JP6071580B2 - 微生物検出システム及び微生物検出方法 - Google Patents

Description

本発明は環境評価技術に関し、特に微生物検出システム及び微生物検出方法に関する。

バイオクリーンルーム等のクリーンルームにおいては、微生物検出装置を用いて、飛散している微生物が検出され、記録される（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照。）。微生物の検出結果から、クリーンルームの空調機器の劣化具合を把握可能である。また、クリーンルームで製造された製品に、参考資料として、クリーンルーム内の微生物の検出記録が添付されることもある。光学式の微生物検出装置は、例えば、クリーンルーム中の気体を吸引し、吸引した気体に光を照射する。気体に微生物が含まれていると、光を照射された微生物が蛍光を発するため、気体に含まれる微生物の数や大きさ等を検出することが可能となる。

特開２０１１−８３２１４号公報

長谷川倫男他，「気中微生物リアルタイム検出技術とその応用」，株式会社山武，azbil Technical Review 2009年12月号，p.2-7，2009年

しかし、気体に蛍光を発する非微生物粒子が含まれていると、微生物検出装置が、非微生物粒子を誤って微生物として検出する場合があることを、本発明者は見出した。そこで、本発明は、誤検出の少ない微生物検出システム及び微生物検出方法を提供することを目的とする。

本発明の態様によれば、（ａ）気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を液体中に取り込み、可溶性の粒子を液体中に溶かす取り込み装置と、（ｂ）液体中に取り込まれた微生物に光を照射して微生物が発する蛍光及び微生物で生じる散乱光の少なくとも一方を検出する液中微生物検出装置と、を備える、微生物検出システムが提供される。

また、本発明の態様によれば、（ａ）気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を液体中に取り込み、可溶性の粒子を液体中に溶かすことと、（ｂ）液体中に取り込まれた微生物に光を照射して微生物が発する蛍光及び微生物で生じる散乱光の少なくとも一方を検出することと、を含む、微生物検出方法が提供される。

本発明によれば、誤検出の少ない微生物検出システム及び微生物検出方法を提供可能である。

本発明の第１の実施の形態に係る微生物検出システムが配置されるクリーンルームの模式図である。 本発明の第１の実施の形態に係るインピンジャーの模式図である。 本発明の第１の実施の形態に係る微生物の種類毎の蛍光強度を示すグラフである。 本発明の第１の実施の形態に係る液体中の微生物の粒径と、蛍光強度と、の関係を模式的に示すグラフである。 本発明の第２の実施の形態に係るスクラバーの模式図である。 本発明の第３の実施の形態に係る粉体分離器の模式図である。 本発明の第４の実施の形態に係るインパクタの模式図である。 本発明の第５の実施の形態に係る取り込み装置の模式図である。 本発明の第５の実施の形態に係るフィルターの模式図である。 本発明の第５の実施の形態に係る取り込み装置の模式図である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

（第１の実施の形態）
第１の実施の形態に係る微生物検出システムは、図１に示すように、気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を液体中に取り込み、可溶性の粒子を液体中に溶かす取り込み装置５０と、液体中に取り込まれた微生物に光を照射して微生物が発する蛍光及び微生物で生じる散乱光の少なくとも一方を検出する液中微生物検出装置１と、を備える。取り込み装置５０及び液中微生物検出装置１は、例えば、クリーンルーム７０内に配置されている。クリーンルーム７０には、ダクト７１、並びにＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）及びＵＬＰＡ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）等の超高性能エアフィルタを有する噴き出し口７２を介して、清浄な空気等の気体が送り込まれる。

クリーンルーム７０内には、生産ライン８１、８２が配置されている。生産ライン８１、８２は、例えば精密機器、電子部品、又は半導体装置の生産ラインである。あるいは生産ライン８１、８２は、食品、飲料、又は医薬品の生産ラインである。例えば、生産ライン８１、８２において、輸液が点滴や注射器に充填される。あるいは、生産ライン８１、８２において、経口剤や漢方薬が製造される。またあるいは、生産ライン８１、８２において、栄養ドリンクやビールが容器に充填される。

