JP2005120082A - New protein complex and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、新規結合タンパク質などに関する。さらに詳しくは、TACT427タンパク質と、該タンパク質と結合しうるタンパク質との複合体、該複合体に対する抗体（該複合体の形成を阻害または促進するTACT427タンパク質に対する抗体等）、該複合体の形成を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング、該スクリーニングで得られうる化合物またはその塩、癌または神経変性疾患の予防・治療剤、診断薬などに関する。 The present invention relates to a novel binding protein and the like. More specifically, a complex of a TACT427 protein and a protein that can bind to the protein, an antibody against the complex (such as an antibody against the TACT427 protein that inhibits or promotes the formation of the complex, etc.), and inhibition of the complex formation The present invention also relates to screening of a promoting compound or a salt thereof, a compound or salt thereof obtainable by the screening, a preventive / therapeutic agent for cancer or neurodegenerative disease, a diagnostic agent, and the like.
TACT427は、乳癌や肺癌などのヒト癌組織で高発現している1回膜貫通型タンパク質であり、癌細胞の細胞質膜上に発現し、アンチセンスオリゴヌクレオチドで癌細胞のアポトーシスが誘発されることから癌細胞のアポトーシス抑制に関与していることが報告されている（特許文献１ 特願2003-296081号公報）。また、TACT427のラットオルソログが脳で最も多く発現しており、かつ、血清飢餓条件で誘発された神経芽腫細胞株のアポトーシスを抑制することが知られている（J. Biol. Chem. 278巻、10531頁-10537頁、2003年）。
以下、ヒトFilamin A（GenBank NP_001447；J. Cell Biol. 111巻、1089頁-1105頁、1990年）、ヒトFilamin B（GenBank NP_001448；J. Biol. Chem. 273巻、17531頁-17538頁、1998年）、ヒトFilamin C（GenBank NP_001449；Biochem. Biophys. Res. Commun. 251巻、914頁-919頁、1998年）を、それぞれFLNA、FLNB、およびFLNCと称する。
FLNA、FLNBおよびFLNCからなるFilaminは、当初、アクチン結合タンパク質として見出された（J.Biol.Chem. 250巻、5696頁-5705頁、1975年）。Filaminは、N末端の275アミノ酸からなるアクチン結合ドメインと、C末側に約96アミノ酸からなるβシート構造が24回繰り返された構造を有し、かつ、繰り返し構造の途中には1ヶ所または2ヶ所のヒンジ領域が認められていること、Filaminは2量体を形成し、アクチン線維の架橋に関与していること、Filaminは、Fcレセプター、インテグリンまたはド−パミンD2レセプターなどのレセプター、Rho、RacまたはCDC42などの低分子量Gタンパク質、またはTRAF2やSEK1などのシグナル伝達分子とC末側を介して結合し、細胞外の刺激を細胞内部に伝える足場として働いていることが報告されている（非特許文献１ Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2巻、138頁-145頁、2001年）。また、大脳皮質神経細胞の移動障害を特徴とするPeriventricular heterotopia病の原因がFLNA遺伝子の変異であることも報告されている（Neuron 21巻、1315頁-1325頁、1998年）
以下、ヒトNeuron navigator 2（GenBank NP_892009；Gene 290巻、73頁-94頁、2002年；別名、POMFIL2またはHELAD1）を、NAV2と称する。
NAV2は、線虫のUNC-53に相同性の高いタンパク質であり、UNC-53は筋細胞の遊走や神経軸索の伸長に関与している（Development 129巻、3367頁-3379頁、2002年）。NAV2は、2428アミノ酸よりなるタンパク質で、89番目〜190番目のアミノ酸よりなるカルポニンホモロジードメイン、2098番目〜2105番目のアミノ酸よりなるATP/GTP結合部位、および2091番目〜2208番目のアミノ酸よりなるATPaseドメインからなる（Genomics 80巻、21頁-30頁、2002年；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99巻、3422頁-3427頁、2002年）。NAV2は、細胞内では細胞質または核に局在すること、ヒト大腸癌で発現亢進していること、ATP/GTP結合部位およびATPaseドメインを含む1958番目〜2234番目のアミノ酸からなる組換えタンパク質がヘリカーゼ活性を有すること、およびNAV2のアンチセンスオリゴヌクレオチド導入により大腸癌細胞株SW480にアポトーシスが誘導されることが報告されている（非特許文献２ Oncogene 21巻、6387頁-6394頁、2002年）。
以下、ヒトBTB domain-containing 2（GenBank NP_060267；Gene 262巻、275頁-281頁、2001年）を、BTBD2と称する。
BTBD2は525アミノ酸よりなるタンパク質で、110番目〜217番目のアミノ酸よりなるBTBドメイン（Pfam accession No.PF00651）を有している。酵母ツーハイブリッド法での解析で、DNA topoisomerase I（以下、TOP1と称する）と結合すること、BTBD2の86番目〜525番目のアミノ酸からなる組換えタンパク質がTOP1のDNAスーパーコイル弛緩活性、DNA切断活性を阻害することが報告されている（非特許文献３ BMC Genomics 3巻、1頁-9頁、2002年）。
以下、ヒトRAB3A interacting protein-like 1(非特許文献４ GenBank NP_037533）を、RAB3IL1と称する。
RAB3IL1はRAB3A interacting protein（RAB3IP、GenBank NP_071901）と59％の相同性を示すタンパク質として登録されている。RAB3IPとの配列相同性から、低分子量Gタンパク質Rab3AのGTP/GDPヌクレオチド交換活性を有し小胞輸送やエキソサイトーシスに関与すると予測されている（Public HumanPSDTMvolume of the BioKnowledge Library：www.incyte.com/control/researchproducts/ insilico/proteome）。
Hereinafter, human Filamin A (GenBank NP_001447; J. Cell Biol. 111, 1089-1105, 1990), human Filamin B (GenBank NP_001448; J. Biol. Chem. 273, 1753-17538, 1998) ), Human Filamin C (GenBank NP_001449; Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 914-919, 1998) are referred to as FLNA, FLNB, and FLNC, respectively.
