JP2014168442A - 微生物検出装置及び微生物検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】微生物粒子と、非微生物粒子と、を判別可能な微生物検出装置を提供する。
【解決手段】粒子に励起光を照射する光源２５と、粒子が発した蛍光を検出する蛍光検出器２７と、蛍光検出器２７が検出した蛍光のスペクトルのピークが複数ある場合、粒子が微生物であると判定し、蛍光検出器２７が検出した蛍光のスペクトルのピークが一つである場合、粒子が非微生物であると判定する判定部３０１と、を備える、微生物検出装置。
【選択図】図１

Description

本発明は環境評価技術に関し、特に微生物検出装置及び微生物検出方法に関する。

バイオクリーンルーム等のクリーンルームにおいては、微生物検出装置を用いて、飛散している微生物が検出され、記録される（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照。）。微生物の検出結果から、クリーンルームの空調機器の劣化具合を把握可能である。また、クリーンルームで製造された製品に、参考資料として、クリーンルーム内の微生物の検出記録が添付されることもある。光学式の微生物検出装置は、例えば、クリーンルーム中の気体を吸引し、吸引した気体に光を照射する。気体に微生物が含まれていると、光を照射された微生物が蛍光を発するため、気体に含まれる微生物の数や大きさ等を検出することが可能となる。

特開２０１１−８３２１４号公報

長谷川倫男他，「気中微生物リアルタイム検出技術とその応用」，株式会社山武，azbil Technical Review 2009年12月号，p.2-7，2009年

しかし、気体に蛍光を発する非微生物粒子が含まれていると、微生物検出装置が、非微生物粒子を誤って微生物として検出する場合があることを、本発明者は見出した。そこで、本発明は、微生物粒子と、非微生物粒子と、を判別可能な微生物検出装置及び微生物検出方法を提供することを目的の一つとする。

本発明の態様によれば、（ａ）粒子に励起光を照射する光源と、（ｂ）粒子が発した蛍光を検出する蛍光検出器と、（ｃ）蛍光のスペクトルのピークが複数ある場合、粒子が微生物であると判定し、蛍光のスペクトルのピークが一つである場合、粒子が非微生物であると判定する判定部と、を備える、微生物検出装置が提供される。なお、蛍光は、自家蛍光も含む。

また、本発明の態様によれば、（ａ）粒子に励起光を照射することと、（ｂ）粒子が発した蛍光を受光することと、（ｃ）蛍光のスペクトルのピークが複数ある場合、粒子が微生物であると判定し、蛍光のスペクトルのピークが一つである場合、粒子が非微生物であると判定することと、を含む、微生物検出方法が提供される。

本発明によれば、微生物粒子と、非微生物粒子と、を判別可能な微生物検出装置及び微生物検出方法を提供可能である。

本発明の実施の形態に係るクリーンルームの模式図である。 本発明の実施の形態に係る微生物検出装置の模式的な断面図である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の励起蛍光マトリクスである。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの励起蛍光マトリクスである。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルである。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの一次微分である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルである。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの一次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分である。 本発明の実施の形態に係る蛍光のスペクトルを二回微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークにおける蛍光強度の微分値の絶対値を、有意ではない蛍光強度の大きさの微分値の絶対値で割った値の表である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分である。 本発明の実施の形態に係る蛍光のスペクトルを三回微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークにおける蛍光強度の微分値の絶対値を、有意ではない蛍光強度の大きさの微分値の絶対値で割った値の表である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分である。 本発明の実施の形態に係る蛍光のスペクトルを二回微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積を、有意ではないピークの面積で割った値の表である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分である。 本発明の実施の形態に係る蛍光のスペクトルを二回微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積を、有意ではないピークの面積で割った値の表である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分である。 本発明の実施の形態に係る蛍光のスペクトルを三回微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積を、有意ではないピークの面積で割った値の表である。 本発明の実施の形態に係る大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分である。 本発明の実施の形態に係るポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分である。 本発明の実施の形態に係る蛍光のスペクトルを三回微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積を、有意ではないピークの面積で割った値の表である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