生産ライン８１、８２は、通常、微生物及び非微生物粒子等をクリーンルーム７０内の気体に飛散させないよう管理されている。しかし、生産ライン８１、８２は、何らかの事情で、クリーンルーム７０内の気体に飛散する微生物及び非微生物粒子の発生源になる。また、生産ライン８１、８２以外の要因で、クリーンルーム７０内の気体に微生物及び非微生物粒子が飛散することもある。

クリーンルーム７０内の気体に飛散しうる微生物の例としては細菌が含まれる。細菌の例としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌、及びカビ胞子を含む真菌が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、大腸菌が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムが挙げられる。カビ胞子を含む真菌の例としては、アスペルギルスが挙げられる。ただし、クリーンルーム７０内の気体に飛散しうる微生物はこれらに限定されない。また、クリーンルーム７０内の気体に飛散しうる非微生物粒子の例としては、化学物質、薬品及び食品の飛沫、ごみ、ちり、並びに埃等のダスト等が挙げられる。

ここで、微生物は、光を照射されると、微生物に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及びリボフラビン等が、蛍光を発する。従来、気体中の微生物を検出する装置は、光を照射されて蛍光を発する気体中の粒子を、微生物とみなしている。しかし、非微生物粒子であっても、例えばクリーニングしたガウンから飛散した蛍光粒子、並びに生産ライン８１、８２から飛散したビタミンを含む輸液、経口剤、漢方薬、栄養ドリンク、及びビールの飛沫や結晶粒子は、光を照射されると蛍光を発する場合がある。そのため、従来の気体中の微生物を検出する装置は、気体中を飛散する、蛍光を発する非微生物粒子を、微生物と誤って検出する場合がある。

これに対し、第１の実施の形態に係る取り込み装置５０は、例えば、気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を液体中に取り込む図２に示すインピンジャー５１を備える。インピンジャー５１は、液体５１６を含む容器５１１と、クリーンルーム７０内の気体を吸引し液体５１６中に散気するための吸引パイプ５１２と、を備える。気体が液体５１６中に散気された場合、気体に含まれる微生物５１７は、不溶性であるため、液体５１６中に溶けない。しかし、気体に含まれる可溶性の蛍光粒子は、液体５１６中に溶ける。液体５１６の体積は、気体に含まれる可溶性の蛍光粒子の体積より充分大きいため、液体５１６に溶けた蛍光粒子は希釈され、検出可能な程度に蛍光を発しなくなる。

液体５１６は、純水又は溶液である。容器５１１には、容器５１１内に液体５１６を供給するための供給パイプ５１４が設けられている。また、容器５１１には、図１に示す液中微生物検出装置１に図２に示す容器５１１内の液体５１６を通すための連結パイプ５１５が設けられている。ただし、容器５１１内の液体５１６を液中微生物検出装置１に供給する機構はこれに限定されない。容器５１１内の余計な気体は、排気パイプ５１３を介して排出される。

図１に示す液中微生物検出装置１としては、米国特許第７４３００４６号公報あるいは米国特許第８２１８１４４号公報に開示された装置が使用可能であるが、これに限定されない。例えば、液中微生物検出装置１は、レーザ等の光源を備える。光源は、取り込み装置５０から来た液体に向けてレーザ光等の光を照射する。光は、可視光であっても、紫外光であってもよい。光が可視光である場合、光の波長は、例えば４００乃至５５０ｎｍの範囲内であり、例えば４０５ｎｍである。光が紫外光である場合、光の波長は、例えば３１０乃至３８０ｎｍの範囲内であり、例えば３４０ｎｍである。また、液中微生物検出装置１は、照射光を焦点に結ぶ光学系、及び焦点に液体を通過させる配管等を備える。

液中微生物検出装置１は、蛍光検出器をさらに備える。蛍光検出器は、微生物が発した蛍光を検出し、蛍光強度を計測する。蛍光検出器が蛍光を検出した回数から、液体に含まれる微生物の数を計測することが可能である。また、図３に示すように、微生物が発する蛍光の強度は、微生物の種類によって異なる。そのため、図１に示す液中微生物検出装置１の蛍光検出器が検出した蛍光の強度から、液体に含まれる微生物の種類を特定することが可能である。なお、光を照射された液体でラマン散乱が生じる場合は、ラマン散乱光をカットするフィルターを蛍光検出器に設けてもよい。

