KR102013060B1 - Klf-4를 이용하는 연골세포 분화 촉진 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4)의 과발현을 유도하여 연골세포의 분화를 촉진하는 방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 심바스타틴(Simcastatin)을 처리한 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4)의 과발현을 유도하여 연골세포의 분화를 촉진하는 방법에 대한 것이다.
상기 연골세포 분화 촉진 방법은, 연골세포에서 KLF-4(Krupple-like factor 4) 과발현을 유도하여 연골세포에서 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현을 증가시켜 연골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.

Description

KLF-4를 이용하는 연골세포 분화 촉진 방법 {Method for stimulating chondrogenesis by using KLF-4}

본 발명은 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4)의 과발현을 유도하여 연골세포의 분화를 촉진하는 방법에 대한 것이다.

또한, 본 발명은 심바스타틴(Simcastatin)을 처리한 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4)의 과발현을 유도하여 연골세포의 분화를 촉진하는 방법에 대한 것이다.

골관절염(OA)은 관절의 가장 흔한 질병으로 노인 인구의 거의 절반이 영향을 미치며 관절 연골의 진행성 퇴행이 특징이다. 골관절염 환자, 그들의 가족 및 직업의 심리 사회적 지위에 상당한 영향을 미친다. 주요 임상 증상은 만성 무릎 통증, 강직, 무릎 부종 및 제한된 신체 활동의 증상을 포함한다. OA는 중급 또는 고급 단계에서 심각한 통증 및 운동 문제를 일으키며 선진국 사회에서 선도적인 사회 경제적 부담을 나타낸다.

스타틴(Statins)은 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A(HMG-CoA) 환원 효소 억제제를 포함하고 있으며 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL) 콜레스테롤 순환 수준을 크게 감소시키므로 고콜레스테롤 혈증 치료를 위한 대표적인 치료제이다. 스타틴은 일반적으로 고지혈증성 심혈관 질환의 치료에 사용되어 병에 걸릴 확률 및 사망할 확률을 줄인다. 최근 스타틴 요법의 가치는 지질의 감소에만 근거한 것이 아니라 오히려 직접적인 혈관 효과를 포함하는 것으로 나타났다. 또 다른 연구는 스타틴이 염증성 사이토카인의 면역 조절 또는 연골 세포에서의 MMP 발현의 억제제로서 직접 작용할 수 있기 때문에 예방적 항염증 효과가 있음을 보여 주었다. 최근보고 된 바에 따르면 심바스타틴(simvastatin, SVT)이 연골 세포의 분화를 유도할 수 있으며, 그 구조식은 하기 [화학식 1]과 같다.

Kruppel-like factor 4(KLF-4)는 위장관, 피부, 고환, 뼈 및 다른 조직에서 발현되는 징크 핑거형 전사 인자이다. KLF-4는 5'-gagaggctgct-3' 또는 5'-caccc-3' DNA 서열에 결합하는 C 말단에 3개의 탠덤 C₂H₂ 징크 핑거 모티프를 가지고 있다. 이 단백질은 전사를 활성화하거나 억제할 수 있기 때문에 다면 발현 인자로 간주된다.

골격 발생 과정에서 KLF-4는 미성숙 골아 세포에서 상향 조절되며 조골세포가 성숙되면서 그 발현이 서서히 감소한다. 그것은 또한 골격 형성에 밀접하게 관련되어있는 Notch 신호 전달의 발암 효과를 중화시키는 것으로 나타났다. 또한, 섬유아세포에서의 발현은 성장 정지 세포에서 가장 높고, 급격한 증식 단계에서 가장 낮다. 이것은 다양한 세포 유형에서의 KLF-4 발현의 생리적 조절이 발달에 결정적임을 시사한다.