図１に示すように、実施の形態に係る微生物検出装置１は、例えば、クリーンルーム７０内に配置されている。クリーンルーム７０には、ダクト７１、並びにＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）及びＵＬＰＡ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）等の超高性能エアフィルタを有する噴き出し口７２を介して、清浄な空気等の気体が送り込まれる。

クリーンルーム７０内には、生産ライン８１、８２が配置されている。生産ライン８１、８２は、例えば精密機器、電子部品、又は半導体装置の生産ラインである。あるいは生産ライン８１、８２は、食品、飲料、又は医薬品の生産ラインである。例えば、生産ライン８１、８２において、輸液が点滴や注射器に充填される。あるいは、生産ライン８１、８２において、経口剤や漢方薬が製造される。またあるいは、生産ライン８１、８２において、栄養ドリンクやビールが容器に充填される。

生産ライン８１、８２は、通常、微生物及び非微生物粒子等をクリーンルーム７０内の気体に飛散させないよう管理されている。しかし、生産ライン８１、８２は、何らかの事情で、クリーンルーム７０内の気体に飛散する微生物及び非微生物粒子の発生源になる。また、生産ライン８１、８２以外の要因で、クリーンルーム７０内の気体に微生物及び非微生物粒子が飛散することもある。

クリーンルーム７０内の気体に飛散しうる微生物の例としては細菌が含まれる。細菌の例としては、グラム陰性菌、グラム陽性菌、及びカビ胞子を含む真菌が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、大腸菌が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムが挙げられる。カビ胞子を含む真菌の例としては、アスペルギルスが挙げられる。ただし、クリーンルーム７０内の気体に飛散しうる微生物はこれらに限定されない。また、クリーンルーム７０内の気体に飛散しうる非微生物粒子の例としては、化学物質、薬品及び食品の飛沫、ごみ、ちり、並びに埃等のダスト等が挙げられる。

ここで、微生物は、光を照射されると、微生物に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及びリボフラビン等が、蛍光を発する。従来、気体中の微生物を検出する装置は、光を照射されて蛍光を発する気体中の粒子を、微生物とみなしている。しかし、非微生物粒子であっても、例えばポリエステルからなるクリーニングしたガウンから飛散した蛍光粒子は、光を照射されると蛍光を発する場合がある。また、ポリスチレン粒子も蛍光を発し、その後退色する。そのため、従来の気体中の微生物を検出する装置は、気体中を飛散する、蛍光を発する非微生物粒子を、微生物と誤って検出する場合がある。

これに対し、実施の形態に係る微生物検出装置１は、図２に示すように、粒子に励起光を照射する光源２５と、粒子が発した蛍光を検出する蛍光検出器２７と、蛍光検出器２７が検出した蛍光のスペクトルのピークが複数ある場合、粒子が微生物であると判定し、蛍光検出器２７が検出した蛍光のスペクトルのピークが一つである場合、粒子が非微生物であると判定する判定部３０１と、を備える。

光源２５と、蛍光検出器２７と、は、筐体２１に設けられている。微生物検出装置１は、クリーンルーム７０の内部から筐体２１の内部に、気体を吸引する第１の吸引装置２２をさらに備える。第１の吸引装置２２で吸引された空気は、筐体２１内部の流路のノズル２３の先端から放出される。ノズル２３の先端から放出された空気は、ノズル２３の先端と対向して筐体２１の内部に配置された第２の吸引装置２４で吸引される。

光源２５は、ノズル２３の先端から放出され、第２の吸引装置２４で吸引される空気に向けて、広帯域波長のレーザ光２６を照射する。レーザ光２６の波長は、例えば２５０ないし５５０ｎｍである。レーザ光２６は、可視光であっても、紫外光であってもよい。レーザ光２６が可視光である場合、レーザ光２６の波長は、例えば４００ないし５５０ｎｍの範囲内であり、例えば４０５ｎｍである。レーザ光２６が紫外光である場合、レーザ光２６の波長は、例えば３００ないし３８０ｎｍの範囲内であり、例えば３４０ｎｍである。ただし、レーザ光２６の波長は、これらに限定されない。

