JP6019530B2 - Peptide that inhibits interaction between HSF1 and RPA1 - Google Patents

Peptide that inhibits interaction between HSF1 and RPA1 Download PDF

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本発明は、ＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）と
の相互作用阻害活性を有するペプチドおよびこのペプチドをコードするＤＮＡや、かかるＤＮＡを含んだ組換えベクターや、かかるペプチドを含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤や、かかるペプチドを含んでなる抗腫瘍剤や、かかるペプチドに特異的に結合する抗体や、かかるペプチドを非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法や、抗腫瘍剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a peptide having inhibitory activity on the interaction between HSF1 (heat shock factor 1) and RPA1 (replication protein A 1), a DNA encoding this peptide, a recombinant vector containing such a DNA, and such a peptide. An inhibitor of interaction between HSF1 and RPA1 comprising, an antitumor agent comprising such a peptide, an antibody that specifically binds to such a peptide, and the administration of such a peptide to a non-human animal The present invention relates to tumor prevention / treatment methods and anti-tumor agent screening methods.

細胞は、細胞内のタンパク質の質と量を一定に保つ機構、つまりタンパク質ホメオスタシスの維持機構を有しており、維持機構は、主に、タンパク質が正しくフォールディングするのを介助する過程と、ミスフォールディングを行ったタンパク質を分解する過程からなる。この細胞内タンパク質のミスフォールディングに対する緩衝作用の容量は、タンパク質ホメオスタシス容量とよばれ、老化、神経疾患等のタンパク質ミスフォールディング病、さらにがんの発症と密接に関連していることが分ってきた。タンパク質ホメオスタシス容量の重要な調節機構の１つが熱ショック応答である。この応答は、タンパク質毒性を持つストレスに対して、タンパク質フォールディングや分解を担う熱ショックタンパク質であるＨＳＰ（heat shock protein）、及び、非ＨＳＰタンパク質の誘導を特徴とし、熱ショック因子であるＨＳＦ（heat shock factor）により転写のレベルで調節される。
ＨＳＦは哺乳動物細胞において３種類（ＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４）が明らかにされているが、このうち、ＨＳＦ１が、はじめてがん治療のターゲットとして示唆されたのは前立腺がんにおけるその発現上昇の発見にさかのぼる（非特許文献１）。この発見は特定のがんにおけるＨＳＦ１発現量とがんとの相関関係を示したものであり、特別な例と考えられていた。しかし、２００７年のＤａｉらの発見により、ＨＳＦ１はがん治療のターゲットとして大きな注目を集めることとなった（非特許文献２）。彼らは、様々ながん細胞株の増殖がＨＳＦ１ノックダウンにより顕著に抑制されることを示し、がん細胞の増殖がＨＳＦ１に依存することを示した。ここで重要なことは、正常な細胞増殖はＨＳＦ１のノックダウンの影響は受けず、これはがん細胞に特異的な作用であったことである。発明者らも、新しくメラノーマ細胞株の増殖がＨＳＦ１に依存することを明らかにした（非特許文献３）。つまり、ＨＳＦ１をターゲットとしてがん細胞の増殖を抑制する化合物を見いだすことができれば、がんの治療に大きく貢献できると考えられた。その後、大規模な臨床解析が行われ、乳がんや肝細胞がんの患者組織でもＨＳＦ１の活性化ががん細胞の悪性度と関連することが明らかとなってきた（非特許文献４、５）。 Cells have a mechanism that maintains the quality and quantity of proteins in the cell, that is, the maintenance mechanism of protein homeostasis, which is mainly a process that helps the protein to fold correctly and misfolding. It consists of the process of degrading the protein that was performed. This capacity of buffering action against intracellular protein misfolding is called protein homeostasis capacity and has been found to be closely related to protein misfolding diseases such as aging and neurological diseases, and to the development of cancer. . One important regulatory mechanism of protein homeostasis capacity is the heat shock response. This response is characterized by the induction of heat shock protein (HSP), which is a heat shock protein responsible for protein folding and degradation, and non-HSP protein against stress with protein toxicity, and HSF (heat shock factor) It is regulated at the transcription level by the shock factor).
Three types of HSF have been clarified in mammalian cells (HSF1, HSF2, and HSF4). Of these, HSF1 was first suggested as a target for cancer treatment. (Non-Patent Document 1). This discovery showed a correlation between HSF1 expression level and cancer in a specific cancer, and was considered a special example. However, with the discovery of Dai et al. In 2007, HSF1 attracted much attention as a target for cancer treatment (Non-patent Document 2). They showed that the growth of various cancer cell lines was significantly suppressed by HSF1 knockdown, and that the growth of cancer cells was dependent on HSF1. What is important here is that normal cell growth was not affected by HSF1 knockdown, which was specific to cancer cells. The inventors have also revealed that the growth of a new melanoma cell line is dependent on HSF1 (Non-patent Document 3). That is, if a compound that suppresses the growth of cancer cells with HSF1 as a target could be found, it was considered that it could greatly contribute to the treatment of cancer. Thereafter, large-scale clinical analysis has been conducted, and it has become clear that activation of HSF1 is associated with the malignancy of cancer cells even in patient tissues of breast cancer and hepatocellular carcinoma (Non-Patent Documents 4 and 5). .

しかしながら、今日までＨＳＦ１の活性を特異的に抑制する物質は見つかっていない。一般に、このような物質のスクリーニング方法として、熱ストレスを暴露した後の熱ショック遺伝子プロモーターを持つレポーターによるレポーターアッセイ法で調べるが、転写機構全般に作用する、あるいは他の経路に作用して細胞毒性がある場合などがあり、従来のスクリーニング系でＨＳＦ１を特異的にターゲットとする物質の同定が困難となっているのが現状である。近年、発明者らは、ＨＳＦ１とＲＰＡ１（replication protein A 1）の複合体はヌクレオソーム構造をとるＤＮＡにアクセスすることを明らかにしたが（非特許文献６）、この複合体とがん細胞の増殖との関係は全く明らかにされていなかった。   However, to date, no substance that specifically suppresses the activity of HSF1 has been found. In general, as a screening method for such substances, a reporter assay method using a reporter having a heat shock gene promoter after exposure to heat stress is examined, but it acts on the transcription mechanism in general or on other pathways to cytotoxicity. In some cases, it is difficult to identify substances that specifically target HSF1 in conventional screening systems. In recent years, the inventors have clarified that the complex of HSF1 and RPA1 (replication protein A 1) has access to DNA having a nucleosome structure (Non-patent Document 6). The relationship with was not clarified at all.

Hoang et al. Am. J. Pathol. 156, 857-864, 2000Hoang et al. Am. J. Pathol. 156, 857-864, 2000 Dai et al. Cell 130, 1005-1018, 2007Dai et al. Cell 130, 1005-1018, 2007 Nakamura et al. J. Dermatol. Sci. 60, 187-192, 2010Nakamura et al. J. Dermatol. Sci. 60, 187-192, 2010 Santagata et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 118 no.45, 18378-18383, 2011Santagata et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 118 no. 45, 18378-18383, 2011 Fang et al. Cancer 118 no.7, 1782-1794, 2012Fang et al. Cancer 118 no.7, 1782-1794, 2012 藤本ら、第３４回日本分子生物学会年会プログラムp161, 2011Fujimoto et al., 34th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan p161, 2011

ＨＳＦ１が、がん治療のターゲットとして大きな注目を集めているが、現在なおＨＳＦ１の活性を抑える物質は見出されていない。本発明の課題は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有する物質や、かかる物質を含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤や、かかる物質を含んでなる抗腫瘍剤や、かかる物質を非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法や、抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供することにある。   Although HSF1 has attracted much attention as a target for cancer treatment, no substance that suppresses the activity of HSF1 has been found yet. The subject of this invention is the substance which has interaction inhibitory activity of HSF1 and RPA1, the interaction inhibitor of HSF1 and RPA1 which contains such substance, the antitumor agent which contains such substance, and such substance It is intended to provide a method for preventing and treating tumors and a method for screening for antitumor agents, characterized by administering to a non-human animal.

ＨＳＦ１の活性を抑える物質の開発が急がれる中で、本発明者らは、ＨＳＦ１に相互作用するタンパク質とがんとの関係に着目し、ＨＳＦ１のｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘ-ｔｕｒｎ-ｈｅｌｉｘ型のＤＮＡ結合ドメイン（DNA-binding domain:DBD）のうち、ｗｉｎｇ領域がＲＰＡ１のｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ（ssDNA）結合ドメインと相互作用することを見出した。さらに、ＨＳＦ１におけるｗｉｎｇ領域のアミノ酸置換や、ＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸置換により、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との複合体の形成、つまりＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害すると、腫瘍細胞の一つであるメラノーマ細胞の増殖が顕著に抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。   In the urgent need of development of a substance that suppresses the activity of HSF1, the present inventors focused on the relationship between a protein that interacts with HSF1 and cancer, and the WSF's winged helix-turn-helix type DNA binding domain. It was found that the wing region of (DNA-binding domain: DBD) interacts with the single-strand DNA (ssDNA) binding domain of RPA1. Furthermore, inhibition of the formation of a complex of HSF1 and RPA1, that is, the interaction between HSF1 and RPA1, by amino acid substitution of the wing region in HSF1 or amino acid substitution of the ssDNA binding domain of RPA1 is one of tumor cells. The inventors have found that the proliferation of melanoma cells is remarkably suppressed, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、（１）（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；のいずれかのペプチド又はその塩や、（２）ペプチドが、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することを特徴とする上記（１）記載のペプチド又はその塩に関する。   That is, the present invention is (1) (A) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (B) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, excluding the fourth glycine residue of SEQ ID NO: 1, A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having an activity of inhibiting interaction between HSF1 (heat shock factor 1) and RPA1 (replication protein A 1); (C) sequence A peptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in No. 1 and having an activity of inhibiting interaction between HSF1 and RPA1; (D) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2 (E) an amino acid wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; A peptide having an inhibitory activity on the interaction between HSF1 and RPA1; (F) an amino acid sequence having at least 85% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and comprising HSF1 and RPA1 Any one of the peptides having the interaction inhibitory activity or a salt thereof, and (2) the peptide has an interaction inhibitory activity between the wing region of HSF1 and the ssDNA binding domain of RPA1 (1 ) The peptides or salts thereof described.

また、本発明は、（３）（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；のいずれかのペプチドをコードするＤＮＡや、（４）上記（３）記載のＤＮＡを含み、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドを発現することができる組換えベクターに関する。   The present invention also includes (3) (A) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (B) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, excluding the fourth glycine residue of SEQ ID NO: 1, A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having an activity of inhibiting interaction between HSF1 (heat shock factor 1) and RPA1 (replication protein A 1); (C) sequence A peptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in No. 1 and having an activity of inhibiting interaction between HSF1 and RPA1; (D) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2 (E) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; And (F) a peptide having inhibitory activity on the interaction between HSF1 and RPA1; (F) an amino acid sequence having at least 85% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a reciprocal relationship between HSF1 and RPA1 A peptide encoding any peptide of (4), and (4) the peptide described in (3) above, and a peptide having an interaction inhibitory activity between HSF1 and RPA1. Recombinant vector.

さらに、本発明は、（５）上記（１）又は（２）記載のペプチド又はその塩を含んでなるＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤や、（６）上記（１）又は（２）記載のペプチド又はその塩を含んでなる抗腫瘍剤や、（７）上記（１）又は（２）記載のペプチド又はその塩に特異的に結合する抗体や、（８）上記（１）又は（２）記載のペプチド又はその塩を非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法に関する。   Further, the present invention provides (5) an inhibitor of interaction between HSF1 and RPA1 comprising the peptide or salt thereof described in (1) or (2) above, or (6) the description in (1) or (2) above. An antitumor agent comprising the peptide or a salt thereof, (7) an antibody that specifically binds to the peptide or a salt thereof described in (1) or (2) above, (8) the above (1) or (2 The present invention relates to a method for preventing and treating tumors, which comprises administering the peptide or salt thereof described above to a non-human animal.