液中微生物検出装置１は、散乱光検出器をさらに備えていてもよい。散乱光検出器は、液体に含まれる粒子によって散乱した光を検出する。散乱光検出器が散乱光を検出した回数から、粒子の数を計測することが可能である。また、粒子による散乱光の強度は、粒子の粒径と相関する。したがって、散乱光検出器で散乱光の強度を検出することにより、液体に含まれる粒子の粒径を求めることが可能である。また、微生物の粒径は、微生物の種類によって異なる。そのため、散乱光検出器が検出した散乱光の強度から、液体に含まれる微生物の種類を特定することが可能である。

なお、散乱光検出器が散乱光を検出し、かつ蛍光検出器が蛍光を検出しなかった場合、液体に含まれる粒子が非生物粒子であることが分かる。散乱光検出器が散乱光を検出し、かつ蛍光検出器が蛍光を検出した場合、液体に微生物が含まれていることが分かる。また、上述したように、可溶性の蛍光粒子は、図２に示すインピンジャー５１の容器５１１内の液体５１６に溶け、希釈されるため、液中微生物検出装置１で検出可能な程度に蛍光を発しなくなる。そのため、図１に示すクリーンルーム７０内を飛散していた可溶性の蛍光粒子を、液中微生物検出装置１が微生物として誤って検出することはない。

液中微生物検出装置１は、検出した蛍光強度、及び散乱光強度に基づく粒径の少なくとも一方を用いて、液体に含まれる微生物の種類を特定する。蛍光強度及び散乱光強度の両方に基づいて微生物の種類を特定する方法は、これらに限定されないが、米国特許６８８５４４０号公報及び米国特許７１０６４４２号公報に開示されている。例えば図４に示すように、微生物の種類によって、粒径と、蛍光強度と、は相関がみられる。したがって、図４に示すようなグラフを予め取得することによって、蛍光強度及び粒径から微生物の種類を特定することが可能である。

液中微生物検出装置１は、蛍光を検出せず、散乱光のみによって微生物を検出し、微生物の種類を特定してもよい。同心円状の散乱光検出器を用いて、角度毎の散乱光強度を検出し、サポートベクターマシン（ＳＶＭ： Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ）等の統計手法により、微生物種類を特定することが可能である（例えば、Ｍｕｒｕｇｅｓａｎ Ｖｅｎｋａｔａｐａｔｈｉら著、「Ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」、ＡＰＰＬＩＥＤ ＯＰＴＩＣＳ、米国、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、２００８年２月１０日、Ｖｏｌ．４７、Ｎｏ．５、６７８ないし６８６頁参照。）。

あるいは、液中微生物検出装置１は、取り込み装置５０から来た液体に向けて複数の波長の励起光を照射して蛍光スペクトルを検出し、液体に含まれる微生物を特定してもよい。例えば、波長が２６６ｎｍ及び３５５ｎｍの励起光を微生物に照射し、波長が３５０ｎｍ、４５０ｎｍ、及び５５０ｎｍの蛍光スペクトルを検出することによって、微生物を特定することが可能である（例えば、Ｖａｓａｎｔｈｉ Ｓｉｖａｐｒａｋａｓａｍら著、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＵＶ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｂｉｏａｒｅｒｏｓｏｌｓ」、ＯＰＴＩＣＳ ＥＸＰＲＥＳＳ、米国、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、２００４年９月２０日、Ｖｏｌ．１２、Ｎｏ．１９、４４５７ないし４４６６頁参照。）。

（第２の実施の形態）
第１の実施の形態においては、図１に示す取り込み装置５０が、図２に示すインピンジャー５１を備える例を示した。これに対し、図１に示す取り込み装置５０は、気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を液滴又は液膜中に捕集し、微生物及び可溶性の粒子を捕集した液滴又は液膜を液体中に取り込む図５に示すスクラバー５２を備えていてもよい。

スクラバー５２は、クリーンルーム７０内から吸引した気体が流れ、底に液体５２６が溜まるパイプ５２１と、パイプ５２１に設けられた液滴供給装置５２８と、を備える。液滴供給装置５２８は、パイプ５２１内に液滴を含むミストを噴霧する。この際、気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子は液滴で捕集され、微生物及び可溶性の粒子を捕集した液滴は、パイプ５２１の底に溜まっている液体５２６に滴下する。

