JP6038945B2 - ビタミンｄ化合物に関する遊離試薬 - Google Patents

Description

本発明は、ビタミンＤ結合タンパク質に結合したビタミンＤ化合物を遊離させるための試薬組成物、ビタミンＤ化合物がこの試薬組成物の使用によりビタミンＤ結合タンパク質から遊離するビタミンＤ化合物の検出のためのインビトロの方法、およびこの方法で得られる試薬混合物に関する。それは、ビタミンＤ化合物を遊離させるための開示された試薬組成物の使用、ならびに一般的な検出試薬に加えてビタミンＤ化合物を遊離させるための試薬組成物を含有するビタミンＤ化合物を検出するためのキットにも関する。

ビタミンＤの適切な供給は、“ビタミン”という用語が既に示唆しているように、極めて重要である。ビタミンＤの欠乏は、くる病または骨粗鬆症のような深刻な疾患につながる。ビタミンＤは前世紀の初期にはまだ単一の物質と考えられていたが、ビタミンＤ系はこの数十年の間に複雑かつ多様なビタミンＤ代謝産物のネットワークへと変化してきた。今日では４０種類より多くの異なるビタミンＤ代謝産物が知られている(Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281)。

ヒトはＤ_３ビタミンまたはカルシフェロールを太陽光からの紫外線の皮膚への作用によってのみ生成することができる。血中でビタミンＤ_３はいわゆるビタミンＤ結合タンパク質に結合し、肝臓へと輸送され、そこでそれは２５−ヒドロキシル化により２５−ヒドロキシビタミンＤ_３に変換される。今日では既に言及した２つの器官である皮膚および肝臓に加えて多数の他の組織がビタミンＤ代謝に関わっていることが知られている(Schmidt-Gayk, H. et al. (編者), “Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP”, Springer Verlag, Heidelberg (1990) pp. 24-47)。２５−ヒドロキシビタミンＤならびにより具体的には２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および２５−ヒドロキシビタミンＤ_３は、それらの量に関して人体におけるビタミンＤの中心的な貯蔵形態である。必要な時にこれらの前駆体が腎臓において変換されて、生物学的に活性な１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（いわゆるＤホルモン）を形成することができる。その生物学的に活性なビタミンＤはとりわけ腸からのカルシウムの取り込み、骨鉱化を制御し、そしてそれは例えばインスリン系のような多数の他の代謝経路に影響を及ぼす。

ビタミンＤ（ビタミンＤ_２およびビタミンＤ_３）の濃度は食物の取り込みまたは太陽光への曝露に依存して大きく変動するため、ビタミンＤのレベル自体を測定することは患者のビタミンＤの状態を決定する際にほとんど有益でない。加えて、ビタミンＤは循環中で比較的短い生物学的半減期（２４時間）を有し、従ってそれはこの理由でも患者のビタミンＤの状態を決定するための適切なパラメーターではない。同じことはビタミンＤの生理的に活性な形態（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ）にも当てはまる。これらの生物学的に活性な形態も、２５−ヒドロキシビタミンＤと比較して比較的小さく、かつ高度に変動する濃度で存在する。これら全ての理由のため、特に２５−ヒドロキシビタミンＤの定量化は患者の総ビタミンＤ状態を包括的に分析するための適切な手段である。

２５−ヒドロキシビタミンＤのようなビタミンＤ代謝産物は高い親和性でビタミンＤ結合タンパク質と結合しており、限られた程度（ｅｘｔｅｎｄ）までアルブミンおよび一部のリポタンパク質にも結合している。ビタミンＤ代謝産物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるのに適した方法は、通常の状況下では、あらゆる他のタンパク質からもビタミンＤ代謝産物を遊離させるのにも十二分に適しているであろう。

２５−ヒドロキシビタミンＤまたは他のビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質への結合は、ビタミンＤ化合物の決定を極めて複雑にする。全ての既知の方法は、分析されるべきビタミンＤ化合物をそれがビタミンＤ結合タンパク質と共に形成する複合体から遊離させる、または引き離すことを必要とする。以下では単純化のためにこれをビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離と呼ぶが、当然それはビタミンＤ化合物およびビタミンＤ結合タンパク質の複合体から遊離することだけが可能なのであって、ビタミンＤ結合タンパク質単体から遊離するわけではない。

そのビタミンＤ結合タンパク質は酸性ｐＨでは折り畳みがほどけるが、そのｐＨが移行して中性の状態に戻った場合、再度正しく折り畳まれて分析物と再結合する高い傾向を有する。従って、しばしばまず第一にビタミンＤ化合物を遊離させ、次いでそのビタミンＤ結合タンパク質を分析されるべきビタミンＤ化合物から分離する必要がある。

２５−ヒドロキシビタミンＤの高い臨床的重要性のため、２５−ヒドロキシビタミンＤを多かれ少なかれ信頼できるように決定することを可能にする多数の方法が文献から既知である。

例えばHaddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995、およびEisman, J.A. et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた血液試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤの決定を記述している。

２５−ヒドロキシビタミンＤの決定に関する他のアプローチは、とりわけ乳汁中に存在するビタミンＤ結合タンパク質のようなビタミンＤ結合タンパク質の使用に基づいている。従って、Holick, M.F.およびRay, R.（米国特許第5,981,779号）ならびにDeLucaら（欧州特許第0 583 945号）はヒドロキシビタミンＤおよびジヒドロキシビタミンＤに関するこれらの物質のビタミンＤ結合タンパク質への結合に基づくビタミンＤアッセイを記述しており、ここでこれらの物質の濃度は競合試験手順により決定される。しかし、この方法の必要条件は、決定されるべきビタミンＤ代謝産物をまず元の血液または血清試料から単離しなければならず、例えばクロマトグラフィーにより精製しなければならないことである。

Armbruster, F.P.ら（国際公開第99/67211号）は、血清または血漿試料はビタミンＤの決定に関してエタノール沈殿により調製されるべきであると教示している。この方法では、タンパク質沈殿を遠心分離により除去し、エタノール性の上清が可溶性のビタミンＤ代謝産物を含有する。これらを競合結合アッセイで測定することができる。

あるいは、欧州特許第0 753 743号は、そのタンパク質を過ヨウ素酸塩を用いて血液または血清試料から分離することができることを教示している。この場合、ビタミンＤ化合物を過ヨウ素酸塩で処理された試料からのタンパク質を含まない上清において決定する。いくつかの商業的な試験において（例えばＤｉａＳｏｒｉｎからの放射免疫アッセイにおいて、または企業“Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ”からのビタミンＤ試験において）、血清または血漿試料の抽出に関してアセトニトリルが推奨されている。

近年、原理的にビタミンＤ化合物を試料中に存在するあらゆる結合タンパク質から遊離させるのに適しているはずであるいくつかの異なる遊離試薬が提案された。しかし、この遊離または解離は比較的穏やかな条件下で実施され、そうして遊離試薬で処理された試料の結合試験における直接の使用を可能にするべきである（例えば、国際公開第02/57797号および米国特許出願公開第2004/0132104号を参照）。近年の多大な努力にも関わらず、ビタミンＤを検出するための全ての利用可能な方法は、面倒な試料の調製、不十分な標準化、試験手順間の不十分な一致、または急激に上昇した（ｓｐｉｋｅｄ）ビタミンＤの悪い回収率のような欠点を有する（これに関して特にZerwekh, J.E.（上記）を参照）。

