JP6059138B2 - 植物におけるdhaおよび他のlc−pufaの産生 - Google Patents
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Description
本発明は全体として、宿主生物における多価不飽和脂肪酸(PUFA)の産生を可能にする、および/または向上させる、PUFAシンターゼ系および1つまたは複数のアクセサリータンパク質によって遺伝的に改変された組換え宿主生物(例えば、植物)に関する。本発明はまた、(例えば、PUFAを得るために)そのような生物を作製および使用する方法、ならびにそのような生物から得られる産物(例えば、油および種子)にも関する。
植物、植物種子または植物油の中に、かなりの数量(例えば、商業ベースの数量)の、比較的長鎖の、または比較的飽和度の高いPUFAを効率的かつ効果的に産生させるための比較的安価な方法、ならびに植物、植物種子または植物油中の、そのようなPUFAに富むかなりの数量の脂質(例えば、トリアシルグリセロール(TAG)およびリン脂質(PL))に対しては、当技術分野において需要がある。本明細書に記載されたような、多価不飽和脂肪酸(PUFA)シンターゼおよび1つまたは複数のアクセサリータンパク質によって遺伝的に改変された組換え宿主生物を提供することにより、宿主生物(例えば、植物)におけるPUFA産生をもたらし、かつ向上させるための系は、当技術分野におけるアプローチに代わる意義深い選択肢である。
[本発明1001]
(i)少なくとも1つのPUFAを産生する多価不飽和脂肪酸(PUFA)シンターゼ系をコードする核酸配列;および
(ii)ホスホパンテテイニル補因子をPUFAシンターゼ系ACPドメインへと転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)をコードする核酸配列
を含む、遺伝的に改変されたアブラナ属(Brassica)植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1002]
ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)である、本発明1001の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1003]
ブラッシカ・ジュンセア(Brassica juncea)である、本発明1001の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1004]
PUFAシンターゼ系が、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1005]
PUFAシンターゼ系がSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1006]
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:6の核酸配列に対して少なくとも80%同一な核酸配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1007]
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列がSEQ ID NO:6の核酸配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1008]
PUFAシンターゼ系が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1007のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1009]
PUFAシンターゼ系がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1007のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1010]
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:7の核酸配列に対して少なくとも80%同一な核酸配列を含む、本発明1001〜1007のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1011]
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列がSEQ ID NO:7の核酸配列を含む、本発明1001〜1007のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1012]
PUFAシンターゼ系が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1011のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1013]
PUFAシンターゼ系がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1011のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1014]
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:8の核酸配列に対して少なくとも80%同一な核酸配列を含む、本発明1001〜1011のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1015]
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列がSEQ ID NO:8の核酸配列を含む、本発明1001〜1011のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1016]
PUFAシンターゼ系がSEQ ID NO:1〜3のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1017]
PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:6〜8の核酸配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1018]
PPTアーゼが、SEQ ID NO:5に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1017のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1019]
PPTアーゼがSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1017のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1020]
PPTアーゼをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:10の核酸配列に対して少なくとも80%同一である、本発明1001〜1017のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1021]
PPTアーゼをコードする核酸配列がSEQ ID NO:10の核酸配列を含む、本発明1001〜1017のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1022]
(i)および(ii)の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれる、本発明1001〜1021のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1023]
(i)および(ii)の核酸配列が種子特異的プロモーターと機能的に連結している、本発明1001〜1022のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1024]
(i)および(ii)の核酸配列が、PvDlec2、LfKCS3およびFAE 1からなる群より選択されるプロモーターと機能的に連結している、本発明1001〜1023のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1025]
(iii)長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする核酸配列
をさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1026]
ACoASが、SEQ ID NO:4に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、本発明1025の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1027]
ACoASがSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、本発明1025の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1028]
ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:9の核酸配列に対して少なくとも80%同一な核酸配列を含む、本発明1025の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1029]
ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:9の核酸配列を含む、本発明1025の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1030]
ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:34の核酸配列を含む、本発明1025の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1031]
(i)、(ii)および(iii)の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれる、本発明1025〜1030のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1032]
(i)、(ii)および(iii)の核酸配列が種子特異的プロモーターと機能的に連結している、本発明1025〜1031のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1033]
(i)、(ii)および(iii)の核酸配列が、PvDlec2、LfKCS3およびFAE 1からなる群より選択されるプロモーターと機能的に連結している、本発明1025〜1032のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1034]
アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)をコードする核酸配列および/または2型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT2)をコードする核酸配列をさらに含む、本発明1001〜1033のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1035]
SEQ ID NO:6〜10から選択される核酸配列を含む、単離された核酸分子。
[本発明1036]
組換え発現ベクターpDAB7361。
[本発明1037]
組換え発現ベクターpDAB7362。
[本発明1038]
組換え発現ベクターpDAB7363。
[本発明1039]
検出可能な量のDHA(ドコサヘキサエン酸(C22:6、n-3))、DPA(C22:5、n-6またはn-3)またはEPA(エイコサペンタエン酸(C20:5、n-3))を含む、本発明1001〜1034のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1040]
0.01%〜15%のDHAを含む、本発明1001〜1034および1039のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1041]
0.05%〜10%のDHAを含む、本発明1001〜1034、1039および1040のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1042]
0.05%〜5%のDHAを含む、本発明1001〜1034および1039〜1041のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1043]
0.01%〜5%のEPAを含む、本発明1001〜1034および1039〜1042のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1044]
0.05%〜5%のEPAを含む、本発明1001〜1034および1039〜1043のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1045]
