JP6085568B2 - プラスミノーゲンおよびプラスミンの変異体 - Google Patents
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Description
(i)これらは触媒領域において、位置Pのリジンまたはアルギニン、および位置[P+/−n]の少なくとも1つのアミノ酸の突然変異を含み、ここでnは1、2、3、4または5であり、位置[P+/−n]のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく;および
(ii)(i)の突然変異により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が減少し、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定される
ことを特徴とする。
−位置[P+/−n]と[P+/−n’]においてであり;nとn’は1、2、3、4または5であり;位置[P+/−n]とと[P+/−n’]のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく;nとn’がPに加算されるか、またはPから減算されるかのいずれかの場合、両者は互いに異なっている;または、
−位置[P+/−n]と[P’+/−n]においてであり;P’はPおよびP’の大い方の値であり;位置P’のアミノ酸はリジンまたはアルギニンであり;nは1、2、3、4または5であり;位置[P’+/−n]のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく;[P+n]および[P’−n]の間に重複する位置が有る場合、これらは排除され;
前記少なくとも2つの内部アミノ酸の突然変異により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が減少し、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定できる。
(i)ヒトプラスミンの触媒領域の位置137のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するリジンもしくはアルギニン;
(ii)ヒトプラスミンの触媒領域の位置147のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するリジンもしくはアルギニン;または、
(iii)ヒトプラスミンの触媒領域の位置158のアルギニン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するアルギニンもしくはリジン;
から選択されてもよく、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置1のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
(i)位置[P+/−n]のアミノ酸を変異させるステップで、ここで位置Pのアミノ酸はアルギニンまたはリジンであり、nは1、2、3、4または5であり;
(ii)(i)から得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップで、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定され;
(iii)(ii)において測定された突然変異体の自己タンパク質分解安定性を野生型プラスミンの自己タンパク質分解安定性と比較するステップ;および
(iV)野生型プラスミンより自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として(iii)から選択するステップ、
を含む。
(i)ヒトプラスミンの触媒領域の位置138のグルタミン酸アミノ酸、または、非ヒトプラスミンの対応するアミノ酸残基を、天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させるステップ、
(ii)(i)から得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップで、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定され、および
(iii)安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体として、自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を(ii)から選択するステップ;
を含み、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置1のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
(i)本発明のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと;
(ii)前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて(i)で得られた宿主細胞を生育するステップと;
(iii)(ii)において発現したプラスミノーゲンを回収するステップとを含む。
そのような方法は任意でさらに、(iii)において回収されたプラスミノーゲンを精製するステップ(iv)を含んでもよい。
(i)本発明のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと;
(ii)前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて(i)で得られた宿主細胞を生育するステップと;
(iii)(ii)において発現したプラスミノーゲンを回収するステップと;
(iv)(iii)のプラスミノーゲンをプラスミンへ活性化するステップとを含む。
そのような方法はさらに任意で、(iv)における活性化に先立って(iii)において回収されたプラスミノーゲンを精製するステップを含んでもよい。さらに、本発明のプラスミン変異体を産生するためのいかなる方法においても、(iv)において得られた活性プラスミンを任意で精製してもよい。また、さらには、本発明の方法によって産生された活性プラスミン変異体は、任意で、誘導および/または可逆的に不活化されてもよい。
(i)これらは触媒領域において、位置Pのリジンまたはアルギニン、および位置[P+n]または[P−n](さらに[P+/−n]として示される)の少なくとも1つのアミノ酸の、非野生型のアミノ酸への(または天然のアミノ酸もしくは天然に生じているアミノ酸とは異なるアミノ酸への)突然変異を含み、nは1、2、3、4または5であり、位置[P+/−n]のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく;および
