KR102108582B1 - 비타민 d 화합물용 방출 시약 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비타민 D-결합 단백질에 결합한 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물, 비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험관내 방법 (이때, 비타민 D 화합물은 이러한 시약 조성물을 사용하여 비타민 D-결합 단백질로부터 방출됨), 및 이러한 방식으로 수득되는 시약 혼합물에 관한 것이다. 또한, 이는 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 개시된 시약 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 방법은 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -), 환원제 및 알칼리화제를 사용하는 것을 기반으로 한다.

Description

비타민 D 화합물용 방출 시약 {RELEASE REAGENT FOR VITAMIN D COMPOUNDS}
본 발명은 비타민 D-결합 단백질에 결합한 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물, 비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험관내 방법 (이때, 비타민 D 화합물은 이러한 시약 조성물을 사용하여 비타민 D-결합 단백질로부터 방출됨), 및 이러한 방식으로 수득되는 시약 혼합물에 관한 것이다. 또한, 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 개시된 시약 조성물의 용도 뿐 아니라 통상적인 검출 시약에 추가로 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물을 함유하는 비타민 D 화합물의 검출용 키트에 관한 것이다.
비타민 D 의 적절한 공급은 이미 제시된 용어 "비타민" 으로서 필수적인 것이다. 비타민 D 결핍은 구루병 또는 골다공증과 같은 심각한 질병을 초래한다. 비타민 D 는 지난 세기 초반에는 단일 물질로서 여전히 고려되었으나, 비타민 D 시스템은 지난 10 년 동안 비타민 D 대사산물의 복잡하고 다양한 네트워크로 변화하였다. 요즘, 40 개 초과의 상이한 비타민 D 대사 생성물이 공지되어 있다 (Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281).
인간은 오직 햇빛의 자외선이 피부에 작용해야지만 D3 비타민 또는 칼시페롤을 생성시킬 수 있다. 혈액에서, 비타민 D3 은 소위 비타민 D-결합 단백질에 결합하고, 25-히드록실화에 의해 25-히드록시비타민 D3 으로 전환되는 곳인 간으로 이동한다. 요즘, 이미 언급된 2 개의 기관인 피부 및 간 외에도 다수의 다른 조직이 비타민 D 대사에 연계된 것으로 공지되어 있다 (Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP", Springer Verlag, Heidelberg (1990) pp. 24-47). 25-히드록시비타민 D, 보다 구체적으로는 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 은 이들의 양에 관해서 인간 유기체에서 비타민 D 의 중심 저장 형태이다. 필요한 경우, 이들 전구체가 신장에서 전환되어 생물학적으로 활성인 1α,25-디히드록시비타민 D (소위 D 호르몬) 을 형성할 수 있다. 생물학적으로 활성인 비타민 D 는 기타 칼슘 흡수 중에서 장으로부터의 칼슘 흡수를 조절하고, 골 무기화를 조절하고, 예를 들어 인슐린 시스템과 같은 다수의 다른 대사 경로에 영향을 미친다.
비타민 D 수준 그 자체를 측정하는 것은, 환자의 비타민 D 상태를 측정할 때 식품 흡수 또는 햇빛에 대한 노출에 따라 비타민 D (비타민 D2 및 비타민 D3) 의 농도가 수시로 변하기 때문에 이점이 거의 없다. 또한 비타민 D 는 순환기 (24 시간) 에서 상대적으로 짧은 생물학적 반감기를 가지며, 따라서 이러한 이유로 환자의 비타민 D 상태를 측정하기 위한 적합한 매개변수가 아니다. 이는 또한 비타민 D 의 생리학적 활성 형태 (1,25-디히드록시비타민 D) 에도 동일하게 적용된다. 이들 생물학적 활성 형태는 또한 상대적으로 적게 발생하고 25-히드록시비타민 D 와 비교하여 농도가 매우 수시로 변한다. 이러한 모든 이유로, 특히 25-히드록시비타민 D 의 정량화는 환자의 총 비타민 D 상태를 전반적으로 분석하는데 적합한 수단이다.
25-히드록시비타민 D 와 같은 비타민 D 대사산물은 비타민 D-결합 단백질에 의해 매우 높은 친화도로, 그리고 제한된 정도로 또한 알부민 및 일부 리포단백질에 결합한다. 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 대사산물을 방출시키기 위한 적절한 방법은 또한 정상 환경 하에서 임의의 기타 단백질로부터 비타민 D 대사산물을 방출시키는 것보다 더 적절할 것이다.
비타민 D-결합 단백질에 대한 25-히드록시비타민 D 또는 기타 비타민 D 화합물의 결합은 비타민 D 화합물의 측정을 심하게 복잡하게 한다. 모든 공지된 방법에는, 분석할 비타민 D 화합물이 비타민 D-결합 단백질과 형성하는 착물로부터 방출되거나 탈착되는 것이 요구된다. 하기에서, 이는 단순화의 이유로 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 것으로 지칭되나, 물론 이는 비타민 D-결합 단백질 단독으로부터가 아닌 비타민 D 화합물 및 비타민 D-결합 단백질의 착물로부터만 방출될 수 있다.
비타민 D-결합 단백질은 산성 pH 에서 접히지 (folding) 않으나 올바르게 다시 접히는 경향이 강하고 pH 가 다시 중성 조건이 될 때 분석물과 재결합한다. 따라서, 비타민 D 화합물을 우선 방출시키는 것이 필요하고 이어서 분석할 비타민 D 화합물로부터 비타민 D-결합 단백질을 분리하는 것이 필요하다.
25-히드록시비타민 D 의 높은 임상적 중요성으로 인해 수많은 방법이 문헌을 통해 공지되어 있으며, 이들은 25-히드록시비타민 D 가 대략적인 신뢰도로 측정되게 한다.
예를 들어 [Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995], 및 [Eisman, J.A. et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305] 는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 사용하는 혈액 샘플 중의 25-히드록시비타민 D 농도 측정을 기재하고 있다.
25-히드록시비타민 D 를 측정하기 위한 기타 접근법은 그 중에서도 우유에 존재하는 비타민 D-결합 단백질류의 사용을 기반으로 한다. 따라서 [Holick, M.F. and Ray, R. (US 5,981,779)] 및 [DeLuca et al. (EP 0 583 945)] 는 이들 물질의 농도가 경쟁적 시험 절차에 의해 측정되는, 이들 물질의 비타민 D-결합 단백질에 대한 결합을 기반으로 하는 히드록시비타민 D 및 디히드록시비타민 D 에 대한 비타민 D 검정을 기재하고 있다. 그러나, 이러한 방법의 필수전제조건은 우선 측정되는 비타민 D 대사산물이 본래의 혈액 또는 혈청 샘플로부터 단리되어야만 하고 예를 들어 크로마토그래피에 의해 정제되어야만 한다는 것이다.
[Armbruster, F.P. et al. (WO 99/67211)] 은 혈청 또는 혈장 샘플이 에탄올 침전에 의해 비타민 D 측정용으로 준비되어야 한다는 것을 교시하고 있다. 이러한 방법에서, 단백질 침전물은 원심분리에 의해 제거되며 에탄올 상청액은 가용성 비타민 D 대사산물을 함유한다. 이들은 경쟁적 결합 검정에서 측정될 수 있다.