0.05%〜1%のEPAを含む、本発明1001〜1034および1039〜1044のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1046]
0.01%〜5%のDPAを含む、本発明1001〜1034および1039〜1045のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1047]
0.05%〜5%のDPAを含む、本発明1001〜1034および1039〜1046のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1048]
0.05%〜1%のDPAを含む、本発明1001〜1034および1039〜1047のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
[本発明1049]
本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分から得られる、油。
[本発明1050]
本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織または部分から得られる、種子。
[本発明1051]
本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分から得られる、種子油。
[本発明1052]
本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から得られた油を含むか、または本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む、食品。
[本発明1053]
本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から得られた油を含むか、または本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む、機能性食品。
[本発明1054]
本発明1001〜1034および1039〜1045のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から得られた油を含むか、または本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む、医薬製品。
[本発明1055]
少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法であって、本発明1001〜1034および1039〜1045のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から、または本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分の種子から、油を回収する段階を含む前記方法。
[本発明1056]
少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法であって、本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分を成育させる段階を含む前記方法。
[本発明1057]
種子油中に少なくとも1つのPUFAを産生させるための方法であって、本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織または部分の種子から油を回収する段階を含む前記方法。
[本発明1058]
種子油中に少なくとも1つのPUFAを産生させるための方法であって、本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分を成育させる段階を含む前記方法。
[本発明1059]
少なくとも1つのPUFAを含む栄養補助食品または治療用製品を個体に提供するための方法であって、本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分、本発明1049の油、本発明1050の種子、本発明1051の種子油、本発明1052の食品、本発明1053の機能性食品、または本発明1054の医薬製品を個体に提供する段階を含む前記方法。
[本発明1060]
PUFAがDHAである、本発明1055〜1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
PUFAがEPAである、本発明1055〜1059のいずれかの方法。
[本発明1062]
本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織または部分を作製するための方法であって、(i)少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を産生する藻類PUFAシンターゼをコードする核酸配列;および(ii)ホスホパンテテイニル補因子を藻類PUFAシンターゼACPドメインへと転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)をコードする核酸配列によって、アブラナ属植物またはアブラナ属植物細胞を形質転換させる段階を含む前記方法。
[本発明1063]
(iii)長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする核酸配列によって、アブラナ属植物またはアブラナ属植物細胞を形質転換させる段階をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
約0.05%〜5%のDHAを含む、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
[本発明1065]
約0.05%〜5%のDHA
を含み、かつ
(重量で)オレイン酸が70%を上回る脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
[本発明1066]
約0.05%〜5%のDHA
を含み、かつ
(重量で)α-リノレン酸が3.5%未満である脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
[本発明1067]
約0.05%〜5%のDHA
を含み、かつ
(重量で)オレイン酸が70%を上回り、かつα-リノレン酸が3.5%未満である脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
[本発明1068]
本発明1001〜1034および1039〜1048のいずれかの遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分を作製するための方法であって、(i)少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を産生するPUFAシンターゼ系をコードする核酸配列;(ii)長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする核酸配列;および(iii)PUFAシンターゼ系ACPドメインを活性化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)をコードする核酸配列を含む発現カセットによって、アブラナ属植物またはアブラナ属植物細胞を形質転換させる段階を含む前記方法。
「多価不飽和脂肪酸」または「PUFA」という用語は、本明細書で用いる場合、炭素鎖の長さが少なくとも炭素16個、少なくとも炭素18個、少なくとも炭素20個、または炭素22個もしくはそれ以上であって、少なくとも3つもしくはそれ以上の二重結合、4つもしくはそれ以上の二重結合、5つもしくはそれ以上の二重結合、または6つもしくはそれ以上の二重結合を有し、すべての二重結合がシス配置にある脂肪酸のことを指す。
真核生物における長鎖PUFA(LC-PUFA)の合成のための「標準的」または「古典的」な経路は中鎖長の飽和または一不飽和脂肪酸の伸長および不飽和化を伴い、それは記載されている。PUFAシンターゼ系を介した長鎖PUFAの合成のための経路も記載されており、これは「標準的」経路とは非常に異なる。具体的には、PUFAシンターゼはマロニル-CoAを炭素源として利用し、中間体を大量に放出することなく、最終的なPUFAを産生する。また、PUFAシンターゼの場合には、酸素を必要としない機構を用いて、合成時に適切なシス二重結合も付加される。いくつかの態様においては、NADPHが合成サイクルにおける還元剤として用いられる。
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)は、脂肪酸合成、ポリケチド合成および非リボソーム性ペプチド合成における特徴が十分に明確にされている酵素のファミリーである。特に、PUFAシンターゼ酵素に存在するACPドメインは、補酵素A由来の補因子(4-ホスホパンテテイン)のアシルキャリアータンパク質(ACP)との結合による活性化を必要とする。この補因子の結合はPPTアーゼによって行われる。宿主生物の内因性PPTアーゼがPUFAシンターゼのACPドメインを活性化することができなければ、その機能を遂行しうるPPTアーゼを与えることが必要である。多くのPPTアーゼの配列が公知であり、結晶構造が決定されている上に(例えば、Reuter et al., EMBO J. 18:6823-31 (1999))、活性にとって重要なアミノ酸残基の突然変異分析も行われている(Mofid et al., Biochemistry 43:4128-36 (2004))。
本発明は、長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)タンパク質を提供する。PUFAシンターゼによるPUFAの内因性産生体であるシゾキトリウム属は、そのPUFAシンターゼの脂肪酸産物をアシル-CoAに変換させることのできる1つまたは複数のACoASを有する。このことは、この生物ではそのような画分に高レベルのPUFAが蓄積するという事実によって明らかである。このため、シゾキトリウム属、ならびにPUFAシンターゼを内因性に含む他の生物(例えば、他のヤブレツボカビ科生物)、またはPUFA FFAをアシル-CoAに変換することのできる他の生物(タラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana)またはクリプテコディニウム・コーニイ(Crypthecodinium cohnii)など)は、異種宿主において発現されるPUFAシンターゼの産物の蓄積を許容または増加させるのに有用な酵素をコードする遺伝子の優れた供給源になりうると考えられる。他のACoAS配列は、米国特許出願公開第2007/0245431号に記載されている。
有意に高い収量の1つまたは複数の所望の多価不飽和脂肪酸を産生させるために、ある生物(例えば、植物)を、PUFAシンターゼがその植物に導入されるように遺伝的に改変することができる。本発明はまた、そのような遺伝的改変の有効性を向上させるかまたは強化するための、特に、PUFAシンターゼの最終産物、例えばPUFAなどの産生および/または蓄積を向上させるかまたは強化するための方法に関する。
本発明によれば、1つまたは複数の標的PUFAの産生および蓄積のための異種宿主の作製において、宿主におけるPUFAの産生および/または蓄積を向上させるために、本明細書に記載した戦略の任意の1つまたは複数(任意の組み合わせ)を用いることができる。実際に、戦略のさまざまな組み合わせは相加的または相乗的であると考えられ、1つまたは複数のそのような戦略の非存在下と比較して、PUFAの産生および/または蓄積の向上をもたらすことが予想される。実際に、実施例では、宿主生物におけるPUFAの産生のための例示的な戦略を提供している。
いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された生物は、EPA(C20:5、n-3)、DHA(C22:6、n-3)、DPA(C22:5、n-6またはn-3)、ARA(C20:4、n-6)、GLA(C18:3、n-6)、ALA(C18:3、n-3)および/またはSDA(C18:4、n-3))を非限定的に含む、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生し、さらにいくつかの態様において、EPA(C20:5、n-3)、DHA(C22:6、n-3)、DPA(C22:5、n-6またはn-3)もしくはDTA(C22:4、n-6)、またはそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む、1つまたは複数の比較的長鎖のPUFAを産生する。いくつかの態様において、本発明の遺伝的に改変された植物は、EPA(C20:5、n-3)、DHA(C22:6、n-3)および/もしくはDPA(C22:5、n-6またはn-3)、またはそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生する。
本発明は、上記に詳述した本発明の遺伝的に改変された生物(例えば、植物)を成育させること、または培養することによって、PUFAを産生するための方法を含む。いくつかの態様において、そのような方法は、例えば、本明細書において前述した通りに、および本発明に従って、遺伝的改変を有する植物を、土壌などの適した環境で成育させる段階を含む。
PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIのコドン最適化