Filamin consisting of FLNA, FLNB and FLNC was originally found as an actin binding protein (J. Biol. Chem. 250, 5696-5705, 1975). Filamin has a structure in which an N-terminal 275-amino acid actin-binding domain and a β-sheet structure consisting of about 96 amino acids on the C-terminal side are repeated 24 times, and one or two in the middle of the repeating structure The presence of a hinge region in two places, Filamin forms a dimer and is involved in the cross-linking of actin fibers, Filamin is a receptor such as Fc receptor, integrin or dopamine D2 receptor, Rho, It has been reported that it binds to low molecular weight G proteins such as Rac or CDC42, or signaling molecules such as TRAF2 and SEK1, via the C-terminal side, and acts as a scaffold to transmit extracellular stimuli to the inside of the cell ( Non-Patent
Hereinafter, human Neuron navigator 2 (GenBank NP_892009; Gene 290, 73-94, 2002; also known as POMFIL2 or HELAD1) is referred to as NAV2.
NAV2 is a protein highly homologous to the nematode UNC-53, and UNC-53 is involved in muscle cell migration and nerve axon elongation (Development 129, 3367-3379, 2002). ). NAV2 is a protein consisting of 2428 amino acids, a calponin homology domain consisting of amino acids 89 to 190, an ATP / GTP binding site consisting of amino acids 2098 to 2105, and an ATPase domain consisting of amino acids 2091 to 2208 (Genomics 80, 21-30, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 3422-3427, 2002). NAV2 is a helicase that is a recombinant protein consisting of amino acids 1958 to 2234, which is localized in the cytoplasm or nucleus in cells, is upregulated in human colorectal cancer, and contains an ATP / GTP binding site and an ATPase domain. It has been reported that apoptosis is induced in the colon cancer cell line SW480 by having an activity and introduction of an antisense oligonucleotide of NAV2 (Non-patent Document 2, Oncogene 21, 6387-6394, 2002).
Hereinafter, human BTB domain-containing 2 (GenBank NP — 060267; Gene 262, 275-281, 2001) is referred to as BTBD2.
BTBD2 is a protein consisting of 525 amino acids and has a BTB domain (Pfam accession No. PF00651) consisting of the 110th to 217th amino acids. Analysis by yeast two-hybrid method, binding to DNA topoisomerase I (hereinafter referred to as TOP1), recombinant protein consisting of amino acids 86 to 525 of BTBD2 is TOP1 DNA supercoil relaxation activity, DNA cleavage activity (Non-patent Document 3 BMC Genomics Vol. 3, pp. 1-9, 2002).
Hereinafter, human RAB3A interacting protein-like 1 (Non-Patent Document 4 GenBank NP_037533) is referred to as RAB3IL1.
RAB3IL1 is registered as a protein showing 59% homology with RAB3A interacting protein (RAB3IP, GenBank NP_071901). The sequence homology with RAB3IP is predicted to have GTP / GDP nucleotide exchange activity of low molecular weight G protein Rab3A and participate in vesicle transport and exocytosis (Public HumanPSD ™ volume of the BioKnowledge Library: www.incyte .com / control / researchproducts / insilico / proteome).
癌細胞や神経細胞に特異的に発現するタンパク質複合体を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な癌の予防・治療剤、および神経細胞の細胞死を抑制する安全で優れた神経変性疾患の予防・治療剤が切望されている。 Targeting protein complexes that are specifically expressed in cancer cells and nerve cells, safe cancer preventive and therapeutic agents that induce cancer cell growth inhibition, and safe and excellent neurodegeneration that suppresses neuronal cell death There is an urgent need for preventive and therapeutic agents for diseases.
TACT427が介在する抗アポトーシスシグナルを調節することにより、癌細胞を死滅させ抗腫瘍効果を導き出す、または、神経細胞の細胞死を抑制し神経変性疾患の予防・治療に役立てることが期待できるものの、TACT427の細胞内結合タンパク質または細胞内情報伝達経路に関する詳細な報告は現時点では殆どなされていない。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、FLNA、FLNB、FLNC、NAV2、BTBD2およびRAB3IL1が、TACT427の細胞内領域と結合することを酵母ツーハイブリッド法（Trends in Genet. 10巻、286頁-292頁、1994年；Annu. Rev. Genet. 31巻、663頁-704頁、1997年；The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press, Bartel and Fields, 1997年）を用いて見出し、さらに、TACT427依存性抗アポトーシスシグナルを調節する活性の評価方法を見出し、これらの知見に基づき検討を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、ならびに配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩から選ばれる一または二種以上を含有する複合体、
〔１ａ〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔１〕記載の複合体、
〔１ｂ〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：４７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔１〕記載の複合体、
〔１ｃ〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔１〕記載の複合体、
〔１ｄ〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：４９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔１〕記載の複合体、
〔１ｅ〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔１〕記載の複合体、
〔１ｆ〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔１〕記載の複合体、
〔２〕 配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である上記〔１〕記載の複合体、
〔２ａ〕 配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である上記〔１〕記載の複合体、
〔３〕 （a）配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、および（b）配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記〔１〕記載の複合体、
〔４〕 上記〔１〕記載の複合体の形成を阻害する活性を有する、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
〔５〕 上記〔１〕記載の複合体の形成を促進する活性を有する、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
〔６〕 配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である上記〔４〕または〔５〕記載の抗体、
〔６ａ〕 配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である上記〔４〕または〔５〕記載の抗体、
〔７〕 上記〔４〕記載の抗体を含有してなる医薬、
〔８〕 上記〔５〕記載の抗体を含有してなる医薬、
〔９〕 癌細胞のアポトーシス促進剤または癌の予防・治療剤である上記〔７〕記載の医薬、
〔１０〕 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防・治療剤である上記〔８〕記載の医薬、
〔１１〕 上記〔４〕または〔５〕記載の抗体を含有してなる診断薬、
〔１２〕 癌または神経変性疾患の診断薬である上記〔１１〕記載の診断薬、
〔１３〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記〔１〕記載の複合体の形成を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔１４〕 配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞を用いることを特徴とする上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５〕 配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞を用いることを特徴とする上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５ａ〕 配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の第２１６２番目〜第２４１２番目、第２２０６番目〜第２３５５番目または第２１４１番目〜第２３５１番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５ｂ〕配列番号：４７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列の第１９６０番目〜第２２９９番目、第２１５６番目〜第２３１４番目または第２１７４番目〜第２５６５番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５ｃ〕 配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の第２２９５番目〜第２７０５番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５ｄ〕 配列番号：４９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列の第６８番目〜第２８６番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５ｅ〕 配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の第２０１番目〜第５２５番目または第２１５番目〜第５０６番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５ｆ〕 配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列の第２８２番目〜第３５６番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５ｇ〕 配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである上記〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１６〕 （a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b）配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、上記〔１〕記載の複合体の形成を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔１６ａ〕 上記〔１３〕記載のスクリーニング方法または上記〔１６〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記〔１〕記載の複合体の形成を阻害する化合物またはその塩、
〔１６ｂ〕 上記〔１３〕記載のスクリーニング方法または上記〔１６〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記〔１〕記載の複合体の形成を促進する化合物またはその塩、
〔１６ｃ〕 上記〔１６ａ〕記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔１６ｄ〕 上記〔１６ｂ〕記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔１６ｅ〕 癌細胞のアポトーシス促進剤または癌の予防・治療剤である上記〔１６ｃ〕記載の医薬、
〔１６ｆ〕 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防・治療剤である上記〔１６ｄ〕記載の医薬、
〔１７〕 上記〔１〕記載の複合体の形成を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤または癌の予防・治療剤、
〔１７ａ〕 上記〔１〕記載の複合体の形成を阻害する化合物またはその塩、
〔１８〕 上記〔１〕記載の複合体の形成を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防・治療剤、
〔１８ａ〕 上記〔１〕記載の複合体の形成を促進する化合物またはその塩、