ノズル２３から噴出された気流中に細菌等の微生物が含まれる場合、レーザ光２６を照射された細菌が、蛍光を発する。また、ノズル２３から噴出された気流中にポリエステル粒子等のの非微生物粒子が含まれる場合も、レーザ光２６を照射された非微生物粒子が、蛍光を発する。蛍光検出器２７は、微生物粒子又は非微生物粒子が発した蛍光を検出する。

微生物は、リボフラビン（ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）、フラビンヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）、ピリドキサミン（ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ）、ピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ピリドキシン（ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、及びフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）等の蛍光物質を含む。

リボフラビン、フラビンヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドは、５１０ないし５４０ｎｍの蛍光を発する。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸は、４４０ないし４８０ｎｍの蛍光を発する。ピリドキサミン、ピリドキサールリン酸、及びピリドキシンは、励起光に応じて、３８０ないし４１０ｎｍ、又は４８０ないし５２０ｎｍの蛍光を発する。トリプトファンは、３３０ないし３６０ｎｍの蛍光を発する。チロシンは、２９０ないし３２０ｎｍの蛍光を発する。フェニルアラニンは、２７０ないし３００ｎｍの蛍光を発する。

したがって、ノズル２３から噴出された気流中に含まれる粒子が微生物粒子である場合、広帯域波長のレーザ光２６を照射された微生物粒子が発する蛍光スペクトルは、複数のピークを有する。これに対し、クリーンルーム７０内の作業者のクリーンウェアから発生する蛍光性非微生物粒子は、通常、単一の蛍光物質からなる。そのため、ノズル２３から噴出された気流中に含まれる粒子が非微生物粒子である場合、広帯域波長のレーザ光２６を照射された非微生物粒子が発する蛍光スペクトルは、単一のピークを有する。

図３は、大腸菌細胞の励起蛍光マトリクスの一実施例であり、図４は、ポリエステル製クリーンルームウェアの励起蛍光マトリクスの一実施例である。励起蛍光マトリクスにおいては、ｘ軸に励起光波長、ｙ軸に蛍光波長、ｚ軸に蛍光強度が規定され、蛍光スペクトルが含まれる。図３及び図４において、矢印で示したピークが、蛍光による有意なピークであり、その他のピークは、迷光あるいは散乱光等に起因するノイズによるピークであった。図３に示すように、大腸菌細胞の蛍光スペクトルにおいては、有意なピークが少なくとも２つあったが、図４は、ポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルにおいては、有意なピークが１つのみであった。

判定部３０１は、例えば、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３００に含まれている。判定部３０１は、例えば、蛍光検出器２７から即時的に蛍光スペクトルを受信し、蛍光スペクトルに含まれるピークが複数であるか否かを判定する。判定部３０１は、蛍光スペクトルのピークが複数ある場合、粒子が微生物であると判定する。また、蛍光スペクトルのピークが一つである場合、粒子が非微生物であると判定する。なお、判定部３０１は、蛍光スペクトルに含まれる、蛍光検出器２７等の電気回路に由来する電気的ノイズ等は、あらかじめ判定対象から除去する。ノイズを除去する方法としては、例えば、最小自乗法、単純移動平均法、及びサビツキ・ゴーレイ（Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ）法等が使用可能である。

さらに、判定部３０１は、蛍光スペクトルを微分して、蛍光スペクトルに含まれるピークが複数であるか否かを判定してもよい。例えば、蛍光スペクトルを奇数回微分した、１次、３次等の奇数次の微分スペクトルでは、元の蛍光スペクトルのピーク波長において、蛍光強度の微分値が０となる。したがって、判定部３０１は、微分スペクトルにおいて、蛍光強度の微分値が０になる波長を数えることによって、元の蛍光スペクトルに含まれるピークが複数であるか否かを判定してもよい。