シゾキトリウム属の種ATCC_20888株由来のPUFA OrfA(GenBank ID:AF378327、GI:158518688)、シゾキトリウム属の種ATCC_20888株由来のPUFA OrfB(GenBank ID:AF378328、GI:158518690)、シゾキトリウム属の種ATCC_20888株およびヤブレツボカビ属由来のキメラPUFA OrfC(米国特許出願公開第2008/0022422号)(「キメラOrfC」または「ハイブリッドOrfC」)、シゾキトリウム属の種ATCC_20888株由来のアシル-CoAシンテターゼ(米国特許出願公開第2007/0245431号)、およびネンジュモ属の種PCC 7120株由来の4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI(GenBank ID:P37695、GI:20141367)コード領域をコードするDNA配列の解析により、最適な植物発現にとって有害な恐れのある最適でないコドン組成を含む、いくつかの配列モチーフの存在が明らかになった。PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIタンパク質をコードする遺伝子のデザインを最適化することで、より「植物のような(plant-like)」性質を持ち、かつ、最適でないコドン組成のために配列改変によって翻訳が妨げられることもmRNA不安定性が生じることもないDNA配列を作製した。
*DNU=使用せず
C1の加重平均%=1/(%C1+%C2+%C3+その他(etc.))×%C1×100
ここで式中、C1は、問われるコドンであり、%C2、%C3、その他(etc.)は、表2のキャノーラに関する残りの同義コドンの%値の平均を表す(該当コドンに関する平均%値は列CおよびGから得られる)。
段階1:各反復アミノ酸ドメインをコードするネイティブDNA配列を別個の配列として抽出する。
段階2:個々の反復DNA配列を、別個の配列として、遺伝子設計用プログラム(例えば、OPTGENE(商標)、Ocimum Biosolutions, Hyderabad, India)に取り込む。段階3〜5は各配列に対して別々に行う。
段階3:DNA配列を標準的な遺伝暗号を用いて翻訳する。
段階4:翻訳されたタンパク質配列を、標準的な遺伝暗号および適切なコドンバイアス表を用いて逆翻訳する。この例では、530個のブラッシカ・ナプスタンパク質コード領域からコンパイルしたバイアスありのコドン表を用い、生成された各配列に「nap」(「napus」に因んで)にバージョン番号を付したコード名をつけた。つまり、反復配列1(Repeat 1)に対する、逆翻訳された第1のコドンバイアスあり配列は「rpt1 nap1.」と命名した。この実例では、このプロセスを10回行って、反復配列1(Repeat 1)のタンパク質配列をコードする10種のDNA配列バージョンが生成された。
段階5:10種の配列バージョンを、対応する数のテキストファイルに書き出す。
段階6:他の反復配列ドメインのそれぞれに対して段階3〜5を繰り返す。この実例では、合計90種の「nap」配列バージョンが生成された(各反復要素毎に10種ずつ)。
段階7:90個の配列ファイルをClustal WプログラムMega 3.1(Megasoftwareにてアクセス)に取り込み、90種の配列すべてを入力として用いて複数の配列アラインメントを行う。これらの配列はタンパク質コード領域のセグメントであるため、アラインメントはギャップを許容せずに行う。Clustal Wアラインメントの後に、近隣結合樹を組み立てて画像化し、タンパク質の中の9個の反復ドメインのそれぞれについて、10個のコドン最適化配列のうち1つを視認の上で選び出す。選択される各配列バージョンは、樹のうち最も深く分岐した区域から選ばれる。
段階8:それぞれの特定の反復配列について、各反復ドメインに関して選ばれた配列を、タンパク質全体をコードするコドン最適化DNA配列の適正な位置に組み入れる。
段階9:望まれないモチーフ、制限酵素認識部位などが存在しないことを確実なものとするために、別々に設計した多様性をもつ反復エレメントを含む、コドン最適化配列全体の最終的解析を行う。
pDAB7361、pDAB7362、pDAB7363のプラスミド構築物、およびその他の構築物
pDAB7361の構築
pDAB7361プラスミド(図2;SEQ ID NO:35)を、マルチサイトGateway組換えL-R反応(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて構築した。pDAB7361は、3つのPUFAシンターゼ植物転写単位(PTU)、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および以下の通りの1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、短縮型のインゲンマメフィトヘマグルチニン-L遺伝子プロモーター(PvDlec2プロモーターv2;GenBankアクセッション番号X06336)、シロイヌナズナAT2S3遺伝子5'非翻訳領域(2S 5'UTR;GenBankアクセッション番号NM_118850)、シゾキトリウム属の種の多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームA(Sz PUFA OrfA v2)およびシロイヌナズナ2Sアルブミン遺伝子3'非翻訳領域ターミネーターv1(At2S SSPターミネーターv1;GenBankアクセッション番号M22035)を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、シゾキトリウム属の種の多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームB(SzPUFA OrfB v3)およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、シゾキトリウム属およびヤブレツボカビ属の種の多価不飽和脂肪酸シンターゼオープンリーディングフレームC(hSzThPUFA OrfC v3)ならびにAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、シゾキトリウム属の種のアシル-CoAシンテターゼ(SzACS-2 v3)およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、ネンジュモ属の種の4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI(NoHetI v3)およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB7362プラスミド(図3;SEQ ID NO:36)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7362は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU配列、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB7363(図4;SEQ ID NO:37)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7363は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTUおよび1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU配列を含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。加えて、PTUはすべて、表記「v4」によって示されるシロイヌナズナリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小型鎖1A葉緑体標的化配列も含んだ。
pDAB7365は、SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、hSzThPUFA OrfC v2、SzACS-2 v2およびNoHetI v2のネイティブでありコドンが最適化されていないバージョンを含むように構築したバイナリープラスミドである。pDAB7365プラスミド(図19;SEQ ID NO:39)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7365は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfC v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v2遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB7368は、SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、hSzThPUFA OrfC v2およびNoHetI v2のネイティブでありコドンが最適化されていないバージョンを含むように構築したバイナリープラスミドである。この構築物はSzACS-2コード配列を含まない。pDAB7368プラスミド(図20;SEQ ID NO:40)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7368は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfC v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v2およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB7369は、SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3およびNoHetI v3の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物はSzACS-2コード配列PTUを含まない。pDAB7369プラスミド(図21;SEQ ID NO:41)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7369は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB7370は、コード配列のアミノ末端に融合させたリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小型鎖1A(SSU-TP v1と表記)を含む、SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4およびNoHetI v4の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物はSzACS-2コード配列PTUを含まない。pDAB7370プラスミド(図22;SEQ ID NO:42)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7370は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v4およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB100518は、コード配列のアミノ末端に融合させたアシル-ACP-チオエステラーゼ由来の葉緑体移行ペプチド(チオエステラーゼ移行ペプチドと表記)を含む、SzPUFA OrfA v5、SzPUFA OrfB v5、hSzThPUFA OrfC v5およびNoHetI v5の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。加えて、このプラスミドは、葉緑体移行ペプチドを保有しないSzACS-2 v3コード配列PTUも含む。pDAB100518プラスミド(図23;SEQ ID NO:43)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB100518は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v5およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v5およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v5およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v5およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB101476は、SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3およびNoHetI v3の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。SzACS-2 v2遺伝子配列は、ネイティブでありコドンが最適化されていないバージョンである。pDAB101476プラスミド(図24;SEQ ID NO:44)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB101476は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v2遺伝子およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB101477は、SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3およびNoHetI v3の再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。pDAB101477プラスミド(図25;SEQ ID NO:45)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB101477は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzACS-2 v4 geneおよびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