気体に含まれていた微生物５２７は、不溶性であるため、液体５２６中に溶けない。しかし、気体に含まれていた可溶性の蛍光粒子は、液体５２６中に溶ける。液体５２６の体積は、気体に含まれる可溶性の蛍光粒子の体積より充分大きいため、液体５２６に溶けた蛍光粒子は希釈され、検出可能な程度に蛍光を発しなくなる。

液体５２６は、純水又は溶液である。パイプ５２１には、パイプ５２１内に液体５２６を供給するための供給パイプ５２４が設けられている。また、パイプ５２１には、図１に示す液中微生物検出装置１に図５に示すパイプ５２１内の液体５２６を通すための連結パイプ５２５が設けられている。ただし、パイプ５２１内の液体５２６を液中微生物検出装置１に供給する機構はこれに限定されない。

なお、パイプ５２１には、液膜供給装置が設けられていてもよい。この場合、液膜供給装置は、パイプ５２１の内壁に液膜を供給し、気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子は液膜で捕集され、微生物及び可溶性の粒子を捕集した液膜は、パイプ５２１の底に溜まっている液体５２６に流れ落ちる。第２の実施の形態に係る微生物検出システムのその他の構成要素は、第１の実施の形態と同様であるので、説明は省略する。

（第３の実施の形態）
図１に示す取り込み装置５０は、図６に示すように、クリーンルーム７０内から吸引した気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を分離する粉体分離器５３と、分離された微生物及び可溶性の粒子が落下する場所に配置された液体の容器５４と、を備えていてもよい。

粉体分離器５３においては、漏斗状又は円筒のサイクロンの円周方向から、微生物及び可溶性の粒子を含む気体が、渦を描く様に流し込まれる。ここで、微生物及び可溶性の粒子は遠心分離され、重力により容器５４に含まれる液体５３１に向かって落下する。また、微生物及び可溶性の粒子が除去された気体は、サイクロンの円の中心から上方向に排出される。

気体に含まれていた微生物５３２は、不溶性であるため、液体５３１中に溶けない。しかし、気体に含まれていた可溶性の蛍光粒子は、液体５３１中に溶ける。液体５３１の体積は、気体に含まれる可溶性の蛍光粒子の体積より充分大きいため、液体５３１に溶けた蛍光粒子は希釈され、検出可能な程度に蛍光を発しなくなる。液体５３１は吸引され、図１に示す液中微生物検出装置１に供給される。第３の実施の形態に係る微生物検出システムのその他の構成要素は、第１の実施の形態と同様であるので、説明は省略する。

（第４の実施の形態）
図１に示す取り込み装置５０は、図７に示すように、クリーンルーム７０内から吸引した気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を液体中に捕集するインパクタ５５を備えていてもよい。インパクタ５５は、クリーンルーム７０内から吸引した気体が流れるノズル５５１を備える。ノズル５５１の下方には、液体５５３を含む捕集容器５５２が配置されている。

クリーンルーム７０内から吸引された気体は、ノズル５５１のオリフィスから捕集容器５５２に向かって噴射される。この際、所定の大きさの慣性を有する微生物及び可溶性の粒子は、捕集容器５５２上で偏向される気流に追従できず、捕集容器５５２に含まれる液体５５３に衝突する。これにより、所定の大きさの慣性を有する微生物及び可溶性の粒子が液体５５３で捕集される。

気体に含まれていた微生物５５４は、不溶性であるため、液体５５３中に溶けない。しかし、気体に含まれていた可溶性の蛍光粒子は、液体５５３中に溶ける。液体５５３の体積は、気体に含まれる可溶性の蛍光粒子の体積より充分大きいため、液体５５３に溶けた蛍光粒子は希釈され、検出可能な程度に蛍光を発しなくなる。液体５５３は吸引され、図１に示す液中微生物検出装置１に供給される。第４の実施の形態に係る微生物検出システムのその他の構成要素は、第１の実施の形態と同様であるので、説明は省略する。

（第５の実施の形態）
図１に示す取り込み装置５０は、フィルターで捕集された微生物及び可溶性の粒子を液体中に取り込んでもよい。例えば、取り込み装置５０は、図８に示すように、液体５０１を含む容器５００を備える。また、図９に示すように、クリーンルーム７０内から吸引した気体をパイプ５０３で吸引し、フィルター５０４で微生物及び可溶性の粒子を捕集する。さらに、図１０に示すように、液体５０１を含む容器５００内に微生物及び可溶性の粒子を捕集したフィルター５０４を搬送する。