그러나, 연골세포에서의 KLF-4의 역할에 대해서는 현재까지 연구되거나 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은, 연골세포 분화를 촉진할 수 있는 조성물을 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 심바스타틴(Simvastatin)이 처리된 연골세포의 분화를 KLF-4가 촉진함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명자들은, KLF-4(Kruppel-like factor 4) 및 SVT를 이용하여 연골세포의 분화를 촉진하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계;를 포함하는 연골세포 분화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 심바스타틴(Simvastatin)을 처리한 연골세포에서 KLF-4(Krupple-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계;를 포함하는, 연골세포 분화 촉진 방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계;를 포함하는, 연골세포 분화 촉진 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 KLF-4를 과발현하는 것은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 KLF-4 유전자를 포함하는 KLF-4 발현 벡터를 연골세포에 형질감염(Transfection)하여 유도하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 KLF-4를 과발현하는 것은 연골세포 내에 KLF-4을 암호화하는 유전자 염기서열을 직접 형질감염하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분화 촉진된 연골세포는 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현 수준의 증가를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 심바스타틴(Simvastatin)을 처리한 연골세포에서 KLF-4(Krupple-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계;를 포함하는, 연골세포 분화 촉진 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 심바스타틴(Simvastatin)의 농도는 10 내지 100μM인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분화 촉진된 연골세포는 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현 수준의 증가를 나타내는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명은 연골세포에서 KLF-4(Krupple-like factor 4) 과발현을 유도하여 연골세포에서 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현을 증가시켜 연골세포의 분화를 촉진하므로, 연골세포 분화 촉진 방법을 제공한다.

도 1은 심바스타틴(Simvastatin)이 관여하는 연골세포 분화과정에서 KLF-4의 발현을 확인하였다.
도 2는 KLF-4와 SOX-9의 상호작용에 심바스타틴(Simvastatin)이 미치는 영향을 확인하였다.
도 3은 연골세포의 탈분화를 유도하기 위하여 연골세포를 계대배양 후 심바스타틴(Simvastatin)으로 유도한 KLF-4의 발현을 확인하였다.
도 4는 심바스타틴(Simvastatin)이 관여하는 연골세포 분화과정에서 cDNA를 이용하여 KLF-4를 증폭시키거나, siRNA를 이용하여 KLF-4를 녹다운(knockdown)시킨 효과를 확인하였다.
도 5는 심바스타틴(Simvastatin)이 관여하는 연골세포 분화과정에서 KLF-4와 SOX-9의 위치를 확인하였다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 안전하면서도 효과적인 연골세포 분화 촉진방법에 대한 연구가 요구되고 있으나, 연골세포에서의 KLF-4의 역할에 대해서는 현재까지 연구되거나 보고된 바가 없다.

본 발명에 따른 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계를 포함하는, 연골세포 분화 촉진 방법은 연골세포에서 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현이 증가되어 연골세포의 분화를 촉진하므로, 연골세포 분화 촉진 방법으로서 효과적이다.

따라서, 본 발명은 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계;를 포함하는, 연골세포 분화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 KLF-4를 과발현하는 것은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 KLF-4 유전자를 포함하는 KLF-4 발현 벡터를 연골세포에 형질감염(Transfection)하여 유도하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 KLF-4를 과발현하는 것은 연골세포 내에 KLF-4을 암호화하는 유전자 염기서열을 직접 형질감염하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 분화 촉진된 연골세포는 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현 수준의 증가를 나타내는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 심바스타틴(Simvastatin)이 관여하는 연골세포 분화과정에서 KLF-4의 발현을 확인하였다. SVT가 처리된 연골세포는 KLF-4와 Ⅱ형 콜라겐 및 황산화된 프로디오글리칸의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 1).

본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 KLF-4와 SOX-9의 상호작용에 심바스타틴(Simvastatin)이 미치는 영향을 확인하였다. SVT가 처리되는 경우 KLF-4와 SOX-9의 발현이 증가하고 핵에 함께 존재하는 반면, Ⅱ형 콜라겐은 세포질에 존재함을 확인하였다(도 2).

본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 연골세포의 탈분화를 유도하기 위하여 연골세포를 계대배양 후 심바스타틴(Simvastatin)으로 유도한 KLF-4의 발현을 확인하였다. 탈분화된 연골세포의 경우 Ⅱ형 콜라겐과 황산화된 프로티오글리칸의 발현량이 증가하였으며, SVT의 처리가 KLF-4의 발현양을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3).

본 발명의 다른 구체적인 실시예에서. 심바스타틴(Simvastatin)이 관여하는 연골세포 분화과정에서 서열번호 1의 cDNA를 이용하여 KLF-4를 증폭시키거나, siRNA를 이용하여 KLF-4를 녹다운(knockdown)시킨 효과를 확인하였다. KLF-4의 형질감염 방법과 관계없이 연골세포에서 과발현되는 경우 Ⅱ형 콜라겐 발현이 상승되었으며, KLF-4가 녹다운 되는 경우 Ⅱ형 콜라겐 발현이 현저히 감소하였다(도 4).