また、本発明は、（９）（Ａ）ＨＳＦ１とＲＰＡ１とを、被検物質の存在下に接触させ、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する工程；（Ｂ）対照と比較して前記相互作用阻害活性が高い被検物質を選択する工程；を順次備えたことを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法や、（１０）ＨＳＦ１とＲＰＡ１との接触が、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの接触であることを特徴とする、上記（９）記載のスクリーニング方法に関する。   The present invention also includes (9) (A) a step of contacting HSF1 and RPA1 in the presence of a test substance and detecting an interaction inhibitory activity between HSF1 and RPA1; A step of selecting a test substance having a high interaction inhibitory activity; and (10) a method of screening an antitumor agent, wherein (10) contact between HSF1 and RPA1 comprises the WSF1 wing region and RPA1 The screening method according to (9) above, wherein the screening method is a contact with the ssDNA binding domain.

本発明によると、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害することができるペプチドを提供することができ、また、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用体が腫瘍細胞の増殖にも関与することが明らかになったことから、前記ペプチドは抗腫瘍剤として用いることができる。さらに、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用部位が明らかになったことから、従来は細胞を用いたレポーターアッセイによるスクリーニング系であったものを、特異的なタンパク質相互作用をターゲットとするスクリーニング系にすることで、多くの化合物ライブラリーからの抗腫瘍剤のスクリーニングが短時間で可能となる。   According to the present invention, it is possible to provide a peptide capable of inhibiting the interaction between HSF1 and RPA1, and it becomes clear that the interaction between HSF1 and RPA1 is also involved in the growth of tumor cells. Therefore, the peptide can be used as an antitumor agent. Furthermore, since the interaction site between HSF1 and RPA1 has been clarified, a screening system that uses a reporter assay using cells as a screening system that targets specific protein interactions has been developed. Thus, screening of antitumor agents from many compound libraries becomes possible in a short time.

マウスＲＰＡ１の野生型及び欠損変異体とヒトＨＳＦ１との相互作用を調べた図である。上段は大腸菌で合成したＧＳＴ−マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及び欠損変異体（Ｎ１−Ｎ５，Ｃ１−Ｃ４）の構造を示し、数字はアミノ酸の位置を示す。下段はウエスタンブロッティングを行った結果を示す。It is the figure which investigated interaction with the mouse | mouth RPA1 wild type and a deletion mutant, and human HSF1. The upper row shows the structures of GST-mouse RPA1 wild type (GST-RPA1) and deletion mutant (N1-N5, C1-C4) synthesized in E. coli, and the numbers indicate the amino acid positions. The lower row shows the results of Western blotting. ヒトＨＳＦ１の野生型及び欠損変異体とマウスＲＰＡ１との相互作用を調べた図である。上段は合成したＧＳＴ−ＨＳＦ１の野生型（ＧＳＴ−ＨＳＦ１）、及び欠損変異体Ｎ１−Ｎ３，Ｃ１−Ｃ３）のアミノ酸領域を示し、数字はアミノ酸の位置を示す。図中、ＤＢＤはＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＤＮＡ結合ドメイン）、ＨＲはｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ（疎水性７アミノ酸繰り返し）、ＤＨＲはｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＨＲ−Ｃ（ＨＲ−Ｃの下流）を意味する。下段はウエスタンブロッティングを行った結果を示す。It is the figure which investigated the interaction of the wild type and deletion mutant of human HSF1, and mouse | mouth RPA1. The upper row shows the amino acid regions of the synthesized GST-HSF1 wild type (GST-HSF1) and deletion mutants N1-N3, C1-C3), and the numbers indicate the amino acid positions. In the figure, DBD means DNA binding domain (DNA binding domain), HR means hydrophobic heptad repeat (hydrophobic 7 amino acid repeat), and DHR means downstream of HR-C (downstream of HR-C). The lower row shows the results of Western blotting. 上段Ａは、ＲＰＡ１はヒトＨＳＦ１とともにＨＳＦ４と相互作用するがＨＳＦ２とは相互作用しないことを示す図である。下段Ｂは、ヒトＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列の比較を示す図である。Upper panel A shows that RPA1 interacts with HSF4 together with human HSF1, but does not interact with HSF2. The lower part B is a figure which shows the comparison of the amino acid sequence of the DNA binding domain of human HSF1, HSF2, and HSF4. ヒトＨＳＦ１はｗｉｎｇ領域を介してマウスＲＰＡ１と相互作用することを示す図である。Ａは、ＨＥＫ２９３細胞へｈＨＳＦ１−ＨＡあるいはその変異体の発現ベクターを導入して細胞抽出液を作製し、その後抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降したタンパク質を用いて抗ＲＰＡ抗体、あるいは抗ＨＡ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。Ｂは、ゲルシフトアッセイによるＤＮＡ活性を示す図である。Ｃは、真核細胞ＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を比較した結果を示す。It is a figure which shows that human HSF1 interacts with mouse | mouth RPA1 through a wing area | region. A is a method in which an expression vector of hHSF1-HA or a variant thereof is introduced into HEK293 cells to prepare a cell extract, followed by immunoprecipitation using an anti-HA antibody, and anti-RPA antibody using the precipitated protein, or It is a figure which shows the result of having performed Western blotting with the anti- HA antibody. B is a figure which shows the DNA activity by a gel shift assay. C shows the result of comparing the amino acid sequences of DNA binding domains of eukaryotic cells HSF1. ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体は遺伝子発現を調節することを示す図である。Ａは、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）において、ｍＨＳＦ１又はｍＲＰＡ１それぞれの遺伝子ノックダウン後にＤＮＡマイクアレイ解析を行った結果を示す。Ｂは、ノックダウンによって発現が２．０倍以下となる顕著な３３遺伝子を示す。Ｃは、発現変化が顕著な５つの遺伝子についてＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体への依存性を詳細に解析した結果を示す。FIG. 5 shows that the HSF1-RPA1 complex regulates gene expression. A shows the result of DNA microphone array analysis after knockdown of mHSF1 or mRPA1 in mouse fetal fibroblasts (MEF). B shows remarkable 33 genes whose expression is 2.0 times or less by knockdown. C shows the result of analyzing in detail the dependence on the HSF1-RPA1 complex for five genes with marked changes in expression. ＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用はがん細胞の増殖に必要であることを示す図である。ＨＭＶ−１細胞、ヒトメラノーマ細胞株であるＭｅＷｏ及びＨｅｌａ細胞においてＨＳＦ１をノックダウンした後、ｈＨＳＦ１又はｈＨＳＦ１の変異体を再導入した場合の細胞増殖結果を示す。It is a figure which shows that HSF1-RPA1 interaction is required for the proliferation of a cancer cell. The cell proliferation result when hSFF1 or a mutant of hHSF1 is reintroduced after knocking down HSF1 in HMV-1 cells, MeWo and Hela cells, which are human melanoma cell lines, is shown. マウスを用いて、ＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用と腫瘍形成の関係を示す図である。Ａは、代表的な腫瘍を形成したマウス及び摘出した腫瘍の写真（２８日後）を２個体ずつ示し、Ｂは、腫瘍の容量変化の時間経過を示し、（＊印は有為差を示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ検定））、Ｃは、腫瘍の重量（２８日後）を示す。Ｂａｒは平均値を示す。It is a figure which shows the relationship between HSF1-RPA1 interaction and tumor formation using a mouse | mouth. A shows two mice each of which formed a representative tumor and an excised tumor (after 28 days), B shows the time course of changes in tumor volume, and (* indicates a significant difference ( p <0.01, ANOVA test)), C indicates the weight of the tumor (after 28 days). Bar represents an average value. ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域あるいはＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインＡ−Ｂを含むポリペプチドはＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用に対して競合することを示す図である。Ａは、ＥＬＩＳＡ法によりＨＳＦ１-ＨｉｓとＧＳＴあるいはＧＳＴ-ＲＰＡ１の相互作用を定量化した結果を示し、Ｂは、ＨＳＦ１-ＨｉｓとＧＳＴ-ＲＰＡ１の相互作用に対するリコンビナントＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはその変異体ＲＰＡ１−ＡｒｏＡ（２２８−３９１）の競合活性を調べた結果であり、横軸の数字はＧＳＴ-ＲＰＡ１とＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはＲＰＡ１-ＡｒｏＡ（２２８−３９１）のモル比を示す。Ｃは、ＥＬＩＳＡ法によりＲＰＡ１-ＨｉｓとＨＳＦ１-Ｈｉｓの相互作用を定量化した結果を示し、Ｄは、ＲＰＡ１-ＨｉｓとＨＳＦ１−Ｈｉｓの相互作用に対するリコンビナントＨＳＦ１-ＤＢＤ-Ｈｉｓあるいはその変異体ＨＳＦ１-ＤＢＤＧ８７Ｓ-Ｈｉｓの競合活性を調べた結果を示す。横軸の数字はＨＳＦ１-ＨｉｓとＨＳＦ１-ＤＢＤ-ＨｉｓあるいはＨＳＦ１-ＤＢＤＧ８７Ｓ-ＨｉｓＲＰＡ１（２２８−３９１）のモル比を示す。Ｅは、ＲＰＡ１-ＨｉｓとＨＳＦ１−Ｈｉｓの相互作用に対する合成ポリペプチドＨＳＦ１-ｗｉｎｇあるいはその変異体ＨＳＦ１-ｗｉｎｇ-ｍｕ（ともに１３アミノ酸からなる）の競合活性を調べた結果を示す。横軸の数字はＨＳＦ１-ｗｉｎｇあるいはＨＳＦ１-ｗｉｎｇ-ｍｕのモル比を示す。Ｂ、Ｄ、Ｅともに＊はＰ＜０．０１を示している。It is a figure which shows that the polypeptide containing the wing area | region of HSF1 or the ssDNA binding domain AB of RPA1 competes for HSF1-RPA1 interaction. A shows the result of quantifying the interaction between HSF1-His and GST or GST-RPA1 by ELISA, and B shows the recombinant RPA1 (228-391) or its mutation with respect to the interaction between HSF1-His and GST-RPA1. It is the result of investigating the competitive activity of the body RPA1-AroA (228-391), and the numbers on the horizontal axis indicate the molar ratio of GST-RPA1 and RPA1 (228-391) or RPA1-AroA (228-391). C shows the result of quantifying the interaction between RPA1-His and HSF1-His by the ELISA method, and D shows the recombinant HSF1-DBD-His or its mutant HSF1-H with respect to the interaction between RPA1-His and HSF1-His. The result of having investigated the competitive activity of DBDG87S-His is shown. The numbers on the horizontal axis indicate the molar ratio of HSF1-His and HSF1-DBD-His or HSF1-DBDG87S-HisRPA1 (228-391). E shows the results of examining the competitive activity of the synthetic polypeptide HSF1-wing or its mutant HSF1-wing-mu (both consisting of 13 amino acids) for the interaction between RPA1-His and HSF1-His. The numbers on the horizontal axis indicate the molar ratio of HSF1-wing or HSF1-wing-mu. For all of B, D, and E, * indicates P <0.01. ＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体による遺伝子発現制御の分子機構を示す図である。ストレスを受けていない正常な細胞内には主に非ＤＮＡ結合型の単量体ＨＳＦ１が存在するが、一部（数パーセント）はＤＮＡ結合型の三量体も存在する。この三量体ＨＳＦ１は単独ではＨＳＥと一過性に結合しても、ヌクレオソームの存在のために安定に結合できない。しかし、ＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体はヒストンシャペロンＦＡＣＴやクロマチン再構成因子であるＢＲＧ１複合体を引き込むことでヌクレオソームを除き、安定に結合できる。その結果、ＨＳＦ１の活性化ドメインを介して転写開始前複合体とともにＲＮＡポリメラーゼIIが引き込まれて構成的な転写が進行する。がん細胞ではこの構成的な転写に依存して細胞が増殖できる。It is a figure which shows the molecular mechanism of gene expression control by a HSF1-RPA complex. In non-stressed normal cells, there are mainly non-DNA-binding monomeric HSF1, but some (several percent) also have DNA-binding trimers. Even when this trimeric HSF1 alone binds transiently to HSE, it cannot bind stably due to the presence of nucleosomes. However, the HSF1-RPA complex can bind stably except for the nucleosome by drawing in the histone chaperone FACT and the BRG1 complex that is a chromatin reconstituting factor. As a result, RNA polymerase II is drawn together with the pre-transcriptional complex through the activation domain of HSF1, and constitutive transcription proceeds. Cancer cells can grow depending on this constitutive transcription.

