JPS62208293A - ビフイドバクテリウム菌増殖促進因子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産呈上９皿里盆野 本発明は、乳糖を原料するビフィドバクテリウム菌増殖
促進因子の製造法に関するものである。

ｊ ビフィドバクテリウム菌増殖促進因子すなわちビフィド
バクテリウム菌の増殖を促進する作用を有する物質とし
ては多数のものが知られているが、その中で、本発明者
らにより有効性が確認されたオリゴ糖・Ｇａ１−（Ｇａ
ｌ）ｎ−Ｇｌｃ　（但し式中Ｇ　ａ　ｌはガラクトース
残基、Ｇｌｃはグルコース残基、Ｇｌｃは１〜４の整数
をそれぞれ表わす；特公昭５８−２０２６６号）は、大
腸内におけるビフィドバクテリウム菌の増殖促進作用が
特にすぐれたものとして注目されている。しかしながら
、本発明者らが上記オリゴ糖（以下、〃ラクトオリゴ糖
という）からなるビフィドバクテリウム菌増殖促進因子
の工業的製法として最初に提案した方法すなわちアスペ
ルギルス・オリゼの、生産するβ−ガラクトシダーゼを
乳糖に作用させる方法は、種々有利な点はあるものの、
ガラクトオリゴ糖の対乳糖収率および反応生成物の〃ラ
クトオリゴ糖含有率の２点で、改良の余地のあるもので
あった。

一方、特開昭６０−２５１８９６号公報には、乳糖含有
培地でクリプトコツカス属微生物を培養して培養物中に
〃ラクトオリゴ糖を：！Ｆ積させ、培養物より〃ラクト
オリゴ糖を採取することからなるガラクトオリゴ糖の製
法が開示されており、この製法は、上記β−がラクトシ
ダーゼを用いる方法のような欠点がないとされている。

しかしながらこの製法は、４〜６日問という長期間培養
を必要とするだけでなく、用いるクリブトフッカス属微
生物かがラクトースを資化するため、一部の乳糖の加水
分解反応とそれにより生成したガラクトースの転移反応
に上り〃ラクトオリゴ糖が生成される過程で、乳糖に転
移すべきがラクトースの一部が該微生物によって消費さ
れてしまうこと、したがってがラクトオリゴ糖の対乳糖
収率がそれほど高くはなり得ないことが問題点である。

また、ビフィドバクテリウム菌増殖促進因子の製法とし
て興味を持って行われたものではないが、カナディアン
・ジャーナル・オブ・ケミストリー　４２．ｐ、１３４
１　　（１９６４）には、酵母・スポロボロマイセス・
シンイユラリス（Ｓｐｏｌｏ−ｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓ
ｉｎｇｕｌａｒｉｓ；但し現在はブレラ属に分類されて
いる）を乳糖と酵母エキスとを含有する培地で培養し、
培養物から〃ラクトオリゴ糖を得たという研究報告が掲
載されている。それによれば、上記酵母を用いる場合は
培地の初発ｐＨ値の調整が重要であって、ｐＨを３．７
５にしたときはオリゴ糖の生成が認められたが、初発ｐ
Ｈが４をこえると、オリゴ糖は生成しなかったという。

本発明者らの追試によれば、初発１）Ｈを３．７５程度
とした場合、培養の中期以降はｐＨが３以下となる。こ
の上うな低ｐＨ領域では酵母の増殖はきわめて緩慢にな
らざるをえないか呟この製法も、長時日培養を続けたと
しても高収率は望めない。また、酵母の増殖にとって限
界に近い低ｒ＋Ｈのせまい領域でしか実施できないとす
れば、この方法を工業的に実施するには培養技術上も多
くの困難がある。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、従来の製法がいずれも上述のような欠点を持
つものであったことに鑑み、より短時間で〃ラクトオリ
ゴ糖が生成し、反応生成物の〃ラクトオリゴ糖含有率が
高く、〃ラクトオリゴ糖の分離精製も容易な〃ラクトオ
リゴ糖調製法を見いだし、それにより、高純度のビフィ
ドバクテリウム菌増殖促進因子を従来よりも安価に得ら
れるようにすることを目的とするものである。