본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 심바스타틴(Simvastatin)이 관여하는 연골세포 분화과정에서 KLF-4와 SOX-9의 위치를 확인하였다. KLF-4의 발현은 SOX-9의 발현을 증가시키며 또한 핵에 함께 존재하게 되는 것을 확인하였다(도 5).

따라서, 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계를 포함하는, 연골세포 분화 촉진 방법은 연골세포에서 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현이 증가되어 연골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 심바스타틴(Simvastatin)을 처리한 연골세포에서 KLF-4(Krupple-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계;를 포함하는, 연골세포 분화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 심바스타틴(Simvastatin)의 농도는 10 내지 100μM인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 분화 촉진된 연골세포는 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현 수준의 증가를 나타내는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

따라서, SVT가 처리된 연골세포에서 KLF-4(Kruppel-like factor 4) 과발현을 유도하는 단계를 포함하는, 연골세포 분화 촉진 방법은 연골세포에서 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현이 증가되어 연골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

시료 및 처리

<1-1> 시료

SVT는 시그마 알드리히(Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO, USA)에서 구입했다. 세포를 50 μM의 SVT 또는 비히클(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 24 시간 동안 처리하였다. 연골세포의 분화를 위해 소듐 니트로프루세이드(Sodium nitroprussade, SNP; Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. KLF-4 cDNA(GFP-태그) 및 pCMV-AC6 벡터는 오리진 테크놀로지(Origene technologies; Rockville, MD, USA)로부터 구입하였다. KLF-4 siRNA는 바이오니아(Bioneer; Daejeon, Korea)로부터 입수하였다. 터포팩트 트랜스팩션 시약(TurboFect transfection; Fisher Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA 및 siRNA의 형질 감염을 수행하였다.

<1-2> 토끼 관절 연골 세포의 분리 및 단층 배양

뉴질랜드 흰 토끼(2주령)는 코텍(평택, 대한민국)에서 구입했다. 동물을 에테르 마취로 희생시킨 후, 75 % 에탄올로 소독하고 페니실린(100 units/mL) 및 스트렙토 마이신(100㎍/mL)을 함유하는 PBS로 헹구었다. 연골 조직을 1 ~ 3 mm²의 작은 조각으로 자르고, 37 ℃에서 7시간 동안 0.2 % 콜라게네이즈 Ⅱ(collagenase Ⅱ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 함유 된 DMEM으로 분해하고 1000 rpm 에서 10분 동안 원심분리 하였다. 원심 분리 후, 10 %(v/v) 소 태아 혈청, 페니실린(50 units/mL), 및 스트렙토마이신(50㎍ mL)을 보충한 DMEM에 세포(2×10⁴ 세포/접시)를 재현탁하고, 37 ℃에서 5 % CO₂ 배양기에서 단층배양 하였다. 하루동안 배양한 후, 연골 세포가 배양 접시의 벽에 부착되었으며, 매질을 2일마다 교체하였다. 뻗어있는 세포는 불규칙한 스핀들 또는 다각형 모양을 보였다. 후속 실험은 적어도 3번 독립적으로 수행되었다. 본 발명은 프로토콜은 공주 대학교 윤리위원회의 승인을 받았다.

SVT가 Ⅱ형 콜라겐과 KLF -4의 발현을 촉진하는지 여부

본 발명자들은 KLF-4와 연골 세포 분화 사이의 상관관계를 결정하기 위해 연골 세포의 분화를 검사했다. 연골 세포의 분화 상태는 Ⅱ형 콜라겐 및 황산화된 프로테오 글라이칸 합성의 발현을 조사하여 확인하였다.

구체적으로, 일차 배양에서 토끼의 관절 연골 세포를 SVT로 처리하고 KLF-4와 Ⅱ형 콜라겐 발현을 웨스턴 블랏 분석 및 알시안 블루(Alcian blue) 염색으로 확인하였다.