また、例えば、蛍光スペクトルを偶数回微分した、２次、４次等の偶数次の微分スペクトルでは、元の蛍光スペクトルに含まれていたピークが、より明確に顕在化する。したがって、判定部３０１は、偶数次の微分スペクトルにおいてピークを数えることによって、元の蛍光スペクトルに含まれるピークが複数であるか否かを判定してもよい。

図５は、大腸菌細胞の蛍光スペクトルの一実施例であり、図６は、大腸菌細胞の蛍光スペクトルの一次微分の一実施例であり、図７は、大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例であり、図８は、大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例である。また、図９は、ポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの一実施例であり、図１０は、ポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの一次微分の一実施例であり、図１１は、ポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例であり、図１２は、ポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例である。

蛍光スペクトルを複数回微分することにより、元のスペクトルにおけるピーク高さのばらつきが抑制され、ピーク数の検出が容易になる傾向にある。また、蛍光スペクトルを複数回微分することにより、元のスペクトルにおいて、ショルダーと呼ばれる、近接しており、分離されていないピークを分離することも可能となる。

さらに、判定部３０１は、蛍光のスペクトルを微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークにおける蛍光強度の微分値の絶対値Ｐ_Eを、予め取得された判別値（閾値）と比較して、蛍光強度の微分値の絶対値Ｐ_Eが大きい場合は、粒子が微生物であると判定し、蛍光強度の微分値の絶対値Ｐ_Eが小さい場合は、粒子が非微生物であると判定してもよい。なお、判定部３０１は、微生物が発する蛍光に由来しうるピークにおける蛍光強度の微分値の絶対値Ｐ_Eを、微分スペクトルにおける有意ではない蛍光強度の大きさの微分値の絶対値Ｐ_Nで割ったＰ_E／Ｐ_Nの値を、予め取得された判別値と比較してもよい。これにより、有意ではない蛍光強度に由来する誤差を抑制することが可能となる。

なお、ここで、有意ではない蛍光強度とは、例えば、ノイズによるピークにおける蛍光強度や、ロングパスフィルターのカットオン波長で現れるピークにおける蛍光強度等、微生物に含まれる蛍光物質が発する蛍光のピーク波長とは異なる波長で現れるピークにおける蛍光強度をさす。また、微生物が発する蛍光に由来しうるピークとは、例えば、微分スペクトルが、偶数次の微分スペクトルである場合、微生物が発する蛍光の波長におけるピークである。また、微分スペクトルが、奇数次の微分スペクトルである場合、微生物が発する蛍光の波長に隣接するピークである。

図１３に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例と、図１４に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長４２０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Nは、ロングパスフィルターによって波長４２０ｎｍ未満の蛍光の透過が妨げられたことによって現れた有意ではないピークである。また、図１３に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Eは、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来するピークである。図１４に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Eは、この蛍光スペクトルが微生物によるものか、非微生物によるものか、不明である場合は、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうるピークである。

図１３に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Eにおける蛍光強度の微分値の絶対値を、波長４２０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Nにおける有意ではない蛍光強度の微分値の絶対値で割ったＰ_E／Ｐ_Nの値は、図１５に示すように、１．８２１３であった。別途用意した表皮ブドウ球菌の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、０．４５９９であった。マイクロコッカスの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、０．７６４４であった。コリネバクテリウムの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、１．３４１１であった。枯草菌芽胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、０．２６７７であった。

これに対し、図１４に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、図１５に示すように、０．０１１２であった。また、別途用意したポリエチレン系ポリマー製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は０．１４３３であった。この場合、一変量判別分析を行うと、判別値は０．１９、危険率は０．１１となった。つまり、Ｐ_E／Ｐ_Nの値が０．１９よりも大きければ、危険率０．１１で微生物と判定できることが明らかになった。

次に、図１６に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例と、図１７に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長４２０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Nは、ロングパスフィルターによって波長４２０ｎｍ未満の蛍光の透過が妨げられたことによって現れた有意ではないピークである。また、図１６に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Eは、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来するピークである。図１７に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Eは、この蛍光スペクトルが微生物によるものか、非微生物によるものか、不明である場合は、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうるピークである。