刑達Ａ上漫迭ｊ玉ム及り手Ｂ 上記目的を達成することに成功した本発明のビフィドバ
クテリウム菌増殖促進因子の製造法は、乳糖上りがラク
トオリゴ糖すなわち一般式Ｇａ１（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ
　（但し式中Ｇａｌはがラクトース残基、Ｇｌｃはグル
コース残基、Ｇｌｃは１〜４の整数をそれぞれ表わす）
で示されるオリゴ糖をｐＨ４，５において生産する能力
を有するブレラ属の酵母を、炭素源として乳糖を含有す
る培地で該培地のｐＨを３〜７に保ちながら培養し、培
養物よりがラクトオリゴ糖を採取することを特徴とする
ものである。

以下、本発明の製法について詳述する。

本発明の製法において使用可能なブレラ属酵母の具体例
としては、ブレラ・シンギュラリス（Ｂｕｌｌｅｒａ　
ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）ＹｒＴ８２４３がある。この菌
株は、もともとは本発明者らが１９８２年にＡＴＣＣよ
り分譲を受けたブレラ・シンギュラリスＡＴＣＣ２４１
９３であるが、現在は上記側の名称を付して微生物工業
技術研究所に寄託しである（微工研薗寄第８６７７号）
。その菌学的性質の主なものは次のとおりである。

Ａ、各種培地における生育 ■　麦芽汁液体培地：２０℃・３日間の培養で細胞は卵
形から伸長形で、（２，５−３，５）ｕｍＸ（４，５〜
７．０）ＩＪ＋ｍ。

多極出芽、リング状の皮膜を形成、培地はにごり、沈殿
を生成。

■　麦芽汁寒天培地：２０°Ｃ・１力月でコロニーは乳
白色、光沢があり、平滑型で粘調である。

■　スライド培養：バレイショ抽出液寒天培地で偽菌糸
を形成しない。

Ｂ、子嚢胞子の形成ニ一般的な胞子形成培地では認めら
れない。

Ｃ０射出胞子の形Ｉ＆：麦芽汁寒天またはコーンミール
寒天培地での培養では認められない。

Ｄ、生理的性質 ■　最適生育条件：ｐＨ４〜６．温度２８℃■　生育範
囲：ｐＨ３〜８．温度２０〜２９℃■　硝酸塩の同化：
同化しない。

■　カロチノイドの生成：生成しない。

■　デンプン様物質の生成：生成しない。

■　ビタミンの要求性：ビタミン欠培地で生育しない。

■　５０％グルコース酵母エキス培地での生育：生育し
なし１゜ ■　３０℃での生育：生育しない。

Ｅ、各炭素源に対する同化性 Ｌ−７ラビノース　　　　− Ｄ−リボース　　　　　　− Ｄ−キシロース　　　　　　− Ｄ−グルコース　　　　　　＋ Ｄ−ガラクトース　　　　− Ｌ−ラムノース　　　　　　− 麦芽糖　　　　　　　　　− シタ糖　　　　　　　　　− 乳糖　　　　十′ セロビオース　　　　　　＋ トレハロース　　　　　　　＋ ラフィノース　　　　　　− 可溶性デンプン　　　　　− エリトリット　　　　　　　− イノシラＦ　　　　　　　− Ｄ−マンニット　　　　　　＋ Ｄ−グルコン酸塩　　　　士 コハク酸塩　　　　　　　士 クエン酸塩　　　　　　　　士 なお糖類に対する発酵性はない。

上記菌株以外のものでも、ｐＨ４，５において〃ラクト
オリゴ糖生産能を有するものはすべて本発明の製法に使
用することができることはいうまでもない。なお、前述
のように現在ではブレラ属とされているスポロボロマイ
セス・シンギエラリスな用いてガラクトオリゴ糖を得た
という１９６４年の研究報告があるが、そこにおいて使
われた菌株は、ｐＨが４をこえるとオリゴ糖を生産し得
ない゛ものであり、この点で、本発明が採択したブレラ
属酵母とは異なるものである。