웨스턴 블랏 분석은, 총 단백질은 연골 세포에서 수확하고, 동량의 단백질 (20 ~ 40 μg)을 8% 소듐 데도실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS)-폴리 아크릴 아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하고 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 멤브레인을 트리스 완충 식염수-0.01 % 트윈 20(TBST, pH 8.0) 완충액 중 5%(w/v) 탈지 분유로 실온에서 1시간 동안 블로킹 한 다음, 일차 항체로 하루동안 배양하였다. 사용한 항체는 다음과 같다: 염소 항-콜라겐 Ⅱ형 단일 클론 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, SC-7764, 0.2 μg/mL); 토끼 항-KLF-4 폴리클로날 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, SC-20691, 0.2 μg/mL); 마우스 anti-GAPDH(Santa Cruz Biotechnology; SC-166545; 0.2 μg/㎖); 항-토끼 IgG(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; A0545; 80 ng/mL); 항 염소 IgG (Chemicon International, Billerica, MA, USA, AP106P, 40 ng/mL); 및 항 마우스 IgG(Enzo Life Sciences International, Farmingdale, NY, USA, ADI-SAB-100, 80 ng/mL)를 포함한다. TBST로 10분간 3회 세척 한 후, 막을 2차 겨자무과산화효소-결합 항체로 2시간 동안 항온처리 하였다. 향상된 화학 발광 시약(Dogen, Seoul, Republic of Korea)을 사용하여 반응성 밴드를 시각화하였고 LAS4000 카메라 시스템(Fuji Film, Tokyo, Japan)을 사용하여 정량화하였다.

알시안블루 염색의 경우, 세포(P0)를 PBS 중 3.5% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 15분간 고정하고 3% 아세트산 중 1% 알시안블루로 하루동안 염색하고 0.1N HCl로 3회 세척하였다. 염색된 세포를 증류수로 3회 세척하고 6M 구아니딘 HCl을 6시간 동안 첨가하였다. 황산화 프로티오글라이칸(sulfated-proteoglycans)의 생산은 595nm에서 측정되었다. 데이터는 최소 4회의 독립적인 실험 결과를 나타낸다.

그 결과, [도 1]에서 나타난 바와 같이, SVT를 처리한 연골 세포는 KLF-4의 상향 조절과 용량 및 시간 의존적으로 일치하는 Ⅱ형 콜라겐 발현을 보였다(도 1A 및 B). Ⅱ형 콜라겐의 발현과 일치하여, SVT 처리된 연골세포는 황산화 프로테오글리칸에 대한 향상된 알시안 블루 염색을 보였다(도 1C). 이러한 결과는 KLF-4 발현이 SVT 처리된 1차 배양 토끼 관절 연골 세포에서 증가함을 보여 주며 KLF-4 발현과 연골 세포 분화 사이의 관련성을 시사한다.

SVT가 KLF -4와 SOX-9의 상호작용에 미치는 영향 확인

<3-1> RT- PCR 검사

본발명의 KLF-4 발현과 분화 사이의 연관성을 결정하기 위해 연골 세포를 SVT로 처리하고 연골 세포 표지자 Ⅱ형 콜라겐, SOX-9 및 KLF-4의 발현을 RT-PCR로 검사하였다.

구체적으로, RT-PCR을 수행하기 위하여 TRIzol 시약(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 역전사 및 cDNA 합성은 Maxime ™ RT premix 키트(iNtRON Biotechnology, 성남)를 사용하였으며, RNA(0.2 μg)를 제조사의 지시에 따라 cDNA로 역전사시켰다. 사용된 프라이머 는 하기 [표 1]과 같으며, 이때 각각의 어닐링(annealing) 온도와 사이클 수는 Ⅱ형 콜라겐은 52 ℃ 및 27 사이클, SOX-9 는 62 ℃ 및 27 사이클, KLF-4는 52 ℃ 및 27 사이클, GAPDH는 56 ℃ 및 25 사이클이다.