대안적으로는 EP 0 753 743 은, 퍼이오데이트 (periodate) 염을 사용하여 혈액 또는 혈청 샘플로부터 분리될 수 있음을 교시하고 있다. 이 경우, 비타민 D 화합물은 퍼이오데이트로 처리된 샘플로부터 단백질-미함유 상청액에서 측정된다. 일부 상업적 시험에서, 아세토니트릴이 혈청 또는 혈장 샘플의 추출을 위해 권장된다 (예를 들어, 방사면역측정법 (DiaSorin) 또는 "Immundiagnostik" Company 로부터의 비타민 D 시험에서).
최근, 다수의 상이한 방출 시약이 제안되었는데, 이는 원칙적으로 샘플에 존재하는 임의의 결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는데 적합해야 한다. 그러나, 이러한 방출 또는 탈착은 상대적으로 온화한 조건 하에서 수행되어, 그에 따라 결합 시험에서 방출 시약으로 처리된 샘플의 직접적인 사용을 가능하게 해야 한다 (예를 들어 WO 02/57797 및 US 2004/0132104 참조). 최근의 이러한 수많은 노력에도 불구하고, 모든 이용가능한 비타민 D 측정 방법은, 어려운 샘플 준비, 불량한 표준화, 시험 절차 사이의 불량한 조화 또는 스파이킹된 비타민 D 의 불량한 회수와 같은 단점을 갖는다 (특히 이에 대해 상기 Zerwekh, J.E. 참조).
US 7,087,395 에서는, 금속 히드록시드 뿐 아니라 시클로덱스트린 및 이의 유도체, 및 금속 살리실레이트가 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위해 사용되었고, 이것이 비타민 D-결합 단백질 또는 다른 혈청 단백질의 비가역성 변성을 야기한다. Triton X100 또는 Tween-20 과 같은 계면활성제가, 비타민 D 화합물이 변성 후 샘플에서 지질 및 단백질에 비특이적으로 부착되는 것을 방지하기 위해 사용되었다.
비타민 D 화합물에 대한 시험을 자동화하는 것은 특히 어렵다. 자동화를 위해서는 매우 어려운 문제가 해결되어야 하는데, 즉 줄타기 상황 (tightrope walk) 에서 살아남아야 한다는 점이다: 한편으로는 적합한 방출 시약을 보조로 사용하여 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 것이 필요하며, 다른 한편으로는 샘플이 추가로 직접 분석될 수 있도록 하는 조건이 선택되어야 한다. 이러한 직접적인 추가 분석의 필수전제조건은, 한편으로는 내인성 비타민 D-결합 단백질이 이러한 분석 동안 비타민 D 화합물에 결합하지 않거나 더 이상 유의한 정도로 결합하지 않고, 따라서 이러한 분석을 간섭하지 않으며, 다른 한편으로는 사용한 방출 시약이 항체와 같은 검출 시약 또는 비타민 D-결합 단백질의 결합을 간섭하지 않는다는 것이다. 또한, 생화학적으로 상이하게 거동하는 비타민 D-결합 단백질의 상이한 대립형질이 인간 개체군에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 비타민 D 화합물의 방출 및 측정은 다양한 대립형질/표현형에 대해 비교가능해야만 한다.
따라서 본 발명의 목적은 비타민 D 화합물의 방출을 위한 시약 조성물을 개발하는 것이고, 특히 종래 기술의 문제점을 적어도 부분적으로 극복할 수 있는, 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터의 히드록시비타민 D 화합물에 대한 시약 조성물을 개발하는 것이다. 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 적합한 시약 조성물, 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법, 상기 시약 조성물의 용도, 이러한 시약 조성물을 사용하여 비타민 D 화합물을 측정하기 위한 키트가 하기에서 기재되며, 첨부된 특허청구범위에 포함된다.
발명의 개요
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계, 및
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 시약 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 그로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 단계.
추가의 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비타민 D 화합물을 측정하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 시약 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 그로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 단계, 및
c) 단계 (b) 에서 방출된 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
추가의 구현예에서, 본 발명은 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임) 및 환원제를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사할 샘플, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임) 및 환원제를 포함하는 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물, 및 알칼리화제를 포함하는 시약 혼합물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 키트에 관한 것이며, 이는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임) 및 환원제를 포함하는 시약 조성물을 함유한다.
상세한 설명
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 시약 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 그로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 단계.
본원에 사용되는 바와 같이, 하기 각 용어는 이러한 섹션에 관련된 의미를 갖는다.
단수형 표현은 관사의 하나 또는 하나 초과의 문법적 대상 (즉, 하나 이상) 을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다.
표현 "하나 이상" 은 1 내지 50, 바람직하게는 1 내지 20, 또한 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 또는 15 를 나타낸다.
달리 언급하지 않는 경우, 용어 "비타민 D 화합물" 은 하기 구조식 I 및 II 에 따른 비타민 D2 의 골격 또는 비타민 D3 의 골격을 함유하는 모든 자연발생적 화합물을 포함하는 것으로 이해된다.
식 I
Figure 112014045162557-pct00001
식 II
Figure 112014045162557-pct00002
상기 구조식 I 및 II 에서 비타민 D 의 위치는 스테로이드 명명법에 따라 언급된다. 25-히드록시비타민 D 는 구조식 I 및 II 의 위치 25 에서 히드록실화되는 비타민 D 대사산물, 즉 25-히드록시비타민 D2 뿐 아니라 25-히드록시비타민 D3 을 나타낸다. 추가로 공지된 히드록시비타민 D 화합물은 예를 들어, 1,25-디히드록시비타민 D 및 24,25-디히드록시비타민 D 형태이다.
1,25-디히드록시비타민 D 는 구조식 I 및 II 의 위치 25 뿐 아니라 위치 1 에서 히드록실화된 비타민 D 의 활성 형태 (소위 D 호르몬) 를 지칭한다.
기타 널리 공지된 비타민 D 화합물은 24,25-디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 이다.
놀랍게도 본 발명자들에 의해, 본 발명에 개시된 시험관내 방법에서 알칼리 조건 하에서 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염의 존재가 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 "수소 카르보네이트 이온" (바이카르보네이트 이온) 은 실험식 HCO3 - 을 갖는 음이온이고 61.01 달톤의 분자 질량을 갖는다.
본 발명에 따른 "수소 카르보네이트 염" 은 탄산수소나트륨 (NaHCO3), 탄산수소칼륨 (KHCO3), 탄산수소암모늄 (NH4HCO3), 탄산수소칼슘 (Ca(HCO3)2) 및 탄산수소마그네슘 (Mg(HCO3)2) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물이다.
본 발명의 구현예에 따른 "가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질" 은 카르보네이트 에스테르이다.
본 발명에 따른 "카르보네이트 에스테르" 는 2 개의 알콕시기가 측면으로 위치한 카르보닐기이다. 이들 카르보네이트의 일반적 구조는 R1O(C=O)OR2 이다. 시클릭 카르보네이트 에스테르 (예를 들어, 에틸렌 카르보네이트) 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 (예를 들어, 디메틸 카르보네이트) 뿐 아니라 이의 히드록실화 또는 할로겐화 유도체가 이용가능하다.