〔１９〕 配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、癌または神経変性疾患の予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２０〕 上記〔１〕記載の複合体の形成を阻害することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進法または癌の予防・治療法、
〔２１〕 上記〔１〕記載の複合体の形成を促進することを特徴とする神経細胞のアポトーシス阻害法または神経変性疾患の予防・治療法、
〔２２〕 上記〔４〕記載の抗体の有効量を、哺乳動物に対して投与することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進法または癌の予防・治療法、
〔２３〕 上記〔５〕記載の抗体の有効量を、哺乳動物に対して投与することを特徴とする神経細胞のアポトーシス阻害法または神経変性疾患の予防・治療法、
〔２４〕 癌細胞のアポトーシス促進剤または癌の予防・治療剤の製造のための上記〔４〕記載の抗体の使用、
〔２５〕 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防・治療剤の製造のための上記〔５〕記載の抗体の使用、
〔２６〕 請求項１記載の複合体の癌または神経変性疾患の診断マーカーとしての使用などを提供する。
Although TACT427-mediated anti-apoptotic signal is regulated, it can be expected to kill cancer cells and induce anti-tumor effects, or suppress neuronal cell death and be useful for prevention / treatment of neurodegenerative diseases. There have been few detailed reports on intracellular binding proteins or intracellular signal transduction pathways at present.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have confirmed that FLNA, FLNB, FLNC, NAV2, BTBD2, and RAB3IL1 bind to the intracellular region of TACT427 (Trends in Genet. 10, 286-292, 1994; Annu. Rev. Genet. 31, 663-704, 1997; The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press, Bartel and Fields, 1997 And a method for evaluating the activity of regulating the TACT427-dependent anti-apoptotic signal, and based on these findings, the present invention has been completed.
That is, the present invention
[1] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) represented by SEQ ID NO: 46 A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 Partial peptide or a salt thereof, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 or a partial peptide thereof or a salt thereof, the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 Or a protein containing substantially the same amino acid sequence or its A partial peptide or a salt thereof, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50, a partial peptide thereof or a salt thereof, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 A complex containing one or more selected from proteins containing the same or substantially the same amino acid sequence, partial peptides thereof, or salts thereof;
[1a] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) represented by SEQ ID NO: 46 The complex according to the above [1], comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
[1b] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) represented by SEQ ID NO: 47 The complex according to the above [1], comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
[1c] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) represented by SEQ ID NO: 48 The complex according to the above [1], comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
[1d] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) represented by SEQ ID NO: 49 The complex according to the above [1], comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
[1e] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) represented by SEQ ID NO: 50 The complex according to the above [1], comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
[1f] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) represented by SEQ ID NO: 51 The complex according to the above [1], comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
[2] A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, sequence. The complex according to the above [1], which is a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27;
[2a] A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, sequence. The complex according to [1] above, which is a protein comprising the amino acid sequence represented by No. 25 or SEQ ID No. 27;
[3] (a) An amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 A protein containing the sequence, and (b) identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51 The complex according to the above [1], comprising a protein containing the same amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof,
[4] A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, or a partial peptide thereof, having the activity of inhibiting the formation of the complex according to [1] Antibodies against salts,
[5] A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 45, or a partial peptide thereof, having the activity of promoting the formation of the complex described in [1] above, or a partial peptide thereof Antibodies against salts,
[6] A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, sequence. The antibody according to [4] or [5] above, which is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27,
[6a] A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, sequence. The antibody according to [4] or [5] above, which is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27;
[7] A medicament comprising the antibody according to [4] above,
[8] A medicament comprising the antibody according to [5] above,
[9] The medicament according to [7] above, which is an apoptosis promoter for cancer cells or a preventive / therapeutic agent for cancer,
[10] The pharmaceutical according to [8] above, which is a neuronal apoptosis inhibitor or a preventive / therapeutic agent for neurodegenerative diseases,
[11] A diagnostic agent comprising the antibody according to [4] or [5] above,
[12] The diagnostic agent according to the above [11], which is a diagnostic agent for cancer or neurodegenerative disease,
[13] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, or a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 or a partial peptide thereof or a salt thereof A screening method for a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the formation of the complex according to the above [1],
[14] The above-mentioned method, wherein a cell having the ability to produce a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 45, a partial peptide thereof, or a salt thereof is used. 13] The screening method according to the above,
[15] Contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, or SEQ ID NO: 51 A screening method according to the above [13], characterized by using a cell having the ability to produce a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof,
[15a] The partial peptide of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 is located at positions 2162 to 2412 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 The screening method according to [13] above, which is a partial peptide having the amino acid sequence of 2206th to 2355th or 2141st to 2351st,
[15b] The partial peptide of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 is the 1960th to 2299th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 , The screening method according to [13] above, which is a partial peptide having the amino acid sequence of 2156th to 2314th or 2174th to 2565th,
[15c] The partial peptide of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 is from the 2295th to 2705th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48. The screening method according to [13] above, which is a partial peptide having the amino acid sequence of:
[15d] The partial peptide of the protein containing the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 is the 68th to 286th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49. The screening method according to [13] above, which is a partial peptide having the amino acid sequence of:
[15e] The partial peptide of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 is from the 201st to the 525th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 Or the screening method according to [13] above, which is a partial peptide having the amino acid sequence of positions 215 to 506,
