JP6067800B2 - 微生物の死菌化方法 - Google Patents
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Description
(a)検液の調製
微生物菌体液の約2.5g〜約6.0gを50mL容メスフラスコに正確に秤量し、50mMリン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液(pH4.0)(以下、「緩衝液」という)で定容して、十分に溶解ないし懸濁させて検液とした。また、微生物菌体液が糖質(乳糖)を含む場合には、その約2.5gを50mL容の遠沈管に正確に秤量し、緩衝液に懸濁した後に、遠心分離(20,000G、15分間)して洗浄し、糖質を除いた。この洗浄操作を3回行なった後に、50mL容メスフラスコに移し、緩衝液で定容して十分に懸濁させて検液とした。更に、被検試料が微生物菌体乾燥粉末(以下、「乾燥品」という)の場合は、その約150〜350mgについて、同様の操作で洗浄した後に検液を調製した。
o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside;ONPG)0.3766gを100mL容メスフラスコに秤量し、緩衝液に溶解・定容して12.5mMの溶液を調製した。試験管に、このONPG溶液を0.8mL入れ、30℃の恒温水槽中で5分間保持した。これに検液を0.2mL添加してよく混合し、30℃で10分間反応させた後に0.25M炭酸ナトリウム溶液を4mL加えて反応を停止した(試験系)。別に、試験管にONPG溶液0.8mLと0.25M炭酸ナトリウム溶液4mLを入れ、更に検液を0.2mL加えてよく混合した(盲検系)。試験系および盲検系のそれぞれを、遠心分離(2,000G、10分間、15〜20℃)にかけ、得られた上清について、波長420nmで吸光度を測定し、次式により単位数を算出した。なお、上記の反応条件で、1分間に1μmolのo−ニトロフェノール(o-nitrophenol;ONP)を遊離するのに要する酵素量を1Uとした。
死菌化処理前後の微生物菌体液の5〜10g、または5〜10mLをアルミ皿に正確に秤量し、105℃で16時間乾燥した。この操作における乾燥前後の重量から、固形分含量(質量%)を算出した。また、噴霧乾燥において、固形分あたりのβ−ガラクトシダーゼ力価を算出する際に用いる乾燥原液と乾燥品の固形分含量も同様の条件で求めた。なお、微生物菌体液が培養液のときは(培地成分を含むときは)、遠沈管に正確に秤量し、遠心洗浄して培地成分を除いた後に、洗浄菌体の全量をアルミ皿に移し、上記と同様の操作で乾燥し、固形分含量を算出した。
噴霧乾燥における乾燥品の残留水分量は、(株)ケット科学研究所製の赤外線水分計を用いて105℃、15分間の条件で測定した。
乾燥品の粒度分布は、シンパテック社製のレーザー回折式粒度分布測定装置(HELOS&RODOSシステム)を用いて乾式で測定した。
ラクトース2.5%、酵母エキス0.5%、リン酸一カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%、寒天1.5%になるように溶解し、2N塩酸でpH5.0に調整した後に、オートクレーブ滅菌(121℃、10分間)し、平板プレート(φ90mm)を作成した。これに、生理食塩水で溶解・希釈したサンプルを100μL塗抹し、25℃で約1週間培養した後に、生じたコロニーを計測し、スポロボロマイセス・シンギュラリスの生菌数とした。
糖組成はHPLCを用いて以下の条件で分析した。
[HPLC条件]
カラム:Shodex SUGAR KS−802(昭和電工(株))
溶媒:純水
流速:0.5mL/分
温度:80℃
検出器:示差屈折計
微生物の死菌化:
(1)培養
スポロボロマイセス・シンギュラリス(Sporobolomyces singularis) YIT 10047(ISK−##2B6、以下、「Ss」と表記)を、グルコース5%、酵母エキス1.0%、リン酸一カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%を含む培地(pH5)で、27℃、4日間好気的に培養した。この培養液を遠心分離(10000G、30分間)して得られた湿菌体に、滅菌した市水を加えて十分に懸濁した。これを同条件で遠心分離し、固形分含量が5%程度となるように湿菌体を少量の市水に懸濁したものをSs濃縮液とした。