米国特許第7,087,395号において、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるために金属水酸化物（ｈｙｄｒｏｘｉｄｓ）ならびにシクロデキストリンおよびその誘導体、ならびに金属サリチル酸塩が用いられており、それは結果としてビタミンＤ結合タンパク質または他の血清タンパク質の不可逆的な変性をもたらす。ビタミンＤ化合物が変性後に試料中の脂質およびタンパク質に非特異的に付着するのを防ぐために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００またはＴｗｅｅｎ−２０のような界面活性剤が用いられてきた。

ビタミンＤ化合物に関する試験を自動化することは特に困難である。自動化は非常に困難な問題を解決すること、すなわち綱渡りを生き延びることを必要とする：一方では適切な遊離試薬の助けを借りてビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させることが必要であり、他方ではその条件はその試料を直接さらに分析することができるように選択されなければならない。この直接的なさらなる分析の必要条件は、一方ではその内因性ビタミンＤ結合タンパク質はこの分析の間にビタミンＤ化合物に結合せず、またはもはや有意な程度まで結合せず、従ってこの分析を妨げず、かつ他方では用いられる遊離試薬は検出試薬、例えば抗体またはビタミンＤ結合タンパク質の結合を妨げないことである。加えて、生化学的に異なる挙動をするビタミンＤ結合タンパク質の異なるアレルがヒト集団中に存在することが知られている。ビタミンＤ化合物の遊離および測定は、様々なアレル／表現型に関して比較可能であるべきである。

従って、本発明の目的は、先行技術の問題を少なくとも部分的に克服することができる、ビタミンＤ化合物、特にヒドロキシビタミンＤ化合物の試料中のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物を開発することであった。ビタミンＤ化合物を遊離させるための適切な試薬組成物、ビタミンＤ化合物を決定するためのインビトロの方法、その試薬組成物の使用、およびこの試薬組成物を用いたビタミンＤ化合物の決定のためのキットを以下で記述し、それは添付された特許請求の範囲に包含される。

米国特許第5,981,779号 欧州特許第0 583 945号 国際公開第99/67211号 欧州特許第0 753 743号 国際公開第02/57797号 米国特許出願公開第2004/0132104号 米国特許第7,087,395号

Schmidt-Gayk, H. et al. (編者), "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP", Springer Verlag, Heidelberg(1990) pp. 24-47 Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281 Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995 Eisman, J.A. et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305

本発明は、以下の工程を含む、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるためのインビトロの方法に関する：ａ）調べるべき試料を提供し、そしてｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する試薬、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである；ｉｉ）還元剤；ならびにｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、それによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させる。

さらなる態様において、本発明は、以下の工程を含む、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法に関する：ａ）調べるべき試料を提供し、ｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する試薬、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである；ｉｉ）還元剤；ならびにｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、それによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させ、そしてｃ）工程（ｂ）において遊離したビタミンＤ化合物を測定する。

さらなる態様において、本発明は、１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含む、ビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物に関し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである。

さらなる態様において、本発明は、調べるべき試料、１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含むビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含む試薬混合物に関し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである。

さらなる態様において、本発明はビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のためのキットに関し、それは１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含む試薬組成物を含有し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである。

本発明は、以下の工程を含む、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるためのインビトロの方法に関する：ａ）調べるべき試料を提供し、ｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する試薬、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである；ｉｉ）還元剤；ならびにｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、それによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させる。

本明細書で用いられる際、以下の用語のそれぞれはこの節においてそれと関連付けられた意味を有する。
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１個を、または１個より多くを（すなわち少なくとも１個を）指して用いられる。

表現“１以上”は、１〜５０、好ましくは１〜２０、やはり好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５を意味する。
別途記載されない場合、用語“ビタミンＤ化合物”には以下の構造式ＩおよびＩＩに従うビタミンＤ２の骨格またはビタミンＤ３の骨格を含有する全ての天然存在化合物が含まれることは理解されるべきである。

構造式ＩおよびＩＩにおいて、ビタミンＤの位置はステロイド命名法に従って記載される。２５−ヒドロキシビタミンＤは、構造式ＩおよびＩＩの２５位においてヒドロキシル化されたビタミンＤ代謝産物、すなわち２５−ヒドロキシビタミンＤ_２ならびに２５−ヒドロキシビタミンＤ_３を意味する。追加の既知のヒドロキシビタミンＤ化合物は、例えば１，２５−ジヒドロキシビタミンＤおよび２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ形態である。

１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、構造式ＩおよびＩＩの１位において、ならびに２５位においてヒドロキシル化を有するビタミンＤの活性な形態（いわゆるＤホルモン）を指す。

他の周知のビタミンＤ化合物は２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３およびＣ３−エピ２５−ヒドロキシビタミンＤである。
驚くべきことに、本発明者らは、本発明において開示されるインビトロの方法におけるアルカリ条件下での１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質の存在は、ビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離をもたらすことを発見している。

本発明に従う“炭酸水素イオン”（重炭酸イオン）は、経験式ＨＣＯ_３および６１．０１ダルトンの分子量を有する陰イオンである。
本発明に従う“炭酸水素塩”は、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ_３）、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ_４ＨＣＯ_３）、炭酸水素カルシウム（Ｃａ（ＨＣＯ_３）_２）および炭酸水素マグネシウム（Ｍｇ（ＨＣＯ_３）_２）からなる群から選択される化合物である。

本発明の態様に従う“加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質”は、炭酸エステルである。
“本発明に従う“炭酸エステル”は、２個のアルコキシ基に隣接されるカルボニル基である。これらのカーボネートの一般的な構造は、Ｒ_１Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ_２である。利用可能な環状炭酸エステル（例えば炭酸エチレン）または非環状炭酸エステル（例えば炭酸ジメチル）ならびにそれらのヒドロキシル化またはハロゲン化誘導体が存在する。

好ましくは、その方法の工程ｉ）に従う１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質は、それぞれ０．１Ｍ〜１．５Ｍの、または０．２Ｍ〜１．０Ｍの、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍの、または最大で２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの総濃度を有する。

好ましい態様において、その炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素マグネシウムからなる群から選択される。さらなる好ましい態様において、その炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、その炭酸水素塩は炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウムからなる群から選択される。

好ましい態様において、加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質は、それぞれ環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体である。さらなる好ましい態様において、加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質は、それぞれ環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのハロゲン化誘導体である。さらなる好ましい態様において、その環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、エリスリトールビスカーボネート、グリセロール１，２−カーボネート、４−クロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、４，５−ジクロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、２，５−ジオキサヘキサン二酸ジメチルエステル、１，２ブチレンカーボネート、シス２，３ブチレンカーボネートおよびトランス２，３ブチレンカーボネートからなる群から選択される。さらに好ましくは、その環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、エリスリトールビスカーボネート、グリセロール１，２−カーボネート、４−クロロ−１，３−ジオキソラン−２−オンおよび４，５−ジクロロ−１，３−ジオキソラン−２−オンからなる群から選択される。

さらに好ましくは、その環状または非環状炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、グリセロール１，２−カーボネート、炭酸プロピレンおよび炭酸ビニレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、その環状または非環状炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、グリセロール１，２−カーボネートおよび炭酸プロピレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、その環状または非環状炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチルおよびグリセロール１，２−カーボネートからなる群から選択される。

当業者には、１種類以上の炭酸水素塩（単数または複数）および１種類以上の加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質（単数または複数）は、それぞれ本発明において開示される作用を達成するために任意に混合することができることは既知である。