[15f] The partial peptide of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 is the 282nd to 356th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51. The screening method according to [13] above, which is a partial peptide having the amino acid sequence of:
[15g] The above-mentioned [13, wherein the partial peptide of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 The screening method described in the above,
[16] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (b) SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51, or a partial peptide thereof, or a salt thereof A screening kit for a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the formation of the complex according to the above [1],
[16a] A compound or a salt thereof that inhibits the formation of the complex according to [1] obtained using the screening method according to [13] or the screening kit according to [16],
[16b] A compound or a salt thereof that promotes the formation of the complex according to [1] obtained using the screening method according to [13] or the screening kit according to [16],
[16c] A medicament comprising the compound or salt thereof according to [16a] above,
[16d] A medicament comprising the compound of the above [16b] or a salt thereof,
[16e] The medicament according to [16c] above, which is a cancer cell apoptosis promoter or cancer preventive / therapeutic agent,
[16f] The medicament according to [16d] above, which is a neuronal apoptosis inhibitor or a preventive / therapeutic agent for neurodegenerative diseases,
[17] A cancer cell apoptosis promoter or cancer preventive / therapeutic agent comprising a compound or a salt thereof that inhibits the formation of the complex according to [1] above,
[17a] A compound or a salt thereof that inhibits formation of the complex according to [1] above,
[18] A neuronal apoptosis inhibitor or a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases, comprising a compound or salt thereof that promotes the formation of the complex according to [1] above,
[18a] A compound or a salt thereof that promotes formation of the complex according to [1] above,
[19] Contains an amino acid sequence that is identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, or SEQ ID NO: 51. A method for screening a compound having a preventive / therapeutic effect on cancer or neurodegenerative diseases or a salt thereof, characterized by using a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof,
[20] A method for promoting apoptosis of cancer cells or a method for preventing or treating cancer, which comprises inhibiting the formation of the complex according to [1] above,
[21] A method for inhibiting apoptosis of neuronal cells or a method for preventing / treating neurodegenerative diseases characterized by promoting the formation of the complex according to [1] above,
[22] A method for promoting apoptosis of cancer cells or a method for preventing or treating cancer, which comprises administering an effective amount of the antibody according to [4] to a mammal,
[23] A method for inhibiting apoptosis of neuronal cells or a method for preventing or treating neurodegenerative diseases, which comprises administering an effective amount of the antibody according to [5] to a mammal,
[24] Use of the antibody according to [4] above for the production of a cancer cell apoptosis promoter or a cancer preventive / therapeutic agent,
[25] Use of the antibody according to [5] above for the manufacture of a neuronal apoptosis inhibitor or a preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease,
[26] Use of the complex according to
（a）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（b）配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の形成を阻害する化合物またはその塩は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）などの予防・治療剤として、上記複合体の形成を促進する化合物またはその塩は、例えば神経変性疾患（例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）など）などの予防・治療剤として有用である。
配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、癌、神経変性疾患などの予防・治療剤のスクリーニング、癌、神経変性疾患などの診断に有用である。
(A) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 or a partial peptide thereof or a salt thereof; and (b) SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: : 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, or a complex containing a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 or a partial peptide thereof or a salt thereof The compound that inhibits formation or a salt thereof is, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis. As a prophylactic / therapeutic agent for cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.), a compound or a salt thereof that promotes the formation of the complex is, for example, Diseases (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease), etc.) is useful as a preventive and therapeutic agent, such as.
A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51, or The partial peptide or a salt thereof is useful for screening for preventive / therapeutic agents for cancer, neurodegenerative diseases and the like, and for diagnosis of cancer, neurodegenerative diseases and the like.
本明細書では、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を、TACT427タンパク質と称する。配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を、FLNAタンパク質と称する。配列番号：４７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を、FLNBタンパク質と称する。配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を、FLNCタンパク質と称する。配列番号：４９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を、NAV2タンパク質と称する。配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を、BTBD2タンパク質と称する。配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を、RAB3IL1タンパク質と称する。
TACT427タンパク質、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質を、まとめて、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と、略称することもある。
本発明のタンパク質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、赤血球、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例、MEL，M1，CTLL-2，HT-2，WEHI-3，HL-60，JOSK-1，K562，ML-1，MOLT-3，MOLT-4，MOLT-10，CCRF-CEM，TALL-1，Jurkat，CCRT-HSB-2，KE-37，SKW-3，HUT-78，HUT-102，H9，U937，THP-1，HEL，JK-1，CMK，KO-812，MEG-01など）などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
In the present specification, a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is referred to as TACT427 protein. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 is referred to as FLNA protein. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 is referred to as FLNB protein. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 is referred to as FLNC protein. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 is referred to as NAV2 protein. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 is referred to as BTBD2 protein. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 is referred to as RAB3IL1 protein.
The TACT427 protein, FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein may be collectively abbreviated as the protein of the present invention or the protein used in the present invention.
The protein of the present invention can be used in cells of humans and warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys, etc.), such as hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, Pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T Cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), erythrocytes, megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts , Breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells are present, for example, the brain, each part of the brain (eg, olfactory bulb) Amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung , Gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, or blood cell Cultured cells (eg, MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM , TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG -01 etc.) or a synthetic protein may be used.