바람직하게는 본 방법의 단계 i) 에 따른, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염은 각각, 0.1 M 내지 1.5 M, 또는 0.2 M 내지 1.0 M, 또는 적어도 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M, 또는 최대 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 의 총 농도를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 수소 카르보네이트 염은 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산수소암모늄, 탄산수소칼슘 및 탄산수소마그네슘으로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 수소 카르보네이트 염은 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 및 탄산수소암모늄으로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가로 바람직한 수소 카르보네이트 염은 탄산수소나트륨 및 탄산수소칼륨으로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 히드록실화 또는 할로겐화 유도체이다. 또한 바람직한 구현예에서, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체이다. 추가로 바람직한 구현예에서 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스-카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 2,5-디옥사헥산디온산 디메틸 에스테르, 1,2 부틸렌 카르보네이트, 시스 2,3 부틸렌 카르보네이트 및 트랜스 2,3 부틸렌 카르보네이트로 이루어지는 군에서 선택된다. 더 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스-카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온 및 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온으로 이루어지는 군에서 선택된다.
또한 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트 및 비닐렌 카르보네이트로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트 및 프로필렌 카르보네이트로 이루어지는 군에서 선택된다. 더 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트 및 글리세롤 1,2-카르보네이트로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명에서 개시된 효과를 얻기 위해서, 물에 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 하나 이상의 물질(들) 및 하나 이상의 수소 카르보네이트 염(들) 을 각각 임의로 혼합할 수 있다는 것이 당업자에게 공지되어 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 단계 (i) 의 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 시약은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 적절한 조건 하에서 수용액 중 2 M 이상으로 가용성이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 단계 (i) 의 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 시약은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 적절한 조건 하에서 수용액 중 1.5 M 이상, 또는 보다 바람직하게는 1.0 M 이상으로 가용성이다. 본 발명에 따른 방법의 단계 (i) 의 시약을 얻기 위해서, 물에 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 어떻게 용해시킬지는 당업자에게 공지되어 있다. 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 수소 카르보네이트 염은 25℃ 에서 수용성이어야 한다. 수용액에 용해되는, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 수소 카르보네이트 염은 드롭 아웃 (drop out) 또는 결정화 없이 4℃ 의 온도에서 저장가능해야 한다.
가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 수소 카르보네이트 염 대 알칼리화제의 몰비는 각각, 바람직하게는 1 : 3 내지 3 : 1, 보다 바람직하게는 1 : 2 내지 2 : 1, 더욱 바람직하게는 1 : 1.5 내지 1.5 : 1 이다.
또한 당업자는, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및/또는 수소 카르보네이트 염에 대한 알칼리화제의 몰비가 반응성 이온 OH- 또는 HCO3 - 의 상응하는 농도로 계산된다는 것을 숙지하고 있다.
가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염의 혼합물이 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 공지되어 있다. 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및/또는 수소 카르보네이트 염의 상기 혼합물 대 알칼리화제의 몰비는 바람직하게는 1 : 3 내지 3 : 1, 보다 바람직하게는 1 : 2 내지 2 : 1, 더욱 바람직하게는 1 : 1.5 내지 1.5 : 1 이다.
이론에 얽매이지 않으면서, 시약 조성물에서 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염의 존재가 pH 의 이동을 유도하는 것이 익히 알려져 있다. 시약 조성물에서 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 상기 물질 및/또는 상기 수소 카르보네이트 염의 더 낮은 농도는 전처리 반응 동안 시약 혼합물의 더 느린 pH 감소를 초래한다. 시약 조성물에서 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 상기 물질 및/또는 상기 수소 카르보네이트 염의 더 높은 농도는 전처리 반응 동안 시약 혼합물의 더 빠른 pH 감소를 초래한다. 또한, 알칼리 완충제 조건에서 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염과 환원제의 합의된 작용으로 인해 비타민 D-결합 단백질의 비가역성 변성이 이루어지고 그로써 비타민 D 화합물의 추후 검출이 촉진되는 것으로 보인다.
한 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 ii) 의 환원제는 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), N-메틸말레이미드, 엘만 시약 (Ellman's Reagent) 및 1,2-디티올란-3-카르복실산으로 이루어지는 군에서 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 ii) 의 환원제는, 단계 ii) 의 환원제가 티올기를 함유하는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 ii) 의 환원제는 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어지는 군에서 선택된다.
한 구현예에서 본 방법에 따른 단계 ii) 의 환원제는 2 mM 내지 30 mM 의 농도, 추가의 구현예에서 3 mM 내지 20 mM 의 농도, 추가의 구현예에서 3.5 mM 내지 15 mM 의 농도, 그리고 추가의 구현예에서 4 mM 내지 10 mM 의 농도를 갖는다.
"알칼리화제" 는 알칼리 히드록시드 또는 알칼리 토금속 히드록시드일 수 있다 (즉, 수용액 중의). 또한, 알칼리화제는 알칼리 히드록시드 및/또는 알칼리 토금속 히드록시드의 혼합물을 포함할 수 있어, 즉 NaOH 및 KOH, NaOH 및 LiOH, NaOH 및 Ca(OH2), KOH 및 Ca(OH)2, KOH 및 LiOH 뿐 아니라 다른 조합을 포함할 수 있다.
"알칼리 히드록시드" 는 알칼리 금속 양이온 및 히드록시드 음이온 (OH-) 으로 구성되는 화합물 부류이다. 알칼리 히드록시드는 예컨대 NaOH, KOH, LiOH, RbOH 및 CsOH 이다. "알칼리 금속" 은 주기율표의 1 족 (IUPAC) 을 형성하는 일련의 화학 원소이다: 리튬 (Li), 나트륨 (Na), 칼륨 (K), 루비듐 (Rb), 세슘 (Cs) 및 프랑슘 (Fr).
"알칼리 토금속 히드록시드" 는 알칼리 토금속 양이온 및 2 개의 히드록시드 음이온 (OH-) 으로 구성되는 화합물 부류이다. "알칼리 토금속" 은 주기율표의 2 족 (IUPAC 방식) (IIA 족) 을 포함한다: 베릴륨 (Be), 마그네슘 (Mg), 칼슘 (Ca), 스트론튬 (Sr), 바륨 (Ba) 및 라듐 (Ra).
한 구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 단계 iii) 의 알칼리화제는 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 로 이루어지는 군에서 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 iii) 의 알칼리화제는 각각, 0.1 M 내지 2.0 M, 또는 0.1 M 내지 1.5 M, 또는 0.2 M 내지 1.75 M, 또는 0.2 M 내지 1.0 M, 또는 적어도 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M, 또는 최대 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 의 농도를 갖는다.
추가의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 iii) 의 알칼리화제는 NaOH 및 KOH 로 이루어지는 군에서 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 알칼리화제는, 샘플 + 시약 i) + 환원제 ii) + 알칼리화제 iii) 의 혼합물 중에서, 각각 0.1 M 내지 0.6 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 0.5 M 의 농도, 또는 적어도 0.1 또는 0.2 M, 또는 최대 0.6 또는 0.5 M 의 최종 농도를 갖는다.
추가의 구현예에서, 각각 단계 i), ii) 및 iii) 의 3 개 시약 대 조사할 샘플의 혼합비는 바람직하게는 1 : 3 내지 3 : 1 이다.