上記(1)で得られたSs濃縮液(固形分含量5.0%)のpHを5N水酸化ナトリウム溶液で、3.5〜6.3に段階的に調整した。これらとpH未調整(pH3.1)のSs濃縮液を35℃、40℃、45℃、50℃または55℃で18時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前後のSsの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)の結果を表1に示した。
上記(1)と同様にして得られたSs濃縮液(固形分含量5.6%)のpHを、5N水酸化ナトリウム溶液で4.0、4.5、4.9、5.7または6.5に調整した。これらを44℃、46℃、48℃、50℃または52℃で5時間または18時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前後のSsの生菌数および力価残存率の結果を表2(加熱処理5時間)、表3(加熱処理18時間)に示した。
上記(1)と同様にして得られたSs濃縮液(固形分含量5.0%)のpHを、5N水酸化ナトリウム溶液で4.5に調整し、40℃または45℃で保持して加熱処理をした。加熱処理中のSsの生菌数を経時的に測定した結果を表4に示した。
上記(1)と同様にして得られたSs濃縮液(固形分含量5.6%)について、5N水酸化ナトリウム溶液でpH4.5に調整したもの、乳糖を1%になるように添加したもの(pH未調整)、乳糖を1%になるように添加した後にpHを4.5に調整したものの3種を調製し、50℃で18時間保持して加熱処理をした(試験I)。同様の操作で、乳糖を2%添加した場合も実施した(試験II)。各Ss懸濁液の力価残存率を表5に示した。なお、加熱処理後のSs生菌数は、すべて10cfu/mL以下であった。
乾燥品の調製:
実施例1と同様にして得られたSs濃縮液(固形分含量5.3%)のpHを、5N水酸化ナトリウム溶液で4.5に調整し、40℃で18時間保持して、加熱処理をした。この死菌化Ss濃縮液7.8Lに、8、20、40%乳糖溶液を2.6L加えて十分に混合し、固形分含量がSs:約4%、乳糖:2、5、10%の乾燥原液を調製した。これらと、乳糖を添加していない死菌化Ss濃縮液をそれぞれ、噴霧乾燥のパイロット装置(プロダクションマイナ、GEAプロセスエンジニアリング(株))を用いて、入口温度:120℃、出口温度:約80℃、アトマイザー回転数:12,500rpm、原液処理量:4Kg/時間の条件で乾燥し、良好な乾燥品を得た。これらの力価残存率(乾燥原液の固形分あたり力価に対する乾燥品の固形分あたり力価の割合)、平均粒径、残留水分を測定した結果を表6に示す。
オリゴ糖生成試験:
(1)乾燥品の懸濁液の調製
上記実施例2で得られた乾燥品のうち、製品1と製品2をそれぞれ45U相当量を秤量し、これらをそれぞれ10mlのイオン交換水に加え、懸濁した。
上記(1)で調製した乾燥品の懸濁液の全量または実施例1と同様の方法で得られたSs濃縮液45U相当量を、それぞれ60%乳糖溶液800mLに添加して混合し、65℃、pH6で22時間反応させた。このときの糖組成を調べた結果を表7に示した。
微生物の死菌化:
(1)培養
実施例1の(1)と同様にしてSs濃縮液(固形分含量5.8%)を得た。
上記(1)で得られたSs濃縮液と乳糖溶液を3:1で混合し、乳糖を0.2〜15%含むSs濃縮液を調製した。これらと乳糖無添加のSs濃縮液を35℃、40℃、45℃、50℃または55℃で18時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前後のSsの生菌数の測定および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)の結果を表8に示した。
デキストリン(NSD#300、サンエイ糖化(株))、ガラクトオリゴ糖3糖以上画分、乳糖、マルトースおよびグルコースについて、死菌化時の酵素活性の安定化効果を比較した。上記(1)と同様にして得られたSs濃縮液(固形分含量5.6%)と、8、20%の糖質溶液を3:1で混合し、糖質を2%または5%含むSs濃縮液を調製した。これらを45℃または50℃で18時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後の力価の割合(力価残存率)の結果を表9に示した。なお、加熱処理前のSs生菌数は108cfu/mLであったが、加熱処理後には何れの糖質、何れの濃度も10cfu/mL以下に低減し、死菌化されていた。
上記(1)と同様にして得られたSs濃縮液(固形分含量5.0%)と20%乳糖溶液を3:1で混合し、乳糖を5%含むSs濃縮液を調製し、40℃、45℃で保持して加熱処理をした。加熱処理中のSsの生菌数を経時的に測定した結果を表10に示した。