(ii)(i)の突然変異(の存在)により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度(または感受性、または敏感さ、または脆弱性)が減少し、これは例えば発色性または生物学的基質活性分析で測定できる(後を参照)
ことを特徴とする。
−位置[P+/−n]と[P+/−n’]においてであり;nとn’は1、2、3、4または5であり;位置[P+/−n]とと[P+/−n’]のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく;nとn’がPに加算されるか、またはPから減算されるかのいずれかの場合、両者は互いに異なっている;または
−位置[P+/−n]と[P’+/−n]においてであり;P’はPおよびP’の大きい方の値であり;位置P’のアミノ酸はリジンまたはアルギニンであり;nは1、2、3、4または5であり;位置[P’+/−n]のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもなく;および、[P+n]および[P’−n]の間に重複する位置が有る場合、これらは排除され;
前記少なくとも2つの内部アミノ酸の突然変異(の存在)により、野生型プラスミンの自己タンパク質分解による分解の程度と比較して、前記プラスミン変異体の自己タンパク質分解による分解の程度が減少し、これは発色性または生物学的基質活性分析で測定できる。
− 疎水性の脂肪族アミノ酸:Met、Ile、LeuおよびVal
− 疎水性の芳香族アミノ酸:Phe
− 親水性の酸性アミノ酸:Asp、Glu、AsnおよびGln
− 親水性の塩基性アミノ酸:Arg、LysおよびHis
− 中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸:Gly、Ala、Ser、Thr、Cys、Pro
− 中程度に疎水性の芳香族アミノ酸:TyrおよびTrp
この中で突然変異の目的では、CysおよびProは、Cysが遊離できるチオール基を生成すること、または、Proがタンパク質構造を大きく乱すため、野生型プラスミンまたはプラスミノーゲンアミノ酸の置換アミノ酸としては好ましくない可能性がある。他のアミノ酸置換には、プラスミン(プラスミノーゲン)触媒領域の位置[P+/−n]の、および任意でさらに位置P、P’、P”等の1つまたは複数の野生型アミノ酸の、非天然もしくは非標準アミノ酸への、またはノルロイシン、ノルバリン、オルニチンもしくはシトルリン等のアミノ酸類似体への突然変異がある(より詳細な一覧については、例えば、Hendricksonら、2004、Annu Rev Biochem 73、147−176を参照)。
(i)ヒトプラスミンの触媒領域の位置137のリジン、または非ヒトプラスミンの対応するリジンもしくはアルギニン;
(ii)ヒトプラスミンの触媒領域の位置147のリジン、または非ヒトプラスミンの対応するリジンもしくはアルギニン;および/または
(iii)ヒトプラスミンの触媒領域の位置158のアルギニン、または非ヒトプラスミンの対応するリジンもしくはアルギニン;
から選択されてもよく、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置1のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562で生じているのと同じバリンアミノ酸である。ヒトプラスミノーゲンおよびヒトプラスミンの触媒領域でのアミノ酸の番号付けを明確にするために、本明細書では図1を参照する。
(i)位置[P+/−n]のアミノ酸を位置[P+/−n]の天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ変異させるステップで、位置Pのアミノ酸はアルギニンまたはリジンであり、nは1、2、3、4または5であり;
(ii)(i)で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップで、これは上述のように、例えば、発色性または生物学的基質活性分析によって測定され;
(iii)(ii)において測定された突然変異体の自己タンパク質分解安定性を野生型プラスミンの自己タンパク質分解安定性と比較するステップ;および
(iv)野生型プラスミンより自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として(iii)から選択するステップ;
を含み、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置1のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562で生じているのと同じバリンアミノ酸である。上記の方法において、位置[P+/−n]のアミノ酸はリジンでもアルギニンでもないことが好ましい。
(i)ヒトプラスミンの触媒領域の位置138のグルタミンアミノ酸、または非ヒトプラスミンの対応するグルタミン酸を、前記位置138の天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させること、
(ii)(i)で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定すること、これは上述のように、例えば、発色性または生物学的基質活性分析を用いて測定または分析され;および
(iii)自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として(ii)から選択すること;を含み、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置1のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562で生じているのと同じバリンアミノ酸である。
(i)本発明のプラスミノーゲン変異体をコードする核酸を前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと;
(ii)前記宿主細胞において前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて(i)で得られた宿主細胞を生育するステップと;
(iii)(ii)で発現したプラスミノーゲンを回収するステップとを含む。
この方法には、最後に(iii)で回収されたプラスミノーゲンの精製を含むステップ(iv)を付加できる。
発現ベクター
Invitrogen Corporation(Carlsbad,California)から購入したpPICZαA分泌ベクターを、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)における組み換えヒトマイクロプラスミノーゲンの発現および分泌のために使用した。