한 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 a) 의 샘플, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 단계 i) 의 시약 + 단계 ii) 의 환원제 + 단계 iii) 의 알칼리화제는 임의의 피펫팅 순서로 첨가될 수 있다. 혼합시, 본 발명의 방법에 따른 단계 b) 는 추가의 구현예에서, 9.5 내지 14 의 pH 값 및 적어도 10, 12, 15 또는 20 초 동안인 것을 특징으로 할 수 있으며, 추가로 바람직하게는 단계 b) 는 혼합시 10.5 내지 14 의 pH 값 및 적어도 10, 12, 15 또는 20 초 동안인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 방법의 구현예에서, 단계 a) 의 조사할 샘플을, 단계 b) 에서, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 단계 i) 의 시약, 단계 ii) 의 환원제, 단계 iii) 의 알칼리화제와 혼합하고 인큐베이션한다. 인큐베이션 단계 b) 는 필요한 만큼 계속 수행될 수 있다. 인큐베이션 시간은 예를 들어 15 초 내지 24 시간이다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 단계 b) 의 혼합물은 1 내지 60 분 동안 인큐베이션되고 그로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출한다.
본 방법에 따른 단계 b) 의 성분의 농도는, 조사할 샘플과 함께 인큐베이션하는 동안, 특정 pH 범위 및 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염, 환원제 및 알칼리화제 각각의 바람직한 농도가 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기에 적절하도록 당업자에 의해 용이하게 선택된다.
알칼리 조건은 비타민 D-결합 단백질의 변성 및 조사할 샘플에 존재하는 비타민 D 의 방출을 초래한다. 알칼리화제의 농도는 전처리 반응에서 "시약 혼합물" (= 조사할 샘플 + 본 발명에 따른 시약 조성물 + 알칼리화제) 의 pH 를 pH 10.0 이상, 바람직하게는 pH 10.5 이상, 보다 바람직하게는 11.0 이상으로 증가시키기에 충분해야 한다. 당업자는 시약 혼합물의 pH 가 조사할 샘플 + 본 발명에 따른 시약 조성물 + 알칼리화제의 혼합물 생성 시기에 측정되어야 한다는 것을 숙지하고 있다. 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및/또는 수소 카르보네이트 염의 가수분해로 인해, 시약 혼합물에서 pH 는 감소될 것이다 (도 1 및 실시예 1.5 참조).
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "샘플" 은 시험관내 평가 목적으로 개체로부터 수득되는 생물학적 샘플을 지칭한다. 본 발명의 방법에서, 조사할 샘플은 한 구현예에서 액체 샘플이다. 본 발명의 추가의 구현예에서 샘플은 임의의 체액을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 조사할 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장이고, 혈청 또는 혈장이 가장 바람직하다. 추가의 구현예에서, 액체 샘플은 필터지 또는 필터막 상에서 건조된다. 한 구현예에서, 본원에서 사용되는 샘플은 개체로부터 수득되는 샘플의 분액을 지칭한다.
추가의 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함한다:
(a) 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 단계 및
(b) 단계 (a) 에서 방출되는 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
추가의 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함한다:
(a) 관심 샘플에서 비타민 D-결합 단백질에 결합한 비타민 D 화합물을 방출시키는 단계 및
(b) 단계 (a) 에서 방출되는 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
추가의 구현예에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 시약 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 내지 2.0 M 임), ii) 환원제 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 그로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 단계, 및
c) 단계 (b) 에서 방출되는 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
추가의 구현예에서 본 발명은 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함하며, 이때 측정되는 상기 비타민 D 화합물은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25-디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 를 포함하는 군에서 선택된다.
추가의 구현예에서 본 발명은 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함하며, 이때 측정되는 상기 비타민 D 화합물은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25-디히드록시비타민 D2 및 24,25-디히드록시비타민 D3 을 포함하는 군에서 선택된다.
추가의 구현예에서 본 발명은 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함하며, 이때 상기 비타민 D 화합물 25-히드록시비타민 D2 및/또는 25-히드록시비타민 D3 이 측정된다.
시약 조성물:
한 구현예에서, 본 발명은 조사할 샘플 중 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 집중적으로 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 내지 2.0 M 임) 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사할 샘플 중 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 내지 1.5 M 임) 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사할 샘플 중 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.2 내지 1.0 M 임) 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사할 샘플 중 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 적어도 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 임) 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사할 샘플 중 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물에 관한 것이며, 이는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 최대 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 임) 및 환원제를 함유한다.
추가로 바람직한 구현예에서, 시약 조성물에서의 수소 카르보네이트 염은 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산수소암모늄, 탄산수소칼슘 및 탄산수소마그네슘으로 이루어지는 군에서 선택된다. 시약 조성물에서의 추가로 바람직한 수소 카르보네이트 염은, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 및 탄산수소암모늄으로 이루어지는 군에서 선택된다. 시약 조성물에서의 추가로 바람직한 수소 카르보네이트 염은 탄산수소나트륨 및/또는 탄산수소칼륨이다.
추가로 바람직한 구현예에서, 시약 조성물에서 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 히드록실화 또는 할로겐화 유도체이다.
추가로 바람직한 구현예에서, 시약 조성물에서 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체이다. 추가로 바람직한 구현예에서, 시약 조성물에서의 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스-카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 2,5-디옥사헥산디온산 디메틸 에스테르, 1,2 부틸렌 카르보네이트, 시스 2,3 부틸렌 카르보네이트 및 트랜스 2,3 부틸렌 카르보네이트로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가로 바람직한 시약 조성물에서의 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스-카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온 및 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온으로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가로 바람직한 시약 조성물에서의 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가로 바람직한 시약 조성물에서의 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트 및 프로필렌 카르보네이트로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가로 바람직한 시약 조성물에서의 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트 및 글리세롤 1,2-카르보네이트로 이루어지는 군에서 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 환원제가 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), N-메틸말레이미드, 엘만 시약 및 1,2-디티올란-3-카르복실산으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 환원제가 티올기를 함유하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 환원제가 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서 환원제의 농도는 2 mM 내지 30 mM 이고, 추가의 구현예에서 3 mM 내지 20 mM 이고, 추가의 구현예에서 3.5 mM 내지 15 mM 이고, 추가의 구현예에서 4 mM 내지 10 mM 이다.
환원제의 수용능이 관능기, 즉 환원기의 존재에 의존적이라는 것이 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 활성 환원기의 수를 고려하여 환원제의 적절한 농도를 선택하는 것이 당업자에게 공지되어 있다.
비타민 D-결합 단백질에 대한 유전자 코딩은 상이한 대립형질의 형태로 인간 개체군에서 발생한다. 이들 대립형질에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 생화학적으로 상이하여, 즉 상이한 표현형을 초래한다는 것이 공지되어 있다. 또한, 이들 생화학적 차이는 비타민 D 화합물의 결합 및 방출에 영향을 미친다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 비타민 D-결합 단백질의 표현형과 관계없이 비타민 D 화합물을 방출시키기에 적합하다. 따라서 본 발명의 바람직한 구현예는 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 본 발명에 따른 시약 조성물의 용도이다.
한 구현예에서, 본 발명에 따른 시약 조성물은 비타민 D-결합 단백질의 표현형에 불문하고 또 이와 관계없이, 조사할 샘플 중 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위해 사용된다.
비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 목적으로, 본 발명에 따른 시약 조성물은 조사할 샘플, 예를 들어 혈청 또는 혈장, 및 알칼리화제와 혼합된다.
시약 혼합물:
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "시약 혼합물" 은 조사할 샘플, 본 발명에 따른 시약 조성물, 및 알칼리화제를 포함한다.