〃ラクトオリゴ糖からなるビフィドバクテリウム菌増殖
促進因子を微生物を利用して製造する場合にお′ける“
〃ラクトオリゴ糖生産能を有するブレラ属酵母”の有利
な点は、この酵母が一部の乳糖の加水分解により生成す
るグルコースとがラクトースのうち前者を資化して増殖
し、したがって培養物中に無用の（そして精製の負担と
なる）グルコースな残さないこと、および、ガラクトー
スを資化しない特性を有し、したがってそれ自身のため
にガラクトースを消費することがないことである。また
“ｐＨ４，５において〃ラクトオリゴ糖を生産する能力
”は、ブレラ属酵母の培養工程を酵母が旺盛に増殖し得
るｐＨ４以上の弱酸性領域において実施することを可能
にする０本発明の製法においては、これらの特長が充分
に生かされることにより、乳糖から〃ラクトオリゴ糖へ
、短時間で高率の転移反応が達成され、また培養物は〃
ラクトオリゴ糖含有率の高いものとなる。

本発明の製法を実施する場合、培養に用いる“ｐＨ４，
５において〃ラクトオリゴ糖を生産する能力を有するブ
レラ属酵母”（以下、単にブレラ属酵母という）は、あ
らかじめ乳糖含有培地で１〜３日間前培養して面体のが
ラクトシル転移能を高めたものであることが望ましいが
、乳糖を含まない培地で前培養したものでも差支えない
。

本培養の培地は、炭素源として乳糖のみを含むものであ
ることが望ましい。他の炭素源を共存させることは、酵
母の増殖には有利でも消費されずに残った場蚕に培養物
の〃ラクトオリゴ糖含有率を低下させ、精製工程の負担
となるから、用いるとしても必要最小限度にとどめるべ
きである。培地の乳糖濃度は約２〜２５％とすることが
望ましい。それ以上の濃度、特に約３０％以上では、酵
母の増殖が緩慢になりがラクトオリゴ糖の生成速度も低
下する。他の培地成分には特に制限がなく、酵母エキス
、ペプトン、コーンスチープリカー、肉エキスなどの窒
素源や、リン酸塩、マグネシウム塩、ビタミン類など、
酵母用培地成分として通常使用されるものを適宜含有さ
せることができる。

培地のｐＨは、培養の全期間を通じて、酵母の増殖に好
適な３〜７の範囲内に保たれなければならない。特に好
ましいｐＨは３．５−６であり、少なくとも培養の大部
分の期間は、このｐＨ範囲で行われることが望ましい、
ｐＨが３以下でも、生育中のブレラ属酵母が存在する限
り〃ラクトオリゴ糖は生成するが、生成速度が着しく遅
くなる。培地ｐＨを３〜７に保つ方法としては、培養末
期においてもｐＨが３以上であるように培地の初発ｐＨ
を充分高くしておく方法（通常４以上にすることが必要
である）、培養中希アルカリまたは緩衝液を時々添加し
て９Ｈが３以下にならないように制御する方法、あるい
はこれら二つの方法を併用する方法などがある。

培養温度は約２０〜２９℃の範囲内であればよいが、２
８℃付近が酵母の増殖と〃ラクトオリゴ糖の生成に最も
適している。ブレラ属酵母は好気的条件下でのみ増殖す
るので、振盪培養または通気攪拌培養を行う必要がある
。

上述のような条件で培養を行なった場合、培地中の乳糖
が消費されて徐々に減少し、それに応じて、菌体濃度お
よＶ〃ガラクトオリゴ糖主として３糖類）の濃度が上昇
する。但しオリゴ糖濃度はある時点から徐々に減少し始
める。〃ラクトオリゴ糖の組成も培養時間の経過ととも
に変化し、オリゴ糖濃度が最高になる頃から４糖類以上
のオリゴ糖の比率がふぇてくる。最高のがラクトオリゴ
糖収率が達成されるまでに要する培養時間は、培養条件
（特に培地ｐＨ）によって異なるが、たとえば乳糖濃度
１０％としｐＨを３．７５に制御しながら２７℃で培養
を行なった場合、２〜３日である。培地に蓄積される単
糖すなわちグルコースとガラクトースの全糖に対する割
合は、培養の全期間を通じて、多くても２％程度である
。