대상	길이	방향	서열	서열목록 번호
Ⅱ형 콜라겐	370 bp	정방향	5'-GAC CCC ATG CAG TAC ATG CG-3 '	2
		역방향	5'-AGC CGC CAT TGA TGG TCT CC-3 '	3
SOX-9	386 bp	정방향	5'-GAC CCC ATG CAG TAC ATG CG-3 '	4
		역방향	5'-AGC CGC CAT TGA TGG TCT CC-3'	5
KLF-4	253 bp	정방향	5'-AGC TCA TGC CAC CGG GTT C-3'	6
		역방향	5'-GTG TGT TTG CGG TAG TGC CTG-3'	7
GAPDH	299 bp	정방향	5'-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GA-3 '	8
		역방향	5'-CAC AAT GCC GAA GTG GTC GT-3'	9

증폭된 DNA 산물은 1% 아가로스 겔에서 분리하고 EcodyeTM 핵산 염색 용액(BioFact, 대전, 대한민국)으로 염색 하였다. GAPDH의 발현 수준을 기준으로 표적 유전자의 mRNA를 표준화 한 후, 이를 정량적으로 계산하였다.

그 결과, [도 2A]에 나타난 바와 같이, 세포를 SVT로 처리하였을 때 Ⅱ형 콜라겐, SOX-9, KLF-4 발현이 증가했다.

<3-2> IP 분석

본 발명자들은, 상기 실시예<3-1>의 결과가 KLF-4와 SOX-9 사이의 기능적 연관성을 확립하고 KLF-4가 연골 세포의 분화에 어떤 역할을 할 수 있는지 조사하고자, 전체 세포 추출물을 수집하고 IP 분석을 수행했다.

구체적으로, IP분석을 위해 먼저 세포 추출물을 IP 완충액(20 mM 트리스 -HCl pH 8.0, 137 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% NP-40, 2 mM EDTA)으로 제조한 다음 용해시켰다. 상등액에 항 SOX-9 항체 및 단백질 G 비드(GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 가하고 하루동안 배양하였다. 사용된 항체는 다음과 같다: 염소 항 SOX-9 다클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, SC-17340, 0.2 μg/mL). IP 분획은 항-KLF-4 항체를 사용하여 상기 [실시예 2]에 기재된 웨스턴 블랏 분석법과 동일한 방법으로 분석하였다. 이때, SNP는 SOX-9 발현을 감소시켜 연골 세포의 분화를 조절하는 것으로 알려진 산화질소 공여자이므로, SOX-9 발현에 대한 음성 대조군으로서 SNP 처리된 연골 세포를 사용했다.

그 결과, [도 2B]에 나타난 바와 같이, KLF-4와 SOX-9 사이의 상호 작용이 연골 세포에서 SVT 처리에 의해 유의하게 유도된다는 것을 발견했다.

<3-3> 면역형광 염색

본 발명자들은, KLF-4와 Ⅱ형 콜라겐의 발현장소를 확인하기 위하여 면역형광 염색방법을 수행하였다.

구체적으로, 면역형광 염색을 수행하기 위해 연골 세포는 미리 설정된 멸균 된 커버 슬립이 있는 35mm 접시에 2×10⁴ 세포의 농도로 접목시켰다. 세포가 부착된 후 PBS로 세척하고 3.5% 파라 포름알데히드로 30분간 고정시켰다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 5% BSA로 37 ℃에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 샘플을 1차 항체(Mouse Anti-COL2A1 /Ⅱ형 콜라겐, MAB8887; 0.2 μg/mL)와 함께 4℃에서 하루동안 배양했다. 그 후 세포를 퍼옥시다아제 결합(peroxidase-conjugated) 2차 항체와 함께 37 ℃에서 1시간 동안 항온배양한 후 실온에서 5분 동안 4',6--다이아미노-2페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI; Invitrogen, Burlington, ON, 캐나다)으로 세포를 대조염색 하였다. 면역형광은 BX51 형광 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 연골 기질은 Ⅱ형 콜라겐이 풍부하기 때문에 그 성분의 합성과 분비는 연골 세포의 분화 표현형을 확인하기 위한 특정 마커로 사용될 수 있다.

그 결과, [도 2C]에 나타난 바와 같이 KLF-4는 핵 주변에 국한되었지만, Ⅱ형 콜라겐은 주로 세포질에 존재하였다. 반면, [도 2D]에 나타난 바와 같이, SOX-9는 핵에서 KLF-4와 공존하였다.

SVT가 연속적으로 분화된 연골세포에서 KLF -4를 상향조절하는지 여부확인

단층 배양에서 연속적인 실험은 연골 세포에서 분화된 표현형의 손실을 초래하는 것으로 알려져있다. 본 발명자들은 KLF-4가 SVT에 의해 유발된 Ⅱ형 콜라겐 발현을 양성으로 조절하는지를 결정하기 위해, 단층 배양에서 연장된 단계를 통하여 탈분화된 연골세포에 대한 이 마커의 영향을 확인하였다.