図１６に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Eにおける蛍光強度の微分値の絶対値を、波長４２０ｎｍ付近に現れるピークＰ_Nにおける有意ではない蛍光強度の微分値の絶対値で割ったＰ_E／Ｐ_Nの値は、図１８に示すように、３．３９２４であった。別途用意した表皮ブドウ球菌の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、０．７４５９であった。マイクロコッカスの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、２．６１７４であった。コリネバクテリウムの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、４．８１２２であった。枯草菌芽胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、０．９３６１であった。

これに対し、図１７に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は、図１８に示すように、０．０５７６であった。また、別途用意したポリエチレン系ポリマー製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｐ_E／Ｐ_Nの値は０．２６３９であった。この場合、一変量判別分析を行うと、判別値は０．１４、危険率は０．０６となった。つまり、Ｐ_E／Ｐ_Nの値が０．１４よりも大きければ、危険率０．０６で微生物と判定できることが明らかになった。

あるいは、判定部３０１は、蛍光のスペクトルを微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積Ｓ_Eを、予め取得された判別値と比較して、ピークの面積Ｓ_Eが大きい場合は、粒子が微生物であると判定し、ピークの面積Ｓ_Eが小さい場合は、粒子が非微生物であると判定してもよい。なお、判定部３０１は、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積Ｓ_Eを、微分スペクトルにおける有意ではないピークの面積Ｓ_Nで割ったＳ_E／Ｓ_Nの値を、予め取得された判別値と比較してもよい。

図１９に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例と、図２０に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長４２０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ_Nは、蛍光強度の微分値０を底辺にした場合の、ロングパスフィルターによって波長４２０ｎｍ未満の蛍光の透過が妨げられたことによって現れた有意ではないピークの面積である。また、図１９に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ_Eは、蛍光強度の微分値０を底辺にした場合の、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来するピークの面積である。図２０に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ_Eは、この蛍光スペクトルが微生物によるものか、非微生物によるものか、不明である場合は、蛍光強度の微分値０を底辺にした場合の、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積である。

図１９に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうる波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ_Eを、波長４２０ｎｍ付近に現れる有意ではないピークの面積Ｓ_Nで割ったＳ_E／Ｓ_Nの値は、図２１に示すように、３．２１５７であった。別途用意した表皮ブドウ球菌の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、０．４５４９であった。マイクロコッカスの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、１．０６１２であった。コリネバクテリウムの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、１．１５３４であった。枯草菌芽胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、０．４５４０であった。

これに対し、図２０に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、図２１に示すように、０であった。また、別途用意したポリエチレン系ポリマー製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は０．１７２１であった。この場合、一変量判別分析を行うと、判別値は０．２０、危険率は０．０９となった。つまり、Ｓ_E／Ｓ_Nの値が０．２０よりも大きければ、危険率０．０９で微生物と判定できることが明らかになった。

次に、図２２に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例と、図２３に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長４２０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ’_Nは、ピークの両下端を結ぶ直線を底辺にした場合の、ロングパスフィルターによって波長４２０ｎｍ未満の蛍光の透過が妨げられたことによって現れた有意ではないピークの面積である。また、図２２に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ’_Eは、ピークの両下端を結ぶ直線を底辺にした場合の、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来するピークの面積である。図２３に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ’_Eは、この蛍光スペクトルが微生物によるものか、非微生物によるものか、不明である場合は、ピークの両下端を結ぶ直線を底辺にした場合の、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積である。

図２２に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうる波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ’_Eを、波長４２０ｎｍ付近に現れる有意ではないピークの面積Ｓ’_Nで割ったＳ’_E／Ｓ’_Nの値は、図２４に示すように、３．７６９０であった。別途用意した表皮ブドウ球菌の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、０．９１９０であった。マイクロコッカスの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、１．８７７１であった。コリネバクテリウムの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、３．２４３０であった。枯草菌芽胞の蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、０．７５０３であった。

これに対し、図２３に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、図２４に示すように、０．０９８０であった。また、別途用意したポリエチレン系ポリマー製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの二次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は０．３１４７であった。この場合、一変量判別分析を行うと、判別値は０．４０、危険率は０．０９となった。つまり、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値が０．４０よりも大きければ、危険率０．０９で微生物と判定できることが明らかになった。