プラスミドpDAB7361、pDAB7362、pDAB7363用のアグロバクテリウム系統の作製
pDAB7361、pDAB7362およびpDAB7363プラスミドを、標準的なエレクトロポレーション手法を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換導入した。具体的には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス系統Z707S(Hepburn et al. J. Gen. Microbiol. 757:2961-2969 (1985))に対して、pDAB7361、pDAB7362またはpDAB7363プラスミドによるエレクトロポレーションを行った。プラスミドを含んでいたアグロバクテリウムの形質転換コロニーを選択して、制限酵素消化を用いて確認した。pDAB7361、pDAB7362またはpDAB7363を含むアグロバクテリウム系統を、グリセロールストックとして-80℃で保存した。
キャノーラのアグロバクテリウムを介した形質転換
アグロバクテリウムの調製
pDAB7361、pDAB7362またはpDAB7363のいずれかを含むアグロバクテリウム系統のグリセロールストックのループを用いて、ストレプトマイシン(100mg/ml)およびスペクチノマイシン(50mg/ml)を含むYEP(バクトペプトン20.0gm/Lおよび酵母抽出物10.0gm/L)プレートへの画線を行い、28℃で2日間インキュベートした。続いて、2日間の画線培養プレートのループを、滅菌500mLバッフルフラスコに入れた、ストレプトマイシン(100mg/ml)およびスペクチノマイシン(50mg/ml)入りの150mLの変法YEP液体培地に接種して、28℃で200rpmにて振盪した。培養物をM培地(LS塩、3%グルコース、調製B5ビタミン、1μMカイネチン、1μM 2,4-D、pH 5.8)中に再懸濁させて、キャノーラ胚軸の形質転換の前に適切な密度(50 Klett単位)に希釈した。
種子発芽:キャノーラ種子(Nexera 710品種)を、10%クロラックス(Clorox)中で10分間かけて表面滅菌して、滅菌蒸留水で3回すすぎ洗いした(このプロセスの間は、種子を鋼製水切り容器に収容しておく)。種子を、Phytatrayに収容した1/2 MSキャノーラ培地(1/2 MS、2%スクロース、0.8%寒天)上に、Phytatray 1枚につき種子25個ずつ発芽のために植え付け、25℃、光周期が明16時間-暗8時間の成育用レジメンに設定したPercivalチャンバーに入れて、5日間かけて発芽させた。
トランスジェニックキャノーラにおけるコピー数分析およびコード領域の検出
実施例4から選択されたT0植物を、導入遺伝子PTU発現カセットのそれぞれを含む植物を同定するためにさらに分析した。Invaderアッセイおよび加水分解プローブアッセイを行って、形質転換されたT0植物と推定されるものの試料をまずスクリーニングして、PAT発現カセットを含む事象を同定した。その後に、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの遺伝子発現カセットのPCR分析を完了し、植物を形質転換させるために用いたバイナリーベクター由来の各遺伝子発現カセットPTUを含む植物をさらに同定した。PTUのすべてを含む事象を、T1植物に進めるために選択した。
トランスジェニックキャノーラ種子脂質におけるDHAの検出
キャノーラ種子試料(個々の種子またはバルク試料のいずれか)を、鋼製ボールミルを用いて、トリヘプタデカノイン(Nu-Chek prep)をトリアシルグリセロール内部標準物質として含むヘプタン中でホモジネート化した。ホモジネート化の前に、新たに調製した0.25Mナトリウムメトキシド(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)のメタノール溶液を添加した。抽出は一定の振盪下にて40℃で実施した。回収は、メチル化された代用C17脂肪酸の回収によって検証した。FAME(脂肪酸メチルエステル)の抽出を3回繰り返して、ヘプタン層をプールした後に分析を行った。反応の完了は、第4の抽出/誘導体化における内因性FAMEの存在を確かめることによって検証した。その結果生じたFAMEを、SGE製のキャピラリーカラムBPX 70(15m×0.25mm×0.25μM)を用いるGC-FIDによって分析した。各FAMEを保持時間によって同定し、適切な長鎖多価不飽和脂肪酸(Nu-Chek Prep, Elysian MN)の添加とともに、Matreya LLC(Pleasant Gap, PA)製のナタネ油参照mixを較正標準物質として注入することによって定量した。
a.T1バルクからの、検出可能なDHAを含んでいた種子の数/分析した種子の総数。
b.DHA陽性種子すべての平均DHA含有率(総脂質に占める%)。
c.DHA陽性種子すべての平均PUFA含有率(総脂質に占める%)。
d.DHAn-3/総LC-PUFA(DHA+DPAn-6)の平均%比。
e.単一の種子で観察された最大DHA含有率。
キャノーラ種子におけるPUFAシンターゼタンパク質の検出
PUFAシンターゼポリペプチドを、成熟トランスジェニック種子試料においてウエスタンブロットによって検出した。種子を、ステンレス鋼製ビーズ2個を用いてKleco Bead Beater(Garcia Machine, Visalia, CA)中で乾燥種子を破砕することによって分析のために調製した。抽出緩衝液を添加して(50mM Tris、10mM EDTA、2% SDS)、試料チューブを30分間穏やかに揺り動かした。試料を3000rcfで30分間遠心した。上清を収集して、分析のために用いた。種子抽出物中の総可溶性タンパク質の量をLowryアッセイ(BioRad, Hercules, CA)によって決定した。試料を1.55mg/mlの総可溶性タンパク質に標準化した上で、40mM DTTを有するLDS試料緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, CA)中に、1レーン当たり20μgの総可溶性タンパク質という標準化ロードとなるように調製した。試料を3〜8% Tris酢酸ゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で電気泳動して、ニトロセルロース膜に転写させた。ブロットをブロッキング緩衝液中でブロックし、異なるPUFAシンターゼOrfA、OrfBおよびOrfCポリペプチドに対する抗体によるプローブ検査を行った。シゾキトリウム属PUFAシンターゼサブユニットA(SzPUFS-A)のA2領域を対象とするウサギ抗A2-A、およびシゾキトリウム属PUFAシンターゼサブユニットB(SzPUFS-B)のB3領域を対象とするウサギ抗B3-Aを用いた。領域B3はエノイルレダクターゼ(ER)領域である。また、サブユニットCにはER領域もあり、そのため、この抗血清はウエスタンブロット上でサブユニットBおよびCの両方を認識すると考えられる。抗ウサギ蛍光標識二次抗体(ヤギ抗ウサギAF 633(Invitrogen, Carlsbad, CA))を検出用に用いた。ブロットをTyphoon Trio Plus fluorescent imager(GE Healthcare, New Brunswick NJ)上で描出した。
T2キャノーラ種子におけるDHA、DPAおよびEPAのレベル
事象5197[14]-032.002からのT1種子を温室内に植え、4〜5葉の段階にある96件の植物からDNA分析のために葉試料を採取して、各T1分離個体植物における導入遺伝子のコピー数を決定した。これを上記のプロトコールを用いるpat遺伝子の加水分解プローブアッセイによって行ったところ、ホモ接合植物21件、ヘテロ接合植物45件およびヌル植物30件という3つの別個のクラスの分離個体が同定された。ホモ接合植物のすべておよびヌル植物31件を温室内で成熟するまで成育させて、種子を収穫した。ホモ接合植物およびヌル植物からの植物当たりのT2種子の平均収量は、それぞれ7.36gmおよび8.61gmであった。
キャノーラ事象-10 T2種子におけるDHA産生
キャノーラ事象5197[13]-010.001(図11に示されているようにpat遺伝子の2つのコピーを含む)からの60個のT1種子を温室内に植えた。pat遺伝子の加水分解プローブアッセイにより、pat遺伝子の0〜4個のコピーに対応する5つの別個のクラスの分離個体が同定された。
キャノーラにおけるDHAの圃場産生
最も高いレベルのDHAを含んでいた5197[14]-032.002の10件のホモ接合系統からのT2種子をプールして、60gmの種子が取れた。10件のヌル分離個体系統からも種子をプールして、陰性対照として用いるための47gmの種子が得られた。これらの種子を2009年5月にNorth Dakotaの2つの場所に植え、それぞれの場所に、導入遺伝子を含む種子を8つの小区画(plot)、ヌル分離個体種子を6つの小区画、および商業的対照(Nexera 845CL)を2つの小区画とした。開花中は、トランスジェニック植物の小区画のすべておよびヌル分離個体の小区画のうち4つを隔離ケージで覆った。残りの2つのヌル小区画およびNexera 845CL小区画は覆わないままにした。小区画の刈り取りおよび収穫を通常の慣行に従って9月に行った。場所1では、トランスジェニック植物からは小区画平均で0.95kgの種子が得られ、ヌル植物からは0.99kgが得られた。場所2では、小区画平均はトランスジェニック植物からは0.64kgであり、ヌル植物からは0.73kgであった。圃場で成育させた種子におけるLC-PUFAのレベルを決定するために、各小区画からの種子のGC-FAME脂質分析を行った(表16)。
マイクロアレイ技術を用いたDHA遺伝子発現分析
トランスジェニックホモ接合事象5197[14]-032.002系統および非形質転換ヌル植物から、受粉後日数(DAP)15、20、25、30、35および42日に、発育中のキャノーラ種子を収集した。単色の全体的遺伝子発現プロファイリングデザインを用いて、ホモ接合形質転換系統に新たに導入された遺伝子のそれぞれの発現レベルを、種子発育中の定められた時点のそれぞれに関して、非形質転換ヌル系統とは相対的に決定した。個々の60merオリゴアレイ(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)の3つの同一な技術的複製物に対して、各試料から増幅されたCy3標識cRNAをハイブリダイズさせた。受注設計された(eArray, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)60merの網羅的トランスクリプトームワイドのキャノーラオリゴヌクレオチドアレイを用いて、前述のハイブリダイゼーションを実施した。このアレイは、公開データソースから得られた37,000個を上回る異なるキャノーラ転写物を含む(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)。各転写物の発現レベルを効率的に測定するために、アレイ中に存在するオリゴ体が、予想される標的配列と効率的にハイブリダイズするように、各標的に対して一意的かつ特異的であるように設計した。複数の転写物と二重鎖を形成するオリゴ体はアレイから除去した。各オリゴ体はまた、マイクロアレイ処理の全体を通じての最適な成績のために必要とされる化学的および物理的特性も満たす。加えて、新たに導入された遺伝子、ならびに他のいくつかの関心対象の遺伝子に相当する特異的かつ一意的なオリゴ体も、受注設計されたキャノーラオリゴアレイ中に表示されている。60merオリゴ体は、製造元によるSure-Print技術を用いてインサイチューで合成した。
事象5197[14]-032.002およびヌル植物対照からの発育中の種子の試料を凍結し、RNA単離および精製のための出発材料として用いるためにプールした。プールした試料当たり合計500mgの種子組織を液体窒素とともに乳鉢および乳棒を用いて粉砕し、およそ50mgの粉砕組織を、RNA抽出用RNeasy Kit(Qiagen, Valencia, CA)からの抽出緩衝液RLT 450μL中に再懸濁させた。組織を破壊するために試料を短時間ボルテックス処理して、その後に抽出プロトコールを続けた。RNA抽出用RNeasy Kit(Qiagen, Valencia, CA)による指示に従って、全RNAを精製した。続いて、精製された全RNAをNanoQuant(TECAN, Research Triangle Park, NC)分光光度計を用いて定量し、標準的な1%アガロースゲル電気泳動によって描出した。