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)におけるヒトマイクロプラスミノーゲンの発現を改善するために、ヒトマイクロプラスミノーゲンおよびその変異体をコードする遺伝子を、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)にとって好ましいコドン利用を考慮に入れて、新しく合成した。
Glu138Gln突然変異
活性化に先立って、マイクロプラスミノーゲン突然変異体を免疫アフィニティによって直接ピキア・パストリス(Pichia pastoris)上清から精製した。マウスの抗ヒトマイクロプラスミン抗体(抗原としてマイクロプラスミンを使用して、Balb/cマウスで産生;ハイブリドーマセルライン5D10A4により産生、ThromboGenics N.V.で入手可能)をGE Healthcareのプロトコル番号71500015ADのセファロースビーズに結合した。このプロトコルに従い、7.5mLの免疫アフィニティ樹脂を45mgの抗体から調製し、XK16/20カラムに詰めた。未精製の上清200〜400mL(ピキア(Pichia)培養物を0.2μでろ過/pH6.0)を直接5D10A4アフィニティーカラムに添加した。洗浄ステップ(100mMのKH2PO4、0.5MのNaCl、pH6.2、カラム容量の10倍量)後、マイクロプラスミノーゲン変異体を0.2Mのグリシン−HCl、pH3.0の緩衝剤で溶出し、溶出液を中和し、25mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2に透析した)。
様々なマイクロプラスミン突然変異体に対して得られたkcat/Km値および自己分解速度定数を下の表2に記載する。これらの値は、国際特許出願PCT/欧州特許出願公開第2010/059902号明細書の実施例3および4に記載の方法に基本的に従って得た。
2.1脳梗塞サイズに対するプラスミン変異体の影響。
国際公開第00/18436号パンフレットの実施例2の記載のように、またはWelshら(1987、J Neurochem 49、846−851)によれば、脳梗塞サイズを減少させる本発明のプラスミン変異体の効果を、マウスの脳梗塞モデルにおいて見ることができる。野生型プラスミンの脳梗塞サイズへの有益な効果が、国際公開第00/18436号パンフレットの実施例5で実証されている。類似の実験を本発明のいずれかのプラスミン変異体で行い、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
ウサギの体外ループ血栓溶解モデル(国際公開第02/50290号パンフレットの実施例6;Hotchkissら、1987、Thromb Haemost 58、107 要約書377)、イヌの冠動脈回旋枝の銅コイル誘導血栓症モデル(国際公開第02/50290号パンフレットの実施例8;Bergmannら、1983、Science 220、1181−1183)、またはウサギの頚静脈血栓症モデル(Collenら、1983、J Clin Invest 71、368−376)を本発明のプラスミン変異体のインビボの血栓溶解活性を実証するために使用できる。国際公開第00/18436号パンフレットの実施例7および9、およびCollenら(1983)による記載にあるように、血栓溶解への野生型プラスミンの有益な効果をこれらのモデルで実証した。類似の実験を本発明のプラスミン変異体のいずれかで行い、これらのプラスミン変異体の有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
末梢動脈閉鎖(PAO)のインビトロモデルは国際公開第01/36609号パンフレットの実施例6に記載されており、野生型プラスミンの血栓溶解の効果をこのモデルにおいて実証した。類似の実験を本発明のプラスミン変異体のいずれかで行い、これらのプラスミン変異体の末梢動脈閉鎖の血栓溶解への有益な効果を測定し、野生型プラスミンの有益な効果と比較する。
国際公開第2004/052228号パンフレットの実施例5は、死後のブタの眼における硝子体の液化におけるマイクロプラスミンの効果と、効果を測定するための分析を開示している。国際公開第2004/052228号パンフレットの実施例6は、死後のヒトの眼における後部硝子体剥離(PVD)の誘導におけるマイクロプラスミンの効果の他に、効果を測定するための分析を開示する。本発明のプラスミン変異体による硝子体液化およびPVDの誘導を、類似の死後モデルにおいて実証する。
国際公開第2004/052228号パンフレットの実施例7は、インビボのネコのモデルにおけるPVDの誘導に対するマイクロプラスミンの効果の他に、その効果を測定するための分析を開示している。本発明のプラスミン変異体によるPVDの誘導を、インビボのモデルにおいて実証する。
Claims (27)
- 触媒領域において、ヒトプラスミンの触媒領域の位置138のアミノ酸のグルタミン酸、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するアミノ酸残基のグルタミンへの突然変異を含み;
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置1のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562で生じているのと同じバリンアミノ酸である
ことを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体、もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体。 - 前記触媒領域のリジンまたはアルギニンアミノ酸のいずれか1つ以上の突然変異をさらに含む、請求項1に記載のプラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体であって、
前記突然変異が、
(i)ヒトプラスミンの触媒領域の位置147のアミノ酸のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するリジンもしくはアルギニンのグルタミン酸またはヒスチジンへの突然変異;または
(ii)ヒトプラスミンの触媒領域の位置158のアミノ酸のアルギニン、または非ヒトプラスミンの触媒領域の対応するアルギニンもしくはリジンのヒスチジンへの突然変異;