１態様において、本発明の方法に従う工程（ｉ）の１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する試薬は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための適切な条件下で、水溶液中で少なくとも２Ｍまで可溶性である。さらなる態様において、本発明の方法に従う工程（ｉ）の１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する試薬は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための適切な条件下で、水溶液中で少なくとも１．５Ｍまで可溶性であり、より好ましくは少なくとも１．０Ｍまで可溶性である。当業者には、本発明に従う方法の工程（ｉ）の試薬を達成するためにどのようにして１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を水中で可溶化するかは既知である。その炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質は、水中で２５℃において可溶性であるべきである。その水溶液中で可溶化された炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質は、４℃の温度においてドロップアウト（ｄｒｏｐ ｏｕｔ）または結晶化（ｃｈｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）することなく保管可能であるべきである。

その炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質のアルカリ化剤に対するモル比は、好ましくは１：３〜３：１、より好ましくは１：２〜２：１、より好ましくは１：１．５〜１．５：１である。

当業者は、アルカリ化剤の炭酸水素塩および／または加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質に対するモル比は反応性イオンＯＨ⁻またはＨＣＯ_３ ⁻の対応する濃度に基づいて計算されることも知っている。

当業者には、１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質の混合物を本発明に従う方法において用いることができることは既知である。前記の炭酸水素塩および／または加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質の混合物のアルカリ化剤に対するモル比は、好ましくは１：３〜３：１、より好ましくは１：２〜２：１、より好ましくは１：１．５〜１．５：１である。

この理論に束縛されることを望むわけではないが、試薬組成物中の１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質の存在はｐＨ変化を誘導するであろう。試薬組成物中の前記の炭酸水素塩および／または前記の加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質のより低い濃度は、前処理反応の間にその試薬混合物のより遅いｐＨの低下を引き起こす。試薬組成物中の前記の炭酸水素塩および／または前記の加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質のより高い濃度は、前処理反応の間にその試薬混合物のより速いｐＨの低下を引き起こす。１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤のアルカリ性緩衝液条件における協奏的作用のため、ビタミンＤ結合タンパク質の不可逆的変性が達成され、それにより後のビタミンＤ化合物の検出が容易になることも考えられるであろう。

１態様において、その方法に従う工程ｉｉ）の還元剤は、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−メチルマレイミド、エルマン試薬および１，２−ジチオラン−３−カルボン酸からなる群から選択される。

さらなる態様において、その方法に従う工程ｉｉ）の還元剤は、工程ｉｉ）の還元剤がチオール基を含有することを特徴とする。
さらなる態様において、その方法に従う工程ｉｉ）の還元剤は、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択される。

１態様において、その方法に従う工程ｉｉ）の還元剤は、２ｍＭから３０ｍＭまで、さらなる態様において３ｍＭから２０ｍＭまで、さらなる態様において３．５ｍＭから１５ｍＭまで、さらなる態様において４ｍＭから１０ｍＭまでの濃度を有する。

“アルカリ化剤”は、アルカリ水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物（すなわち水溶液中）であることができる。アルカリ化剤は、アルカリ水酸化物および／またはアルカリ土類金属水酸化物の混合物、すなわちＮａＯＨおよびＫＯＨ、ＮａＯＨおよびＬｉＯＨ、ＮａＯＨおよびＣａ（ＯＨ_２）、ＫＯＨおよびＣａ（ＯＨ）_２、ＫＯＨおよびＬｉＯＨ、ならびに他の組み合わせを含むこともできる。

“アルカリ水酸化物”は、アルカリ金属陽イオンおよび水酸化物陰イオン（ＯＨ−）からなる化学化合物のクラスである。アルカリ水酸化物は、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨおよびＣｓＯＨである。“アルカリ金属”は、周期表の第１族（ＩＵＰＡＣ方式）を形成する化学元素の系列である：リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）、セシウム（Ｃｓ）、およびフランシウム（Ｆｒ）。

“アルカリ土類金属水酸化物”は、アルカリ土類金属陽イオンおよび２個の水酸化物陰イオン（ＯＨ−）からなる化学化合物のクラスである。“アルカリ土類金属”は、周期表の第２族（ＩＵＰＡＣ方式）（第ＩＩＡ族）を構成する：ベリリウム（Ｂｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、バリウム（Ｂａ）およびラジウム（Ｒａ）。

１態様において、本発明の方法に従う工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、およびＬｉＯＨからなる群から選択される。
さらなる態様において、その方法に従う工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤は、それぞれ０．１Ｍ〜２．０Ｍの、または０．１Ｍ〜１．５Ｍの、または０．２Ｍ〜１．７５Ｍの、または０．２Ｍ〜１．０Ｍの、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍの、または最大で２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度を有する。

さらなる態様において、その方法に従う工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤は、ＮａＯＨおよびＫＯＨからなる群から選択される。
さらなる態様において、本発明に従う方法において用いられるアルカリ化剤は、試料＋試薬ｉ）＋還元剤ｉｉ）＋アルカリ化剤ｉｉｉ）の混合物中で、それぞれ０．１Ｍ〜０．６Ｍの、または０．２Ｍ〜０．５Ｍの、または少なくとも０．１Ｍもしくは０．２Ｍの、または最大で０．６Ｍもしくは０．５Ｍの終濃度を有する。

その方法のさらなる態様において、工程ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）それぞれの３種類の試薬の調べるべき試料に対する混合比は、好ましくは１：３〜３：１である。
１態様において、その方法に従う工程ａ）の試料、１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する工程ｉ）の試薬＋工程ｉｉ）の還元剤＋工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤は、あらゆるピペット操作の順序で添加され得る。混合の際、本発明の方法に従う工程ｂ）は、さらなる態様において、それが少なくとも１０、１２、１５、または２０秒間９．５〜１４のｐＨ値を有することを特徴としてよく、さらに好ましくは、工程ｂ）は混合の際に少なくとも１０、１２、１５、または２０秒間１０．５〜１４のｐＨ値を有する。

その方法の１態様において、工程ａ）の調べるべき試料を、工程ｂ）において１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する工程ｉ）の試薬、工程ｉｉ）の還元剤、工程ｉｉｉ）のアルカリ化剤と混合し、保温する。その保温工程ｂ）は、必要なだけの長さであることができる。その保温時間は、例えば１５秒間から２４時間までである。１態様において、本発明の方法に従う工程ｂ）の混合物は１〜６０分間保温され、それによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させる。

当業者は、その方法に従う工程ｂ）の構成要素の濃度を、調べるべき試料との保温の間の明記されたｐＨ範囲ならびに１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質、還元剤ならびにアルカリ化剤それぞれの所望の濃度がビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるために適切であるように、容易に選択する。

アルカリ性条件は結果として、調べるべき試料中に存在するビタミンＤ結合タンパク質の変性およびビタミンＤの遊離をもたらす。そのアルカリ化剤の濃度は、その“試薬混合物”（＝調べるべき試料＋本発明に従う試薬組成物＋アルカリ化剤）のｐＨを前処理反応において少なくともｐＨ１０．０まで、好ましくは少なくともｐＨ１０．５まで、より好ましくは少なくとも１１．０まで上昇させるのに十分でなければならない。当業者は、その試薬混合物のｐＨを調べるべき試料＋本発明に従う試薬組成物＋アルカリ化剤の混合の時点において測定しなければならないことに気付いている。炭酸水素塩および／または加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質の加水分解により、そのｐＨはその試薬混合物中で低下するであろう（図１および実施例１．５を参照）。