本発明のペプチドとしては、（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドであれば、特に限定されない。
ここで、「ＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用阻害活性を有するペプチド」は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用を阻害する活性を有するペプチドであれば、その具体的な作用機構は特に限定されないが、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することが好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することがより好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１の２３８位若しくは２６９位との相互作用阻害活性を有することが特に好ましい。また、本発明において「相互作用」とは、「タンパク質分子間での非共有結合による複合体形成」を意味する。 Examples of the peptide of the present invention include (A) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (B) one or a number excluding the fourth glycine residue of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. A peptide comprising an amino acid sequence in which one amino acid is deleted, substituted or added, and having an activity of inhibiting interaction between HSF1 and RPA1, (C) at least 90% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 A peptide having an inhibitory activity on interaction between HSF1 and RPA1, (D) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and (E) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. And consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and HS (F) a peptide having an inhibitory activity on the interaction between RPA1 and (F) comprising an amino acid sequence having at least 85% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and having an inhibitory activity on the interaction between HSF1 and RPA1 If it is a peptide which has, it will not specifically limit.
Here, the specific action mechanism of the “peptide having inhibitory activity of interaction between HSF1 and RPA1” is not particularly limited as long as it is a peptide having an activity that inhibits the interaction between HSF1 and RPA1. It preferably has an interaction inhibitory activity between the region and the ssDNA binding domain of RPA1, more preferably has an interaction inhibitory activity between glycine at position 87 of HSF1 and the ssDNA binding domain of RPA1, and glycine at position 87 of HSF1. It is particularly preferable to have an activity of inhibiting interaction between RPA1 and 238 or 269. In the present invention, “interaction” means “complex formation by non-covalent bond between protein molecules”.

本発明における配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ヒトＨＳＦ１タンパク質の８４位から９６位のアミノ酸配列に相当し、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ヒトＲＰＡ１タンパク質の２２８位から３９１位のアミノ酸配列に相当する。   The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the present invention corresponds to the amino acid sequence from positions 84 to 96 of human HSF1 protein, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acids from positions 228 to 391 of human RPA1 protein. Corresponds to an array.

本発明のペプチドには、１）配列番号１の４番目のグリシン（ヒトＨＳＦ１タンパク質の８７位に相当するグリシン）残基を除くアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドや、２）配列番号２の１１番目若しくは４２番目のフェニルアラニン（ヒトＲＰＡ１タンパク質の２３８位若しくは２６９位に相当するフェニルアラニン）を除くアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜５個、中でも１〜３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなり、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害する活性を有するものも含まれ、これらペプチドは、当該アミノ酸配列情報や当該アミノ酸をコードする塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。   In the peptide of the present invention, 1) 1 or several amino acid sequences in the amino acid sequence excluding the fourth glycine (glycine corresponding to position 87 of human HSF1 protein) residue of SEQ ID NO: 1, preferably 1 to 2, more preferably Is a peptide consisting of an amino acid sequence in which one amino acid is deleted, substituted or added, or 2) 11th or 42nd phenylalanine of SEQ ID NO: 2 (phenylalanine corresponding to position 238 or 269 of human RPA1 protein) It consists of a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, especially 1 to 3 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence excluding HSF1 and Also included are those having an activity of inhibiting the interaction with RPA1, and these peptides It can be appropriately prepared or obtained by those skilled in the art based on the information of nucleotide sequence encoding the amino acid sequence information and the amino acid.

本発明のペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、本発明のペプチドは、化学合成したペプチドでも、ＤＮＡ組換え技術により作製した組み換えペプチドの何れでもよい。化学合成によりペプチドを調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成することもできる。ＤＮＡ組換え技術によりペプチドを調製する場合には、該ペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のペプチドを調製することができる。   The method for obtaining and preparing the peptide of the present invention is not particularly limited, and the peptide of the present invention may be either a chemically synthesized peptide or a recombinant peptide produced by a DNA recombination technique. When a peptide is prepared by chemical synthesis, for example, the peptide of the present invention can be synthesized according to a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) or the like. it can. Moreover, the peptide of this invention can also be synthesize | combined using various commercially available peptide synthesizers. When a peptide is prepared by a DNA recombination technique, the peptide of the present invention can be prepared by introducing DNA consisting of a base sequence encoding the peptide into a suitable expression system.

本発明のペプチドは、必要に応じて、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させ、融合ペプチドとすることができる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。
かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。 If necessary, the peptide of the present invention can be combined with a marker protein and / or a peptide tag to form a fusion peptide. The marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein. Specific examples include an enzyme such as alkaline phosphatase and HRP, an Fc region of an antibody, and a fluorescent substance such as GFP. As peptide tags, known peptide tags such as epitope tags such as HA, FLAG, and Myc, and affinity tags such as GST, maltose-binding protein, biotinylated peptide, oligohistidine, etc. It can be illustrated.
Such a fusion peptide can be prepared by a conventional method. Purification of the peptide of the present invention utilizing the affinity between Ni-NTA and His tag, detection of the peptide of the present invention, and quantification of an antibody against the peptide of the present invention It is also useful as a research reagent in this field.

本発明においてペプチドの塩としては、薬理学上許容される塩であれば特に制限されるものではなく、本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害する活性を有するペプチドの塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機塩；酢酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等を例示することができる。   In the present invention, the salt of the peptide is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable salt, and the hydrochloride and sulfate of the peptide having the activity of inhibiting the interaction between HSF1 and RPA1 of the present invention And inorganic salts such as phosphates; organic acid salts such as acetates and citrates; alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts it can.

本発明のＤＮＡは、（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドからなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド、のいずれかのペプチドをコードするＤＮＡであれば特に限定されない。ここで、「ＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用阻害活性を有するペプチド」は、前述した通りである。
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離する、あるいは常法に従って化学合成により調製することができる。 The DNA of the present invention comprises (A) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (B) one or several of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 excluding the fourth glycine residue of SEQ ID NO: 1. A peptide consisting of an amino acid sequence in which the amino acid is deleted, substituted or added, and having an activity of inhibiting the interaction between HSF1 and RPA1, (C) at least 90% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 A peptide comprising an amino acid sequence having homology and having an activity of inhibiting the interaction between HSF1 and RPA1, (D) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (E) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and HSF1 and R A peptide having an inhibitory activity on interaction with A1, (F) a peptide comprising an amino acid sequence having at least 85% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an inhibitory activity on interaction between HSF1 and RPA1 If it is DNA which codes any peptide of these, it will not specifically limit. Here, “a peptide having an interaction inhibiting activity between HSF1 and RPA1” is as described above.
The method for obtaining and preparing the DNA of the present invention is not particularly limited, and an appropriate probe or primer is prepared based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 disclosed in the present specification. They can be used to isolate a target DNA by screening a cDNA library in which the DNA is expected to exist, or can be prepared by chemical synthesis according to a conventional method.

具体的には、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明のＤＮＡに特有の適当なプローブをその塩基配列情報に基づいて作製し、かかるプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、ヒト、マウス、ラット等の動物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。   Specifically, a cDNA library is prepared according to a conventional method, and then an appropriate probe specific to the DNA of the present invention is prepared from the library based on the nucleotide sequence information. The DNA of the present invention can be obtained by selecting. Examples of the origin of the cDNA include various cells or tissues derived from animals such as humans, mice, rats and the like. In addition, isolation of total RNA from these cells or tissues, isolation and purification of mRNA, cDNA Both acquisition and cloning thereof can be performed according to conventional methods. Examples of the method for screening the DNA of the present invention from a cDNA library include methods commonly used by those skilled in the art, such as the method described in Molecular Cloning Second Edition.

本発明のＤＮＡとして、上記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのペプチドをコードする限りは、配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号３に示される塩基配列と９０％以上相同性を有し、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号４に示される塩基配列と８５％以上相同性を有し、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができるが、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするヒト由来のＤＮＡの塩基配列である配列番号３に示すＤＮＡや、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするヒト由来のＤＮＡの塩基配列である配列番号４に示すＤＮＡを挙げることができる。   As long as the DNA of the present invention encodes any of the peptides (A) to (F) above, substitution, deletion, insertion of one or several bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, or DNA encoding a peptide having an added base sequence and having an activity of inhibiting the interaction between HSF1 and RPA1, or having a homology of 90% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and HSF1 and RPA1 A peptide encoding a peptide having an activity that inhibits interaction with DNA, or a peptide that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and has an activity that inhibits interaction between HSF1 and RPA1 1 or a base substitution, deletion, insertion, or addition of one or several bases in DNA encoding SEQ ID NO: 4 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 DNA encoding a peptide having a sequence and inhibiting the interaction between HSF1 and RPA1, and having a homology of 85% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and interaction between HSF1 and RPA1 DNA encoding a peptide having inhibitory activity, or DNA encoding a peptide hybridizing under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having interaction inhibitory activity between HSF1 and RPA1 Preferably, it consists of the DNA shown in SEQ ID NO: 3 which is the base sequence of human-derived DNA encoding the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Examples of the DNA shown in SEQ ID NO: 4, which is the base sequence of human-derived DNA encoding the peptide Can.

上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加された塩基配列を意味する。
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡであって、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができ、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。 The above “base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, inserted, or added” is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably It means a base sequence in which any number of 1 to 5 bases is substituted, deleted, inserted or added.
The above-mentioned “DNA that encodes a peptide that hybridizes under stringent conditions and has an activity of inhibiting the interaction between HSF1 and RPA1” means that a nucleic acid such as DNA or RNA is used as a probe. It means DNA obtained by using a hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like, and encoding a peptide having an activity of inhibiting interaction between HSF1 and RPA1.
Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition, etc. DNA that can be hybridized under stringent conditions is the same as the base sequence of DNA used as a probe. DNA having the above homology can be mentioned, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98%. A DNA having the above homology can be preferably exemplified.

本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを１種以上含み、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチドを発現する組換えベクターであれば特に制限されない。本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができ、本発明の遺伝子を適切なプロモーターの下流につないだコンストラクトを好適に例示することができる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、酵母用発現ベクター、細菌用発現ベクター等を用いることができるが、動物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。 The recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it is a recombinant vector that contains one or more of the DNAs of the present invention and expresses a peptide having an activity of inhibiting interaction between HSF1 and RPA1. The recombinant vector of the present invention can be constructed by appropriately integrating the DNA of the present invention into an expression vector, and a construct in which the gene of the present invention is connected downstream of an appropriate promoter is preferably exemplified. it can.
The expression vector is preferably one that can replicate autonomously in the host cell, or one that can be integrated into the chromosome of the host cell, and controls a promoter, enhancer, terminator, etc. at a position where the DNA of the present invention can be expressed. Those containing the sequence can be preferably used. As an expression vector, an animal cell expression vector, a yeast expression vector, a bacterial expression vector, or the like can be used, and a recombinant vector using an animal cell expression vector is preferred.

動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、pcDNA3（Stratagene社製）、pCMV-FLAG6a（Sigma-Aldrich社製)、pEGFP-C3（Clontech社製)、pcDM8（フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133, 1990〕、pAS3-3（特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840, 1987〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社製)、pREP4（Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Biochem., 101, 1307, 1987〕、pAGE210等を例示することができる。
動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトＣＭＶ)のＩＥ（immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。 Examples of expression vectors for animal cells include pcDNA3 (manufactured by Stratagene), pCMV-FLAG6a (manufactured by Sigma-Aldrich), pEGFP-C3 (manufactured by Clontech), pcDM8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [ -22979; Cytotechnology, 3, 133, 1990], pAS3-3 (JP-A-2-27075), pCDM8 (Nature, 329, 840, 1987), pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), Examples include pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307, 1987], pAGE210, and the like.
Examples of promoters for animal cells include cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SRα promoter, etc. Can do.