上記(1)と同様にして得られたSs濃縮液(固形分含量5.3%)と8、20、40%乳糖溶液を3:1で混合し、乳糖を2%、5%、10%含むSs濃縮液を調製した。これらを40℃で18時間保持して加熱処理した。以下のHPLC条件で、加熱処理後の糖組成を分析した。その結果を表11に示した。また、加熱処理前の力価を測定し、残存力価を算出した結果もあわせて表11に示した。なお、加熱処理前のSs生菌数は108cfu/mLであったが、加熱処理後には何れも10cfu/mL以下に低減し、死菌化されていた。
乾燥品の調製:
実施例1と同様にして得られたSs濃縮液(固形分含量5.3%)と8、20、40%乳糖溶液を3:1で混合し、固形分含量がSs:4%、乳糖:2、5、10%の乾燥原液を調製した。これらを40℃で18時間保持して、加熱処理をした。この死菌化Ss濃縮液を噴霧乾燥のパイロット装置(プロダクションマイナ、GEAプロセスエンジニアリング(株))を用いて、入口温度:120℃、出口温度:約80℃、アトマイザー回転数:12500rpm、原液処理量:4Kg/時間の条件で乾燥し、良好な乾燥品を得た。これらの力価残存率(乾燥原液の固形分あたり力価に対する乾燥品の固形分あたり力価の割合)、平均粒径、残留水分を測定した。その結果を表12に示した。
オリゴ糖生成試験:
(1)乾燥品の懸濁液の調製
上記実施例5で得られた乾燥品のうち、製品5と製品6をそれぞれ45U相当量を秤量し、これらをそれぞれ10mlのイオン交換水に加え、懸濁した。
上記(1)で調製した乾燥品の懸濁液の全量または実施例1と同様の方法で得られたSs濃縮液45U相当量を、それぞれ60%乳糖溶液800mLに添加して混合し、65℃、pH6で22時間反応させた。このときの糖組成を調べた結果を表13に示した。
微生物の死菌化:
(1)培養
実施例1の(1)と同様にしてSs濃縮液(固形分含量5.2%)を得た。
上記(1)で得られたSs濃縮液と乳糖溶液を3:1で混合し、乳糖を2〜5%含むSs濃縮液を調製した。これらと乳糖無添加のSs濃縮液を50℃で18時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)の結果を表14に示した。なお、加熱処理後のSs生菌数はいずれも10cfu/ml以下であった。
微生物の死菌化:
(1)培養
実施例1の(1)と同様にしてSs濃縮液(固形分含量5.4%)を得た。
上記(1)で得られたSs濃縮液について、2N水酸化ナトリウム溶液でpH4.5に調整したもの、乳糖を1%になるように添加したもの(pH未調整)、乳糖を1%になるように添加した後にpHを4.5に調整したものの3種を調製し、45℃で18時間保持して加熱処理をした(試験III)。同様の操作で、乳糖を2%添加した場合も実施した(試験IV)。各Ss懸濁液の力価残存率を表15に示した。なお、加熱処理後のSs生菌数は、すべて10cfu/mL以下であった。
上記(1)で得られたSs濃縮液について、2N水酸化ナトリウム溶液でpH4.5、5.0、5.5に調整したもの、乳糖を2%になるように添加したもの(pH未調整)、乳糖を2%になるように添加した後にpHを4.5、5.0、5.5に調整したものの3種を調製し、50℃で5時間または18時間保持して加熱処理をした。各Ss懸濁液の力価残存率を表16に示した。なお、加熱処理後のSs生菌数は、すべて10cfu/mL以下であった。
微生物の死菌化:
(1)培養
Ssを、グルコース2%、酵母エキス0.4%、リン酸一カリウム0.05%、硫酸マグネシウム0.025%を含む培地(pH5)で、27℃、4日間好気的に培養した。この培養液を遠心分離(10000G、30分間)して得られた湿菌体に、滅菌した市水を加えて十分に懸濁した。これを同条件で遠心分離し、得られた湿菌体に乳糖溶液および滅菌水を加え、乳糖を2%または5%含み、かつ菌体濃度が2.5%、4.5%および6.5%(w/v)となるSs濃縮液を調製した。
上記(1)で得られたSs濃縮液を45℃または50℃で5時間または18時間保持し、加熱処理をした。加熱処理前後のSsの生菌数の測定および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)を図1〜4に示した。
微生物の死菌化:
(1)培養
Ssを、グルコース4%、酵母エキス0.8%、リン酸一カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%を含む培地(pH5)で、27℃、4日間好気的に培養し、Ss培養液(固形分含量2.5%)を得た。