用語“試料”は、本明細書で用いられる際、インビトロでの評価の目的で個体から得られた生物学的試料を指す。本発明の方法において、調べるべき試料は１態様において液体試料である。その試料は、本発明のさらなる態様において、あらゆる体液を含んでいてよい。さらなる態様において、調べるべき試料は血液、血清または血漿であり、血清または血漿が最も好ましい。さらなる態様において、その液体試料を濾紙または膜上で乾燥させる。１態様において、本発明において用いられる試料は、個体から得られた試料の分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）を指す。

本発明は、さらなる態様において、（ａ）ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させ、そして（ｂ）工程（ａ）で遊離したビタミンＤ化合物を測定する工程を含む、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法を含む。

さらなる態様において、本発明は、（ａ）対象の試料中のビタミンＤ結合タンパク質に結合したビタミンＤ化合物を遊離させ、そして（ｂ）工程（ａ）で遊離したビタミンＤ化合物を測定する工程を含む、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法を含む。

さらなる態様において、本発明は、以下の工程を含む、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法に関する：ａ）調べるべき試料を提供し、ｂ）工程（ａ）からの試料をｉ）１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する試薬、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである；ｉｉ）還元剤；ならびにｉｉｉ）アルカリ化剤と混合し、それによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させ、そしてｃ）工程（ｂ）において遊離したビタミンＤ化合物を測定する。

さらなる態様において、本発明はビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法を含み、ここでその測定されるビタミンＤ化合物は２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３およびＣ３−エピ２５−ヒドロキシビタミンＤを含む群から選択される。

さらなる態様において、本発明はビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法を含み、ここでその測定されるビタミンＤ化合物は２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２および２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を含む群から選択される。

さらなる態様において、本発明はビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法を含み、ここでビタミンＤ化合物２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ_３が決定される。

試薬組成：
１態様において、本発明は、調べるべき試料中のビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物に関し、それは濃縮状態の（ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含有し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである。

さらなる態様において、本発明は、調べるべき試料中のビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物に関し、それは１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含有し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜１．５Ｍである。

さらなる態様において、本発明は、調べるべき試料中のビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物に関し、それは１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含有し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．２Ｍ〜１．０Ｍである。

さらなる態様において、本発明は、調べるべき試料中のビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物に関し、それは１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含有し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は少なくとも０．１、０．２、０．３または０．４Ｍである。

さらなる態様において、本発明は、調べるべき試料中のビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物に関し、それは１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含有し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は最大で２．０、１．７、１．５、１．３、１．０または０．７５Ｍである。

さらなる好ましい態様において、その試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素カルシウムおよび炭酸水素マグネシウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、その試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素アンモニウムからなる群から選択される。さらに好ましくは、その試薬組成物中の炭酸水素塩は、炭酸水素ナトリウムおよび／または炭酸水素カリウムである。

さらなる好ましい態様において、その試薬組成物中の加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質は、それぞれ環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体である。

さらなる好ましい態様において、その試薬組成物中の加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質は、それぞれ環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのハロゲン化誘導体である。さらなる好ましい態様において、その試薬組成物中の環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、エリスリトールビスカーボネート、グリセロール１，２−カーボネート、４−クロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、４，５−ジクロロ−１，３−ジオキソラン−２−オン、２，５−ジオキサヘキサン二酸ジメチルエステル、１，２ブチレンカーボネート、シス２，３ブチレンカーボネートおよびトランス２，３ブチレンカーボネートからなる群から選択される。さらに好ましくは、その試薬組成物中の環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのハロゲン化誘導体は、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、炭酸ビニレン、炭酸トリメチレン、エリスリトールビスカーボネート、グリセロール１，２−カーボネート、４−クロロ−１，３−ジオキソラン−２−オンおよび４，５−ジクロロ−１，３−ジオキソラン−２−オンからなる群から選択される。さらに好ましくは、その試薬組成物中の環状または非環状炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、グリセロール１，２−カーボネート、炭酸プロピレン、炭酸ビニレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、その試薬組成物中の環状または非環状炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチル、グリセロール１，２−カーボネートおよび炭酸プロピレンからなる群から選択される。さらに好ましくは、その試薬組成物中の環状または非環状炭酸エステルは、炭酸エチレン、炭酸ジメチルおよびグリセロール１，２−カーボネートからなる群から選択される。

本発明は、さらなる態様において、その還元剤が２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−メチルマレイミド、エルマン試薬および１，２−ジチオラン−３−カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする試薬組成物に関する。

さらなる態様において、本発明は、その還元剤がチオール基を含有することを特徴とする試薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、その還元剤が２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択されることを特徴とする試薬組成物に関する。

本発明の特定の態様における還元剤の濃度は２ｍＭから３０ｍＭまで、さらなる態様において３ｍＭから２０ｍＭまで、さらなる態様において３．５ｍＭから１５ｍＭまで、さらなる態様において４ｍＭから１０ｍＭまでである。

当業者には、還元剤の能力が官能基、すなわち還元性の基の存在に依存していることは既知である。従って、当業者には、還元剤の適切な濃度をその活性な還元性の基の数を考慮して選択することは既知である。

ビタミンＤ結合タンパク質をコードする遺伝子はヒト集団において異なるアレルの形態で存在する。これらのアレルによりコードされるポリペプチドは生化学的に異なる、すなわちそれらは異なる表現型をもたらすことが知られている。これらの生化学的な違いはビタミンＤ化合物の結合および放出にも影響を及ぼす。本発明に従う試薬組成物は、そのビタミンＤ結合タンパク質の表現型に依存せずに、ビタミンＤ化合物を遊離させるのに適している。従って、本発明の好ましい態様は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための、本発明に従う試薬組成物の使用である。

本発明に従う試薬組成物は、１態様において、ビタミンＤ結合タンパク質の表現型とは無関係に、およびそれに依存せずに、調べるべき試料中でビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるために用いられる。

ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させる目的のため、本発明に従う試薬組成物を調べるべき試料、例えば血清または血漿、およびアルカリ化剤と混合する。

試薬混合物：
用語“試薬混合物”は、本明細書において下記で用いられる際、調べるべき試料、本発明に従う試薬組成物、およびアルカリ化剤を含む。

さらなる態様において、その試薬混合物は、そのアルカリ化剤がＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、およびＬｉＯＨからなる群から選択されることを特徴とする。
さらなる態様において、その試薬混合物は、用いられるアルカリ化剤がそれぞれ０．１Ｍ〜２．０Ｍの、または０．１Ｍ〜１．５Ｍの、または０．２Ｍ〜１．７５Ｍの、または０．２Ｍ〜１．０Ｍの、または少なくとも０．１、０．２、０．３もしくは０．４Ｍの、または最大で２．０、１．７、１．５、１．３、１．０もしくは０．７５Ｍの濃度を有することを特徴とする。

さらなる態様において、その試薬混合物は、そのアルカリ化剤がＮａＯＨおよびＫＯＨからなる群から選択されることを特徴とする。
さらなる態様において、本発明に従う方法において用いられるアルカリ化剤は、試薬混合物中でそれぞれ０．１Ｍ〜０．６Ｍの、または０．２Ｍ〜０．５Ｍの、または少なくとも０．１Ｍもしくは０．２Ｍの、または最大で０．６Ｍもしくは０．５Ｍの終濃度を有する。