酵母用の発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。
酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。 Examples of expression vectors for yeast include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp5O (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
Examples of the promoter for yeast include promoters such as PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, and CUP1 promoter.

細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもべーリンガーマンハイム社より市販)、pGEX4T(AmershamBioscience社製)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669, 1984〕、PLSA1〔Agric. Bio1. Chem., 53, 277, 1989〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306, 1985〕、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagen社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pQE-30(QIAGEN社製)等が挙げられる。
細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。 As an expression vector for bacteria, for example, pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all commercially available from Boehringer Mannheim), pGEX4T (manufactured by Amersham Bioscience), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pQE-30 (QIAGEN), pKYP10 (JP-A-58-110600), pKYP200 (Agrc. Biol. Chem., 48, 669, 1984), PLSA1 (Agric. Bio1. Chem., 53, 277, 1989), pGEL1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306, 1985), pBluescriptIISK (+), pBluescriptIISK (-) (Stratagen PTrS30 (FERMBP-5407), pTrS32 (FERM BP-5408), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen), pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pSTV28 (Takara Shuzo), pSTV29 (Takara Shuzo), pUC118 (Takara Shuzo), pQE-30 (QIAGEN).
Examples of the promoter for bacteria include promoters derived from Escherichia coli and phage, such as trp promoter (P trp), lac promoter (P lac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter, SP01 promoter, SP02 promoter, penP A promoter etc. can be mentioned.

本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤としては、本発明のペプチドを含むものであれば特に制限されず、本発明のペプチドを有効成分として含むものでもよい。必要に応じて、その他の成分などを適宜選択することができる。   The interaction inhibitor between HSF1 and RPA1 of the present invention is not particularly limited as long as it contains the peptide of the present invention, and may contain the peptide of the present invention as an active ingredient. If necessary, other components can be appropriately selected.

本発明の抗腫瘍剤としては、上記本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤を含んでなるものであれば特に制限されず、「抗腫瘍剤」には、抗腫瘍組成物が含まれ、予防剤、予後改善剤、治療剤、再発防止剤も含まれる。さらに、本発明の抗腫瘍剤を有効成分として含むものでもよい。   The antitumor agent of the present invention is not particularly limited as long as it comprises the above-described interaction inhibitor of HSF1 and RPA1 of the present invention, and “antitumor agent” includes an antitumor composition. , Prophylactic agents, prognosis improving agents, therapeutic agents, and recurrence preventing agents are also included. Furthermore, the antitumor agent of the present invention may be included as an active ingredient.

本発明の抗腫瘍剤の対象となる「がん」としては、特に制限されないが、例えば食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、肝臓がん、すい臓がん、胆のう・胆管がん等の消化器がん；悪性黒色腫；肺がん；乳がん；卵巣がん；子宮がん；腎がん；前立腺がん等を例示することができる。このように幅広い「がん」が対象となることは、これまでにＨＳＦ１の活性阻害が、乳腺上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、前立腺上皮細胞、末梢神経鞘細胞、腎上皮細胞、色素細胞等の様々なヒトがん由来の細胞株の増殖を顕著に抑制すること、及びヒト前立腺がん、乳がん、肝細胞がんの組織でＨＳＦ１の活性が増強していることが明らかとなっていることから裏付けられる。つまり、ＨＳＦ１の活性の増強が多くのがんの発症および進展を促進しているためである。一般に、がん細胞は細胞内タンパク質の代謝が亢進していると考えられており、タンパク質ホメオスタシスの維持を担うＨＳＦ１の働きの増強を必要としていると考えられているため、本発明が様々な「がん」の抗腫瘍剤となりうる。   “Cancer” as a target of the antitumor agent of the present invention is not particularly limited. For example, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder / bile duct cancer Examples include digestive organ cancer such as malignant melanoma, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, kidney cancer, and prostate cancer. This wide range of “cancer” is targeted because HSF1 activity inhibition has so far been limited to mammary epithelial cells, cervical epithelial cells, prostate epithelial cells, peripheral nerve sheath cells, renal epithelial cells, pigment cells, etc. Has been shown to significantly suppress the growth of various human cancer-derived cell lines and to enhance the activity of HSF1 in human prostate cancer, breast cancer, and hepatocellular carcinoma tissues. It is supported from. That is, the enhancement of HSF1 activity promotes the onset and progression of many cancers. In general, cancer cells are thought to have increased intracellular protein metabolism and are thought to require enhancement of the function of HSF1 responsible for maintaining protein homeostasis. It can be an antitumor agent for "cancer".

これらの抗腫瘍剤を用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射剤として非経口投与することができ、上記ペプチドを２種類以上用いてもよい。   When these antitumor agents are used, usual pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, etc. Various formulation ingredients such as tonicity agents can be added. These therapeutic agents can be administered orally or parenterally, for example, can be administered orally in a dosage form such as powder, granules, tablets, capsules, syrups, suspensions, etc., or For example, a dosage form such as an emulsion or suspension can be administered parenterally as an injection, and two or more of the above peptides may be used.

本発明の抗体としては、上記本発明のペプチド又はその塩に特異的に結合する抗体であれば特に制限はされず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは本発明のペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。
本発明の抗体は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用部位に特異的に結合することにより、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を特異的に阻害することが考えられる。また、本発明の抗体は、上記本発明のペプチドとの抗原抗体反応により、組織細胞、血清などにおけるＨＳＦ１又はＲＰＡ１遺伝子にかかわる疾患の検出に用いることができる。本発明の抗体を用いた免疫学的測定には、例えばＲＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＦＲＥＴ法等公知の免疫学的測定法を用いることができる。 The antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically binds to the peptide of the present invention or a salt thereof, such as a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, a humanized antibody, etc. Specific examples include immunospecific antibodies, and these can be prepared by a conventional method using the peptide of the present invention as an antigen. Among them, a monoclonal antibody is more preferable in terms of its specificity.
It is considered that the antibody of the present invention specifically inhibits the interaction between HSF1 and RPA1 by specifically binding to the interaction site between HSF1 and RPA1. In addition, the antibody of the present invention can be used for detection of diseases related to HSF1 or RPA1 gene in tissue cells, serum, etc., by antigen-antibody reaction with the peptide of the present invention. For immunological measurement using the antibody of the present invention, known immunological measurement methods such as RA method, ELISA method and FRET method can be used.

また、本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のペプチドを含むその断片、又は本発明のペプチドを膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）oyobiEBV-haiburido-mahou (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, 77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985)など任意の方法を用いることができる。   In addition, the antibody of the present invention is produced by administering a fragment containing the peptide of the present invention or a cell expressing the peptide of the present invention on the membrane surface to an animal (preferably non-human) using a conventional protocol. For example, for the preparation of monoclonal antibodies, the hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), the trioma method, the human B cell hybridoma method (Immunology Today 4, 72, 1983) oyobiEBV-haiburido-mahou (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) can be used.

本発明の腫瘍の予防・治療法は、上記本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤を非ヒト動物に投与する方法であり、異なる態様の腫瘍の予防・治療法として本発明のＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害剤をヒトに投与する方法を挙げることができる。
投与方法としては、注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入などを挙げることができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。また、選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。また、投与量も適宜選択することができる。 The tumor prevention / treatment method of the present invention is a method of administering the above-described interaction inhibitor of HSF1 and RPA1 of the present invention to a non-human animal. A method of administering an interaction inhibitor with RPA1 to a human can be mentioned.
Examples of the administration method include injection (intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc.), oral, transdermal, inhalation and the like, and can be appropriately formulated depending on these administration methods. . Also, the dosage form that can be selected is not particularly limited. For example, injections (solutions, suspensions, emulsions, solid agents for dissolution at the time of use), tablets, capsules, granules, powders, liquids, lipoformation Can be widely selected from agents, ointments, gels, powders for external use, sprays, inhaled powders and the like. In addition, in preparing these preparations, conventional excipients, stabilizers, binders, lubricants, emulsifiers, osmotic pressure adjusting agents, pH adjusting agents, other colorants, disintegrating agents, etc. Can be used. In addition, the dose can be appropriately selected.

本発明の抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、（Ａ）ＨＳＦ１とＲＰＡ1とを、被検物質の存在下に接触させ、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する工程；（Ｂ）対照と比較して前記相互作用阻害活性が高い被検物質を選択する工程；を順次備えていれば特に制限されないが、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との接触が、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの接触であることが好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの接触であることがより好ましく、ＨＳＦ１の８７位のグリシンとＲＰＡ１の２３８位若しくは２６９位のフェニルアラニンとの接触であることが特に好ましい。
このような本発明のスクリーニング方法によれば、抗腫瘍剤を効率良くスクリーニングすることができる。被検物質の存在下で、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法やＦＲＥＴ法を挙げることができる。 The method for screening an antitumor agent of the present invention comprises (A) a step of contacting HSF1 and RPA1 in the presence of a test substance, and detecting an interaction inhibitory activity between HSF1 and RPA1; The step of selecting a test substance having a high interaction inhibitory activity is not particularly limited as long as it comprises the steps of the following: the contact between HSF1 and RPA1 is the contact between the wing region of HSF1 and the ssDNA binding domain of RPA1. More preferably, it is a contact between glycine at position 87 of HSF1 and the ssDNA binding domain of RPA1, and it is a contact between glycine at position 87 of HSF1 and phenylalanine at position 238 or 269 of RPA1. Particularly preferred.
According to such a screening method of the present invention, an antitumor agent can be efficiently screened. Examples of the method for detecting the interaction inhibitory activity between HSF1 and RPA1 in the presence of a test substance include an ELISA method and a FRET method.

上記ＥＬＩＳＡ法を用いる検出方法を以下に示す。
１）ライブラリーの化合物をリコンビナントタンパク質とともに一定の濃度でＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレートに添加し、吸光度を測定してＨＳＦ１とＲＰＡ１の相互作用と競合する活性があるかどうかを調べ、次に、競合活性を認めたものについて、濃度を変えて活性を調べる方法が挙げられる。
２）ヒトメラノーマ細胞（ＨＭＶ-１、ＭｅＷｏ）は、ＨＳＦ１のノックダウンによる細胞増殖が顕著に阻害される。この細胞に、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用への競合活性をもつ化合物を添加して、細胞増殖を評価する方法、あるいはヌードマウスにヒトメラノーマ細胞等を接種して腫瘍を作らせる実験系を用いて、マウスに化合物を投与して腫瘍増殖をｉｎ ｖｉｖｏで評価する方法が挙げられる。 A detection method using the ELISA method is shown below.
1) A compound of the library is added to the 96-well plate for ELISA at a constant concentration together with the recombinant protein, and the absorbance is measured to determine whether it has an activity that competes with the interaction between HSF1 and RPA1, and then the competition For those whose activity is recognized, there is a method of examining the activity by changing the concentration.
2) In human melanoma cells (HMV-1, MeWo), cell proliferation due to HSF1 knockdown is significantly inhibited. Using a method for evaluating cell proliferation by adding a compound having a competitive activity to HSF1-RPA1 interaction to these cells, or using an experimental system in which nude mice are inoculated with human melanoma cells, etc. Examples include a method of evaluating a tumor growth in vivo by administering a compound to a mouse.

また、ＦＲＥＴ法を用いる検出方法を以下に示す。
１）Ｈｉｓ−ＨＳＦ１、及びＧＳＴ−ＲＰＡ１の精製リコンビナントタンパク質を準備し、テルビウム（Ｔｂ）標識抗Ｈｉｓ抗体でＨＳＦ１を色素標識し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＧＳＴ抗体でＲＰＡ１を色素標識する。そして、ＴｂとＡＰＣとの蛍光相互作用を、ＴｅｃａｎインフィニットＭ１０００モノクロメーター方式プレートリーダーを用いて検出装置で取得する。ＨＳＦ１とＲＰＡ１のリコンビナントタンパク質は、相互作用部位を含むいくつかの断片を作成し、蛍光相互作用が最適なものを同定することでＴＲ−ＦＲＥＴ法を確立する。次に、化合物ライブラリーの中から蛍光相互作用を阻害するものをスクリーニングする。
２）がん細胞の増殖における活性の評価はＥＬＩＳＡ法のときと同様に行うことができる。 A detection method using the FRET method is shown below.
1) Purified recombinant proteins of His-HSF1 and GST-RPA1 are prepared, HSF1 is dye-labeled with a terbium (Tb) -labeled anti-His antibody, and RPA1 is dye-labeled with an allophycocyanin (APC) -labeled anti-GST antibody. Then, the fluorescence interaction between Tb and APC is acquired by a detection apparatus using a Tecan Infinite M1000 monochromator plate reader. Recombinant proteins of HSF1 and RPA1 create several fragments containing interaction sites, and identify the optimal fluorescent interaction to establish the TR-FRET method. Next, those that inhibit the fluorescence interaction are screened from the compound library.
2) Evaluation of the activity in the growth of cancer cells can be carried out in the same manner as in the ELISA method.