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも、本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
以下のアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。
The protein in the present specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation. In the protein of the present invention, the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO − ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR).
Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc., for example, phenyl C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl, C 7- such as phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or α-naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl 14 aralkyl group, pivaloyloxymethyl group is used.
When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the protein of the present invention also includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
Furthermore, in the protein of the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is a protecting group (eg, C 1-6 acyl such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group, acetyl group, etc.). Group, etc.), an N-terminal glutamine residue produced by cleavage in vivo is pyroglutamine oxidized, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (eg, —OH, —SH, Amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are protected with an appropriate protecting group (for example, C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl group, etc.) Or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
The homology of the following amino acid sequences is determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) and the following conditions (expected value = 10; allow gaps; matrix = BLOSUM62; filtering = OFF) ).
TACT427タンパク質としては、例えば、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質などが用いられる。さらには、配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質なども、TACT427タンパク質に含まれる。 Examples of the TACT427 protein include SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 27 is used. Furthermore, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is also included in the TACT427 protein.
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の４７番目から２９６番目のアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列の４７番目から２９６番目のアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：１７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列の４３番目から２９２番目のアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号：１７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の４７番目から２９６番目のアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の４３番目から２９２番目のアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列の４７番目から２９６番目のアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：２７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列の４３番目から２９２番目のアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号：２７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：７で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号：７で表されるアミノ酸配列の５７７番目から５９４番目のアミノ酸配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferable.
The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95%, relative to the 47th to 296th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Examples thereof include amino acid sequences having the above homology.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 described above. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferable.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 described above. A protein having substantially the same quality of activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is preferable.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95%, relative to the amino acid sequence from the 47th to the 296th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 Examples thereof include amino acid sequences having the above homology.
Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 include the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 described above. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is preferable.
The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95%, with respect to the amino acid sequence from the 43rd to the 292nd of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 Examples thereof include amino acid sequences having the above homology.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 include an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 described above. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is preferable.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95%, relative to the 47th to 296th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Examples thereof include amino acid sequences having the above homology.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 include an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 described above. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is preferable.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95%, with respect to the amino acid sequence from the 43rd to the 292nd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 Examples thereof include amino acid sequences having the above homology.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 include an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 described above. A protein having substantially the same quality of activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is preferable.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable. For example, it is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95% with respect to the amino acid sequence of the 47th to 296th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 Examples thereof include amino acid sequences having the above homology.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 include an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 described above. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is preferable.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95%, with respect to the amino acid sequence from the 43rd to the 292nd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 Examples thereof include amino acid sequences having the above homology.
Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 include the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 described above. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is preferable.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95%, relative to the 577th to 594th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 Examples thereof include amino acid sequences having the above homology.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 described above. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is preferable.
実質的に同質の活性としては、例えば、クロロパーオキシダーゼ活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、クロロパーオキシダーゼ活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
クロロパーオキシダーゼ活性の測定は、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー (J. Biol. Chem.) 241巻、1763〜1768頁（1966年）などに記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
Examples of substantially the same quality of activity include chloroperoxidase activity. Substantially homogeneous indicates that their properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, the chloroperoxidase activity is preferably equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as degree, molecular weight of the protein may vary.
The measurement of chloroperoxidase activity may be carried out according to a known method. For example, the method described in Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 241, 1763-1768 (1966) or the like It can measure according to the method according to it.
また、TACT427タンパク質としては、例えば、（i）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
Examples of the TACT427 protein include (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, 1 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably (Ii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, or 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, preferably About 1-10 pieces More preferably, an amino acid sequence to which a number (1 to 5) amino acids are added, (iii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: : 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, or 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, Preferably, about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids are inserted, (iv) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, or 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 , Preferably about 1-30 A so-called mutein such as a protein containing an amino acid sequence in which preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids, or (v) an amino acid sequence combining them. Is also included.
When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
TACT427タンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
TACT427タンパク質の部分ペプチドとしては、前記したTACT427タンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記したTACT427タンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、TACT427タンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
具体的には、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
Specific examples of the TACT427 protein include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, and SEQ ID NO: 27 Examples thereof include proteins containing the amino acid sequences represented.
As the partial peptide of TACT427 protein, any partial peptide of TACT427 protein described above may be used as long as it has the same properties as TACT427 protein described above.
For example, a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more among the constituent amino acid sequences of TACT427 protein is used. It is done.
Specific examples include a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45.
配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51 is SEQ ID NO: 46. , SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51 and about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90%. As described above, amino acid sequences having homology of about 95% or more are most preferable.
As a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51, For example, it contains an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51. A protein having substantially the same activity as the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51 Etc. are preferable.
実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、かかる活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 Substantially homogeneous indicates that their properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. Therefore, it is preferable that such activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times), but the degree of these activities, Quantitative factors such as protein molecular weight may be different.
FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質としては、それぞれ、例えば、（i）配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０または配列番号：５１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
Examples of the FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein include (i) SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) Amino acid sequence from which amino acid is deleted, (ii) Amino acid represented by SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51 One or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) of arrays (Iii) SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, or 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 An amino acid sequence in which one or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are inserted, (iv) a sequence No. 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 (for example, about 1 to 100, preferably Is an amino acid sequence in which about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids, or (v) an amino acid sequence combining them. So-called muteins such as proteins containing also included.
When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが、それぞれ挙げられる。
FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質の部分ペプチドとしては、前記したFLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記したFLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
具体例として、FLNAタンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の第2162番目〜第2412番目、第2206番目〜第2355番目または第2141番目〜第2351番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドが挙げられる。FLNBタンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列の第1960番目〜第2299番目、第2156番目〜第2314番目または第2174番目〜第2565番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドが挙げられる。FLNCタンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の第2295番目〜第2705番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドが挙げられる。NAV2タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列の第68番目〜第286番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドが挙げられる。BTBD2タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の第201番目〜第525番目または第215番目〜第506番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドが挙げられる。RAB3IL1タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列の第282番目〜第356番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドが挙げられる。
Specific examples of FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50, Examples thereof include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
The partial peptide of FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein is preferably a partial peptide of the aforementioned FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, May be any one as long as it has the same properties as the FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein described above.