適当な段階で培養を打切った後、ろ過または遠心分離に
より面体を分離する。分離された菌体は、分離繰作を無
菌的に行うならば繰返して培養に使用することができる
。菌体分離後の培養物から〃ラクトオリゴ糖を採取する
には、たとえば活性炭やイオン交換樹脂を用いて脱色、
脱塩後、活性炭カラムに通してガラクトオリゴ糖を吸着
させ、次いでエタノール水溶液で溶出し、溶出液を減圧
濃縮してシロップ状にするか、濃縮液をさらに噴霧乾燥
法または凍結乾燥法により粉末化すればよい。

１■Ω刀禾 本発明の製法は、前述のように多くの有利な性質を有す
るブレラ属酵母を旺盛に増殖させながら利用するもので
あるから、従来の微生物を利用する方法のいずれと比べ
ても、所要培養時間が短くてすむだけでなく〃ラクトオ
リゴ糖の収率が高く、対乳糖６０〜７０％の収率を達成
することは容易である。また、培地中にグルコースやガ
ラクトースがほとんど蓄積されず、全糖量に対する〃ラ
クトオリゴ糖の比率の高い培養物が得られるため、培養
後の精製が容易である。

本発明の製法はまた、ブレラ属酵母が旺盛に増殖するｐ
Ｈ領域で培養を行うものであるが呟ｐＨ４，５において
〃ラクトオリゴ糖生産能を有しないブレラ属の酵母を用
いてその増殖には決して好都合でない条件での培養を行
う公知方法と比べて培養工程の管理が容易であり、組成
の安定した培養物が得られるという特長を持つ。

したがって本発明によれば、高品質のビフィドバクテリ
ウム菌増殖促進因子を従来よりも容易かつ安価に製造す
ることができる。

ヌ１男 以下実施例を示して本発明を説明する。なお実施例にお
ける〃ラクトオリゴ糖の定量は高速液体クロマトグラフ
ィーにより行なった。また、「菌体増殖度」は、分光光
度計を用いて培養液につき測定された波長６６０ｎｍの
吸光度をそのまま示したものである。但し、吸光度はそ
の測定値が０．６以上になると菌体濃度との開の比例関
係が失われるので、その場合は吸光度が０．６以下にな
るように希釈した培養液について測定を行い、測定値に
希釈倍率を乗じた値を表示した。

実施例　１ 乳糖１０％、酵母エキス０．３％、リン酸−カリウム０
．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ５，０の液
体培地８ｅを１０ｅのシャーに入れ、同じ培地で前培養
したブレラ・シンギュラリスＹＩＴ８２４３の菌液２０
０ｅｌを加え、通気と撹拌を続けながら２７℃で培養し
た。培養中の培地組成の変化を第１図に示す、〃ラクト
オリゴ糖の生成は６２時間で最大になり、この時のがラ
クトオリゴ糖の対乳糖収率は７０％、乳糖お上り単糖を
含む全糖中のがラクトオリゴ糖の比率は８７％であった
。

また、６２時間目の培養液５００ｍ１を取出し、遠心分
離して菌体な除き、上清に粉末活性炭を２．５ｇ添加し
て攪拌後ろ過することにより、透明な糖液を得た。この
糖液を活性炭カラムに通して糖類を吸着させ、続いて３
Ｃの水を流すことにより、グルコース、ガラクトースお
よび２糖類の一部を溶出させた。さらに５％エタノール
を流して残存する２糖類を除いたのち、５０％エタノー
ルを流して〃ラクトオリゴ糖を溶出させた。溶出液を減
圧濃縮後ろ過し、凍結乾燥すると、白色の粉末３０．Ｉ
ｇが得られた。この粉末は、Ｇａ１−（β１−＋４）−
Ｇａｉ（β１−＋４）−Ｇｌｃを２３．６ｇ、Ｇａ１（
β１−４）−Ｇａｌ−（β１−４）−Ｇａｌ（β１−＋
４）−Ｇｌｃを６．０　ｇ、乳糖を０．５ｇ含むもので
あった。

実施例　２ ｐＨを３．７５に調整したほかは実施例１で用いたのと
同じ組成の培地５ｅを１０ｅのジャーに入れ、同じ培地
で前培養したブレラ・シンギュラリスＹＩＴ８２４３の
菌液１００ｍ１を加え、通気と攪拌を続けながら２７℃
で培養した。培養中、培地ｐＨを監視し、塩酸または水
酸化カリウム水溶液を滴下することによりｐＨ変動を３
．７５±０．１の範囲に抑えた。