以下に、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施
例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail using examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.

［ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体の形成領域］
これまでに、本発明者らは、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用によるＨＳＦ1−ＲＰＡ１複合体が存在し、ヌクレオソーム構造をとるＤＮＡに結合できることを明らかにしている（藤本ら、「ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体はヌクレオソーム構造をとるＤＮＡにアクセスする」、第３４回日本分子生物学会年会プログラムp161, 2011）。今回、ＨＳＦ１とＲＰＡ１とがどの領域を介して相互作用するかを以下の方法により詳細に検討した。 [Formation region of HSF1-RPA1 complex]
So far, the present inventors have revealed that an HSF1-RPA1 complex due to the interaction between HSF1 and RPA1 exists and can bind to DNA having a nucleosome structure (Fujimoto et al., “HSF1-RPA1 complex”). Accesses DNA with nucleosome structure ", 34th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, Program p161, 2011). This time, the region through which HSF1 and RPA1 interact was examined in detail by the following method.

（１）発現ベクターの構築
大腸菌でのＧＳＴ融合タンパク質の発現ベクターを構築するために、ｈＨＳＦ１（ACCESSION番号；NM_005526 XM_937718、VERSION番号；NM_005526.2 GI:132626772）、ｈＨＳＦ１の変異体（ＨＳＦ１−Ｎ１、ＨＳＦ１−Ｎ２、ＨＳＦ１−Ｎ３、ＨＳＦ１−Ｃ１、ＨＳＦ１−Ｃ２、ＨＳＦ１−Ｃ３）（配列番号５〜１１）、マウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）、ｍＲＰＡ１の変異体（ＲＰＡ１−Ｎ１、ＲＰＡ１−Ｎ２、ＲＰＡ１−Ｎ３、ＲＰＡ１−Ｎ４、ＲＰＡ１−Ｎ５、ＲＰＡ１−Ｃ１、ＲＰＡ１−Ｃ２、ＲＰＡ１−Ｃ３、ＲＰＡ１−Ｃ４）（配列番号１２〜２１）。のｃＤＮＡをpGEX-2Tベクター（GE Healthcare社製）へ挿入したまた、Ｃ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）標識したタンパク質の発現ベクターの構築のために、ｃＤＮＡをpET21a（Novagen社製）へ挿入した。 (1) Construction of expression vector In order to construct an expression vector of GST fusion protein in E. coli, hHSF1 (ACCESSION number; NM_005526 XM_937718, VERSION number; NM_005526.2 GI: 132626772), hHSF1 mutant (HSF1-N1, HSF1-N2, HSF1-N3, HSF1-C1, HSF1-C2, HSF1-C3) (SEQ ID NOs: 5 to 11), mouse RPA1 (mRPA1), mRPA1 variants (RPA1-N1, RPA1-N2, RPA1-N3) RPA1-N4, RPA1-N5, RPA1-C1, RPA1-C2, RPA1-C3, RPA1-C4) (SEQ ID NOs: 12 to 21). The cDNA was inserted into pGEX-2T vector (manufactured by GE Healthcare) and the cDNA was inserted into pET21a (manufactured by Novagen) in order to construct an expression vector for a protein labeled with histidine (His) at the C-terminus.

（２）共沈降
発現ベクターを導入された大腸菌にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を０．２ｍＭまたは０．４ｍＭとなるように加え、３７℃で２時間または２５℃で１０時間インキュベートし、リコンビナントタンパク質を誘導した。その抽出液から、Glutathione Sepharose 4B（GE Healthcare社製）、あるいはNi Sepharose6 Fast Flow（GE Healthcare社製）のアフィニティーカラムを用いてＧＳＴあるいはＨｉｓ標識されたリコンビナントタンパク質を精製した。それらをＮＴバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＮＰ４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ ｓｔａｔｉｎ）の中で混合し、Glutathione Sepharose 4BカラムでＧＳＴ融合タンパク質とともに共沈降するＨｉｓ標識タンパク質をＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４、あるいはＲＰＡ１によるウエスタンブロッティングにより検出した。沈降してきたＧＳＴタンパク質はＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。 (2) Coprecipitation Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to Escherichia coli into which the expression vector was introduced so as to be 0.2 mM or 0.4 mM, and at 37 ° C. for 2 hours or at 25 ° C. Incubate for 10 hours to induce recombinant protein. From the extract, recombinant protein labeled with GST or His was purified using an affinity column of Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare) or Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare). They are mixed in NT buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP40, 1 mM PMSF, 1 μg / ml leupeptin, 1 μg / ml statin) on a Glutathione Sepharose 4B column. His-tagged proteins co-precipitated with the GST fusion protein were detected by Western blotting with HSF1, HSF2, HSF4 or RPA1. The precipitated GST protein was detected by Western blotting using a GST antibody (sc-33613, manufactured by Santa Cruz).

（３）ＨＳＦ１とＰＲＡ１との共沈降結果
大腸菌で合成したＧＳＴ−マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及びＧＳＴ−マウスＲＰＡ１欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ１〜Ｎ５、ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ４）を精製し、同じく大腸菌で合成して精製したヒトＨＳＦ１（ＨＳＦ１−Ｈｉｓ）を混合し、Glutathione-sepharose 4BカラムでＧＳＴ融合ＲＰＡ１タンパク質を沈降し、ＨＳＦ１−Ｈｉｓが共沈降するかどうか調べた（GST-pull down assay）。沈降してきたタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＨＳＦ１抗体（α−ｍＨＳＦ１ｊ）または抗ＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。抗ＨＳＦ１抗体は、以下の文献の記載に従って作成した（Fujimoto et al., J. Biol. Chem.283, 29961-29970, 2008）。
図１上段に大腸菌で合成したＧＳＴ−マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及び欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ１〜Ｎ５，ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ４）の構造を示し、図１下段にウエスタンブロッティングの結果を示す。ウエスタンブロッティングの結果より、Ｎ４、Ｎ５、Ｃ３、Ｃ４では抗ＨＳＦ１抗体によるバンドが検出されず、ＨＳＦ１が共沈降していなかった。従って、図１のＣ４の右下に記載した横線に示すように、マウスＲＰＡ１の１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン（ｓｓＤＮＡ結合ドメイン）Ａ−Ｂにおける２２８位から３９１位のアミノ酸がヒトＨＳＦ１と相互作用することが明らかとなった。 (3) Co-precipitation result of HSF1 and PRA1 GST-mouse RPA1 wild type (GST-RPA1) synthesized in E. coli and GST-mouse RPA1 deletion mutants (GST-N1 to N5, GST-C1 to C4) Human HSF1 (HSF1-His), which was purified and synthesized in E. coli, was mixed, and GST-fused RPA1 protein was precipitated with a Glutathione-sepharose 4B column to examine whether HSF1-His co-precipitated (GST- pull down assay). The precipitated protein complex was separated by SDS-PAGE, and Western blotting was performed using an anti-HSF1 antibody (α-mHSF1j) or an anti-GST antibody (sc-33613, manufactured by Santa Cruz). Anti-HSF1 antibody was prepared according to the description in the following literature (Fujimoto et al., J. Biol. Chem. 283, 29961-29970, 2008).
The upper part of FIG. 1 shows the structures of GST-mouse RPA1 wild type (GST-RPA1) and deletion mutants (GST-N1 to N5, GST-C1 to C4) synthesized in E. coli, and the lower part of FIG. Results are shown. From the results of Western blotting, bands due to anti-HSF1 antibody were not detected in N4, N5, C3, and C4, and HSF1 was not co-precipitated. Therefore, as shown in the horizontal line described at the lower right of C4 in FIG. 1, amino acids at positions 228 to 391 in the single-stranded DNA binding domain (ssDNA binding domain) AB of mouse RPA1 interact with human HSF1. It became clear.

次に、大腸菌で合成したＧＳＴ−ヒトＨＳＦ１の野生型（ＧＳＴ−ＨＳＦ１）、及びＧＳＴ−ヒトＨＳＦ１の欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ１〜Ｎ３、Ｃ１〜Ｃ３）を精製し、同じく大腸菌で合成して精製したマウスＲＰＡ１（ＲＰＡ１−Ｈｉｓ）を混合し、Glutathione-sepharose 4BカラムでＧＳＴ融合ＨＳＦ１タンパク質を沈降し、ＲＰＡ１−Ｈｉｓが共沈降するかどうか調べた。沈降してきたタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＲＰＡ１抗体（sc-28304, Santa Cruze社製）または抗ＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。
図２上段に合成したＧＳＴ−ＨＳＦ１の野生型（ＧＳＴ−ＨＳＦ１）、及び欠損変異体Ｎ１−Ｎ３，ＧＳＴ−Ｃ１〜Ｃ３）の構造を示し、図２下段にウエスタンブロッティングの結果を示す。ウエスタンブロッティングの結果より、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３では抗ＲＰＡ１抗体によるバンドが検出されず、ＲＰＡ１が共沈降していなかった。従って、図２のＣ３の下側に記載した横線に示すように、ヒトＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）における１位から１２０位のアミノ酸がマウスＲＰＡ１と相互作用することが明らかとなった。 Next, GST-human HSF1 wild type (GST-HSF1) and GST-human HSF1 deletion mutants (GST-N1-N3, C1-C3) synthesized in E. coli were purified and synthesized in E. coli. Purified mouse RPA1 (RPA1-His) was mixed, and GST-fused HSF1 protein was precipitated with a Glutathione-sepharose 4B column to examine whether RPA1-His co-precipitated. The precipitated protein complex was separated by SDS-PAGE, and Western blotting was performed using an anti-RPA1 antibody (sc-28304, manufactured by Santa Cruze) or an anti-GST antibody (sc-33613, manufactured by Santa Cruz).
The structure of GST-HSF1 wild type (GST-HSF1) and deletion mutants N1-N3, GST-C1 to C3) synthesized are shown in the upper part of FIG. 2, and the results of Western blotting are shown in the lower part of FIG. From the results of Western blotting, bands due to anti-RPA1 antibody were not detected in N1, N2, and N3, and RPA1 was not co-precipitated. Therefore, as indicated by the horizontal line described below C3 in FIG. 2, it was revealed that amino acids 1 to 120 in the DNA binding domain (DBD) of human HSF1 interact with mouse RPA1.

［ＨＳＦ１とＰＲＡ１との相互作用領域の特定］
ＨＳＦ１とＰＲＡ１との相互作用領域をさらに特定するために、他のＨＳＦ群との相互作用を調べた。 [Identification of interaction region between HSF1 and PRA1]
In order to further specify the interaction region between HSF1 and PRA1, the interaction with other HSF groups was examined.