試薬組成物およびアルカリ化剤の試料に対する混合比は、１態様において好ましくは１：３〜３：１である。
調べるべき試料、開示された試薬組成物およびアルカリ化剤は、あらゆるピペット操作の順序で添加されて試薬混合物を形成し得る。混合の際、その試薬混合物は、さらなる態様において、それが少なくとも１０、１２、１５、または２０秒間９．５〜１４のｐＨ値を有することを特徴とし、さらに好ましくは、その試薬混合物は混合の際に少なくとも１０、１２、１５、または２０秒間１０．５〜１４のｐＨ値を有する。

調べるべき試料を本発明に従う試薬組成物およびアルカリ化剤と混合し、保温する。この工程は前処理工程と呼ばれてもよい。その前処理工程は必要である限り実施することができる。その保温時間は、例えば１５秒間〜２４時間である。その試薬混合物を１態様において１〜６０分間保温してビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させる。その試薬混合物を別の態様において４〜１０分間保温してビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させる。

当業者は、その試薬混合物およびその中の構成要素の濃度を、調べるべき試料との保温の間の明記されたｐＨ範囲ならびに１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質、還元剤ならびにアルカリ化剤それぞれの所望の濃度がビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるために適切であるように、容易に選択する。

その試薬混合物は、１態様において、本発明の試薬組成物に関して記述されたような１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質の好ましい物質および／または濃度も含む。

ビタミンＤ化合物の検出は、好ましくは２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２４，２５ジヒドロキシビタミンＤ_２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３およびＣ３−エピ２５−ヒドロキシビタミンＤを含む群から選択される少なくとも１種類のビタミンＤ化合物が検出されるように実施される。

ビタミンＤ化合物の特異的な検出において、さらなる保温工程が前処理工程の後に行われる。その試薬混合物中に存在する還元剤の残りは、非特異的なタンパク質、好ましくは例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加により遮断する（ｂｌｏｃｋｅｄ）ことができる。この非特異的なタンパク質は別々に添加することができ、または単純に検出試薬も含む溶液中に含ませることができる。その還元剤の残留する還元能力を遮断することにより、ビタミンＤ化合物に対するタンパク質性の特異的な結合剤を用いたビタミンＤ化合物の弱められない（ｎｏｎｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）検出が可能である。

当業者は理解するであろうように、特異的な結合剤を含む溶液はその特異的な結合剤を含有する溶液の試薬混合物への添加後にそのｐＨがビタミンＤ化合物のその特異的な結合剤への結合に関する必要条件であることを確実にするｐＨ緩衝系を含有するであろう。その特異的な結合剤のビタミンＤ化合物への結合が起こる限り、緩衝系は必ずしも必要とされず、最終的なｐＨも決定的に重要ではない。ビタミンＤ結合タンパク質が特異的結合剤として用いられる場合、この保温工程の間のｐＨは好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ９．０で選択される。抗体がビタミンＤ化合物に関する特異的結合剤として用いられる場合、この保温工程の間のｐＨは好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５であろう。

その特異的な結合剤を含む溶液は、好ましくは２０ｍＭ〜４００ｍＭである緩衝系を含有する。その緩衝剤が５０ｍＭ〜３５０ｍＭまたは１００ｍＭ〜３００ｍＭのモル濃度を有することも好ましい。

そのビタミンＤ化合物の検出のためのインビトロの方法は（本発明の開示に基づいて）様々な方法で実施することができる。
原則として、全てのタンパク質性結合パートナー、例えば１種類以上のビタミンＤ化合物に結合する特異的に結合するポリペプチドを、特異的な結合剤として用いることができる。特異的な結合剤は、抗体またはビタミンＤ結合タンパク質自体のどちらであることもできる。

多くの商業的な試験系が、アビジンまたはストレプトアビジン（ＳＡ）でコートされた固相、例えばＳＡでコートされたマイクロタイタープレートまたはＳＡでコートされたラテックスの使用に基づいている。

例えばビオチン化された分析物誘導体を、このＳＡ固相に試験手順の前または間に結合させる。ビタミンＤ化合物を検出する場合、このビオチン化された分析物誘導体化合物は、例えばビオチン化された２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および／またはビオチン化された２５−ヒドロキシビタミンＤ_３であることができる。

本発明の１態様において、そのインビトロの検出の方法は競合アッセイとして実施される。そのような競合試験において、その試験に定められた量で添加されたビタミンＤ化合物の誘導体が、その特異的な結合剤の結合部位に関してその試料からの対応するビタミンＤ化合物と競合する。より多くのビタミンＤ化合物がその試料中に存在するほど、その検出シグナルはより小さい。

１態様において、そのビタミンＤ化合物の誘導体は、ビオチン化されたビタミンＤ化合物である。さらなる態様において、そのビオチン化されたビタミンＤ化合物は、ビオチン化された２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および／またはビオチン化された２５−ヒドロキシビタミンＤ_３である。さらなる態様において、そのビオチン化されたビタミンＤ化合物はビオチン化された２５−ヒドロキシビタミンＤ_２である。

上記で言及したように、本記述において開示されたような検出法における使用のための好ましい特異的結合剤は、抗体およびビタミンＤ結合タンパク質である。ビタミンＤ結合タンパク質は、競合アッセイ形式で用いられる場合、その１種類以上の（ビオチン化された）ビタミンＤ化合物誘導体への結合と競合する全てのビタミンＤ化合物の統合された測定をもたらすであろう。１態様において、そのビタミンＤ結合タンパク質は検出可能であるように標識される、例えばルテニウム化される（ｒｕｔｈｅｎｙｌａｔｅｄ）であろう。

使用：
１態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための、アルカリ化剤と一緒での試薬組成物の使用に関する。

さらなる態様において、本発明は、調べるべき試料中に存在することが予想されるビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための、アルカリ化剤と一緒での試薬組成物の使用に関する。

さらなる態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物を検出する方法においてビタミンＤ化合物を遊離させるための、アルカリ化剤と一緒での試薬組成物の使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物を検出する方法において調べるべき試料中に存在することが予想されるビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための、１Ｍ〜１．５Ｍのアルカリ化剤の溶液と一緒での、１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する試薬組成物、２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤の使用に関し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである。

その試薬組成物の使用は、１態様において、本発明の試薬組成物に関して記述されたように、１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質の好ましい物質および／または濃縮物も含む。

キット：
１態様において、本発明はビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のためのキットに関し、それは１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含む試薬組成物を含有し、ここでその炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである。

１態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの検出のためのキットであって、それが１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質、還元剤を有する試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含み、その炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度が０．１Ｍ〜２．０Ｍであることを特徴とする前記キットに関する。

さらなる態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの検出のためのキットであって、それが１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質、２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤を有する試薬組成物、ならびにアルカリ化剤を含み、その炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度が０．１Ｍ〜２．０Ｍであることを特徴とする前記キットに関する。

さらなる態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの検出のためのキットであって、それが検出構成要素に加えて１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質、２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤を有する試薬組成物、１Ｍ〜１．５Ｍのアルカリ化剤の溶液を含み、その炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度が０．１Ｍ〜２．０Ｍであることを特徴とする前記キットに関する。

さらなる態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物の検出のためのキットであって、それが特異的な結合剤を含む溶液に加えて１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質、還元剤を有する試薬組成物、アルカリ化剤の溶液を含むことを特徴とする前記キットに関する。

さらなる態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物の検出のためのキットであって、それが１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質、２ｍＭ〜３０ｍＭの還元剤を有する試薬組成物、１Ｍ〜１．５Ｍのアルカリ化剤の溶液、ならびに特異的な結合剤を含む溶液を含み、その炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度が０．１Ｍ〜２．０Ｍであることを特徴とする前記キットに関する。