オリゴ遺伝子発現アレイを、Agilent Technologies(Santa Clara, CA)遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットおよび洗浄緩衝液キットを用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、完全に自動化されたTECAN HS4800 PRO(TECAN, Research Triangle Park, NC)ハイブリダイゼーション用ステーションにて実施した。ハイブリダイゼーション混合物を65℃で注入し、スライドのプレハイブリダイゼーション段階を65℃で30秒間行った後に、撹拌しながら17時間にわたってインキュベートした。続いて、Agilent GE Wash #1を用いてスライドを37℃で1分間洗浄し、その後にAgilent GE Wash #2を用いて2回目の洗浄を30℃で1分間行って、窒素ガスを用いる最終的な乾燥段階を30℃で2分30秒間行った。シグナル強度に対する環境オキシダントの影響を最小限に抑えるために、スライドを直ちにスキャンした。
スキャニングおよび特徴抽出の後に、生データファイルをGeneSpring GXバージョン10.0.2(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)にアップロードした上で、各アレイのデータファイルを試料として定め、適切なパラメーター値を割り当てるプロジェクトを創設した。同じパラメーター値を有する試料は複製物として処理した。試料が実験条件にどのようにグループ化されたかを特定するための解釈を設け、これを用いてデータの描出および分析を行った。以前に定められたspike-in対照、パラメーターおよび解釈に基づく試料に対する品質管理を、分析を開始する前にデータの品質を保証するために行い、GeneSpringによる品質管理尺度の報告を作成した。
全RNAならびに標識および増幅されたcRNAの濃度に関して得られた値は最適であった。また、一貫性および信頼性のある結果のために必要な、増幅後の濃度、Cy3による標識の効率および比活性に関する値も優れていた。各個々のアレイに関してスキャニング後に特徴抽出プロトコールによって提供された品質管理(QC)報告からは、陽性および陰性spike-in対照に基づいてデータの分散を測定するために用いた変動係数の値が提供された。これらの報告から得られた値はすべて、データ分布、均一性、バックグラウンドおよび感度の最適な品質を示した。この試験中に用いた試料に関するGeneSpring(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)品質管理尺度の報告により、得られたデータの再現性および信頼性の評価の助けとなる有意な統計値が与えられた。技術的に複製されたアレイの群(試料当たり3つ)に関して報告された値は範囲内にあり、得られたデータに信頼性があることが示された(データは示さず)。
代替的なプロモーターを用いた藻類PUFAシンターゼ遺伝子スイートの発現
PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIのタンパク質をコードする遺伝子を発現させるためのさらなる転写調節エレメントの使用により、キャノーラ内部のDHA含有率をさらに高めることができる。発育のより早期に、またはより長期間にわたって発現する転写調節エレメントの同定および使用は、種子発育のより早期の段階(例えば、15〜25 DAP)で異種遺伝子の転写を促進することにより、キャノーラ種子内部のDHAのレベルを増加させることができ、それ故にDHA産生時間を延長させることができる。そのような転写調節領域の例には、LfKCS3プロモーター(米国特許第7,253,337号)およびFAE 1プロモーター(米国特許第6,784,342号)およびACPプロモーター(国際公開公報第1992/18634号)が非限定的に含まれる。これらのプロモーターは、以下のプラスミド;pDAB7361、pDAB7362およびpDAB7363において前述されている、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI発現カセットの発現を作動させるために、単独で、または組み合わせて用いられる。プラスミド内部の転写調節領域を置き換えるための方法は当技術分野において周知である。そのため、PvDlec2プロモーターv2を含むポリヌクレオチド断片を、pDAB7361、pDAB7362またはpDAB7363(またはpDAB7361、pDAB7362もしくはpDAB7363を構成するために用いた前出のプラスミド)から除去して、LfKCS3またはFAE 1プロモーター領域のいずれかによって置き換えた。新たに構築されたプラスミドは、キャノーラ植物を安定に形質転換させるために用いられる。トランスジェニックキャノーラ植物を単離して、分子的特徴を明らかにする。その結果生じたLC-PUFA蓄積を決定し、0.01%〜15%のDHAまたは0.01%〜10%のEPAを産生するキャノーラ植物を同定する。
pDAB9166プラスミド(図26;SEQ ID NO:46)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9166は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、SzPUFA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、SzPUFA OrfB v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、hSzThPUFA OrfC v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
pDAB9167プラスミド(図27;SEQ ID NO:47)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9167は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、SzPUrA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、BoACPプロモーターv1、BoACP 5'UTR v1、SzPUFA OrfB v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、LfKCS3プロモーターv1、hSzThPUFA OrfC v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、BoACPプロモーターv1、BoACP 5'UTR v1、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
pDAB7379は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。SzACS-2遺伝子配列はこの構築物には含まれない。pDAB7379プラスミド(図28;SEQ ID NO:48)は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
pDAB7380は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。SzACS-2遺伝子配列はこの構築物には含まれない。この構築物に用いられているファゼオリンプロモーターのバージョンは、本質的にはBustos et al, 1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)に記載された通りに改変されており、ここでプロモーターの5'部分は短縮しており、ファゼオリン5'非翻訳領域は無傷のままであった。pDAB7380プラスミド(図29;SEQ ID NO:49)は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
pDAB9323は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIのネイティブでありコドンが最適化されていないバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。pDAB9323プラスミド(図30;SEQ ID NO:50)は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
pDAB9330は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。pDAB9330プラスミド(図31;SEQ ID NO:51)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9330は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。第2のPUFAシンターゼPTU は、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTRおよびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。アシル-CoAシンテターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzACS-2 v3遺伝子、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。
pDAB9337は、その発現がファゼオリンプロモーターによって作動する、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。pDAB9337プラスミド(図32;SEQ ID NO:52)は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
pDAB9338は、SzPUFA OrfA、SzPUFA QrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。SzPUFA OrfAの発現を作動させるにはファゼオリンプロモーターを用い、他の導入遺伝子を作動させるにはPvDlec2プロモーターを用いる。pDAB9338プラスミド(図33;SEQ ID NO:53)は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
pDAB9344は、そのすべてが、コード配列のアミノ末端に融合させたリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小型鎖1A(SSU-TP v1と表記)を含む、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfCおよびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ファゼオリンプロモーターがSzPUFA OrfAの発現を作動させるために用いられ、PvDlec2プロモーターが他の導入遺伝子を作動させるために用いられる。
pDAB9396は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。ファゼオリンプロモーターがSzPUFA OrfAおよびSzPUFA OrfBの発現を作動させるために用いられる。PvDlec2プロモーターは、他の導入遺伝子;hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIを作動させるために用いられる。
pDAB101412は、SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2およびNoHetIの再構成され、コドンが最適化されたバージョンを含むように構築されたバイナリープラスミドである。この構築物に用いられているファゼオリンプロモーターのバージョンは、本質的にはBustos et al, 1989 (The Plant Cell, Vol. 1; 839-853)に記載された通りに改変されており、ここでプロモーターの5'部分は短縮しており、ファゼオリン5'非翻訳領域は無傷のままであった。短縮型のファゼオリンプロモーター配列は本出願の全体を通して、バージョン4(v4)、バージョン5(v5)およびバージョン6(v6)として特定される。pDAB101412プラスミド(図36;SEQ ID NO:56)は、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。
これらのプラスミドは、上記のプロトコールを用いてキャノーラ植物を安定に形質転換させるために用いられる。トランスジェニックキャノーラ植物を単離して、分子的特徴を明らかにする。代替的な構築物の使用により、より多くの量のDHAおよびLC-PUFAを含有するキャノーラ植物がもたらされる。その結果生じたLC-PUFA蓄積を決定し、0.01%〜15%のDHAまたは0.01%〜15%のLC-PUFAを産生するキャノーラ植物を同定する。
キャノーラ内部でのDGAT2またはACCアーゼと藻類PUFAシンターゼ遺伝子スイートとの共発現
アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)または2型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT2)をコードして発現するキメラDNA分子の形質転換により、キャノーラ植物内部での油含有率をさらに改変する。これらの遺伝子を、ACCアーゼもしくはDGAT2の発現カセットを含むキャノーラ植物をPUFAシンターゼ遺伝子を含むキャノーラ植物と交配させること;またはACCアーゼもしくはDGAT2の遺伝子およびPUFAシンターゼ遺伝子を含む遺伝子スタックによってキャノーラ植物を形質転換させることのいずれかによって、上記の藻類PUFAシンターゼ遺伝子とともに共発現させる。ACCアーゼまたはDGAT2のコード配列の発現のために必要な調節エレメントは、上記のものを含みうる。当技術分野において公知であるその他の調節エレメント発現配列を用いることもできる。ACCアーゼおよびDGAT2の発現カセットを、上記の形質転換プロトコールを用いて、キャノーラに形質転換導入する。形質転換は、ACCアーゼまたはDGAT2の発現カセットが、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの発現カセットと組み合わされた分子スタックとして起こってもよく;または、選択マーカーと連結された独立したACCアーゼまたはDGAT2の発現カセットとして起こり、続いてその後に、PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの発現カセットを含むキャノーラ植物と交雑させてもよい。陽性形質転換体を単離して、分子的特徴を明らかにする。非形質転換対照キャノーラ植物と比較して、蓄積濃度の増加した植物、植物種子または植物油におけるLC-PUFAを含むキャノーラ植物を同定する。そのような増加は、1.2倍から20倍までの増加の範囲にわたりうる。
植物内部でのより高いレベルのアシル-CoAシンテターゼ発現のためのネイティブアシル-CoAシンテターゼ遺伝子配列の使用
余分なオープンリーディングフレームを除去するようにネイティブ遺伝子配列を改変することによって、シゾキトリウム属の種由来のアシル-CoAシンテターゼ遺伝子の代替的なバージョンを作り出した。このバージョンは「SzACS-2 v4」と表記し、SEQ ID NO:34としてリスト化した。その配列は、サービス提供元であるDNA 2.0(Menlo Park, CA)によって合成された。そのコード配列を、これらの実施例に記載した、プロモーターおよび3'非翻訳領域を含む植物発現カセットに組み入れた。その結果生じた発現カセットを用いて、「SzACS-2 v3」、SEQ ID NO:9と上述したアシル-CoAシンテターゼ発現カセットを置き換え、それをPUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfCおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetIの発現カセットと組み合わせて、pDAB7361、pDAB7362およびpDAB7363を構築した。「SzACS-2 v4」発現カセットを含むこれらの新しいプラスミドに、一意的な識別標識を与えた。新たに構築されたプラスミドは、キャノーラ植物を安定に形質転換させるために用いることができる。トランスジェニックキャノーラ植物を単離して、分子的特徴を明らかにする。遺伝子の代替的なバージョンである「SzACS-2 v4」は、より多くの量のDHAおよびLC-PUFAを含有するキャノーラ植物をもたらすことができる。その結果生じたLC-PUFA蓄積を決定し、0.01%〜15%のDHAまたは0.01%〜10%のEPAを産生するキャノーラ植物を同定する。
成熟トランスジェニックキャノーラ種子におけるPUFAシンターゼ活性
PUFAシンターゼ活性が、アグロバクテリウムベクターpDAB 7361を利用して作製された植物(事象5197[14]-032)からの成熟T1トランスジェニックキャノーラ種子からの抽出物において検出された。種子を水で3〜4時間浸漬させ、その後に種皮を除去し、抽出緩衝液(200mMリン酸 pH 7.0、1mM EDTA、1mM DTT、50mM NaCl、5%グリセロール、1% PVPP、0.52μg/mLアンチパイン、0.58μg/mLロイペプチン、0.83μg/mLペプスタチンA、12μg/mLのTLCK、12μg/mLのTPCK、および6μg/mLダイズトリプシンインヒビター)中にてドライアイス上で粉砕して、微量遠心分離を4℃で10分間行った。脂肪体を除去し、その結果生じたペレットをイオン強度のより高い緩衝液とともにインキュベートして、その後に再び遠心分離を行った。脂肪体および脂質層を試料から除去し、水性上清を、50mMリン酸 pH 7.2、1mM DTT、10%グリセロールおよび1mM EDTAによって前もって平衡化したZeba脱塩カラムに通した。非形質転換Nexera 710種子を陰性対照として並行して処理した。両方の種子セットからの試料を、Metz et al., Plant Physiol. Biochem. 47:6 (2009)に記載されたHIP抽出およびTLC法を用いてアッセイした(図16)。アッセイ条件は、2mM NADH、NADH再生系(グルコース+グルコースデヒドロゲナーゼ)、連続振盪および最終的なマロニル-CoA濃度100μM(0.064μCi/アッセイ100μL当たり)を含めるように改変した。その結果生じた上清のアッセイを容量によって標準化したところ、FFA形成を60分後に検出することができた。これはNexera 710対照では観察されず、このことはFFA形成がPUFAシンターゼを介したDHA形成によることを示している。
キャノーラにおいて産生されたOrfAの、共発現されたHetIによるパンテテイニル化
OrfAは9個のアシルキャリアータンパク質ドメインを含み、機能的であるためにはそれぞれがホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)によるホスホパンテテイン基での誘導体化を必要とする。トランスジェニックキャノーラ種子における、PPTアーゼHetIによるOrfAのパンテテイニル化の度合いを、さまざまなOrfA試料からのパンテテイニル化部位を含むトリプシンペプチドのナノ液体クロマトグラフィー-質量分析(ナノLC-MS)評価によって評価した。
およびパンテテイニル化部位2-9
に対応するトリプチックペプチドが同定された。パンテテイニル化されたペプチドの直接的な証拠は観察されなかった。
その他の構築物
調節エレメントの重複を減らすためのプロモーター多様性の導入
遺伝子サイレンシングは、トランスジェニックキャノーラ事象の子孫世代で観察されている現象である。いくつかの総説論文が、転写性遺伝子サイレンシング(TGS)および転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)について考察しており、これにはWaterhouse et al., 2001 (Nature 411:834-842), Vaucheret and Fagard, 2001 (Trends in Genetics 17(1):29-35、およびOkamoto and Hirochika, 2001 (Trends in Plant Sci. 6 (1 1):527-534)などがある。植物において、遺伝子サイレンシングはトランスジェニックポリヌクレオチド配列の重複(縦列反復導入遺伝子配列、逆方向反復導入遺伝子配列、もしくは染色体への複数挿入)によって、または標的遺伝子配列に対して相同な配列が感染性植物ウイルスもしくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスのT-DNAによって保有されている場合に、誘発させることができる。
pDAB7733バイナリープラスミド(図37;SEQ ID NO:57)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7733は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、BnaNapinCプロモーターv1、BnaNapinC 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびBnaNapinC 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。
pDAB7734バイナリープラスミド(図38;SEQ ID NO:58)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB7734は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、BnaNapinCプロモーターv1、BnaNapinC 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびBnaNapinC 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB101493バイナリープラスミド(図39;SEQ ID NO:59)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB101493は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。
pDAB109507プラスミド(図40;SEQ ID NO:60)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB109507は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびPvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、BnaNapinCプロモーターv1、BnaNapinC 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびBnaNapinC 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、BoACPプロモーター/5'UTR v1、NoHetI v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。
pDAB109508プラスミド(図41;SEQ ID NO:61)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB109508は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびPvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、BnaNapinCプロモーターv1、BnaNapinC 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびBnaNapinC 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
pDAB109509プラスミド(図42;SEQ ID NO:62)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB109509は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、BoACPプロモーター/5'UTR v1、NoHetI v3およびAtuOrf23 3'UTR v1を含む。
PTUカセットの順序によって、単離されたトランスジェニック事象における断片化および再配列を減少させうるか否かを検証するために、SzPUFA OrfA PTUをバイナリー構築物の3'末端に配置した。SzPUFA OrfAは、9つの縦列アシルキャリアータンパク質反復配列を含む大きなオープンリーディングフレーム(およそ8,700b.p.)である。最初の一連の完成した構築物では、SzPUFA OrfA PTUが、T0植物染色体にまず組み込まれるように配置した。その後、SzPUFA OrfA PTUを残りのPUFA合成関連遺伝子PTUの後に置いたが、これはそれらの分子サイズが減少したためである。SzPUFA OrfAコード領域の分子的分析により、いくつかのトランスジェニックキャノーラ事象およびシロイヌナズナ事象が断片化した挿入を含んでいることが示された。PUFAシンターゼPTUの順序を以下の構成に変更した代替的な構築物を記載している;hSzThPUFA OrfC PTU、SzPUFA OrfB PTU、NoHetI PTU、SzPUFA OrfA PTUおよびPAT PTU。バイナリー構築物上のSzPUFA OrfA PTUの位置の変更を、単離されたトランスジェニック事象における断片化および再配列を減少させるために完了させる。
pDAB9151プラスミド(図43;SEQ ID NO:63)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9151は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。最終的な PUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
代替的な構築物のデザインには、PUFAシンターゼPTUの順序および遺伝子発現カセットの転写方向を変更することが含まれる。最初の一連の完成した構築物では、各遺伝子発現カセットを同じ向き(「頭-尾の向き(head to tail)」、この際には、1つの遺伝子発現カセットのプロモーターが第2の遺伝子発現カセットの3'UTRに隣接して設置される)に配置した。以下の構築物は、遺伝子発現カセットが異なる方向に配置されて、代替的なプロモーターを利用する戦略を記載している。これらの実施例では、遺伝子発現カセットは第2の遺伝子発現カセットに対してイントランスに設置され、その結果、両方の遺伝子発現カセットのプロモーターは互いに隣接するように操作される。この構成は「頭-頭」構成と記述される。他の構成も実施例に記載されており、この際には、1つの遺伝子発現カセットが第2の遺伝子発現カセットに対してイントランスに設置され、その結果、両方の遺伝子発現カセットの3'UTRが互いに隣接するように操作される。この構成は「尾-尾」構成と記述される。そのようなデザインで考えられる読み過ごしを軽減するために、二方向性Orf 23/24ターミネーターをこれらの2つのPTUの間に配置した。これらの構成は、導入遺伝子の発現を増大させて、それにより、より高い濃度および含有率のLC-PUFAおよびDHA脂肪酸をもたらすと提唱されている。