（１）マウスＲＰＡ１とヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１）、ヒトＨＳＦ２（ｈＨＳＦ２）、ヒトＨＳＦ４（ｈＨＳＦ４）との相互作用
大腸菌で合成したＧＳＴ、マウスＲＰＡ１の野生型（ＧＳＴ−ＲＰＡ１）、及び欠損変異体（ＧＳＴ−Ｎ５）を精製し、同じく大腸菌で合成して精製したヒトＨＳＦ１（ＨＳＦ１−Ｈｉｓ）、ＨＳＦ２（ＨＳＦ２−Ｈｉｓ）、ＨＳＦ４（ＨＳＦ４−Ｈｉｓ）を混合し、Glutathione-sepharose 4Bカラムを用いてGST-pull down assayを行った。沈降してきたタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＨＳＦ１抗体（α−ｍＨＳＦ１ｊ）、抗ＨＳＦ２抗体（α−ｍＨＳＦ２−４）、抗ＨＳＦ４抗体（α−ｈＨＳＦ４ｂ）を用いてウエスタンブロッティングを行った。α−ｍＨＳＦ１ｊ、α−ｍＨＳＦ２−４及びα−ｈＨＳＦ４ｂについては、以下の文献の記載に従って作成した（Fujimoto et al., J. Biol. Chem. 283, 29961-29970, 2008）。
結果を図３上段Ａに示す。マウスＲＰＡ１はヒトＨＳＦ１と共にヒトＨＳＦ４とは相互作用するが、ヒトＨＳＦ２とは相互作用しないことが明らかとなった。 (1) Interaction of mouse RPA1 with human HSF1 (hHSF1), human HSF2 (hHSF2), human HSF4 (hHSF4) GST synthesized in Escherichia coli, wild type of mouse RPA1 (GST-RPA1), and deletion mutant (GST) -N5) was purified, and human HSF1 (HSF1-His), HSF2 (HSF2-His), and HSF4 (HSF4-His), which were also synthesized and purified in E. coli, were mixed, and GST-G4 was used with a Glutathione-sepharose 4B column. A pull down assay was performed. The precipitated protein complex was separated by SDS-PAGE, and Western blotting was performed using anti-HSF1 antibody (α-mHSF1j), anti-HSF2 antibody (α-mHSF2-4), and anti-HSF4 antibody (α-hHSF4b). . α-mHSF1j, α-mHSF2-4 and α-hHSF4b were prepared as described in the following literature (Fujimoto et al., J. Biol. Chem. 283, 29961-29970, 2008).
The results are shown in the upper part A of FIG. It became clear that mouse RPA1 interacts with human HSF4 along with human HSF1, but does not interact with human HSF2.

（２）ＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列比較
次に、ヒトＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を比較した。図３下段Ｂにおいて、すべてで一致するアミノ酸を黒背景、２つのみで一致するアミノ酸を灰色背景で示し、αヘリックス（Ｈ１−Ｈ３）、βシート（β１−β４）、８４位から９６位の１３アミノ酸からなるｗｉｎｇ領域、ｌｉｎｋｅｒを示す。数字はアミノ酸の位置を示す。ドットで示すアミノ酸の位置は、ＨＳＦ１とＨＳＦ４で一致するが、ＨＳＦ２とは異なるものを示す。
真核細胞のＨＳＦ群のＤＮＡ結合ドメインはｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｈｅｌｉｘ型の構造を持ち進化の過程でよく保存されている。そのドメインを構成するアミノ酸のうち、ヒトＨＳＦ１とヒトＨＳＦ４で一致するが、ヒトＨＳＦ２で異なるものは１５カ所になる。その中から類似のアミノ酸を除いた１０カ所の場所のヒトＨＳＦ１のアミノ酸をそれぞれヒトＨＳＦ２のアミノ酸に置換し（図３下段Ｂのドット）、ＨＥＫ２９３細胞でのマウスＲＰＡ１との相互作用を以下の方法で調べた。 (2) Comparison of amino acid sequences of DNA binding domains of HSF1 Next, the amino acid sequences of the DNA binding domains of human HSF1, HSF2, and HSF4 were compared. In the lower part B of FIG. 3, all matching amino acids are shown with a black background, and only two matching amino acids are shown with a gray background. A wing region consisting of 13 amino acids, linker, is shown. Numbers indicate amino acid positions. The positions of amino acids indicated by dots are identical in HSF1 and HSF4, but different from HSF2.
The DNA binding domain of the eukaryotic HSF group has a winged hellix-turn-helix type structure and is well conserved during evolution. Among the amino acids constituting the domain, human HSF1 and human HSF4 match, but human HSF2 has 15 different amino acids. The amino acid of human HSF1 at 10 locations excluding similar amino acids was substituted with the amino acid of human HSF2 (dots in the lower row of FIG. 3), and the interaction with mouse RPA1 in HEK293 cells was determined by the following method. I examined it.

（３）ベクターの作製
Ｃ末端にＨＡ標識した野生型ヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１−ＨＡ）、変異体（Ｅ８５Ｄ−ＨＡ：８５位のグルタミン酸をアスパラギン酸、Ｇ８７Ｓ−ＨＡ：８７位のグリシンをセリン、Ｐ９２Ｑ−ＨＡ：９２位のプロリンをグルタミン、Ｇ８７Ａ−ＨＡ：８７位のグリシンをアラニンに置換）を挿入したヒトＨＳＦ１−ＨＡのｃＤＮＡ（配列番号２２〜２６）をＰＣＲにより作製し、pcDNA3.1/Neoベクター（Invitrogen社製）へ挿入して細胞での発現ベクターを構築した。 (3) Preparation of vector Wild-type human HSF1 (hHSF1-HA) labeled with HA at the C-terminal, mutant (E85D-HA: glutamic acid at position 85 aspartic acid, G87S-HA: glycine at position 87 as serine, P92Q- HA: cDNA of human HSF1-HA into which proline at position 92 is substituted with glutamine and G87A-HA: glycine at position 87 is substituted with alanine (SEQ ID NO: 22 to 26) is prepared by PCR, and pcDNA3.1 / Neo vector (Invitrogen) was inserted to construct an expression vector in cells.

（４）細胞培養
本発明の実施例に用いる野生型及びＨＳＦ１−／−マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＨＥＫ２９３、ヒトメラノーマ細胞株ＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬａは、１０％胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。 (4) Cell culture Wild-type and HSF1 − / − mouse embryonic fibroblasts (MEF), HEK293, human melanoma cell lines MeWo, HMV-1 and epithelial cancer cells HeLa used in the examples of the present invention are 10%. The cells were cultured in DMEM medium containing fetal serum under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.

（５）ＨＥＫ２９３細胞への導入及び免疫沈降
ＨＥＫ２９３細胞へヒトＨＳＦ１−ＨＡあるいはその変異体の発現ベクターをリン酸カルシウム法で導入して細胞抽出液を作製した。その後抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降したタンパク質を用いて抗ＲＰＡ抗体、あるいは抗ＨＡ抗体でウエスタンブロットした。 (5) Introduction into HEK293 cells and immunoprecipitation An expression vector of human HSF1-HA or a variant thereof was introduced into HEK293 cells by the calcium phosphate method to prepare a cell extract. Thereafter, immunoprecipitation was performed using an anti-HA antibody, and Western blotting was performed using the precipitated protein with an anti-RPA antibody or an anti-HA antibody.

図４Ａに示す通り、８７番目のグリシンをセリンに置換すると複合体形成がなくなることがわかった。さらに、同じアミノ酸をアラニン置換しても複合体形成を認めなかった。つまり、ヒトＨＳＦ１は８７番目のグリシンが存在するｗｉｎｇ領域を介してマウスＲＰＡ１と相互作用することが示された。   As shown in FIG. 4A, it was found that when the 87th glycine was substituted with serine, complex formation was lost. Furthermore, no complex formation was observed when the same amino acid was substituted with alanine. That is, human HSF1 was shown to interact with mouse RPA1 via the wing region where the 87th glycine is present.

（６）ゲルシフトアッセイによるＤＮＡ活性
次に、ＨＳＦ１欠損（−／−）ＭＥＦ細胞（Inouye et al. J. Biol. Chem. 282, 33210-33217, 2007）へ（３）ベクターの作製に記載したｃＤＮＡ（配列番号２２〜２６）およびＧＦＰのｃＤＮＡ（配列番号２７）をpShuttle-CMVベクター(Stratagene社製)へ挿入して作製したアデノウイルスベクターを用いて野生型ヒトＨＳＦ１、変異体、またはコントロールとしてＧＦＰを発現させた。この細胞あるいは野生型ＭＥＦ細胞の抽出液を作製し、３２Ｐ−ＨＳＥオリゴヌクレオチドをプローブとしてゲルシフトアッセイを行うことでＤＮＡ結合活性を調べた。ＨＳＦ１の結合活性（ＨＳＦ１）とフリー（ｆｒｅｅ）のプローブの位置を示す。また、ウエスタンブロットによりＨＳＦ１、ＧＦＰ、β−アクチン（actin）のタンパク質量を調べた。結果を図４Ｂに示す。
このｗｉｎｇ領域はＤＮＡ結合ドメインの一部であるが、その変異はＤＮＡ結合活性には影響を及ぼさないことが明らかとなった。つまり、ｗｉｎｇ領域はＨＳＦ１と相互作用する役割を特異的に担うことが強く示された。 (6) DNA activity by gel shift assay Next, to HSF1-deficient (-/-) MEF cells (Inouye et al. J. Biol. Chem. 282, 33210-33217, 2007) (3) cDNA described in the preparation of vector (SEQ ID NO: 22-26) and GFP cDNA (SEQ ID NO: 27) inserted into pShuttle-CMV vector (Stratagene), using an adenovirus vector, wild type human HSF1, mutant, or GFP as a control Was expressed. Extracts of these cells or wild type MEF cells were prepared, and DNA binding activity was examined by performing a gel shift assay using 32 P-HSE oligonucleotide as a probe. The positions of HSF1 binding activity (HSF1) and free probes are shown. Moreover, the protein amount of HSF1, GFP, and β-actin (actin) was examined by Western blot. The results are shown in FIG. 4B.
Although this wing region is a part of the DNA binding domain, it has been revealed that the mutation does not affect the DNA binding activity. That is, it was strongly shown that the wing region specifically plays a role of interacting with HSF1.

（７）真核細胞ＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列の比較
真核細胞ＨＳＦ１のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を比較した（図４Ｃ）。すべての種で一致するアミノ酸を黒背景、一部の種で一致するアミノ酸を灰色背景で示す。ｈ、ヒト；ｍ、マウス；ｃ、ニワトリ；Ｃｅ、線虫；Ｓｃ、出芽酵母。数字はアミノ酸の位置を示す。ドットで示すアミノ酸の位置は、ＨＳＦ１とＨＳＦ４で一致するが、ＨＳＦ２とは異なるものを示す。黒ドットは、ｗｉｎｇ領域のうちすべての種で保存されたアミノ酸（グリシン、ヒトＨＳＦ１の８７番目のアミノ酸）を示す。
興味深いことに、この８７番目のグリシンは、酵母からヒトまですべての種のＨＳＦ１で保存されており、ＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体が真核細胞で普遍的であることを示唆する。 (7) Comparison of amino acid sequence of DNA binding domain of eukaryotic cell HSF1 The amino acid sequence of DNA binding domain of eukaryotic cell HSF1 was compared (FIG. 4C). Amino acids that match in all species are shown on a black background, and amino acids that match in some species are shown on a gray background. h, human; m, mouse; c, chicken; Ce, nematode; Sc, budding yeast. Numbers indicate amino acid positions. The positions of amino acids indicated by dots are identical in HSF1 and HSF4, but different from HSF2. A black dot shows the amino acid (glycine, the 87th amino acid of human HSF1) conserved in all species in the wing region.
Interestingly, this 87th glycine is conserved in all species of HSF1 from yeast to human, suggesting that the HSF1-RPA complex is universal in eukaryotic cells.

［ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体の遺伝子発現制御］
ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体が遺伝子発現制御を行っているかを明らかにする目的で、まずマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）において、以下の方法によりマウスＨＳＦ１（ｍＨＳＦ１）又はマウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）それぞれの遺伝子ノックダウン後にＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。 [Control of gene expression of HSF1-RPA1 complex]
For the purpose of clarifying whether the HSF1-RPA1 complex is controlling gene expression, first, in mouse fetal fibroblasts (MEF), the gene knockdown of mouse HSF1 (mHSF1) or mouse RPA1 (mRPA1) by the following method, respectively. DNA microarray analysis was performed after down.