この際、フィルター５０４に捕集されていた微生物５５４は、不溶性であるため、液体５０１中に溶けない。しかし、フィルター５０４に捕集されていた可溶性の蛍光粒子は、液体５０１中に溶ける。液体５０１の体積は、気体に含まれる可溶性の蛍光粒子の体積より充分大きいため、液体５０１に溶けた蛍光粒子は希釈され、検出可能な程度に蛍光を発しなくなる。液体５０１は吸引され、図１に示す液中微生物検出装置１に供給される。第５の実施の形態に係る微生物検出システムのその他の構成要素は、第１の実施の形態と同様であるので、説明は省略する。

（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、液中微生物検出装置としては、実施の形態では、米国特許第７４３００４６号公報あるいは米国特許第８２１８１４４号公報に開示された装置が使用可能であると説明したが、その他にも、特開平０７−１４０１４８号公報で開示されているフローサイトメータ、特表２０１２−５０７２８３号公報に開示されているラマン分光を用いる液中微生物検出手段、特表２０１２−５０７７１１号公報で開示されている質量分析計、特開昭６３−０５３４４７号公報に開示されているメンブレンフィルターで微生物を捕集し、レーザを照射する手段、及び特開２００８−２４９６２８号公報に開示されている発光測定装置等が、液中微生物検出装置として使用可能である。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

１ 液中微生物検出装置
５０ 取り込み装置
５１ インピンジャー
５２ スクラバー
５３ 粉体分離器
５４ 容器
５５ インパクタ
７０ クリーンルーム
７１ ダクト
７２ 噴き出し口
８１ 生産ライン
５００ 容器
５０１ 液体
５０３ パイプ
５０４ フィルター
５１１ 容器
５１２ 吸引パイプ
５１３ 排気パイプ
５１４ 供給パイプ
５１５ 連結パイプ
５１６、５２６、５３１、５５３ 液体
５１７、５２７、５３２、５５４ 微生物
５２１ パイプ
５２４ 供給パイプ
５２５ 連結パイプ
５２８ 液滴供給装置
５５１ ノズル
５５２ 捕集容器

Claims (10)

1. 気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を液体中に取り込み、前記可溶性の粒子を前記液体中に溶かす取り込み装置と、
   照射光を発する光源、
   前記照射光の焦点に前記微生物を取り込んだ液体を通過させる配管、及び
   前記光を照射された微生物が発する蛍光及び前記微生物で生じる散乱光の少なくとも一方を検出する検出器
   を備える液中微生物検出装置（ただし、前記液体中において前記微生物を濃縮させる装置を除く）と、
   を備える、微生物検出システム。
2. 前記液中微生物検出装置が前記微生物が発する蛍光及び前記微生物で生じる散乱光の両方を検出する、請求項１に記載の微生物検出システム。
3. 前記液中微生物検出装置が前記微生物が発する蛍光を検出し、前記蛍光の蛍光強度に基づき、前記微生物の種類を特定する、請求項１に記載の微生物検出システム。
4. 前記液中微生物検出装置が前記微生物が発する蛍光を検出し、前記蛍光のスペクトルに基づき、前記微生物の種類を特定する、請求項１に記載の微生物検出システム。
5. 前記微生物検出装置が前記微生物で生じる散乱光を検出し、前記散乱光に基づき、前記微生物の種類を特定する、請求項１に記載の微生物検出システム。
6. 前記取り込み装置が、前記気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を前記液体中に取り込むインピンジャーを備える、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
7. 前記取り込み装置が、前記気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を液滴又は液膜中に捕集し、前記液滴又は液膜を前記液体中に取り込むスクラバーを備える、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
8. 前記取り込み装置が、前記気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を分離する粉体分離器と、前記分離された微生物及び可溶性の粒子が落下する場所に配置された前記液体の容器と、を備える、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
9. 前記取り込み装置が、前記気体に含まれる微生物及び可溶性の粒子を前記液体中に捕集するインパクタを備える、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の微生物検出システム。
10. 前記取り込み装置が、フィルターで捕集された前記微生物及び可溶性の粒子を前記液体中に取り込む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の微生物検出システム。