さらなる態様において、本発明は、ビタミンＤ化合物の検出のためのキットであって、それが１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質、２ｍＭ〜３０ｍＭの２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ、およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択される還元剤を有する試薬組成物、１Ｍ〜１．５ＭのＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２およびＬｉＯＨからなる群から選択されるアルカリ化剤の溶液、ならびに特異的な結合剤を含む溶液を含み、その炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）およびその炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度が０．１Ｍ〜２．０Ｍであることを特徴とする前記キットに関する。

そのキットは、１態様において、本発明の試薬組成物に関して記述されたような１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質の好ましい物質および／または濃度も含む。

本発明に従う試薬組成物は、ビタミンＤ化合物に関する自動化された試験における使用に適していることが証明されている。本発明は、好ましくは、特にビタミンＤ化合物の決定のための試験においてビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための本発明に従う試薬組成物の使用に関する。

ビタミンＤ化合物に関する試験は、好ましくは完全に自動化されている。この場合の完全に自動化されていることは、実験者は調べるべき試料およびビタミンＤ化合物を測定するための全ての構成要素を含有する試薬パックを自動化された分析装置上に配置しさえすればよく、全てのその先の工程はその分析装置により自動的に実施されることを意味する。その完全に自動化された試験は特に好ましくはＲｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）分析装置上で実施される。

本発明に従う試薬組成物は、さらなる態様において、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２４，２５ジヒドロキシビタミンＤ_２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３およびＣ３−エピ２５−ヒドロキシビタミンＤを含む群から選択されるビタミンＤ化合物の検出のためのインビトロの方法において用いられる。

既に上記で言及されたように、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および２５−ヒドロキシビタミンＤ_３は診断のためのビタミンＤの特に適切な形態である。本発明に従うインビトロの方法において、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２または２５−ヒドロキシビタミンＤ_３に対する特異的な抗体による２５−ヒドロキシビタミンＤ_２もしくは２５−ヒドロキシビタミンＤ_３または両方の特異的な検出も好ましい態様である。

本発明は、以下の実施例および図によりさらに明らかになる。実際の保護範囲は、この発明に添付された特許請求の範囲の結果もたらされる。

前処理工程の間の試薬混合物のｐＨ変化。そのアッセイは実施例１．５において概説されるように実施された。試薬組成物（Ａ）は、様々な濃度の炭酸エチレン（ＥＣ）を含有する：０．００Ｍ（●）、０．１０Ｍ（◆）、０．３０Ｍ（□）、０．５０Ｍ（▲）、０．７５Ｍ（○）、１．００Ｍ（■）、１．５０Ｍ（◇）ＥＣ。Ｘ軸は分での時間を示し、Ｙ軸はｐＨを示す。 様々な濃度の炭酸エチレン（ＥＣ）：１．５０Ｍ（●）、１．００Ｍ（□）、０．７５Ｍ（◆）、０．５０Ｍ（○）、０．３０Ｍ（▲）および０．１０Ｍ（◇）ＥＣを含有する試薬組成物（Ａ）を用いた、実施例１．５において記述されるようなビタミンＤアッセイの較正曲線。Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでの濃度を示し、Ｙ軸は企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて通常の方法で決定されたカウントを示す。 様々な濃度の還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１．０ｍＭ（□）、２．０ｍＭ（●）、４．０ｍＭ（◆）、６．７ｍＭ（○）、１０．０ｍＭ／１２．０ｍＭ（▲）、１５．０ｍＭ（◇）を含有する試薬組成物（Ａ）を用いた、実施例１．５において記述されるようなビタミンＤアッセイの較正曲線。Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでの濃度を示し、Ｙ軸は企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて通常の方法で決定されたカウントを示す。 方法の比較：ビタミンＤアッセイ（実施例１）および液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＴＭＳ） ２５−ヒドロキシビタミンＤをＬＣ−ＴＭＳにより、ならびに実施例１．５のビタミンＤアッセイにより決定し、ここで０．５Ｍ炭酸エチレン（ＥＣ）を含む試薬組成物（Ａ）を保温に関して用いた。多数の血清試料に関するｎｇ／ｍｌでの結果をＬＣ−ＴＭＳに関してＸ軸上に、実施例１．５のビタミンＤアッセイに関してＹ軸上にプロットした。 （−−−） ｙ＝ｘ （―――） 線形回帰 ビタミンＤアッセイ＝２．０１１６＋０．９０３６^＊ｘ、ピアソンｒ＝０．９５０９ 方法の比較：ビタミンＤアッセイ（実施例１）およびＬＣ−ＴＭＳ ２５−ヒドロキシビタミンＤをＬＣ−ＴＭＳにより、ならびに実施例１．５のビタミンＤアッセイにより決定し、ここで炭酸エチレン（ＥＣ）を含まない試薬組成物（Ａ）を保温に関して用いた。多数の血清試料に関するｎｇ／ｍｌでの結果をＬＣ−ＴＭＳに関してＸ軸上に、実施例１．５のビタミンＤアッセイに関してＹ軸上にプロットした。 （−−−） ｙ＝ｘ （―――） 線形回帰 ビタミンＤアッセイ＝０．７４９６＋０．７３３８^＊ｘ、ピアソンｒ＝０．７９１４ ０．５Ｍ炭酸エチレン（◆）、０．５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３（○）、０．５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４（▲）、０．５Ｍ ＮａＣｌ（◇）、および対照（□）を含有する試薬組成物（Ａ）を用いた、実施例２において記述されるようなビタミンＤアッセイの較正曲線。Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでの濃度を示し、Ｙ軸は企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて通常の方法で決定されたカウントを示す。 以下： ◆：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＥＣ、または ▲：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、または □：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡを含有する試薬組成物（Ａ）を用いた、実施例３において記述されるようなビタミンＤアッセイの較正曲線。Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでの濃度を示し、Ｙ軸は企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて通常の方法で決定されたカウントを示す。 以下： ○：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＥＣ（実施例１．５参照）、または ◆：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ炭酸ジメチルを含有する試薬組成物（Ａ）を用いた、実施例４において記述されるようなビタミンＤアッセイの較正曲線。Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでの濃度を示し、Ｙ軸は企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて通常の方法で決定されたカウントを示す。 以下： ◆：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＥＣ（実施例１．５参照）、または ○：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３、または ▲：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３＋０．５Ｍエチレングリコール、または □：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴを含有する試薬組成物（Ａ）を用いた、実施例５において記述されるようなビタミンＤアッセイの較正曲線。Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでの濃度を示し、Ｙ軸は企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて通常の方法で決定されたカウントを示す。 以下： ◆：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＥＣ（実施例１．５参照）または ○：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍグリセロール１，２カーボネートを含有する試薬組成物（Ａ）を用いた、実施例４において記述されるようなビタミンＤアッセイの較正曲線。Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでの濃度を示し、Ｙ軸は企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて通常の方法で決定されたカウントを示す。

実施例１
２５−ヒドロキシビタミンＤの検出のためのアッセイ
商業的なアッセイを製造業者の説明書に従って用いる。２５−ヒドロキシビタミンＤの決定を、ＨＰＬＣ（企業“Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ”（ベンスハイム）からの２５（ＯＨ）ビタミンＤ_３に関する試験、注文番号ＫＣ ３４００）により、またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ(Vogeser, M. et al., Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417)により、文献において記述されている通りに実施する。