추가의 구현예에서, 시약 혼합물은 알칼리화제가 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 시약 혼합물은 사용되는 알칼리화제가 각각 0.1 M 내지 2.0 M, 또는 0.1 M 내지 1.5 M, 또는 0.2 M 내지 1.75 M, 또는 0.2 M 내지 1.0 M, 또는 적어도 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M, 또는 최대 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 의 농도를 갖는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 시약 혼합물은 알칼리화제가 NaOH 및 KOH 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 알칼리화제는 시약 혼합물 중에서 각각 0.1 M 내지 0.6 M, 또는 0.2 M 내지 0.5 M, 또는 적어도 0.1, 또는 0.2 M, 또는 최대 0.6, 또는 0.5 M 의 최종 농도를 갖는다.
시약 조성물 및 알칼리화제 대 조사할 샘플의 혼합비는 한 구현예에서 바람직하게는 1 : 3 내지 3 : 1 이다.
조사할 샘플, 개시된 시약 조성물 및 알칼리화제는 임의의 피펫팅 순서로 첨가되어 시약 혼합물을 형성할 수 있다. 혼합시, 시약 혼합물은 추가의 구현예에서 적어도 10, 12, 15 또는 20 초 동안이고 pH 값이 9.5 내지 14 인 것을 특징으로 하며, 추가로 바람직하게는 상기 시약 혼합물은 혼합시 적어도 10, 12, 15 또는 20 초 동안이고 pH 값이 10.5 내지 14 인 것을 특징으로 한다.
조사할 샘플은 본 발명에 따른 시약 조성물 및 알칼리화제와 혼합되고 인큐베이션된다. 이러한 단계는 또한 소위 전처리 단계로 지칭될 수 있다. 전처리 단계는 필요한 만큼 계속 수행될 수 있다. 인큐베이션 시간은 예를 들어 15 초 내지 24 시간 동안이다. 한 구현예에서 시약 혼합물은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위해 1 내지 60 분 동안 인큐베이션된다. 또 다른 구현예에서 시약 혼합물은 4 내지 10 분 동안 인큐베이션되어 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시킨다.
시약 혼합물 및 그 안의 성분의 농도는 조사할 샘플과 함께 인큐베이션하는 동안, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염, 환원제 및 알칼리화제의 원하는 농도 및 특정 pH 범위가 각각, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기에 적절하도록 당업자에 의해 용이하게 선택된다.
한 구현예에서, 시약 혼합물은 또한 본 발명의 시약 조성물에 대해 기재된 바와 같이 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염의 바람직한 물질 및/또는 농도를 포함한다.
비타민 D 화합물의 검출은 바람직하게는, 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25 디히드록시비타민 D2 , 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 를 포함하는 군에서 선택되는 하나 이상의 비타민 D 화합물이 검출되도록 수행된다.
비타민 D 화합물의 특이적 검출에서, 추가의 인큐베이션 단계가 전처리 단계 이후 수행된다. 시약 혼합물에 존재하는 환원제의 잔재물은 비특이적 단백질, 바람직하게는 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA) 의 첨가에 의해 차폐될 수 있다. 이러한 비특이적 단백질은 별개로 첨가될 수 있거나 검출 시약을 또한 포함하는 용액 중에 단순히 포함될 수 있다. 환원제의 수용능을 감소시키는 잔류물을 차폐함으로써, 비타민 D 화합물에 대한 단백질성 특이적 결합제를 사용하는 비타민 D 화합물의 비절충적 (noncompromised) 검출이 가능하다.
당업자에게 숙지된 바와 같이, 특이적 결합제를 포함하는 용액은 시약 혼합물에 대한 특이적 결합제를 함유하는 용액의 첨가 이후 pH 가 특이적 결합제에 비타민 D 화합물이 결합하게 하는 필수전제라는 것을 확실하게 만드는 pH 완충계를 함유할 것이다. 비타민 D 화합물에 대한 특이적 결합제의 결합이 발생하는 한, 완충계도 최종 pH 도 반드시 필요한 것은 아니다. 비타민 D-결합 단백질이 특이적 결합제로서 사용되는 경우, 이러한 인큐베이션 단계 동안 pH 는 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 9.0 사이에서 선택된다. 항체가 비타민 D 화합물에 대한 특이적 결합제로서 사용되는 경우, 이러한 인큐베이션 단계 동안 pH 는 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 7.5 일 것이다.
특이적 결합제를 포함하는 용액은 바람직하게는 20 mM 내지 400 mM 인 완충계를 함유한다. 또한 바람직하게는 상기 완충제는 50 mM 내지 350 mM 또는 100 mM 내지 300 mM 의 몰 농도를 갖는다.
비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험관내 방법은 본 발명의 개시를 기반으로 하여 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
원칙적으로, 하나 이상의 비타민 D 화합물에 결합하는 특이적 결합 폴리펩티드와 같은 모든 단백질성 결합 파트너는 특이적 결합제로서 사용될 수 있다. 특이적 결합제는 항체이거나 비타민 D-결합 단백질 그 자체일 수 있다.
많은 시판되는 시험 시스템은 아비딘 또는 스트렙타비딘 (SA) 으로 코팅되는 고체상, 예를 들어 SA-코팅 마이크로타이터 플레이트 또는 SA-코팅 라티스의 사용을 기반으로 한다.
비오틴화된 분석물 유도체는 예를 들어 시험 절차 동안 또는 그 전에 이러한 SA 고체상에 결합한다. 비타민 D 화합물을 검출할 때, 이러한 비오틴화 분석물 유도체 화합물은 예를 들어 비오틴화 25-히드록시비타민 D2 및/또는 비오틴화 25-히드록시비타민 D3 일 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 검출의 시험관내 방법은 경쟁적 검정으로서 수행된다. 이러한 경쟁적 시험에서, 비타민 D 화합물의 유도체는 규정량으로 상기 시험에 첨가되어, 특이적 결합제의 결합 부위에 대해 샘플로부터의 상응하는 비타민 D 화합물과 경쟁한다. 더 많은 비타민 D 화합물이 샘플 중에 존재할수록, 검출 신호는 더 작다.
한 구현예에서, 비타민 D 화합물의 유도체는 비오틴화 비타민 D 화합물이다. 추가의 구현예에서, 비오틴화 비타민 D 화합물은 비오틴화 25-히드록시비타민 D2 및/또는 비오틴화 25-히드록시비타민 D3 이다. 추가의 구현예에서, 비오틴화 비타민 D 화합물은 비오틴화 25-히드록시비타민 D2 이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 설명에 개시된 바와 같은 검출 방법에서 사용하기에 바람직한 특이적 결합제는 항체 및 비타민 D-결합 단백질이다. 경쟁적 검정 포맷에서 사용되는 경우, 비타민 D-결합 단백질은 하나 이상의 (비오틴화) 비타민 D 화합물 유도체에 대한 이의 결합과 경쟁하는 모든 비타민 D 화합물이 통합 측정되게 할 것이다. 한 구현예에서, 비타민 D-결합 단백질은 검출가능하게 라벨링될 것이며, 예를 들어 루테닐화될 것이다.
용도:
한 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한, 알칼리화제를 함께 갖는 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 조사할 샘플에 존재하는 것으로 예상되는 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한, 알칼리화제를 함께 갖는 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D 화합물을 검출하는 방법에 있어서 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한, 알칼리화제를 함께 갖는 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D 화합물을 검출하는 방법에 있어서 비타민 D-결합 단백질로부터 조사할 샘플에 존재하는 것으로 예상되는 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한, 1 M 내지 1.5 M 의 알칼리화제의 용액을 함께 갖는, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), 2 mM 내지 30 mM 의 환원제를 함유하는 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한 한 구현예에서, 시약 조성물의 용도는 본 발명의 시약 조성물에 대해 기재되는 바와 같이 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염의 바람직한 물질 및/또는 농도를 포함한다.