上記(1)で得られたSs培養液のpHを2N水酸化ナトリウム溶液で、3.5〜5.0に段階的に調整した。これらと、pH未調整のSs培養液を40℃または45℃で、5時間または18時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のSsの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)の結果を表17に示した。
pH調整剤の検討:
(1)培養
Ssを、グルコース4%、酵母エキス0.8%、リン酸一カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%を含む培地(pH5)で、27℃、4日間好気的に培養し、Ss培養液(固形分含量2.8%)を得た。
上記(1)で得られたSs培養液に0.5N、2Nまたは5N水酸化ナトリウム溶液または水酸化カリウム溶液、10%または20%炭酸ナトリウム溶液を滴下してpHを5.0に調整した。pH調整前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対するpH調整後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)を図5に示した。
pH調整剤の検討:
(1)培養
Ssを、グルコース5%、酵母エキス1%、リン酸一カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%を含む培地(pH5)で、27℃、4日間好気的に培養し、Ss培養液(固形分含量2.5%)を得た。
上記(1)で得られたSs培養液のpHを2N水酸化ナトリウムまたは20%炭酸ナトリウム溶液で、4.0〜5.0に段階的に調整した。これらを40℃または45℃で、5時間または18時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のSsの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)を表18に示した。
乾燥品の調製:
(1)Ss濃縮液の調製
Ssを、グルコース4%、酵母エキス0.8%、リン酸一カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%を含む培地(pH5)で、27℃、4日間好気的に培養した。この培養液を遠心分離(10000G、30分間)して菌体濃縮液を回収した。これに滅菌した市水を加えて十分に懸濁して洗浄した後に同条件で遠心分離し、固形分が5%程度になるように調整したものをSs濃縮液(固形分含量5.1%)とした。
Ssを、グルコース4%、酵母エキス0.8%、リン酸一カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%を含む培地(pH5)で、27℃、4日間好気的に培養し、Ss培養液を得た。
上記(1)で得られたSs濃縮液のpHを20%炭酸ナトリウム溶液で、4.8±0.2に調整した。このSs濃縮液を45℃で7時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のSsの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)の結果を表19に示した。また、乾燥直前に、死菌化後のSs濃縮液に24%乳糖溶液を5:1で混合し、乳糖を4%含む乾燥原液を調製した。
上記(1)で得られたSs濃縮液と24%乳糖溶液を5:1で混合し、乳糖を4%含むSs濃縮液を調製した。このSs濃縮液を50℃で7時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のSsの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)の結果を表19に示した。死菌化後のSs濃縮液をそのまま乾燥原液とした。
上記(1)で得られたSs濃縮液と24%乳糖溶液を10:1で混合し、乳糖を2.2%含むSs濃縮液を調製した。さらに、当該Ss濃縮液のpHを20%炭酸ナトリウム溶液で、4.8±0.2に調整した。このSs濃縮液を50℃で7時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のSsの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)の結果を表19に示した。また、乾燥直前に、死菌化後のSs濃縮液に24%乳糖溶液を11:1で混合し、乳糖を4%含む乾燥原液を調製した。