次に、図２５に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例と、図２６に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長４２０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ_Nは、蛍光強度の微分値０を底辺にした場合の、ロングパスフィルターによって波長４２０ｎｍ未満の蛍光の透過が妨げられたことによって現れた有意ではないピークの面積である。また、図２５に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ_Eは、蛍光強度の微分値０を底辺にした場合の、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来するピークの面積である。図２６に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ_Eは、この蛍光スペクトルが微生物によるものか、非微生物によるものか、不明である場合は、蛍光強度の微分値０を底辺にした場合の、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積である。

図２５に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうる波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ_Eを、波長４２０ｎｍ付近に現れる有意ではないピークの面積Ｓ_Nで割ったＳ_E／Ｓ_Nの値は、図２７に示すように、３．７２１１であった。別途用意した表皮ブドウ球菌の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、０．５９９０であった。マイクロコッカスの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、１．４０８５であった。コリネバクテリウムの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、２．７１０８であった。枯草菌芽胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、０．２４１６であった。

これに対し、図２６に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は、図２７に示すように、０．０１０８であった。また、別途用意したポリエチレン系ポリマー製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ_E／Ｓ_Nの値は０．１３２５であった。この場合、一変量判別分析を行うと、判別値は０．１６、危険率は０．０５となった。つまり、Ｓ_E／Ｓ_Nの値が０．１６よりも大きければ、危険率０．０５で微生物と判定できることが明らかになった。

次に、図２８に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例と、図２９に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長４２０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ’_Nは、ピークの両下端を結ぶ直線を底辺にした場合の、ロングパスフィルターによって波長４２０ｎｍ未満の蛍光の透過が妨げられたことによって現れた有意ではないピークの面積である。また、図２８に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ’_Eは、ピークの両下端を結ぶ直線を底辺にした場合の、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来するピークの面積である。図２９に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ’_Eは、この蛍光スペクトルが微生物によるものか、非微生物によるものか、不明である場合は、ピークの両下端を結ぶ直線を底辺にした場合の、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積である。

図２８に示す大腸菌細胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、リボフラビンに起因する、微生物が発する蛍光に由来しうる波長５１０ｎｍ付近に現れるピークの面積Ｓ’_Eを、波長４２０ｎｍ付近に現れる有意ではないピークの面積Ｓ’_Nで割ったＳ’_E／Ｓ’_Nの値は、図３０に示すように、３．３９２４であった。別途用意した表皮ブドウ球菌の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、０．７４５９であった。マイクロコッカスの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、２．６１７４であった。コリネバクテリウムの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、４．８１２２であった。枯草菌芽胞の蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、０．９３６１であった。

これに対し、図２９に示すポリエステル製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は、図３０に示すように、０．０５７６であった。また、別途用意したポリエチレン系ポリマー製クリーンルームウェアの蛍光スペクトルの三次微分の一実施例において、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値は０．２６３９であった。この場合、一変量判別分析を行うと、判別値は０．３４、危険率は０．１０となった。つまり、Ｓ’_E／Ｓ’_Nの値が０．３４よりも大きければ、危険率０．１０で微生物と判定できることが明らかになった。

従来、蛍光スペクトルを多変量解析することにより、微生物粒子と非微生物粒子とを判別する方法がある。しかし、多変量解析は複雑な処理を含むため、計算時間が長くなり、ソフトウェアが重くなる傾向にある。これに対し、実施の形態に係る微生物検出装置１によれば、多変量解析と比較して容易な方法で微生物を非微生物粒子から判別することが可能となる。

（実施例）
実施の形態で説明した実施例は、以下の方法により取得した。

（微生物の入手）
入手した微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、略称Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ １３７０６）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １２２２８）、枯草菌芽胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、ＡＴＣＣ ９３７２）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｌａｅ、ＡＴＣＣ ２７５６６）、及びコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、ＡＴＣＣ ５１４０３）であった。なお、ＡＴＣＣは、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の略である。大腸菌は、グラム陰性菌である。表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムは、グラム陽性菌である。