키트 :
한 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터의 비타민 D 화합물의 방출을 위한 키트에 관한 것이며, 이는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임) 및 환원제를 포함하는 시약 조성물을 함유한다.
한 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터의 비타민 D 화합물의 검출을 위한 키트에 관한 것이며, 이는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), 환원제를 갖는 시약 조성물, 및 알칼리화제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터의 비타민 D 화합물의 검출을 위한 키트에 관한 것이며, 이는 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), 2 mM 내지 30 mM 의 환원제를 갖는 시약 조성물, 및 알칼리화제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터의 비타민 D 화합물의 검출을 위한 키트에 관한 것이며, 이는 검출 성분에 추가로, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), 2 mM 내지 30 mM 의 환원제를 갖는 시약 조성물, 1 M 내지 1.5 M 의 알칼리화제 용액을 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 특이적 결합제를 포함하는 용액에 추가로, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염, 환원제를 갖는 시약 조성물, 알칼리화제 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 화합물의 검출을 위한 키트에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), 2 mM 내지 30 mM 의 환원제를 갖는 시약 조성물, 1 M 내지 1.5 M 의 알칼리화제 용액 및 특이적 결합제를 포함하는 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 화합물의 검출을 위한 키트에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어지는 군에서 선택되는 2 mM 내지 30 mM 의 환원제를 갖는 시약 조성물, NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 M 내지 1.5 M 의 알칼리화제 용액 및 특이적 결합제를 포함하는 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 화합물의 검출을 위한 키트에 관한 것이다.
또한 한 구현예에서, 키트는 본 발명의 시약 조성물에 대해 기재된 바와 같이 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염의 바람직한 물질 및/또는 농도를 포함한다.
본 발명에 따른 시약 조성물은 비타민 D 화합물에 대한 자동화 시험에서 사용하기에 적합한 것으로 증명되었다. 본 발명은 바람직하게는, 특히 비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 본 발명에 따른 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
비타민 D 화합물에 대한 시험은 바람직하게는 완전히 자동화된다. 이 경우, 완전히 자동화된다는 것은, 실험자가 단지 조사할 샘플 및 비타민 D 화합물 측정을 위한 모든 성분을 함유하는 시약 팩을 자동화된 분석기에 넣기만 하면 되며 모든 추가 단계가 분석기에 의해 자동적으로 수행된다는 것을 의미한다. 완전히 자동화된 시험은 특히 바람직하게는 Roche Diagnostics 로부터의 Elecsys® 분석기에서 수행된다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 시약 조성물은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25 디히드록시비타민 D2 , 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 를 포함하는 군에서 선택되는 비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험관내 방법에서 사용된다.
상기 이미 언급된 바와 같이, 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 은 진단용 비타민 D 의 특히 관련 있는 형태이다. 본 발명에 따른 시험관내 방법에서, 25-히드록시비타민 D2 또는 25-히드록시비타민 D3 에 대한 특이적 항체를 통한 25-히드록시비타민 D2 또는 25-히드록시비타민 D3 또는 둘 모두의 특이적 검출이 또한 바람직한 구현예를 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 명확해진다. 실제 보호 범주는 본 발명에 첨부된 특허청구범위에서 유래한 것이다.
도 1: 전처리 단계 동안 시약 혼합물의 pH 변화. 검정은 실시예 1.5 에서 개략적으로 나타낸 바와 같이 수행하였다. 시약 조성물 (A) 는 다양한 농도의 에틸렌 카르보네이트 (EC) 를 함유한다: 0.00 M (●), 0.10 M (◆), 0.30 M (□), 0.50 M (▲), 0.75 M (○), 1.00 M (■), 1.50 M (◇) EC. X 축은 시간 (분) 을 나타내고, Y 축은 pH 를 나타낸다.
도 2: 다양한 농도의 에틸렌 카르보네이트 (EC) 를 함유하는 시약 조성물 (A) 를 이용하는 실시예 1.5 에서 기재된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선: 1.50 M (●), 1.00 M (□), 0.75 M (◆), 0.50 M (○), 0.30 M (▲) 및 0.10 M (◇) EC. X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하는 통상적으로 측정된 계수를 나타낸다.
도 3: 다양한 농도의 환원제 디티오트레이톨 (DTT) 을 함유하는 시약 조성물 (A) 를 이용하는, 실시예 1.5 에 기재된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선: 1.0 mM (□), 2.0 mM (●), 4.0 mM (◆), 6.7 mM (○), 10.0 mM/12.0 mM (▲), 15.0 mM (◇). X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하는 통상적으로 측정된 계수를 나타낸다.
도 4a: 방법 비교: 비타민 D 검정 (실시예 1) 및 액체 크로마토그래피-이중 질량 분석법 (LC-TMS). 25-히드록시비타민 D 를 실시예 1.5 의 비타민 D 검정 뿐 아니라 LC-TMS 에 의해 측정하였고, 이때 0.5 M 에틸렌 카르보네이트 (EC) 를 갖는 시약 조성물 (A) 를 인큐베이션용으로 사용하였다. 다중 혈청 샘플에 대한 결과 (ng/ml) 를 LC-TMS 에 대해서는 X 축에 대해 플롯팅하고 실시예 1.5 의 비타민 D 검정에 대해서는 Y 축에 플롯팅하였다.
(---) y = x
(─) 선형 회귀
비타민 D 검정 = 2.0116 + 0.9036*x, 피어슨 (Pearson) r = 0.9509
도 4b: 방법 비교: 비타민 D 검정 (실시예 1) 및 LC-TMS
25-히드록시비타민 D 를 실시예 1.5 의 비타민 D 검정 뿐 아니라 LC-TMS 에 의해 측정하였으며, 이때 에틸렌 카르보네이트 (EC) 를 갖지 않는 시약 조성물 (A) 를 인큐베이션용으로 사용하였다. 다중 혈청 샘플에 대한 결과 (ng/ml) 를 LC-TMS 에 대해서는 X 축에 대해 플롯팅하고 실시예 1.5 의 비타민 D 검정에 대해서는 Y 축에 플롯팅하였다.
(---) y = x
(─) 선형 회귀
비타민 D 검정 = 0.7496 + 0.7338*x, 피어슨 r = 0.7914
도 5: 0.5 M 에틸렌 카르보네이트 (◆), 0.5 M Na2CO3 (○), 0.5 M NaH2PO4 (▲), 0.5 M NaCl (◇), 및 대조군 (□) 을 함유하는 시약 조성물 (A) 를 이용하는, 실시예 2 에 기재된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선. X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정된 계수를 나타낸다.
도 6: 하기를 함유하는 시약 조성물 (A) 를 이용하는 실시예 3 에 기재된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC, 또는
▲: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 또는
□: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA.
X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정된 계수를 나타낸다.
도 7: 하기를 함유하는 시약 조성물 (A) 를 이용하는 실시예 4 에 기재된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선:
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (실시예 1.5 참조), 또는
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M 디메틸 카르보네이트.
X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정된 계수를 나타낸다.
도 8: 하기를 함유하는 시약 조성물 (A) 를 이용하는 실시예 5 에서 기재된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (실시예 1.5 참조), 또는
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M NaHCO3, 또는
▲: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M NaHCO3 + 0.5 M 에틸렌 글리콜, 또는
□: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT.