pDAB108207プラスミド(図44;SEQ ID NO:64)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108207は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv6、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3、At2S SSPターミネーターv1およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv6、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTRおよびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
pDAB108208プラスミド(図45;SEQ ID NO:65)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108208は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR、PvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
pDAB108209プラスミド(図46;SEQ ID NO:66)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108209は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTRおよびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)およびランダムなDNAスペーサーを含む。
転写干渉は、複数の遺伝子が連続して積み重なり、それにより、下流遺伝子の発現低下がもたらされる場合に起こりうる。この現象は、3'UTRおよびターミネーターから次のプロモーター-転写ユニットへの転写読み過ごしに起因する。転写干渉を最小限に抑えるための2つの戦略からなる代替的な構築物デザインが記載されている。第1の戦略は、次の遺伝子発現カセットへの読み過ごしを制限するために、個々のDHA遺伝子発現カセットの間に積み重ねられた2つのターミネーター/3 'UTRを用いることを採用する。第2の戦略は、遺伝子発現カセットの間に約1000塩基対のスペーサーDNAを挿入し、それにより、転写干渉を最小限に抑える。
pDAB108207プラスミド(図44;SEQ ID NO:64)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108207は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR、PvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3、At2S SSPターミネーターv1およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv6、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3、PvPhas 3'UTR v1およびPvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)を含む。
pDAB108208プラスミド(図45;SEQ ID NO:65)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108208は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR、PvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
pDAB108209プラスミド(図46;SEQ ID NO:66)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108209は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのアシル-CoAシンテターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv5、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3'UTR、PvPhas 3'MAR v2(プラスミド地図上で注釈付けされていない)およびランダムなDNAスペーサーを含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
独占権のある3'UTR-ターミネーターの数が限られているため、転写を終結させるには、アグロバクテリウムORF 23 3'UTR-ターミネーターが主として用いられる。シロイヌナズナにおける転写読み過ごしを終結させるには、ZmLipase 3'UTR-ターミネーターがより有効であることが最近示された。そのため、構築物の1つのバージョンでは、ZmLipase 3'UTR-ターミネーターをPvDlec2プロモーターと組み合わせて利用して、この3'UTRが上流遺伝子の転写読み過ごしを減らし、それにより、転写干渉を低下させることができるか否かを検証する。
pDAB9159プラスミド(図47;SEQ ID NO:67)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9159は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびZmLip 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびZmLip 3'UTR v1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびZmLip 3'UTR v1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv3、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびZmLip 3'UTR v1を含む。
pDAB9147プラスミド(図48;SEQ ID NO:68)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB9147は、3つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3、At2S SSPターミネーターv1およびZmLip 3'UTR v1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第3のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、hSzThPUFA OrfC v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、NoHetI v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。
代替的な構築物デザインは、1つのT-DNA上にあるPUFAシンターゼ遺伝子のサブセットを含む第1のベクター、および第2のT-DNA上にある残りのPUFAシンターゼ遺伝子を含む第2のバイナリーベクターという2つの別個のバイナリーベクターを構築することからなる。これらのバイナリーベクターを個別に用いて、有***雑させる植物を形質転換させて、それにより、PUFAシンターゼ遺伝子発現構築物のすべてを含む子孫を生じさせる。トランスジェニック植物を作製するための代替的な方法は、両方のバイナリーベクターをキャノーラ組織に共形質転換導入させて、両方のT-ストランドを含む単一の植物を選択またはスクリーニングすることである。
pDAB108224プラスミド(図49;SEQ ID NO:69)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108224は、1つのPUFAシンターゼPTU、1つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTU、および1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfA v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、PvPhas 5'UTR、NoHetI v3およびAtuORF23 3'UTR v1を含む。
pDAB108225プラスミド(図50;SEQ ID NO:70)を、マルチサイトGateway L-R組換え反応を用いて構築した。pDAB108225は、2つのPUFAシンターゼPTUおよび1つのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPTUを含む。具体的には、第1のPUFAシンターゼPTUは、PvDlec2プロモーターv2、2S 5'UTR、SzPUFA OrfB v3およびAt2S SSPターミネーターv1を含む。第2のPUFAシンターゼPTUは、PvPhasプロモーターv4、SzPUFA OrfB v3およびAtu ORF23 3'UTR v1を含む。
これらのプラスミドを、上記のプロトコールを用いて、キャノーラ植物を安定に形質転換させるために用いる。トランスジェニックキャノーラ植物を単離して、分子的特徴を明らかにする。代替的な構築物の使用により、より多くの量のDHAおよびLC-PUFAを含有するキャノーラ植物がもたらされる。その結果生じたLC-PUFA蓄積を決定し、0.01%〜15%のDHAまたは0.01%〜15%のLC-PUFAを産生するキャノーラ植物を同定する。
シロイヌナズナの形質転換ならびにその後のLC-PUFAおよびDHAの産生のために用いられる代替的な構築物デザイン
シロイヌナズナ植物を、pDAB101493、pDAB7362、pDAB7369、pDAB101412またはpDAB7380バイナリーベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス系統によって形質転換させた。形質転換のためには、Clough and Bent(1998)によって記載された花芽浸漬形質転換プロトコールを用いた。Clough and Bent, "Floral dip: a simplified method for agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalia," Plant J., 16:735-743, 1998。形質転換されたアラビドプシス植物が得られ、導入遺伝子の存在に関する分子的確認を完了した。トランスジェニックアラビドプシス事象からのT1植物を、温室内で成熟するまで成育させた。これらの植物を自家受精させて、その結果生じたT2種子を成熟時に収穫した。T2アラビドプシス種子におけるLC-PUFAおよびDHA含有率を決定するために、個々の種子をFAME GC-FIDを介して分析した。前記の実施例に記載した通りに、組織をFAME GC-FID方法を介して分析した。アラビドプシス植物のT1植物からの個々のT2種子は、0.00%〜0.95%のDHAおよび0.00%〜1.50%の総LC-PUFAを含んでいた。個々のT1植物からの各T2種子のLC-PUFAおよびDHAの含有率は図51に示されている。
PUFAシンターゼ遺伝子セットによる「非高オレイン酸(non-high oleic)」キャノーラ品種(DH12075)の形質転換
ブラッシカ・ナプス品種DH12075を、プラスミドpDAB7362を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる、本質的には実施例4に記載した通りの胚軸形質転換法によって形質転換させた。Nexera 710の遺伝的バックグラウンドとは異なり、DH 12075は「高オレイン酸」品種ではない。pat遺伝子の存在に関して陽性であったT0 DH12075植物を回収し、5種のDHA遺伝子セットのすべて(PUFAシンターゼOrfA、PUFAシンターゼOrfB、PUFAシンターゼキメラOrfC、アシル-CoAシンテターゼおよび4'ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼHetI)の存在に関して、実施例5に記載した分子的分析方法によって分析した。事象001-2009-006DH(事象006)が、5種のDHA遺伝子すべてを含むT0植物として同定された。それを成育チャンバー内で成熟するまで成育させて、T1種子を収穫した。実施例6に記載した方法による事象006の個々のT1種子の分析により、分析した48個の種子のうち31個は、0.19%〜0.86%のDHAのレベルでDHAを含むことが示された。113個のT1種子を植えて、成育チャンバー内で成育させ、実施例4に記載した方法によって葉組織試料を分析して、個々の植物の接合状態を判定した。23件の植物はqPCR分析によってPAT遺伝子に関してホモ接合であると判定され、さらに5種のDHA遺伝子の共分離も示されたが、このことは単一の遺伝子座の存在を示している。patおよびOrfAプローブを用いた事象006 T1植物組織のサザン分析により、OrfA遺伝子のもう1つのコピーが存在することが示された。ホモ接合植物を成熟するまで成育させて、種子を収穫した。これらの植物のそれぞれからのバルクT2種子試料のFAME分析により、23件のホモ接合T2植物のうち17個はLC-PUFAを産生し、DHAは0.17〜0.72%であったことが示された。5件のT2種子試料はEPAを0.08%〜0.16%で含み、LC-PUFA産生性イベントの総LC-PUFA(DHA+EPA+DPA[n-6])は0.33%〜1.35%であった。表22aは、事象006の2つのDHA含有性バルクT2試料の完全脂肪酸プロファイルを示している。ホモ接合T1系統のうち8件からの48個の個々のT2種子の単一種子分析を行い、これらの種子の平均DHA含有率を表23に示している。最大1.31%のDHA含有率を有する個々のT2種子が検出された。表22bは、4個のDHA含有性T2種子の完全脂肪酸プロファイルを示している。これらのデータは、オレイン酸含有率が72%未満である遺伝的バックグラウンドを有するキャノーラにおいて、PUFAシンターゼ遺伝子セットによる形質転換を介してDHAが産生されうることを示している。