For example, at least 20 or more of the constituent amino acid sequences of FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, Most preferably, a peptide having an amino acid sequence of 200 or more is used.
As a specific example, as a partial peptide of FLNA protein, for example, amino acids 2162 to 2412, 2206 to 2355, or 2141 to 2351 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 Examples include partial peptides having a sequence. As a partial peptide of FLNB protein, for example, a portion having the amino acid sequence of 1960th to 2299th, 2156th to 2314th, or 2174th to 2565th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 Peptides are mentioned. Examples of the partial peptide of the FLNC protein include a partial peptide having the amino acid sequence from the 2295th to the 2705th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48. Examples of the partial peptide of NAV2 protein include a partial peptide having the 68th to 286th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49. Examples of the partial peptide of the BTBD2 protein include a partial peptide having the amino acid sequence from the 201st to the 525th or from the 215th to the 506th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50. Examples of the partial peptide of RAB3IL1 protein include a partial peptide having the 282nd to 356th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
また、本発明のタンパク質の部分ペプチド（本発明で用いられる部分ペプチド）は、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した、本発明のタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
Moreover, the partial peptide (partial peptide used in the present invention) of the protein of the present invention is 1 or 2 (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) in the amino acid sequence. ) Amino acids, or one or more (preferably about 1-20, more preferably about 1-10, and even more preferably (1-5)) amino acids in the amino acid sequence. Or 1 or 2 (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are inserted into the amino acid sequence, Alternatively, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence may be substituted with other amino acids. .
In the partial peptide used in the present invention, the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO − ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR).
Furthermore, the partial peptide used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus and an N-terminal amino acid residue (eg, Methionine residue) amino group is protected with a protecting group, N-terminal side is cleaved in vivo, glutamine residue produced is pyroglutamine oxidized, substituent on amino acid side chain in molecule is suitable Also included are those that are protected by various protecting groups, or complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
The partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for antibody production.
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、、後述の参考例に従って、または前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
As a salt of the protein of the present invention or a partial peptide thereof, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or base (eg, alkali metal salt) is used. Acceptable acid addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
The protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced according to a reference example described later, or from a human or warm-blooded animal cell or tissue described above by a known protein purification method. It can also be produced by culturing a transformant containing the encoded DNA. Moreover, it can also manufacture according to the below-mentioned peptide synthesis method.
When producing from human or mammalian tissue or cells, the human or mammalian tissue or cells are homogenized and then extracted with acid, etc., and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
For the synthesis of the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof, or an amide thereof, a commercially available resin for protein synthesis can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl. Examples include phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid in which the α-amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or their amides To do.
For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimide, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric acid anhydride, HOBt ester or HOBt ester. It can later be added to the resin.
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。 The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide, etc. Examples include sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for protein bond forming reactions, and is usually selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even if the reaction is repeated, acetylation of the unreacted amino acid with acetic anhydride or acetylimidazole can prevent the subsequent reaction from being affected.
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
Examples of the protective group for the amino group of the raw material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group is, for example, alkyl esterified (eg, linear, branched or cyclic alkyl ester such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc. ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxy It can be protected by carbonyl hydrazation, trityl hydrazation or the like.
The hydroxyl group of serine can be protected by, for example, esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include groups derived from carbonic acid such as lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups. Used. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like.
Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc, and the like.
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like. As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoro. Acid treatment with romethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4 -Addition of a cation scavenger such as butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the removal of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein or partial peptide, for example, first, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then the peptide (protein) chain is moved to the desired chain length on the amino group side. After extending, a protein or partial peptide from which only the N-terminal α-amino group protecting group of the peptide chain has been removed and a protein or partial peptide from which only the C-terminal carboxyl group protecting group has been prepared, The protein or peptide is condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein or peptide obtained by condensation, all the protecting groups can be removed by the above method to obtain the desired crude protein or peptide. This crude protein or peptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain an amide of the desired protein or peptide.
In order to obtain a protein or peptide ester, for example, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired protein or peptide amide is obtained in the same manner as the protein or peptide amide. An ester of a peptide can be obtained.
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が挙げられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス(Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
The partial peptide used in the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protective group, the target peptide can be produced by removing the protective group. it can. Examples of known condensation methods and protecting group elimination include the methods described in the following (i) to (v).
(I) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(Ii) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(Iii) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(Iv) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara,
(V) Supervised by Haruaki Yajima, Development of follow-up drugs, Volume 14, Peptide synthesis, Hirokawa Shoten Also, after the reaction, usual purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, etc. Can be combined to purify and isolate the partial peptide used in the present invention. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method equivalent thereto, and conversely, when obtained as a salt, the known method or a method equivalent thereto. It can be converted to the free form or other salts by methods.
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
The polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the protein of the present invention described above. Preferably it is DNA. The DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA.
The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.
TACT427タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
（i）配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ii）配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（iii）配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（iv）配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（v）配列番号：１６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（vi）配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（vii）配列番号：２１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（viii）配列番号：２３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ix）配列番号：２６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（x）配列番号：２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
As DNA encoding the TACT427 protein, for example,
(I) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a base sequence which hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions; SEQ ID NO: 1 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(Ii) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a base sequence which hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 under highly stringent conditions; SEQ ID NO: 4 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(Iii) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a base sequence which hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 under highly stringent conditions; SEQ ID NO: 7 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(Iv) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 under highly stringent conditions; SEQ ID NO: 10 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(V) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 under highly stringent conditions; SEQ ID NO: 15 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(Vi) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or a base sequence which hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 under highly stringent conditions; SEQ ID NO: 17 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(Vii) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 under highly stringent conditions, SEQ ID NO: 20 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(Viii) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 under highly stringent conditions; SEQ ID NO: 22 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(Ix) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 under highly stringent conditions, SEQ ID NO: 25 DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
(X) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 under highly stringent conditions, SEQ ID NO: 27 Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。例えば、配列番号：５で表される塩基配列の１３９番目から８８８番目の塩基配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなども用いられる。
配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。例えば、配列番号：８で表される塩基配列の１７２８番目から１７８２番目の塩基配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなども用いられる。
配列番号：１１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１１で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１６で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１８で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２１で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２３で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２６で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２８で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；フィルタリング＝ON；マッチスコア＝1；ミスマッチスコア＝-3）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95% with respect to the 139th to 888th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 A DNA containing a base sequence having the above homology is also used.
Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 8. Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 95% with respect to the 1728th to 1784th base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 A DNA containing a base sequence having the above homology is also used.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 under highly stringent conditions is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 11; Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 16. Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 under highly stringent conditions is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 18; Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 under highly stringent conditions is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 21, Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 23, Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 under highly stringent conditions is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 under highly stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 28, Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
The homology of the base sequence was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; allow gap; filtering = ON; match score = 1) It can be calculated by mismatch score = -3).
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The highly stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
より具体的には、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（ii）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（iii）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（iv）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（v）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１６で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：１９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（vi）配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：１９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（vii）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２１で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（viii）配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２３で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（ix）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：２９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、
（x）配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：２９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
More specifically, (i) a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. DNA containing the nucleotide sequence represented,
(Ii) As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 Contains DNA etc.
(Iii) As a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 Contains DNA etc.
(Iv) As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 Contains DNA etc.
(V) As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 Contains DNA etc.
(Vi) As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 Contains DNA etc.
(Vii) As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 Contains DNA etc.
(Viii) As a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 Contains DNA etc.
(Ix) As a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 Contains DNA etc.
(X) DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 The contained DNA is used.
FLNAタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
FLNBタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
FLNCタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
NAV2タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
BTBD2タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
RAB3IL1タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；フィルタリング＝ON；マッチスコア＝1；ミスマッチスコア＝-3）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
Examples of the DNA encoding the FLNA protein include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 52, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 52 under highly stringent conditions. And a DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46.
Examples of the DNA encoding the FLNB protein include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 53, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 53 under highly stringent conditions. And a DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47.
Examples of the DNA encoding the FLNC protein include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 54, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 54 under highly stringent conditions. And a DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48.
Examples of DNA encoding the NAV2 protein include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 55, or nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 55 under highly stringent conditions. And a DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49.
Examples of the DNA encoding the BTBD2 protein include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 56, or a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 56 under highly stringent conditions. And a DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50.
Examples of DNA encoding RAB3IL1 protein include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57, or nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57 under highly stringent conditions. And a DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
As a DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57 under highly stringent conditions, For example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57 and about 70% or more, preferably about 80% or more, Particularly preferred is DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
The homology of the base sequence was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; allow gap; filtering = ON; match score = 1) It can be calculated by mismatch score = -3).
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The highly stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
具体的には、（i）配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ii）配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（iii）配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（iv）配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５５で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（v）配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（vi）配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。 Specifically, (i) DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 52, (ii) sequence Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by No. 47 include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID No. 53, (iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 48 As a DNA encoding a protein containing, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 54, etc. (iv) as a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 Is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 55, and the like (v) encodes a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 Examples of NA include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 56, and (vi) DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 includes SEQ ID NO: 56. A DNA containing the represented base sequence is used.
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
TACT427タンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、TACT427タンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
The polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide used in the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
Examples of DNA encoding a partial peptide of TACT427 protein include SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, and sequence. DNA having a part of DNA containing the base sequence represented by No: 23, SEQ ID No: 26 or SEQ ID No: 28, or SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 11, Contains the base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 28 under highly stringent conditions In addition, DNA containing a part of DNA encoding a protein having substantially the same activity as the TACT427 protein is used.
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28 A DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented has the same significance as described above.
Hybridization methods and highly stringent conditions are the same as those described above.
FLNAタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５２で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：５２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
FLNBタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５３で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：５３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
FLNCタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５４で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：５４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
NAV2タンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５５で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：５５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
BTBD2タンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５６で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：５６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
RAB3IL1タンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５７で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：５７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６または配列番号：５７で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
Examples of the DNA encoding the partial peptide of the FLNA protein include DNA having a part of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 52, or highly stringent with the base sequence represented by SEQ ID NO: 52 DNA containing a part of DNA encoding a protein containing a base sequence that hybridizes under conditions and having substantially the same quality of activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 is used. .
Examples of the DNA encoding the partial peptide of the FLNB protein include DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 53, or highly stringent with the base sequence represented by SEQ ID NO: 53. DNA containing a portion of DNA encoding a protein containing a base sequence that hybridizes under conditions and having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 is used. .
Examples of the DNA encoding the partial peptide of the FLNC protein include DNA having a part of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 54, or highly stringent with the base sequence represented by SEQ ID NO: 54. DNA containing a portion of DNA encoding a protein containing a base sequence that hybridizes under conditions and having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 is used. .
Examples of DNA encoding a partial peptide of NAV2 protein include DNA having a part of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 55, or highly stringent with the base sequence represented by SEQ ID NO: 55. DNA containing a portion of DNA encoding a protein containing a base sequence that hybridizes under conditions and having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 is used. .
Examples of DNA encoding a partial peptide of BTBD2 protein include DNA having a part of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 56, or highly stringent with the base sequence represented by SEQ ID NO: 56. DNA containing a portion of DNA encoding a protein containing a base sequence that hybridizes under conditions and having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 is used. .
Examples of the DNA encoding the partial peptide of RAB3IL1 protein include DNA having a part of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 57, or highly stringent with the base sequence represented by SEQ ID NO: 57. DNA containing a portion of DNA encoding a protein containing a base sequence that hybridizes under conditions and having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 is used. .
The DNA capable of hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 or SEQ ID NO: 57 has the same significance as described above.
Hybridization methods and highly stringent conditions are the same as those described above.