구체적으로, [실시예 2]의 웨스턴 블럿 분석방법과 알시안 블루 염색방법을 이용하였다.

그 결과, [도 3]에 나타난 바와 같이 SVT는 대조군의 분화된 연골 세포에 비해 Ⅱ형 콜라겐 발현과 관련 황산화된 프로티오글라이칸 합성을 증가시켰다. 웨스턴 블랏 분석은, 연골 세포의 분화 과정에서 SVT가 KLF-4의 점진적인 증가를 매개한다는 것을 보여 주었다. 이러한 결과는 KLF-4가 탈분화를 지연시켜 연골 세포의 분화를 유지할 수도 있음을 나타낸다.

심바스타틴 ( SVT ) 매개 연골 세포 분화에 KLF -4의 과발현 또는 녹다운의 효과

<5-1> KLF -4 cDNA의 형질 감염을 통한 KLF -4의 과발현

본 발명자들은 KLF-4의 과발현이 연골세포 분화에 미치는 효과를 확인하기 위하여, KLF-4의 cDNA(서열번호 1)을 형질 감염시켰다.

구체적으로, [실시예 2]의 웨스턴 블럿 분석방법과 알시안 블루 염색방법을 이용하였다.

그 결과, [도 4A]에 나타난 바와 같이, SVT 처리 대조군 세포에서의 발현과 비교하여 Ⅱ형 콜라겐 상향 조절을 유도하였다. SVT가 없는 경우 pCMV6 벡터로 형질 감염된 연골 세포와 KLF-4 cDNA로 형질 감염된 연골 세포 사이에는 세포 생존율에 유의한 차이가 없었다. 이와 같은 맥락으로, [도 4B]에 나타나는 바와 같이, RT-PCR은 연골 세포에서 KLF-4 mRNA의 이소성 발현이 Ⅱ형 콜라겐 발현을 증가시키는 것을 보여 주었다.

<5-2> siRNA를 통한 KLF -4 녹다운(knockdown)

본 발명자들은, 상기 실시예 <5-1>의 결과를 더 조사하기 위해 KLF-4 siRNA를 연골 세포에 도입하여 단백질 수준을 낮추는 보완 실험을 수행했다.

구체적으로, Ⅱ형 콜라겐, KLF-4 및 GAPDH의 발현은 [실시예 2]의 웨스턴 블랏 분석 방법 및 [실시예 3]의 RT-PCR 방법으로 확인하였다. 항산화된 프로티오글리칸의 합성은 [실시예 2]의 알시안 블루 염색법으로 확인하였다.

그 결과, [도 4C]에 나타난 바와 같이, siRNA로 녹다운(knockdown)된 KLF-4로 인하여 연골세포에서 SVT에 의해 유발되는 Ⅱ형 콜라겐이 현저히 감소하였다. 알시안 블루 염색은 또한 KLF-4 cDNA 형질 감염 후 SVT 처리를 한 KLF-4가 SVT 단독 조건에 비해 염색이 24% 증가한다는 것을 보여 주었다. 대조적으로, [도 4D]에 나타나는 바와 같이, KLF-4의 넉다운은 SVT 유도 황산화 프로티오글라이칸의 합성을 완전히 막았다. 이러한 결과는 SVT 유도 연골 세포의 분화에 KLF-4의 상향 조절이 필요하고 외인성 KLF-4가 이 과정을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

<5-3> 심바스타틴 ( SVT )-매개 연골 세포 분화에서 KLF -4와 SOX-9의 위치

구체적으로, 실시예 <3-3>의 면역형광염색 방법을 이용하여 KLF-4와 SOX-9가 발현되는 위치를 확인하였다.

그 결과, [도 5]에 나타나는 바와 같이 SVT 처리된 연골세포의 핵에 KLF-4와 SOX-9가 함께 존재함을 확인하였다. KLF-4 cDNA의 형질 감염을 통한 이소성 KLF-4 발현은 SVT 처리된 세포에 비해 SOX-9이 핵에 존재하도록 하였다. 이 결과는 SVT 매개 분화에서 KLF-4와 SOX-9 사이의 연관성을 나타낸다.