成分の調製および新しい試験に関する一般的な試験手順を以下で記述する：
１．１ ヒドロキシビタミンＤ_２−３−２’−シアノエチルエーテルの合成
２０．６ｍｇ（５０μｍｏｌ）の２５−ヒドロキシビタミンＤ_２（Ｆｌｕｋａ Ｎｏ．１７９３７）を、内部温度計を有する２５ｍｌの三つ口丸底フラスコ中で、１０ｍｌの乾燥アセトニトリル中で、アルゴン雰囲気下で溶解させる。１．５ｍｌのｔｅｒｔ．−ブタノール／アセトニトリル（９：１）をその溶液に添加し、氷浴中で６℃まで冷却する。続いて８２０μｌのアクリロニトリル溶液（１．０ｍｌのアセトニトリル中の８６μｌのアクリロニトリル）を添加し、６℃で１５分間攪拌する。次いで２０５μｌの水素化カリウム溶液（０．５ｍｌのｔｅｒｔ．−ブタノール／アセトニトリル（９：１）中の２５ｍｇのＫＨ）を添加する。短時間の凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）が起こり、その後透明な溶液が得られる。その反応溶液を６℃でさらに４５分間、続いて４℃で６０分間攪拌する。

続いて、その反応溶液を１０ｍｌのメチル−ｔｅｒｔ．−ブチルエーテルで希釈し、各回１０ｍｌのＨ_２Ｏで２回洗浄する。有機相を約１ｇの無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、Ｇ３ガラスフリットを通して濾過し、ロータリーエバポレーター上で蒸発させた。それを高真空中で乾燥させると、約５５ｍｇの質量を有する粘着性の透明な残留物が形成される。

１．２ ヒドロキシビタミンＤ_２−３−３−アミノプロピルエーテルの合成
上記で得られた全ニトリルを１５ｍｌのジエチルエーテル中で溶解させ、７．５ｍｌのジエチルエーテル中の７．５ｍｇの水素化リチウムの懸濁液と攪拌しながら混合する。その反応混合物を室温で１時間攪拌する。その後、６．６ｍｌのジエチルエーテル中の３８．４の水素化アルミニウムリチウムの懸濁液を添加する。これは結果としてその混合物の強い濁りをもたらす。その反応混合物を室温でさらに１時間攪拌し、次いでその反応混合物を氷浴中で０〜５℃に冷却し、３５ｍｌの水を注意深く添加する。そのｐＨを、６．６ｍｌの１０Ｍ水酸化カリウム溶液の添加により強塩基性にする。

それを各回６５ｍｌのメチル−ｔｅｒｔ．−ブチルエーテルで３回抽出する。有機相を合わせて約５ｇの無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、濾過し、室温でロータリーエバポレーター上で乾燥させる。その残留物を、オイルポンプを用いて質量が変わらなくなるまで乾燥させる。その粗生成物を５ｍｌのＤＭＳＯおよび３．０ｍｌのアセトニトリル中で溶解させ、分取ＨＰＬＣにより精製する。

溶離液Ａ＝Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｈ_２Ｏ＋０．１％トリフルオロ酢酸；
溶離液Ｂ＝９５％アセトニトリル＋５％Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ；
勾配：１００分間で５０％Ｂから１００％Ｂまで
流速：３０ｍｌ／分
温度：室温
カラム直径：φ＝５．０ｃｍ；Ｌ＝２５ｃｍ
カラム材料：Ｖｙｄａｃ Ｃ１８／３００Å／１５〜２０μｍ
検出波長：２２６ｎｍ
その生成物含有量が分析的ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８／３００Å／５μｍ；４．６×２．５ｍｍ）に従って８５％より大きい画分を丸底フラスコ中にプールし、凍結乾燥する。１３．７ｍｇ（収率：５８％）が無色の凍結乾燥物として得られる。

１．３ ヒドロキシビタミンＤ_２−３−３’−Ｎ−（ヘミスベリル）アミノプロピル−エーテル−ビオチン−（ベータ−Ａｌａ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（イプシロン）コンジュゲート（hydroxyvitamin D2-3-3’-N-(hemisuberyl)aminopropyl-ether-biotin-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(epsilon) conjugate）（＝Ａｇ−Ｂｉ）の合成
１３．７ｍｇ（２５μｍｏｌ）のヒドロキシビタミンＤ_２−３−３’−アミノプロピルエーテルを３．５ｍｌのＤＭＳＯ中で溶解させ、２８．７ｍｇ（３０μｍｏｌ）のビオチン−（ベータ−Ａｌａ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（イプシロン）−ヘミ−スベレート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（biotin-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(epison)-hemi-suberate-N-hydroxysuccinimide ester）（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏ．１１８６６６５６）および１２．５μｌのトリエチルアミンを添加し、それを室温で一夜攪拌する。その反応溶液を４．５ｍｌのＤＭＳＯで希釈し、０．４５μｍのマイクロフィルターを通して濾過し、続いて分取ＨＰＬＣ（条件は実施例２．３ｂを参照））により精製する。分析的ＨＰＬＣに従って８５％より多くの生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥する。９．８（収率：３０％）の精製されたビオチンコンジュゲートが得られる。

１．４ ビタミンＤ結合タンパク質のルテニウム化およびゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
そのビタミンＤ結合タンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に移し、タンパク質濃度を５〜１０ｍｇ／ｍｌに調節する。ルテニウム化試薬（ルテニウム（ＩＩ）トリス（ビピリジル）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）をＤＭＳＯ中で溶解させ、抗体溶液に３：１のモル比で添加する。４５分間の反応時間の後、反応をｌ−リシンの添加により停止し、ルテニウム化されたビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ−Ｒｕ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上でのゲル濾過により精製する。

１．５ そのアッセイにおける試験手順
調べるべき試料を、企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定する。

試薬混合物を、調べるべき試料を試薬組成物（Ａ）およびアルカリ化剤（Ｂ）と混合することにより形成する。
この実施例において、その試薬混合物は１５μｌの試料を１５μｌの試薬組成物（Ａ）および１０μｌのアルカリ化剤（Ｂ）と混合して形成される。その試薬混合物を９分間保温する。次の工程において、７０μｌの検出試薬（溶液Ｃ）をその試薬混合物に添加し、さらに９分間保温する。最後の工程において、ビオチン化された壁抗原（ｗａｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）（溶液Ｄ）（６０μｌ）ならびに３０μｌのストレプトアビジン（ＳＡ）でコートされた磁化可能なポリスチレン粒子（３０μｌ）（懸濁液Ｅ）を添加する。さらに９分間の保温の後、結合したルテニウム化されたビタミンＤ結合タンパク質の量を通常の方法で決定する（図１、２、３、４ａ、４ｂ参照）
試薬組成物（Ａ）は以下：
１０ｍＭ ＮａＯＨ
４ｍＭ ＥＤＴＡ
６．７ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
０．５Ｍ 炭酸エチレン（ＥＣ）
ｐＨ５．５
を含有する。

アルカリ化剤（Ｂ）は以下：
１．３７５Ｍ ＮａＯＨ
を含有する。

ルテニウム化されたビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ−Ｒｕ）を含む溶液Ｃは以下：
０．２Ｍ ビス−トリス−プロパン（ｐＨ ７．５）
２．５％ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
５０ｍＭ ＮａＣｌ
１％ マンニット（ｍａｎｎｉｔ）
０．１％オキシピリオン（ｏｘｙｐｙｒｉｏｎ）
０．１２μｇ／ｍＬ ＤＢＰ−Ｒｕ
を含有する。