（１）ＲＮＡ干渉、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ＲＮＡ定量
本発明の実施例に用いるヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１）、マウスＨＳＦ１（ｍＨＳＦ１）、そしてマウスＲＰＡ１（ｍＲＰＡ１）に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のアデノウイルス発現ベクターは、以下の文献の記載に従って作製した（Fujimoto et al. Mol. Biol. Cell 21, 106-116, 2010）。ＭＥＦ細胞に、作製したAd-sh-mHSF1あるいはAd-sh-mRPA1（１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を２時間感染させ、新しい培地に交換して７０時間維持して細胞を回収した。RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）を用いてＲＮＡを抽出し、GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array（28,853遺伝子をカバー）（Affymetrix社製)を用いて遺伝子発現解析を行った。遺伝子のfold−changeの解析には、ソフトウエアーPartek Genomics Suite 6.5（Partek社製）を用いた。
遺伝子発現を確認するために、まずＭＥＦ細胞に作製したAd-sh-SCR、Ad-sh-mHSF1あるいはAd-sh-mRPA1（１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を２時間感染させ、新しい培地に交換して２２時間維持した。次に、Ad-GFP、Ad-hHSF1-HA、Ad-hHSF1G87S-HA、Ad-hHSF1G87A-HAを２時間感染させて新しい培地に交換して４６時間維持した。これらの細胞を回収してＴｒｉｚｏｌ（Invitrogen社製）を用いてＲＮＡを回収し、以下の文献の記載に従ってＲＴ−ＰＣＲを行った（Inouye et al. Ｊ.Biol. Chem. 282, 33210-33217, 2007）。一部の細胞からはタンパク質を抽出してウエスタンブロッティングを行った。 (1) RNA interference, DNA microarray analysis, RNA quantification Adenoviral expression vectors for short hairpin RNA (shRNA) against human HSF1 (hHSF1), mouse HSF1 (mHSF1), and mouse RPA1 (mRPA1) used in the examples of the present invention are as follows: This was prepared according to the following literature (Fujimoto et al. Mol. Biol. Cell 21, 106-116, 2010). MEF cells were infected with the prepared Ad-sh-mHSF1 or Ad-sh-mRPA1 (1 × 10 8 pfu / ml) for 2 hours, replaced with fresh medium and maintained for 70 hours to collect the cells. RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen) and gene expression analysis was performed using GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array (covering 28,853 genes) (Affymetrix). For analysis of gene fold-change, software Partek Genomics Suite 6.5 (manufactured by Partek) was used.
To confirm gene expression, first infect MEF cells with Ad-sh-SCR, Ad-sh-mHSF1 or Ad-sh-mRPA1 (1 × 10 8 pfu / ml) prepared for 2 hours and replace with fresh medium. And maintained for 22 hours. Next, Ad-GFP, Ad-hHSF1-HA, Ad-hHSF1G87S-HA, Ad-hHSF1G87A-HA were infected for 2 hours, replaced with fresh medium and maintained for 46 hours. These cells were recovered, RNA was recovered using Trizol (Invitrogen), and RT-PCR was performed as described in the following literature (Inouye et al. J. Biol. Chem. 282, 33210-33217, 2007). Proteins were extracted from some cells and Western blotting was performed.

（３）解析結果
結果を図５Ａに示す。発現が１．３倍以下となるものは、ｍＲＰＡ１ノックダウンで１，６７０遺伝子、ｍＨＳＦ１ノックダウンで５６４遺伝子であった。驚くべきことに、ｍＨＳＦ１ノックダウンで発現低下する遺伝子のうち、７０％もの遺伝子がｍＲＰＡ１ノックダウンで発現低下していた。このことは、同じ遺伝子の発現をＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体が制御することを示唆している。
ノックダウンによって発現が２．０倍以下となる顕著なものは３３遺伝子あり、そのうち５遺伝子(Sncaip、Lrrn4、Fmod、Abi3bp、Slc44a5)についてその発現をさらに詳細に検討した（図５Ｂ、Ｃ）。 (3) Analysis result A result is shown to FIG. 5A. Those whose expression was 1.3 times or less were 1,670 genes in mRPA1 knockdown and 564 genes in mHSF1 knockdown. Surprisingly, 70% of the genes whose expression was reduced by mHSF1 knockdown were decreased by mRPA1 knockdown. This suggests that the HSF1-RPA complex controls the expression of the same gene.
There are 33 genes whose expression is reduced to 2.0-fold or less by knockdown. Among them, 5 genes (Sncaip, Lrrn4, Fmod, Abi3bp, Slc44a5) were examined in more detail (FIGS. 5B and 5C).

図５Ｂの遺伝子のうち発現変化が顕著な５つ(Sncaip、Lrrn4、Fmod、Abi3bp、Slc44a5)の遺伝子についてＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体への依存性を詳細に解析した。ＭＥＦ細胞にアデノウイルスを用いてマウスＨＳＦ１あるいはマウスＲＰＡ１の遺伝子ノックダウンを行った。
ＨＳＦ１をノックダウンした細胞へ、やはりアデノウイルスを用いて野生型ヒトＨＳＦ１、変異型ＨＳＦ１（Ｇ８７Ｓ−ＨＡ、Ｇ８７Ａ−ＨＡ）、あるいはコントロールとしてＧＦＰを発現させた。これらの細胞からＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を調べた。ＨＳＦ１、ＲＰＡ１、ＧＦＰ、β−アクチンの量はウエスタンブロッティングで調べた。結果を図５Ｃに示す。まず、ｍＨＳＦ１あるいはｍＲＰＡ１のノックダウンは確かにそれらの遺伝子発現を低下させた。ｍＨＳＦ１をノックダウンしたＭＥＦ細胞へ、ｈＨＳＦ１を再導入すると発現は元のレベルまで回復した。しかし、ｈＨＳＦ１Ｇ８７ＳあるいはｈＨＳＦ１Ｇ８７Ａの再導入は遺伝子発現を回復させることはなかった。この結果は、ＨＳＦ１−ＲＰＡ１複合体による遺伝子発現の調節にｗｉｎｇ領域を介した相互作用が必要であることが示された。 The dependency of the five genes (Sncaip, Lrrn4, Fmod, Abi3bp, Slc44a5) on which the expression change is remarkable among the genes in FIG. 5B on the HSF1-RPA1 complex was analyzed in detail. Mouse HSF1 or mouse RPA1 gene knockdown was performed using adenovirus on MEF cells.
Wild type human HSF1, mutant HSF1 (G87S-HA, G87A-HA), or GFP was also expressed as a control in cells in which HSF1 was knocked down. RNA was extracted from these cells, and gene expression was examined by RT-PCR. The amounts of HSF1, RPA1, GFP and β-actin were examined by Western blotting. The result is shown in FIG. 5C. First, knockdown of mHSF1 or mRPA1 certainly reduced their gene expression. When hHSF1 was reintroduced into MEF cells in which mHSF1 had been knocked down, expression was restored to the original level. However, reintroduction of hHSF1G87S or hHSF1G87A did not restore gene expression. This result showed that interaction via the wing region is required for regulation of gene expression by the HSF1-RPA1 complex.

［ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用とがん細胞の増殖］
ＨＳＦ１−ＲＰＡ１の特異的な相互作用とがん細胞の増殖とが関連するかを調べた。
（１）がん細胞の増殖と腫瘍形成
ヒトメラノーマ細胞株ＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬaに、まずＳＣＲ（ｓｃｒａｍｂｌｅ ＲＮＡ）あるいはＨＳＦ１ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターを２時間感染させて培地を替えて２２時間維持した。次に、ＧＦＰ、野生型ＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１−ＨＡ）、あるいは変異体（Ｇ８７Ｓ−ＨＡ、Ｇ８７Ａ−ＨＡ）のアデノウイルス発現ベクターを２時間感染させ、培地を替えて４６時間維持した（この時点で合計７２時間）。この細胞をまき直して時間を追って細胞数を計測した（図６上段）。＊印は有為差を示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ検定）。また、ウエスタンブロッティングにより合計７２時間の時点でのＨＳＦ１、ＧＦＰ、β−アクチンの発現量を調べた（図６下段）。さらに、ＨＭＶ-１細胞を用いて胸腺を持たないヌードマウスへの移植実験を行った。上記の通り処理した細胞（２×１０６ ｉｎ １００ｍｌ ＰＢＳ）を等量のマトリゲル（BD Biosciences社製）と混合し、２３ゲージの注射針を用いて５週齢のヌードマウスの皮下へ注入した。腫瘍の容量（高さ×幅２÷２）は皮下中の後２８日まで計測した。２８日後には腫瘍を取り出し重量を計測した。 [Interaction between HSF1 and RPA1 and proliferation of cancer cells]
It was investigated whether a specific interaction of HSF1-RPA1 was associated with cancer cell proliferation.
(1) Growth and tumor formation of cancer cells Human melanoma cell lines MeWo, HMV-1 and epithelial cancer cells HeLa are first infected with an adenoviral vector expressing SCR (scramble RNA) or HSF1 shRNA for 2 hours. Was maintained for 22 hours. Next, GFP, wild type HSF1 (hHSF1-HA), or mutant (G87S-HA, G87A-HA) adenoviral expression vector was infected for 2 hours, and the medium was changed and maintained for 46 hours (total at this time) 72 hours). The cells were re-wound and the number of cells was counted over time (upper part of FIG. 6). * Indicates a significant difference (p <0.01, ANOVA test). In addition, the expression levels of HSF1, GFP, and β-actin at a time point of 72 hours in total were examined by Western blotting (lower panel in FIG. 6). Furthermore, a transplantation experiment was performed using HMV-1 cells to nude mice without thymus. Cells treated as described above (2 × 10 6 in 100 ml PBS) were mixed with an equal amount of Matrigel (BD Biosciences) and injected subcutaneously into 5-week-old nude mice using a 23-gauge injection needle. Tumor volume (height × width 2 ÷ 2) was measured up to 28 days after subcutaneous. After 28 days, the tumor was taken out and weighed.

（２）がん細胞の増殖結果
ヒトメラノーマ細胞株であるＭｅＷｏ、ＨＭＶ−１及び上皮系がん細胞ＨｅＬａにおいてＨＳＦ１をノックダウンすると増殖が著しく低下したが（図６上段）、これらの細胞へｈＨＳＦ１を再導入すると増殖はかなりのレベルまで回復した。ところが、ｈＨＳＦ１Ｇ８７ＳあるいはｈＨＳＦ１Ｇ８７Ａの再導入は細胞増殖をまったく回復させることはなかった。つまり、ヒトメラノーマ細胞の増殖にｗｉｎｇ領域を介した相互作用、特に８７位のグリシンを介した相互作用が必要であることが示された。なお、野生型のｈＨＳＦ１を再導入した場合でも全体としては完全なレベルにまでは回復しないのは、遺伝子導入高率には、個々の細胞によって差があるためである。 (2) Results of cancer cell proliferation When HSF1 was knocked down in human melanoma cell lines MeWo, HMV-1 and epithelial cancer cells HeLa, the proliferation was significantly reduced (upper part of FIG. 6). When reintroduced, proliferation recovered to a considerable level. However, reintroduction of hHSF1G87S or hHSF1G87A did not restore cell growth at all. That is, it was shown that the interaction via the wing region, particularly the interaction via glycine at position 87, is necessary for the growth of human melanoma cells. In addition, even when wild-type hHSF1 is reintroduced, the overall level does not recover because the gene transfer rate varies depending on individual cells.

