27.权利要求20的方法,其中所述方法包含以下步骤:
i)通过用包含三酰基甘油脂肪酶的溶液稀释***而形成第一溶液;
ii)将包含藻酸盐、二价阳离子释放化合物和式I化合物的第二溶液加入到在步骤i)中获得的第一溶液中,引发胶凝:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12-烷基羰基链;
iii)将步骤ii)中获得的溶液转移到用于藻酸盐水凝胶胶凝的容器中;
iv)任选地将iii)的藻酸盐水凝胶冷藏保存。
28.权利要求20的方法,其中所述方法包含以下步骤:
i)通过用包含式I化合物的溶液稀释***而形成第一溶液:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12-烷基羰基链;
ii)将包含藻酸盐、二价阳离子释放化合物和三酰基甘油脂肪酶的第二溶液加入到步骤i)中获得的溶液中,引发胶凝;
iii)将ii)中获得的溶液转移到用于藻酸盐水凝胶胶凝的容器中;
iv)任选地将iii)的藻酸盐水凝胶冷藏保存。
29.权利要求25和26中任一项的方法,其中所述底物选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯,优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
30.权利要求14和15中任一项的方法,其中对iii)中获得的溶液冷藏保存,并且其中i)和ii)的第一溶液和第二溶液分别包含冷冻保护剂。
31.权利要求14-16的方法,其中所述藻酸盐为富含古罗糖醛酸的藻酸盐。
32.根据权利要求1-18中任一项制备的藻酸盐水凝胶。
33.一种藻酸盐水凝胶,其包含:
a)藻酸盐;
b)任选地待包埋在所述藻酸盐水凝胶中的目标物;
c)所述藻酸盐水凝胶制备中所使用的水解酶。
34.一种藻酸盐水凝胶试剂盒,其包含一个含有水解酶的容器和另一个含有可被该水解酶水解的底物的容器。
35.权利要求27的试剂盒,其中所述可被水解酶水解的底物为式I的化合物:
其中R1、R2和R3独立地相同或不同并代表C1-C12-烷基羰基链。
36.权利要求23的试剂盒,其中所述试剂盒另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。
37.权利要求28的试剂盒,其包含一个容器,其包括含有水解酶的溶液;以及另一个容器,其包括含有藻酸盐、二价阳离子释放化合物和可被该水解酶水解的底物的溶液。
38.权利要求28的试剂盒,其包含一个容器,其包括含有可被水解酶水解的底物的溶液;以及另一个容器,其包括含有藻酸盐、二价阳离子释放化合物和水解酶的溶液。
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