ビオチン化された壁抗原を含む溶液Ｄは以下：
０．２Ｍ ビス−トリス−プロパン（ｐＨ８．６）
０．５％ ｔｗｅｅｎ−２０溶液
０．１％ オキシピリオン
３０ｎｇ／ｍｌ ビオチン
０．０１０８μｇ／ｍＬ Ａｇ−Ｂｉ（実施例１．１から）
を含有する。

ＳＡでコートされたラテックス粒子を含む懸濁液Ｅは以下：
０．７２ｍｇ／ｍｌ ４７０ｎｇ／ｍｌの結合能力を有するＳＡでコートされた磁化可能なポリスチレン粒子
を含有する。

実施例２
炭酸エステルの金属塩、リン酸緩衝液およびカーボネートに対する比較
調べるべき試料を、企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定する。全アッセイ手順は実施例１．５において示されている。

実施例１．５と異なるのは、試薬組成物（Ａ）がそれぞれ０．５Ｍ炭酸エチレン（ＥＣ）、０．５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３、０．５Ｍ ＮａＣｌまたは０．５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４のいずれかを含有することである。

試薬組成物（Ａ）：
１０ｍＭ ＮａＯＨ
４ｍＭ ＥＤＴＡ
６．７ｍＭ ＤＴＴ
０．５ＭのＥＣ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＣｌまたはＮａＨ_２ＰＯ_４のいずれか
対照として、１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴを含有する試薬組成物（Ａ）が用いられてきた。その結果を図５において示す。アルカリ前処理（試薬混合物）中に存在する炭酸エステル（０．５Ｍ ＥＣ（◆））は、競合アッセイにおけるシグナル増強作用を引き起こす。特に、そのシグナル力学はＥＣなしの試験（□）と比較して向上する。塩（０．５ＭＮａＣｌ、（◇））は作用を示さない。０．５Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３（○）または０．５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４（▲）の添加はそのシグナルに小さい作用を示す。

実施例３
炭酸エステルを含む／含まないアルカリ前処理
調べるべき試料を、企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定する。アッセイ手順は実施例１．５において示されている。

実施例１．５と異なるのは、以下のいずれかを含有する３種類の異なる試薬組成物を調製したことである：
◆：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＥＣ（実施例１．５参照）または
▲：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴまたは
□：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ。

試料＋それぞれ◆（実施例１．５において記述された通りの試薬組成物（Ａ）＋アルカリ化剤（Ｂ））、▲、または□のいずれか（＝試薬混合物）の４分間の前処理保温の後、溶液Ｃの添加の前に、その試薬混合物のｐＨをビス−トリス−プロパン（ｐＨ６．３）の添加によりｐＨ９に設定した（図６）。アルカリ前処理（試薬混合物）中に存在する炭酸エステルＥＣは、競合アッセイにおいてシグナル増強作用を引き起こす。特に、そのシグナル力学はＥＣなしの試験と比較して向上する。

実施例４
炭酸エチレン対炭酸ジメチル
調べるべき試料を、企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定する。アッセイ手順は実施例１．５において示されている。

実施例１．５と異なるのは、以下のいずれかを含有する２種類の異なる試薬組成物（Ａ）を調製したことである：
○：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＥＣ（実施例１．５参照）または
◆：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ炭酸ジメチル。

炭酸エステル、炭酸エチレンまたは炭酸ジメチルそれぞれは両方とも同じアッセイ性能を示す（図７）。
実施例５
炭酸エチレンの加水分解産物の作用
調べるべき試料を、企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定する。アッセイ手順は実施例１．５において示されている。

実施例１．５と異なるのは、以下のいずれかを含有する５種類の異なる試薬組成物（Ａ）を調製したことである：
◆：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＥＣ（実施例１．５参照）または
○：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３または
▲：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３＋０．５Ｍエチレングリコール
□：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ。

ＥＣのアルカリ加水分解産物はエチレングリコールであり、それはそのアッセイに対して影響を有しない（▲）。炭酸水素塩（ＮａＨＣＯ_３）もシグナル増強作用を示すが、炭酸エステルほどではない（図８）。

実施例６
炭酸エチレン対グリセロール１，２カーボネート
調べるべき試料を、企業Ｒｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムを用いて測定する。アッセイ手順は実施例１．５において示されている。

実施例１．５と異なるのは、以下のいずれかを含有する２種類の異なる試薬組成物（Ａ）を調製したことである：
◆：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍ ＥＣ（実施例１．５参照）または
○：１０ｍＭ ＮａＯＨ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、６．７ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｍグリセロール１，２カーボネート。

炭酸エステル、炭酸エチレンまたはグリセロール１，２カーボネートそれぞれは両方とも同じアッセイ性能を示す（図９）。

Claims (14)

1. ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるためのインビトロの方法であって、以下の工程：
   ａ）調べるべき試料を提供し、そして
   ｂ）工程（ａ）からの試料を、以下：
   ｉ）１種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質を含有する試薬、ここで該炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）および該炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度は０．１Ｍ〜２．０Ｍである
   ｉｉ）還元剤、ならびに
   ｉｉｉ）アルカリ化剤
   と混合し、それによりビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させる；
   を含む、前記方法。
2. 工程（ｉ）に従う試薬がビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための適切な条件下で水溶液中で可溶性である、請求項１に記載の方法。
3. 加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）を遊離させることができる物質がそれぞれ環状もしくは非環状炭酸エステルまたはそのヒドロキシル化もしくはハロゲン化誘導体である、請求項１および２のいずれか１項に記載の方法。
4. 試料が液体試料である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 試料が血液、血清または血漿である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
6. ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法であって、以下の工程：
   ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法に従ってビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させ、そして
   ｂ）工程（ａ）で遊離したビタミンＤ化合物を測定する；
   を含む、前記方法。
7. ビタミンＤ化合物が２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３およびＣ３−エピ２５−ヒドロキシビタミンＤからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. ビタミンＤ化合物２５−ヒドロキシビタミンＤ_２および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ_３が決定される、請求項７に記載の方法。
9. １種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含み、該炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）および該炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度が０．１Ｍ〜２．０Ｍである、ビタミンＤ化合物のビタミンＤ結合タンパク質からの遊離のための試薬組成物の使用。
10. 還元剤が２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−メチルマレイミド、エルマン試薬および１，２−ジチオラン−３−カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の試薬組成物の使用。
11. 還元剤が２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の試薬組成物の使用。
12. 還元剤が２ｍＭから３０ｍＭまでの濃度を有することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の試薬組成物の使用。
13. 調べるべき試料、
    １種類の炭酸水素塩および加水分解の際に炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質ならびに還元剤を含み、該炭酸水素塩からの炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）および該炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）を遊離させることができる物質から遊離する炭酸水素イオン（ＨＣＯ_３ ⁻）の総濃度が０．１Ｍ〜２．０Ｍである試薬組成物、ならびに
    ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、およびＬｉＯＨからなる群から選択されるアルカリ化剤、
    を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において用いるための試薬混合物であって、該試料が血液、血清または血漿であり、そして該アルカリ化剤が０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度を有する、前記試薬混合物。
14. ビタミンＤ化合物をビタミンＤ結合タンパク質から遊離させるための請求項９〜１２のいずれかに記載の試薬組成物の使用であって、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２、およびＬｉＯＨからなる群から選択されるアルカリ化剤を伴い、ここで該アルカリ化剤が０．１Ｍ〜２．０Ｍの濃度を有する、前記使用。

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