から選択され、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置1のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562で生じているのと同じバリンアミノ酸である、請求項1に記載のプラスミノーゲン変異体、またはプラスミン変異体。 - 自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で95%であることをさらに特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項に記載のプラスミン変異体。
- 前記プラスミンが1つまたは複数のクリングルドメインを欠く、および/または、1つまたは複数のクリングルドメインの一部を欠き、前記プラスミンの誘導体の触媒領域が機能を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプラスミンのタンパク質分解活性誘導体。
- 前記プラスミンがペグ化されているか、またはハイブリッドまたはキメラ分子に含まれる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプラスミンのタンパク質分解活性誘導体。
- 可逆的な不活性化がアシル化または非最適pH条件によって引き起こされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプラスミンの可逆的に不活性な誘導体。
- 前記プラスミノーゲンまたは前記プラスミンが、Glu−プラスミノーゲンまたはGlu−プラスミン、Lys−プラスミノーゲンまたはLys−プラスミン、ミジプラスミノーゲンまたはミジプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
- 薬剤として使用する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも1つを含む組成物。
- 抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸***剤、抗ヒスタミン剤または麻酔剤の少なくとも1つをさらに含む、請求項9に記載の組成物。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
(i)ヒトプラスミンの触媒領域の位置138のグルタミン酸アミノ酸、または、非ヒトプラスミンの対応するアミノ酸残基を、天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させるステップと、
(ii)(i)から得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定するステップと、
(iii)安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体として、自己タンパク質分解性が安定している突然変異体を(ii)から選択するステップと
を含み、
前記ヒトプラスミンの触媒領域は位置1のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトGlu−プラスミノーゲンの位置562で生じているのと同じバリンアミノ酸である、方法。 - 前記安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
(i)請求項1〜7のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと;
(ii)(i)で得られた前記宿主細胞で前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて前記宿主細胞を生育するステップと;
(iii)(ii)で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと
を含む方法。 - (iii)において回収された前記プラスミノーゲンを精製するステップ(iv)をさらに含む請求項13に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のプラスミン変異体を産生するための方法であって、前記方法が、
(i)請求項1〜7のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと;
(ii)(i)で得られた前記宿主細胞を、前記宿主細胞内で前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて生育するステップと;
(iii)(ii)で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと;
(iv)(iii)の前記プラスミノーゲンをプラスミンへ活性化するステップと
を含む方法。 - (iii)において回収された前記プラスミノーゲンを(iv)における活性化に先立って精製する、請求項15に記載の方法。
- (iv)において得られた前記活性プラスミンを精製する、請求項15または16に記載の方法。
- 前記活性プラスミンが誘導される、および/または可逆的に不活化される、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離された核酸。
- 請求項19に記載の核酸を含む組換えベクター。
- 請求項19に記載の核酸、または請求項20に記載のベクターで形質転換された生体外(ex-vivo)宿主細胞。
- 前記プラスミノーゲン変異体が配列番号1によって定義されるヒトプラスミノーゲンの変異体であるか、または前記プラスミン変異体が配列番号1によって定義されるヒトプラスミノーゲンの変異体から得られる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体。
- 前記プラスミノーゲン変異体がヒトプラスミノーゲンの変異体であるか、または前記プラスミン変異体がヒトプラスミノーゲンの変異体から得られる、請求項9または10に記載の組成物。
- 前記プラスミノーゲン変異体が配列番号1によって定義されるヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項23に記載の組成物。
- 前記プラスミノーゲン変異体がヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項11〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミノーゲン変異体が配列番号1によって定義されるヒトプラスミノーゲンの変異体である、請求項11〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラスミンが1つまたは複数のクリングルドメインを欠く、および/または、1つまたは複数のクリングルドメインの一部を欠き、前記プラスミンの誘導体の触媒領域が機能を有する、請求項11〜18のいずれか一項に記載の方法。
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