この培養およびｐＨを制御しないほかは同様にした培養
における菌体増殖度および培地中に生成した〃ラクトオ
リゴ糖の濃度の経時的変化は第１表のとおりであった。

第１表 培養開始から７２時間後、培養液を取出し、遠心分離し
て菌体を除き、上清に粉末活性炭を２０ｇ添加して攪拌
後ろ過し更にイオン交換樹脂カラム（強酸性陽イオン交
換樹脂と強塩基性イオン交換樹脂との混合物を充填した
もの）に通して、透明な糖液１０ｅを得た。この糖液な
５００ｍ１まで減圧濃縮後ろ過し、粘稠な糖液を得た。

この糖液中の全糖量に対する〃ラクトオリゴ糖の割合は
９１％であった。

実施例　３ 実施例２と同様の方法でｐＨを制御しながら培養した場
合において培地ｐＨの設定値が〃ラクトオリゴ糖の最高
収率に及ぼす影響を調べた。その結果は第２表のとおり
であった。

第２表 培地ｐＨガラクトオリゴ糖最高収率（％２．０　　　　
　　０ ２．５　　　　　　０ ３．０　　　　　　６１ ３．５　　　　　　６８ ３．７５　　　　　６７ ４．０〜　　　　６７ ４．５　　　　　　６８ Ｓ、０　　　　　　６９ ６．０　　　　　６６ ７．０　　　　　５８ ８．０　　　　　　０ 実施例　４ 乳糖１０％、酵母エキス０．７５％の液体培地１００ｍ
１を５００ｍ１容三角フラスコにとり、これに、前培養
後生理食塩水で洗浄したブレラ・シンギュラリスＹＩＴ
８２４３の菌体の一定量を接種する。その後、回転式振
盪培＊ａを用いて２７℃で＠養する（ｐＨ制御は行わな
い）。

上記の培養を、培地の初発ｐＨを種々変更して行なった
場合、〃ラクトオリゴ糖の最大収率および最大収率に達
したときのｐＨは第３表のとおりであった。

第３表 培地初発ｐＨオリゴ糖最大収率（％）最大収率到達時ｐ
Ｈ２、ＯＸｉ　　　　　　　　　　　− ２・５　　　　　　　×１　　　　　　　　　−３．０
　　　　　　３０，４　　　　　　　　２．４３．５　
　　　　　４１．１　　　　　　　　２．６３．７５　
　　　　４５，８　　　　　　　　２．７４、ＯＳ　２
．４　　　　　　　　３．０４．５　　　　　　６０．
２　　　　　　　　３．３５．０　　　　　　５９．９
　　　　　　　　３．４５．５　　　　　　５６，７　
　　　　　　　３．６６．０　　　　　　６０，６　　
　　　　　　３．８６．５　　　　　　５８，１　　　
　　　　　４．２７．０　　　　　　　５４，５　　　
　　　　　　４．６８．０　　　　　　　　　＊２　　
　　　　　　　　　−９．０　　　　　　　　　＊１　
　　　　　　　　　　　−×１　菌が増殖せず、オリゴ
糖は生成しない＊２　菌の増殖がきわめて緩慢でオリゴ
糖はほとんど生成しない

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における培地組成の経時的変化を示す
グラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）乳糖より一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｎ−Ｇｌｃ（
   但し式中Ｇａｌは″ラクトース残基、Ｇｌｃはグルコー
   ス残基、ｎは１〜４の整数をそれぞれ表わす）で示され
   るオリゴ糖をｐＨ４．５において生産する能力を有する
   ブレラ属の酵母を、炭素源として乳糖を含有する培地で
   該培地のｐＨを３〜７に保ちながら培養し、培養物より
   上記オリゴ糖を採取することを特徴とするビフィドバク
   テリウム菌増殖促進因子の製造法。
2. （２）ｐＨ３．５〜６の範囲内で培養を行う特許請求の
   範囲第１項記載の製造法。
3. （３）酵母としてブレラ・シンギュラリスＹＩＴ８２４
   ３（微工研菌寄第８６７７号）を用いる特許請求の範囲
   第１項記載の製造法。