X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정된 계수를 나타낸다.
도 9: 하기를 함유하는 시약 조성물 (A) 를 이용하는 실시예 4 에 기재된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (실시예 1.5 참조) 또는
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M 글리세롤 1,2 카르보네이트.
X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정된 계수를 나타낸다.
실시예 1
25- 히드록시비타민 D 의 검출을 위한 검정
상업적 검정을 제조사의 지시사항에 따라 사용하였다. 25-히드록시비타민 D 측정을 문헌에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS (Vogeser, M. et al., Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417) 에 의해 또는 HPLC (25(OH)비타민 D3 용 시험, "Immundiagnostik" Company제, Bensheim, 주문 번호 KC 3400) 에 의해 수행하였다.
성분의 제조 및 신규 시험을 위한 일반적 시험 절차를 하기에서 기재한다:
1. 1 히드록시비타민 D 2 -3-2'- 시아노에틸 에테르의 합성
20.6 mg (50 μmol) 의 25-히드록시비타민 D2 (Fluka No. 17937) 를 아르곤 분위기 하에서 내부 온도계를 장착한 25 ml 3 구 둥근 바닥 플라스크에서 10 ml 건식 아세토니트릴에 용해시켰다. 1.5 ml tert-부탄올/아세토니트릴 (9:1) 을 용액에 첨가하고 빙조에서 6℃ 로 냉각시켰다. 이어서 820 ㎕ 의 아크릴로니트릴 용액 (1.0 ml 아세토니트릴 중 86 ㎕ 아크릴로니트릴) 을 첨가하고 15 분 동안 6℃ 에서 교반하였다. 이어서, 205 ㎕ 의 칼륨 히드라이드 용액 (0.5 ml tert-부탄올/아세토니트릴 9:1 중 25 mg KH) 을 첨가하였다. 맑은 용액이 수득된 후 잠시 동안의 응결이 발생하였다. 반응 용액을 추가 45 분 동안 6℃ 에서 교반하고 이어서 60 분 동안 4℃ 에서 교반하였다.
이후, 반응 용액을 10 ml 메틸-tert-부틸 에테르로 희석하고 매번 10 ml H2O 로 2 회 세척하였다. 유기상을 약 1 g 무수 황산나트륨으로 건조시키고, G3 유리 프릿 상에 여과시키고 회전 증발기에서 증발시켰다. 고진공 하에 건조시켜 약 55 mg 의 질량을 갖는 점성이 있는 맑은 잔류물을 형성시켰다.
1. 2 히드록시비타민 D 2 -3-3-아미노프로필 에테르의 합성
상기 수득한 전체 니트릴을 15 ml 디에틸 에테르에 용해시키고, 교반하면서, 7.5 ml 디에틸 에테르 중 7.5 mg 리튬 히드라이드의 현탁액과 혼화시켰다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이후, 6.6 ml 디에틸 에테르 중 38.4 mg 리튬 알루미늄 히드라이드의 현탁액을 첨가하였다. 이로 인해 혼합물의 강한 혼탁이 초래된다. 반응 혼합물을 실온에서 추가 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 빙조에서 0-5℃ 로 냉각하고 35 ml 물을 조심스럽게 첨가하였다. 6.6 ml 10 M 수산화칼륨 용액을 첨가하여 pH 를 강한 염기성으로 만들었다.
매번 65 ml 메틸-tert-부틸 에테르로 3 회 추출하였다. 조합된 유기상을 약 5 g 무수 황산나트륨을 이용하여 건조시키고, 여과하고 회전 증발기에서 실온에서 증발시켰다. 오일 펌프를 사용하여, 질량이 일정하도록 잔류물을 건조시켰다. 미정제 생성물을 5 ml DMSO 및 3.0 ml 아세토니트릴에 용해시키고 제조용 HPLC 에 의해 정제하였다.
용리액 A = Millipore-H2O + 0.1% 트리플루오로아세트산;
용리액 B = 95% 아세토니트릴 + 5% Millipore-H2O + 0.1% TFA;
구배: 100 분에서 50% B → 100% B
유속: 30 ml/분
온도: 실온
컬럼 치수:
Figure 112014045162557-pct00003
= 5.0 cm; L = 25 cm
컬럼 재료: Vydac C18/300Å × 15-20 ㎛
det. 파장: 226 nm
생성물 함량이 분석용 HPLC (Vydac C18/300Å × 5 ㎛; 4.6 x 250 mm) 에 따라 85% 초과인 분획을 둥근 바닥 플라스크에 모으고 동결건조시켰다. 무색의 동결건조물로서 13.7 mg (수율: 58%) 을 수득하였다.
1. 3 히드록시비타민 D 2 -3-3'-N-( 헤미수베릴 )아미노프로필-에테르-비오틴-(베타- Ala )- Glu - Glu - Lys (엡실론) 접합체 (= Ag - Bi ) 의 합성
13.7 mg (25 μmol) 히드록시비타민 D2-3-3'-아미노프로필 에테르를 3.5　ml DMSO 에 용해시키고, 28.7 mg (30 μmol) 비오틴-(베타-Ala)-Glu-Glu-Lys(에피손)-헤미수베레이트-N-히드록시숙시니미드 에스테르 (Roche Applied Science, No. 11866656) 및 12.5 ㎕ 트리에틸아민을 첨가하고 이를 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 4.5 ml DMSO 로 희석하고, 0.45 ㎛ 마이크로필터를 통해 여과하고 이어서 제조용 HPLC 에 의해 정제하였다 (조건은 실시예 2.3 b) 참조). 분석용 HPLC 에 따라 85% 초과의 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조시켰다. 9.8 mg (수율: 30%) 의 정제된 비오틴 접합체를 수득하였다.
1.4 비타민 D-결합 단백질의 루테닐화 및 겔 여과 크로마토그래피에 의한 정제
비타민 D-결합 단백질을, 100 mM 인산칼륨 / 150 mM 염화나트륨 완충제 (pH 8.5) 에 옮기고 단백질 농도를 5-10 mg/ml 로 조정하였다. 루테닐화 시약 (루테늄 (II) 트리스 (바이피리딜)-N-히드록시숙시니미드 에스테르) 를 DMSO 에 용해하고 3 대 1 의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 45 분의 반응 시간 후, l-라이신을 첨가하여 반응을 중단시키고 루테닐화된 비타민 D-결합 단백질 (= DBP-Ru) 을 Superdex 200 컬럼 상에서 겔 여과에 의해 정제하였다.
1.5 검정에서의 시험 절차
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다.
조사할 샘플을 시약 조성물 (A) 및 알칼리화제 (B) 와 혼합함으로써 시약 혼합물을 형성시켰다.
이 실시예에서, 시약 혼합물은 15 ㎕ 의 시약 조성물 (A) 및 10 ㎕ 의 알칼리화제 (B) 와 혼합된 15 ㎕ 샘플로 형성된다. 시약 혼합물을 9 분 동안 인큐베이션하였다. 다음 단계에서, 70 ㎕ 의 검출 시약 (용액 C) 을 시약 혼합물에 첨가하고 추가 9 분 동안 인큐베이션하였다. 마지막 단계에서, 비오틴화 벽 항원 (용액 D) (60 ㎕) 뿐 아니라 스트렙타비딘 (SA) (30 ㎕) 으로 코팅된 자화가능 폴리스티렌 입자 30 ㎕ (현탁액 E) 를 첨가하였다. 추가 9 분의 인큐베이션 후, 결합한 루테닐화된 비타민 D-결합 단백질의 양을 통상적으로 측정하였다 (도 1, 2, 3, 4a, 4b 참조).