<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Method for stimulating chondrogenesis by using KLF-4 <130> 1063544 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF-4_cDNA <400> 1 atgaggcagc cacctggcga gtctgacatg gctgtcagcg acgcgctgct cccatctttc 60 tccacgttcg cgtctggccc ggcgggaagg gagaagacac tgcgtcaagc aggtgccccg 120 aataaccgct ggcgggagga gctctcccac atgaagcgac ttcccccagt gcttcccggc 180 cgcccctatg acctggcggc ggcgaccgtg gccacagacc tggagagcgg cggagccggt 240 gcggcttgcg gcggtagcaa cctggcgccc ctacctcgga gagagaccga ggagttcaac 300 gatctcctgg acctggactt tattctctcc aattcgctga cccatcctcc ggagtcagtg 360 gccgccaccg tgtcctcgtc agcgtcagcc tcctcttcgt cgtcgccgtc gagcagcggc 420 cctgccagcg cgccctccac ctgcagcttc acctatccga tccgggccgg gaacgacccg 480 ggcgtggcgc cgggcggcac gggcggaggc ctcctctatg gcagggagtc cgctccccct 540 ccgacggctc ccttcaacct ggcggacatc aacgacgtga gcccctcggg cggcttcgtg 600 gccgagctcc tgcggccaga attggacccg gtgtacattc cgccgcagca gccgcagccg 660 ccaggtggcg ggctgatggg caagttcgtg ctgaaggcgt cgctgagcgc ccctggcagc 720 gagtacggca gcccgtcggt catcagcgtc agcaaaggca gccctgacgg cagccacccg 780 gtggtggtgg cgccctacaa cggcgggccg ccgcgcacgt gccccaagat caagcaggag 840 gcggtctctt cgtgcaccca cttgggcgct ggaccccctc tcagcaatgg ccaccggccg 900 gctgcacacg acttccccct ggggcggcag ctccccagca ggactacccc gaccctgggt 960 cttgaggaag tgctgagcag cagggactgt caccctgccc tgccgcttcc tcccggcttc 1020 catccccacc cggggcccaa ttacccatcc ttcctgcccg atcagatgca gccgcaagtc 1080 ccgccgctcc attaccaaga gctcatgcca cccggttcct gcatgccaga ggagcccaag 1140 ccaaagaggg gaagacgatc gtggccccgg aaaaggaccg ccacccacac ttgtgattac 1200 gcgggctgcg gcaaaaccta cacaaagagt tcccatctca aggcacacct gcgaacccac 1260 acaggtgaga aaccttacca ctgtgactgg gacggctgtg gatggaaatt cgcccgctca 1320 gatgaactga ccaggcacta ccgtaaacac acggggcacc gcccgttcca gtgccaaaaa 1380 tgcgaccgag cattttccag gtcggaccac ctcgccttac acatgaagag gcatttt 1437 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> type2_collagen_primer_F <400> 2 gaccccatgc agtacatgcg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> type2_collagen_primer_R <400> 3 agccgccatt gatggtctcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9_primer_F <400> 4 gaccccatgc agtacatgcg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9_primer_R <400> 5 agccgccatt gatggtctcc 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF-4_primer_F <400> 6 agctcatgcc accgggttc 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF-4_primer_R <400> 7 gtgtgtttgc ggtagtgcct g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_primer_F <400> 8 tcaccatctt ccaggagcga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_primer_R <400> 9 cacaatgccg aagtggtcgt 20

Claims (7)

1. i) 인 비트로(in vitro) 상에서 연골세포 내에 KLF-4을 암호화하는 유전자 염기서열을 직접 형질감염하는 단계; 및
   ii) 10 내지 100 μM 농도의 심바스타틴(Simvastatin)을 상기 단계 i)의 연골세포에 처리하여 KLF-4(Kruppel-like factor 4)의 과발현을 유도하는 단계; 를 포함하는
   연골세포의 SOX-9, Ⅱ형 콜라겐 또는 황산화된 프로티오글라이칸(Sulfated-proteeoglycan)의 발현 수준을 증가시키는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 단계 i)의 형질감염은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 KLF-4 유전자를 포함하는 KLF-4 발현 벡터를 연골세포에 형질감염(Transfection)하여 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
   
   
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