上記(2)で得られたSs培養液のpHを20%炭酸ナトリウム溶液で、4.8±0.2に調整した。このSs培養液を45℃で7時間保持し、加熱処理をした。加熱処理後のSsの生菌数および加熱処理前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する加熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)の結果を表19に示した。また、死菌化後のSs培養液を遠心分離(16000G)して湿菌体を回収した。これに滅菌した市水を加えて十分に懸濁して、固形分が5%程度になるように調整し、死菌化されたSs濃縮液(固形分含量5.2%)を得た。乾燥直前に、この死菌化されたSs濃縮液に24%乳糖溶液を5:1で混合し、乳糖を4%含む乾燥原液を調製した。
上記(3)〜(6)で得られた乾燥原液を噴霧乾燥のパイロット装置(プロダクションマイナ、GEAプロセスエンジニアリング(株))を用いて、入口温度:120℃、出口温度:80℃、アトマイザー回転数:15000rpm、原液処理量:約4.5kg/時間の条件で乾燥し、良好な乾燥品を得た。これらの乾燥品の力価残存率、平均粒径、残留水分を測定した。その結果を表19に示した。
保存試験:
実施例2で調製した乾燥品(製品1〜3)および実施例5で調製した乾燥品(製品5〜7)をそれぞれ5℃または25℃で360日保存した。保存前のβ−ガラクトシダーゼ力価に対する保存後のβ−ガラクトシダーゼ力価の割合(力価残存率)を測定した。その結果を表20に示した。
微生物の死菌化:
Ssに代えてスポロボロマイセス・シンギュラリス JCM 5356(ATCC 24193)を用いる以外は実施例1と同様にして微生物の死菌化を行ったところ、力価残存率等についてほぼ同様の結果が得られた。例えば、pH5.0、45℃で加熱処理した時に力価残存率が80%以上であった。
死菌化<糖組成の検討>:
Ssに代えてスポロボロマイセス・シンギュラリス JCM 5356(ATCC 24193)を用いる以外は実施例4と同様にして微生物の死菌化を行ったところ、力価残存率等についてほぼ同様の結果が得られた。例えば、乳糖濃度5%、45℃で加熱処理した時に力価残存率が80%以上であった。
Claims (6)
- β−ガラクトシダーゼ活性を有するスポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液に乳糖、グルコース、マルトースおよびガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる糖質の1種以上を添加し、次いでこれを40〜50℃で4〜20時間加熱処理することを特徴とする菌体液の、加熱処理後のβ―ガラクトシダーゼ力価が加熱処理前のβ―ガラクトシダーゼ力価の80%以上である、スポロボロマイセス・シンギュラリスを死菌化する方法。
- 糖質を、0.2〜30質量/体積%で添加する請求項1に記載のスポロボロマイセス・シンギュラリスを死菌化する方法。
- β−ガラクトシダーゼ活性を有するスポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液に乳糖、グルコース、マルトースおよびガラクトオリゴ糖からなる群から選ばれる糖質の1種以上を添加し、次いでこれを40〜50℃で4〜20時間加熱処理することにより得られる、加熱処理後のβ―ガラクトシダーゼ力価が加熱処理前のβ―ガラクトシダーゼ力価の80%以上であることを特徴とする死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液。
- 糖質を、0.2〜30質量/体積%で添加する請求項3に記載の死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液。
- 請求項3または4に記載の死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液を乾燥することにより得られる死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体乾燥粉末。
- 請求項3または4に記載の死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体液および/または請求項5記載の死菌化スポロボロマイセス・シンギュラリス菌体乾燥粉末を含有する酵素組成物。
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