시약 조성물 (A) 는 하기를 함유한다:
10 mM NaOH
4 mM EDTA
6.7 mM 디티오트레이톨 (DTT)
0.5 M 에틸렌 카르보네이트 (EC)
pH 5.5
알칼리화제 (B) 는 하기를 함유한다:
1.375 M NaOH
루테닐화된 비타민 D-결합 단백질 (DBP-Ru) 을 갖는 용액 C 는 하기를 함유한다:
0.2 M 비스-트리스-프로판 (pH 7.5)
2.5% 인간 혈청 알부민 (HSA)
50 mM NaCl
1% 만니톨
0.1% 옥시피리온
0.12 ㎍/mL DBP-Ru
비오틴화 벽 항원을 갖는 용액 D 는 하기를 함유한다:
0.2 M 비스-트리스-프로판 (pH 8.6)
0.5% tween-20 용액
0.1% 옥시피리온
30 ng/ml 비오틴
0.0108 ㎍/mL Ag-Bi (실시예 1.1)
SA-코팅된 라텍스 입자를 갖는 현탁액 E 는 하기를 함유한다:
470 ng/ml 의 결합 능력을 갖는 SA-코팅된 자화가능 폴리스티렌 입자 0.72 mg/ml
실시예 2
금속 염 , 포스페이트 완충제 및 카르보네이트에 대한 카르보네이트 에스테르의 비교
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 총 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타낸다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 시약 조성물 (A) 는 각각 0.5 M 에틸렌 카르보네이트 (EC), 0.5 M Na2CO3, 0.5 M NaCl 또는 0.5 M NaH2PO4 를 함유한다.
시약 조성물 (A):
10 mM NaOH
4 mM EDTA
6.7 mM DTT
0.5 M 의, EC, Na2CO3, NaCl 또는 NaH2PO4
10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT 를 함유하는 시약 조성물 (A) 를 대조군으로서 사용하였다. 결과를 도 5 에 나타내었다. 알칼리 전처리 (시약 혼합물) 에 존재하는 카르보네이트 에스테르 (0.5 M EC (◆)) 는 경쟁적 검정에서 신호 증강 효과를 일으켰다. 특히, 신호 역학은 EC (□) 가 없는 시험에 비해 개선되었다. 염 (0.5 M NaCl (◇)) 은 효과를 나타내지 않았다. 0.5 M Na2CO3 (○) 또는 0.5 M NaH2PO4 (▲) 의 첨가는 신호에 대해 미미한 효과를 나타내었다.
실시예 3
카르보네이트 에스테르의 존재/부재 하의 알칼리 전처리
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타내었다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 하기를 함유하는 3 개의 상이한 시약 조성물을 제조하였다:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (실시예 1.5 참조) 또는
▲: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT 또는
□: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA.
샘플 + ◆ (실시예 1.5 에 기재된 바와 같은 시약 조성물 (A) + 알칼리화제 (B)), ▲, 또는 □ 각각 중 하나 (= 시약 혼합물) 의 4 분 전처리 인큐베이션 후, 그리고 용액 C 의 첨가 전에, 비스-트리스-프로판 (pH 6.3) 을 첨가하여 시약 혼합물의 pH 를 pH 9 로 설정하였다 (도 6). 알칼리 전처리 (시약 혼합물) 에 존재하는 카르보네이트 에스테르 EC 는 경쟁적 검정에서 신호 증강 효과를 일으켰다. 특히 신호 역학은 EC 가 없는 시험과 비교하여 개선되었다.
실시예 4
에틸렌 카르보네이트 대 디메틸 카르보네이트
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타내었다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 하기를 함유하는 2 개의 상이한 시약 조성물 (A) 를 제조하였다:
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (실시예 1.5 참조) 또는
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M 디메틸 카르보네이트.
각각의 카르보네이트 에스테르, 에틸렌 카르보네이트 또는 디메틸 카르보네이트 모두는 동일한 검정 성능을 나타내었다 (도 7).
실시예 5
에틸렌 카르보네이트의 가수분해 생성물의 효과
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타내었다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 하기를 함유하는 5 개의 상이한 시약 조성물 (A) 를 제조하였다:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (실시예 1.5 참조) 또는
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M NaHCO3 또는
▲: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M NaHCO3 + 0.5 M 에틸렌 글리콜
□: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT.
EC 의 알칼리 가수분해 생성물은 에틸렌 글리콜이고, 이는 검정에 영향을 미치지 않았다 (▲). 수소 카르보네이트 염 (NaHCO3) 은 또한 신호 증강 효과를 나타내었으나, 카르보네이트 에스테르만큼은 아니다 (도 8).
실시예 6
에틸렌 카르보네이트 대 글리세롤 1,2 카르보네이트
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타내었다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 하기를 함유하는 2 개의 상이한 시약 조성물 (A) 을 제조하였다:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (실시예 1.5 참조) 또는
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M 글리세롤 1,2 카르보네이트.
각각의 카르보네이트 에스테르, 에틸렌 카르보네이트 또는 글리세롤 1,2 카르보네이트 모두는 동일한 검정 성능을 나타내었다 (도 9).

Claims (14)

  1. 하기 단계를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시험관내 방법:
    a) 조사할 샘플을 제공하는 단계 및
    b) 단계 (a) 로부터의 샘플을,
    i) 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염을 함유하는 시약 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임),
    ii) 환원제, 및
    iii) 알칼리화제
    와 혼합하고, 그로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (i) 에 따른 시약이 알칼리 조건 하에 수용액에 가용성인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질이 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 히드록실화 또는 할로겐화 유도체인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 샘플이 액체 샘플인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장인 방법.
  6. 하기 단계를 포함하는, 비타민 D 화합물을 측정하기 위한 시험관내 방법:
    a) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키는 단계 및
    b) 단계 (a) 에서 방출된 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
  7. 제 6 항에 있어서, 비타민 D 화합물이 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3 , 24,25-디히드록시비타민 D2 , 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 비타민 D 화합물 25-히드록시비타민 D2 및/또는 25-히드록시비타민 D3 을 측정하는 방법.
  9. 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임) 및 환원제를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한 시약 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 환원제가 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), N-메틸말레이미드, 엘만 시약 (Ellman's Reagent) 및 1,2-디티올란-3-카르복실산으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서, 환원제가 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제의 농도가 2 mM 내지 30 mM 인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  13. 조사할 샘플, 가수분해시 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 하나의 수소 카르보네이트 염 (이때 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질로부터 방출된, 그리고 수소 카르보네이트 염으로부터의 수소 카르보네이트 이온 (HCO3 -) 의 총 농도는 0.1 M 내지 2.0 M 임), 환원제를 포함하는 시약 조성물, 및 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 로 이루어지는 군에서 선택되는 알칼리화제를 포함하는 시약 혼합물로서, 이때 상기 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장이고, 상기 알칼리화제의 농도가 0.1 M 내지 2.0 M 인 시약 혼합물.
  14. 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출시키기 위한, NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 로 이루어지는 군에서 선택되는 알칼리화제를 갖는 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 시약 조성물로서, 이때 상기 알칼리화제의 농도가 0.1 M 내지 2.0 M 인 시약 조성물.
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