（３）ＨＭＶ−１細胞を用いたヌードマウスへの移植実験結果
図７Ａは、代表的な腫瘍を形成したマウス及び摘出した腫瘍の写真（２８日後）を２個体ずつ示し、図７Ｂは、腫瘍の容量変化の時間経過を示し、（＊印は有為差を示す（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ検定））、図７Ｃは、腫瘍の重量（２８日後）を示す。Ｂａｒは平均値を示す。本実験から、マウスにおいてもヒトメラノーマ細胞の増殖にｗｉｎｇ領域を介した相互作用、特に８７位のグリシンを介した相互作用が必要であることが示された。個体での腫瘍形成には、細胞増殖以外にも血管形成、細胞浸潤など宿主との相互作用を含む多くの要因が関係している。この実験結果は、複合的な要因が関連するヒトのがんの進展においてＨＳＦ１が重要な役割を担うことを強く示すだけでなく、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用阻害剤のがん進展への抑制効果を実証する優れた実験系を提供する。 (3) Results of transplantation experiment into nude mice using HMV-1 cells Fig. 7A shows two photographs of mice that formed a representative tumor and excised tumor (after 28 days), and Fig. 7B shows tumors (* Indicates a significant difference (p <0.01, ANOVA test)), and FIG. 7C shows the weight of the tumor (after 28 days). Bar represents an average value. From this experiment, it was shown that the interaction via the wing region, particularly the interaction via glycine at position 87, is necessary for the growth of human melanoma cells in mice. Tumor formation in an individual involves many factors including interaction with the host, such as angiogenesis and cell invasion, in addition to cell proliferation. This experimental result not only strongly shows that HSF1 plays an important role in the progression of human cancer involving multiple factors, but also shows the inhibitory effect of HSF1-RPA1 interaction inhibitor on cancer progression. Provide an excellent experimental system to demonstrate.

［ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用を阻害するポリペプチド］
これまでの結果から、ＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用を阻害する化合物はがん細胞の増殖を抑制できることが示された。そこで、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域あるいはＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインＡ−Ｂがこのような化合物のターゲットとなりうるかを明らかに知るために、ＥＬＩＳＡ法を用いてＨＳＦ１-ＲＰＡ１相互作用の競合実験を行った。 [Polypeptide inhibiting HSF1-RPA1 interaction]
From the results so far, it was shown that the compound which inhibits HSF1-RPA1 interaction can suppress the growth of cancer cells. Therefore, in order to clearly know whether the wing region of HSF1 or the ssDNA binding domain AB of RPA1 can be the target of such a compound, a competition experiment of HSF1-RPA1 interaction was performed using the ELISA method.

（１）ＥＬＩＳＡ法
９６−ウェルプレートに精製したＨＳＦ１-Ｈｉｓ（１μｇ/ウェル）を固相化し、ＧＳＴあるいはＧＳＴ-ＲＰＡ１（０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μｇ）を混合した。ウサギ抗ＧＳＴ抗体（sc-33613、Santa Cruz社製）及びペルオキシダーゼ結合した抗ウサギＩｇＧ抗体（Catalog番号:55676、 Cappel社製）で処理し、o-phenylenediamineを基質として発色させて吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。競合実験を行う際は、ヒトＲＰＡ１の２２８位から３９１位のペプチドからなるＲＰＡ１であるＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはヒトＲＰＡ１の２３８位及び２６９位のフェニルアラニンをアラニンに変異させた変異体ＲＰＡ１−ＡｒｏＡ（２２８−３９１）をＧＳＴ-ＲＰＡとともに９６−ウェルプレートへ混合した。
一方、ＨＳＦ１の一部分との競合実験を行うために、９６−ウェルプレートに精製したＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ/ウェル）を固相化し、ＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μｇ）と共にＨＳＦ１−ＤＢＤ（１−１２９）−Ｈｉｓあるいはその８７位のグリシンをセリンに変異させた変異体ＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−Ｈｉｓ、または配列番号１に記載の１３アミノ酸からなる合成ペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいは配列番号１の４番目のグリシン残基をセリンに変異させた変異体ＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕ（純度９０％以上、株式会社スクラム社委託品）を混合した。一次抗体には抗ＨＳＦ１抗体を用いた。結果を図８に示す。 (1) ELISA method Purified HSF1-His (1 μg / well) was immobilized on a 96-well plate, and GST or GST-RPA1 (0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 μg) was immobilized. ) Was mixed. It was treated with a rabbit anti-GST antibody (sc-33613, manufactured by Santa Cruz) and a peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody (Catalog number: 55676, manufactured by Cappel). Color was developed using o-phenylenediamine as a substrate, and the absorbance (490 nm) was measured. It was measured. When conducting a competition experiment, RPA1 (228-391), which is an RPA1 consisting of peptides 228 to 391 of human RPA1, or mutant RPA1-AroA obtained by mutating phenylalanine at positions 238 and 269 of human RPA1 to alanine (228-391) was mixed with GST-RPA into a 96-well plate.
On the other hand, in order to conduct a competition experiment with a part of HSF1, purified RPA1-His (1 μg / well) was immobilized on a 96-well plate, and HSF1-His (0.25, 0.5, 1.0, 1.5,2.0 μg) and HSF1-DBD (1-129) -His or a mutant HSF1-DBDG87S-His obtained by mutating glycine at position 87 to serine, or 13 amino acids described in SEQ ID NO: 1. Synthetic peptide HSF1-wing or mutant HSF1-wing-mu (purity of 90% or more, consignment from Scrum Co., Ltd.) in which the fourth glycine residue of SEQ ID NO: 1 was mutated to serine was mixed. Anti-HSF1 antibody was used as the primary antibody. The results are shown in FIG.

ＥＬＩＳＡ法によりＨＳＦ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＲＰＡ１（０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μg）の相互作用を定量化した（図８Ａ）。図８Ａから分かるように、ＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＲＰＡ１は０．５μｇで定量性があった。次に、ＨＳＦ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＧＳＴ−ＲＰＡ１（０．５μｇ）の相互作用に対するＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはその変異体ＲＰＡ１−ＡｒｏＡ（２２８−３９１）の競合活性を調べた。ＧＳＴ−ＲＰＡ１とＲＰＡ１（２２８−３９１）あるいはＲＰＡ１−ＡｒｏＡ（２２８−３９１）のモル比を示す（図８Ｂ）。
また、ＥＬＩＳＡ法によりＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ０．２５,０．５,１．０,１．５,２．０μg）の相互作用を定量化した（図８Ｃ）。図８Ｃから分かるように、ＨＳＦ１−Ｈｉｓは０．５μｇで定量性があった。次に、ＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．５μｇ）の相互作用に対するＨＳＦ１−ＤＢＤ−Ｈｉｓあるいはその変異体ＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−Ｈｉｓの競合活性を調べた（図８Ｄ）。ＨＳＦ１−ＨｉｓとＨＳＦ１−ＤＢＤ−ＨｉｓあるいはＨＳＦ１−ＤＢＤＧ８７Ｓ−ＨｉｓＲＰＡ１（２２８−３９１）のモル比を示す。
さらに、ＲＰＡ１−Ｈｉｓ（１μｇ）とＨＳＦ１−Ｈｉｓ（０．５μｇ）の相互作用に対する合成ポリペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいはその変異体ＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕ（ともに１３アミノ酸からなる）の競合活性を調べた。ＨＳＦ１−ｗｉｎｇあるいはＨＳＦ１−ｗｉｎｇ−ｍｕのモル比を示す。Ｂ、Ｄ、Ｅともに＊はＰ＜０．０１を示している（図８Ｅ）。
これらの結果、ＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸２２８から３９１）だけでなく、１３アミノ酸からなる短い合成ペプチドＨＳＦ１−ｗｉｎｇもＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用と競合することが明らかとなった。この結果は、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域及びＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインＡ−ＢがＨＳＦ１−ＲＰＡ１相互作用を阻害する化合物のターゲットとなりうることを示している。 The interaction between HSF1-His (1 μg) and GST or GST-RPA1 (0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 μg) was quantified by ELISA (FIG. 8A). As can be seen from FIG. 8A, GST or GST-RPA1 was quantitative at 0.5 μg. Next, the competitive activity of RPA1 (228-391) or its mutant RPA1-AroA (228-391) to the interaction between HSF1-His (1 μg) and GST-RPA1 (0.5 μg) was examined. The molar ratio of GST-RPA1 and RPA1 (228-391) or RPA1-AroA (228-391) is shown (FIG. 8B).
In addition, the interaction between RPA1-His (1 μg) and HSF1-His 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 μg) was quantified by ELISA (FIG. 8C). As can be seen from FIG. 8C, HSF1-His was quantitative at 0.5 μg. Next, the competitive activity of HSF1-DBD-His or its mutant HSF1-DBDG87S-His for the interaction between RPA1-His (1 μg) and HSF1-His (0.5 μg) was examined (FIG. 8D). The molar ratio of HSF1-His and HSF1-DBD-His or HSF1-DBDG87S-HisRPA1 (228-391) is shown.
Furthermore, the competitive activity of the synthetic polypeptide HSF1-wing or its variant HSF1-wing-mu (both consisting of 13 amino acids) for the interaction between RPA1-His (1 μg) and HSF1-His (0.5 μg) was examined. The molar ratio of HSF1-wing or HSF1-wing-mu is shown. In each of B, D, and E, * indicates P <0.01 (FIG. 8E).
These results revealed that not only the ssDNA binding domain of RPA1 (amino acids 228 to 391) but also a short synthetic peptide HSF1-wing consisting of 13 amino acids competes with the HSF1-RPA1 interaction. This result indicates that the wing region of HSF1 and the ssDNA binding domain AB of RPA1 can be targets of compounds that inhibit the HSF1-RPA1 interaction.

これまでの研究と本発明をまとめると、ＨＳＦ１−ＲＰＡ複合体はいくつかの因子を呼び込むことでヌクレオソーム構造をとるＤＮＡに結合し、構成的な遺伝子発現を誘導する（図９）。それががん細胞の増殖を支えることが明らかとなった。   To summarize the previous studies and the present invention, the HSF1-RPA complex binds to DNA having a nucleosome structure by invoking several factors, and induces constitutive gene expression (FIG. 9). It became clear that it supported the growth of cancer cells.

本発明のペプチド又はその塩は、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用を阻害することで、抗腫瘍剤や、非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法や、抗腫瘍剤のスクリーニング方法に利用される。   The peptide of the present invention or a salt thereof inhibits the interaction between HSF1 and RPA1, thereby preventing an antitumor agent, a method for preventing or treating a tumor characterized by administration to a non-human animal, Used in screening methods.

Claims (5)

以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのペプチド又はその塩を含んでなる抗腫瘍剤。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の４番目のグリシン残基を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１（heat shock factor 1）とＲＰＡ１（replication protein A 1）との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド；
（Ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を有するペプチド； An antitumor agent comprising any of the following peptides (A) to (F) or a salt thereof.
(A) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding the fourth glycine residue of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added, and HSF1 (heat a peptide having an inhibitory activity on the interaction between shock factor 1) and RPA1 (replication protein A 1);
(C) a peptide comprising an amino acid sequence having at least 90% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an interaction inhibitory activity between HSF1 and RPA1;
(D) a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(E) a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of inhibiting interaction between HSF1 and RPA1;
(F) a peptide comprising an amino acid sequence having at least 85% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of inhibiting interaction between HSF1 and RPA1; ペプチドが、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの相互作用阻害活性を有することを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍剤。 The antitumor agent according to claim 1, wherein the peptide has an activity of inhibiting interaction between the wing region of HSF1 and the ssDNA binding domain of RPA1. 請求項１又は２記載の抗腫瘍剤を非ヒト動物に投与することを特徴とする腫瘍の予防・治療法。 A method for preventing or treating a tumor, which comprises administering the antitumor agent according to claim 1 or 2 to a non-human animal. 次の工程（Ａ）、（Ｂ）を順次備えたことを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
（Ａ）ＨＳＦ１とＲＰＡ１とを、被検物質の存在下に接触させ、ＨＳＦ１とＲＰＡ１との相互作用阻害活性を検出する工程；
（Ｂ）対照と比較して前記相互作用阻害活性が高い被検物質を選択する工程； A screening method for an antitumor agent, comprising the following steps (A) and (B) in sequence.
(A) a step of contacting HSF1 and RPA1 in the presence of a test substance and detecting an interaction inhibitory activity between HSF1 and RPA1;
(B) a step of selecting a test substance having a higher interaction inhibitory activity than a control; ＨＳＦ１とＲＰＡ１との接触が、ＨＳＦ１のｗｉｎｇ領域とＲＰＡ１のｓｓＤＮＡ結合ドメインとの接触であることを特徴とする、請求項４記載のスクリーニング方法。 The screening method according to claim 4 , wherein the contact between HSF1 and RPA1 is a contact between the wing region of HSF1 and the ssDNA binding domain of RPA1.
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