（微生物サンプルの調整）
−８０℃でストックされた大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスのそれぞれを３００ ｍＬの三角フラスコ中１５０ ｍＬのトリプトソイ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｅｆ： ２１１８２５）に植菌し、定常期に達するまで３２℃で一夜、好気的に培養した。また、コリネバクテリウムについては、液体培地としてＲ培地（ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、麦芽エキス５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビーフエキス２ｇ、グリセリン２ｇ、ツイーン８０ ５０ｍｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｇ、蒸留水 １Ｌ、ｐＨ７．２）に植菌した。

次に、それぞれの液体培地を遠心機（久保田商事株式会社 ２４１０）を用いて１０分間、２，１００ｇで遠心して集菌し、上清の培地を取り除いた後、ＰＢＳに再懸濁した。さらに同条件で遠心し、上清を取り除くことで洗浄した。同様の洗浄を計３回繰り返した。枯草菌芽胞に関しては、市販の芽胞液（ＮＯＲＴＨ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＳ，Ｉｎｃ．，ＳＵＮ−０７）を同条件で遠心し、細胞を得た。

（蛍光スペクトルの測定）
蛍光スペクトルは、蛍光分光光度計ＦＰ８５００（日本分光株式会社）で測定した。遠心により得られた細菌細胞のペレットを回収し、スライドガラス上に十分量塗布した。スライドガラスを、蛍光分光光度計のフィルム測定ホルダに固定し装置にセットした。３Ｄスペクトル（励起蛍光マトリクス）の測定には、蛍光側に４２０ｎｍカットオンのロングパスフィルターを使用した。また、４０５ｎｍ光励起による蛍光スペクトル測定時には、さらに４１０−４２０ｎｍ透過のバンドパスフィルターを使用して、迷光による散乱を抑えた。

クリーンルームウェアは、布地をスライドガラスで挟み、フィルム測定ホルダに固定して測定した。ポリエチレン系のものとしてＴｙｖｅｋ ＩｓｏＣｌｅａｎ （デュポン）、ポリエステル系のものとして超静電クリーンスーツ用フード（ミドリ安全）を使用した。

スペクトルの微分等の演算は、分光光度計付属のスペクトルマネージャーソフトウェアで行った。微分演算する前に、得られたスペクトルを単純移動平均法でノイズ除去した。

（一変量判別分析）
蛍光スペクトルの二次及び三次微分スペクトルに基づき、スペクトルマネージャーソフトウェアでピーク高さ（蛍光強度の微分値）の絶対値を計算した。さらに、微生物に含まれる蛍光物質が発する蛍光に由来しうる蛍光強度の微分値の絶対値を、微分スペクトルにおける有意ではない蛍光強度の大きさの微分値の絶対値で割った。その後、マイクロソフトの表計算ソフトウェア（エクセル）で一変量判別分析を行い、実施の形態で説明した結果を得た。

また蛍光スペクトルの二次及び三次微分スペクトルに基づき、スペクトルマネージャーソフトウェアでピーク面積を計算した。さらに、微生物に含まれる蛍光物質が発する蛍光に由来しうるピーク面積を、微分スペクトルにおける有意ではないピーク面積で割った。その後、マイクロソフトの表計算ソフトウェア（エクセル）で一変量判別分析を行い、実施の形態で説明した結果を得た。

（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、図２に示した微生物検出装置１は、散乱光検出器をさらに備えていてもよい。散乱光検出器は、気流に含まれる粒子によって散乱した光を検出する。粒子による散乱光の強度は、粒子の粒径と相関する。したがって、散乱光検出器で散乱光の強度を検出することにより、気流に含まれる粒子の粒径を求めることが可能である。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

１ 微生物検出装置
２１ 筐体
２２ 第１の吸引装置
２３ ノズル
２４ 第２の吸引装置
２５ 光源
２６ レーザ光
２７ 蛍光検出器
７０ クリーンルーム
７１ ダクト
７２ 噴き出し口
８１ 生産ライン
３０１ 判定部