Claims (34)
- (i)少なくとも1つのPUFAを産生する多価不飽和脂肪酸(PUFA)シンターゼ系をコードする核酸配列であって、PUFAシンターゼ系が、SEQ ID NO:1に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、SEQ ID NO:2に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:3に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、前記核酸配列;
(ii)ホスホパンテテイニル補因子をPUFAシンターゼ系ACPドメインへと転移させるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)をコードする核酸配列であって、PPTアーゼが、SEQ ID NO:5に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、前記核酸配列;および
(iii)長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする核酸配列であって、ACoASが、SEQ ID NO:4に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、前記核酸配列
を含み、
0.01%〜15%の量のDHA(ドコサヘキサエン酸(C22:6、n-3))、0.01%〜5%の量のDPA(C22:5、n-6またはn-3)または0.01%〜5%の量のEPA(エイコサペンタエン酸(C20:5、n-3))を含む、
遺伝的に改変されたアブラナ属(Brassica)植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。 - ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)またはブラッシカ・ジュンセア(Brassica juncea)である、請求項1記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列をコードする、請求項1または2記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:6の核酸配列に対して少なくとも90%同一な核酸配列を含む、請求項1または2記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列をコードする、請求項1または2記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:7の核酸配列に対して少なくとも90%同一な核酸配列を含む、請求項1または2記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードする、請求項1または2記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:8の核酸配列に対して少なくとも90%同一な核酸配列を含む、請求項1または2記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、およびSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むPUFAシンターゼ系をコードする、請求項1または2記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PUFAシンターゼ系をコードする核酸配列が、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、およびSEQ ID NO:8の核酸配列を含む、請求項1または2記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PPTアーゼをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:5のPPTアーゼをコードする、請求項1〜10のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- PPTアーゼをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:10の核酸配列に対して少なくとも90%同一である、請求項1〜10のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- (i)および(ii)の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれる、請求項1〜12のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- (i)および(ii)の核酸配列が、PvDlec2、LfKCS3およびFAE 1からなる群より選択されるプロモーターと機能的に連結している、請求項1〜13のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:4のACoASをコードする、請求項1〜14のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:9の核酸配列に対して少なくとも90%同一な核酸配列を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- ACoASをコードする核酸配列が、SEQ ID NO:34の核酸配列を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- (i)、(ii)および(iii)の核酸配列が単一の組換え発現ベクター中に含まれる、請求項1〜17のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- (i)、(ii)および(iii)の核酸配列が、PvDlec2、LfKCS3およびFAE 1からなる群より選択されるプロモーターと機能的に連結している、請求項1〜17のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)をコードする核酸配列および/または2型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT2)をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- 0.01%〜15%のDHAを含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- 0.01%〜5%のEPAを含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- 0.01%〜5%のDPAを含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分。
- 請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分から得られた、油であって、前記PUFAシンターゼ系をコードする前記核酸配列、前記PPTアーゼをコードする前記核酸配列、および前記ACoASをコードする前記核酸配列を含む、前記油。
- 請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織または部分から得られた、種子であって、前記PUFAシンターゼ系をコードする前記核酸配列、前記PPTアーゼをコードする前記核酸配列、および前記ACoASをコードする前記核酸配列を含む、前記種子。
- 請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から得られた油を含むか、または請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む、機能性食品であって、前記PUFAシンターゼ系をコードする前記核酸配列、前記PPTアーゼをコードする前記核酸配列、および前記ACoASをコードする前記核酸配列を含む、前記機能性食品。
- 請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から得られた油を含むか、または請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分から得られた種子を含む、医薬製品であって、前記PUFAシンターゼ系をコードする前記核酸配列、前記PPTアーゼをコードする前記核酸配列、および前記ACoASをコードする前記核酸配列を含む、前記医薬製品。
- 少なくとも1つのPUFAを含む油を生産するための方法であって、請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子もしくは部分から、または請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織もしくは部分の種子から、油を回収する段階を含む前記方法。
- 種子油中に少なくとも1つのPUFAを産生させるための方法であって、請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織または部分の種子から油を回収する段階を含む前記方法。
- 請求項24記載の油を含み、かつ0.05%〜5%のDHAを含む、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。
- 請求項24記載の油を含み、
0.05%〜5%のDHA
を含み、かつ
(重量で)オレイン酸が70%を上回る脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。 - 請求項24記載の油を含み、
0.05%〜5%のDHA
を含み、かつ
(重量で)α-リノレン酸が3.5%未満である脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。 - 請求項24記載の油を含み、
0.05%〜5%のDHA
を含み、かつ
(重量で)オレイン酸が70%を上回り、かつα-リノレン酸が3.5%未満である脂肪酸プロファイル
を有する、アブラナ属植物の種子由来の油組成物。 - 請求項1〜23のいずれか一項記載の遺伝的に改変されたアブラナ属植物、その子孫、細胞、組織、種子または部分を作製するための方法であって、
(i)少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸(PUFA)を産生するPUFAシンターゼ系をコードする核酸配列であって、PUFAシンターゼ系が、SEQ ID NO:1に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、SEQ ID NO:2に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:3に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、前記核酸配列;
(ii)長鎖PUFA遊離脂肪酸(FFA)からアシル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンテターゼ(ACoAS)をコードする核酸配列であって、ACoASが、SEQ ID NO:4に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、前記核酸配列;および
(iii)PUFAシンターゼ系ACPドメインを活性化するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTアーゼ)をコードする核酸配列であって、PPTアーゼが、SEQ ID NO:5に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、前記核酸配列
を含む発現カセットによって、アブラナ属植物またはアブラナ属植物細胞を形質転換させる段階を含む前記方法。
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