Claims (18)

1. 粒子に励起光を照射する光源と、
   前記粒子が発した蛍光を検出する蛍光検出器と、
   前記蛍光のスペクトルのピークが複数ある場合、前記粒子が微生物であると判定し、前記蛍光のスペクトルのピークが一つである場合、前記粒子が非微生物であると判定する判定部と、
   を備える、微生物検出装置。
2. 前記判定部が、前記蛍光のスペクトルを微分する、請求項１に記載の微生物検出装置。
3. 前記判定部が、前記蛍光のスペクトルを複数回微分する、請求項１又は２に記載の微生物検出装置。
4. 前記判定部が、前記蛍光のスペクトルを微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークにおける蛍光強度の微分値の絶対値を、予め取得された判別値と比較して、前記蛍光強度の微分値の絶対値が大きい場合は、前記粒子が微生物であると判定し、前記蛍光強度の微分値の絶対値が小さい場合は、前記粒子が非微生物であると判定する、請求項２又は３に記載の微生物検出装置。
5. 前記判定部が、前記微生物が発する蛍光に由来しうる蛍光強度の微分値の絶対値を、前記微分スペクトルにおける有意ではない蛍光強度の大きさの微分値の絶対値で割る、請求項４に記載の微生物検出装置。
6. 前記判定部が、前記蛍光のスペクトルを微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積を、予め取得された判別値と比較して、前記ピークの面積が大きい場合は、前記粒子が微生物であると判定し、前記ピークの面積が小さい場合は、前記粒子が非微生物であると判定する、請求項２又は３に記載の微生物検出装置。
7. 前記判定部が、前記微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積を、前記微分スペクトルにおける有意ではないピークの面積で割る、請求項６に記載の微生物検出装置。
8. 前記励起光の照射位置に前記粒子を含む流体を流す流路を更に備える、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
9. 前記励起光の波長が、２５０ないし５５０ｎｍである、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
10. 粒子に励起光を照射することと、
    前記粒子が発した蛍光を受光することと、
    前記蛍光のスペクトルのピークが複数ある場合、前記粒子が微生物であると判定し、前記蛍光のスペクトルのピークが一つである場合、前記粒子が非微生物であると判定することと、
    を含む、微生物検出方法。
11. 前記判定することにおいて、前記蛍光のスペクトルを微分する、請求項１０に記載の微生物検出方法。
12. 前記判定することにおいて、前記蛍光のスペクトルを複数回微分する、請求項１０又は１１に記載の微生物検出方法。
13. 前記蛍光のスペクトルを微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークにおける蛍光強度の微分値の絶対値を、予め取得された判別値と比較して、前記蛍光強度の微分値の絶対値が大きい場合は、前記粒子が微生物であると判定し、前記蛍光強度の微分値の絶対値が小さい場合は、前記粒子が非微生物であると判定する、請求項１１又は１２に記載の微生物検出方法。
14. 前記微生物が発する蛍光に由来しうる蛍光強度の微分値の絶対値を、前記微分スペクトルにおける有意ではない蛍光強度の大きさの微分値の絶対値で割る、請求項１３に記載の微生物検出方法。
15. 前記蛍光のスペクトルを微分した微分スペクトルにおいて、微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積を、予め取得された判別値と比較して、前記ピークの面積が大きい場合は、前記粒子が微生物であると判定し、前記ピークの面積が小さい場合は、前記粒子が非微生物であると判定する、請求項１１又は１２に記載の微生物検出方法。
16. 前記微生物が発する蛍光に由来しうるピークの面積を、前記微分スペクトルにおける有意ではないピークの面積で割る、請求項１５に記載の微生物検出方法。
17. 前記励起光の照射位置に前記粒子を含む流体を流すことを更に含む、請求項１０ないし１６のいずれか１項に記載の微生物検出方法。
18. 前記励起光の波長が、２５０ないし５５０ｎｍである、請求項１０ないし１７のいずれか１項に記載の微生物検出方法。

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