本発明のタンパク質およびその部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
As a means of cloning DNA that completely encodes the protein of the present invention and its partial peptide (hereinafter, in the description of cloning and expression of DNA encoding them, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention). Is amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the base sequence encoding the protein of the present invention, or encodes a part or the entire region of the protein of the present invention by DNA incorporated into an appropriate vector Selection can be performed by hybridization with a DNA fragment or one labeled with synthetic DNA. The hybridization method can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), for example. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
The DNA base sequence is converted by PCR, a known kit such as Mutan ™ -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan ™ -K (Takara Shuzo), etc., using the ODA-LA PCR method, It can be carried out according to a method known per se such as the Gapped duplex method and the Kunkel method or a method analogous thereto.
The DNA encoding the cloned protein can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The protein expression vector of the present invention is, for example, (a) excising the target DNA fragment from the DNA encoding the protein of the present invention, and (b) ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. Can be manufactured.
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
Examples of the vector include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), plasmids derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Of these, the CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter and the like are preferably used. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, .lambda.P L promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc. When the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. When the host is yeast, the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Selectable markers include, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo r, G418 resistance). In particular, when a dhfr gene-deficient Chinese hamster cell is used and the dhfr gene is used as a selection marker, the target gene can also be selected by a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. When the host is Escherichia, the PhoA signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, the α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In some cases, MFα • signal sequence, SUC2 • signal sequence, etc. When the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced using a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，60巻,160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology,120巻,517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12 · DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] Etc. are used.
Examples of the Bacillus bacterium include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)].
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R − , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Used.
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、In Vivo,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Nature,315巻,592(1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five ™ derived from eggs of Trichoplusia ni Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, sputum-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like.
Examples of insects include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr − ) cells), mouse L Cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, human FL cells and the like are used.
Transformation of Escherichia can be performed, for example, according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982).
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics,168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75巻，1929(1978）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology,6,47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
In order to transform yeast, for example, the method described in Methods in Enzymology, 194, 182-287 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) and the like can be performed. it can.
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
In order to transform animal cells, for example, Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, Vol. 52, 456 (1973).
In this way, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding the protein can be obtained.
When cultivating a transformant whose host is an Escherichia bacterium or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, including a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean cake, and potato extract. Examples of inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., Nature,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science,122巻,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,8巻,396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association 199巻,519(1967)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73巻,1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) is preferable. . In order to make the promoter work efficiently as necessary, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added.
When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When cultivating a transformant whose host is yeast, examples of the medium include a Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, 4505 (1980)]. And SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)]. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an insect cell or an insect, an appropriate medium such as 10% bovine serum that has been immobilized on Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) is used as the medium. Additions etc. are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When culturing a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include MEM medium (Science, Vol. 122, 501 (1952)) containing about 5 to 20% fetal calf serum, DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc. Is used. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
As described above, the protein of the present invention can be produced inside the cell, the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
Separation and purification of the protein of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw, etc. A method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration after destroying cells or cells by the method is appropriately used. The buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells and the supernatant are separated by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of the protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point, such as a method or isoelectric focusing method, is used.
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
When the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely when it is obtained as a salt, a method known per se or a method analogous thereto Can be converted to the free form or other salts.
The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
The presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by enzyme immunoassay or Western blotting using a specific antibody.
以下、TACT427タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、単にTACT427タンパク質と、FLNAタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、単にFLNAタンパク質と、FLNBタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、単にFLNBタンパク質と、FLNCタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、単にFLNCタンパク質と、NAV2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、単にNAV2タンパク質と、BTBD2タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、単にBTBD2タンパク質と、RAB3IL1タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、単にRAB3IL1タンパク質とそれぞれ略記する。
（a）TACT427タンパク質、および（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質から選ばれる一または二種以上を含有する複合体を、本発明の複合体と略称することもある。
本発明の複合体は、TACT427タンパク質、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質または（および）RAB3IL1タンパク質に加え、上記以外のタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、核酸、脂質、糖類、アミド基、リン酸基などを含んでいてもよい。例えば、TACT427タンパク質、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質は、アミド化されていてもよく、リン酸化されたアミノ酸を含んでいてもよく、脂質（例、ミリスチン酸など）結合アミノ酸を含んでいてもよく、いかなる翻訳後修飾を受けていても限定されない。翻訳後修飾を受ける領域として、例えば、配列番号：４５で表わされるアミノ酸配列に相当する領域などが挙げられる。
本発明の複合体としては、例えば、（a）TACT427タンパク質の細胞質側ドメイン（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）と（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質から選ばれる一または二種以上を含有している複合体、例えば、（a）TACT427タンパク質の細胞質側ドメイン（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）と（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質から選ばれる一または二種以上とが結合している複合体などが挙げられる。具体例としては、（1）TACT427タンパク質の細胞質側ドメイン（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）とFLNAタンパク質とが結合している複合体、（2）TACT427タンパク質の細胞質側ドメイン（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）とFLNBタンパク質とが結合している複合体、（3）TACT427タンパク質の細胞質側ドメイン（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）とFLNCタンパク質とが結合している複合体、（4）TACT427タンパク質の細胞質側ドメイン（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）とNAV2タンパク質とが結合している複合体、（5）TACT427タンパク質の細胞質側ドメイン（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）とBTBD2タンパク質とが結合している複合体、（6）TACT427タンパク質の細胞質側ドメイン（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）とRAB3IL1タンパク質とが結合している複合体などが挙げられる。
FLNAタンパク質の、TACT427タンパク質との結合活性を有する領域としては、例えば、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の第2162番目〜第2412番目、第2206番目〜第2355番目または第2141番目〜第2351番目が挙げられる。
FLNBタンパク質の、TACT427タンパク質との結合活性を有する領域としては、例えば、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列の第1960番目〜第2299番目、第2156番目〜第2314番目または第2174番目〜第2565番目が挙げられる。
FLNCタンパク質の、TACT427タンパク質との結合活性を有する領域としては、例えば、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の第2295番目〜第2705番目が挙げられる。
NAV2タンパク質の、TACT427タンパク質との結合活性を有する領域としては、例えば、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列の第68番目〜第286番目が挙げられる。
BTBD2タンパク質の、TACT427タンパク質との結合活性を有する領域としては、例えば、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の第201番目〜第525番目または第215番目〜第506番目が挙げられる。
RAB3IL1タンパク質の、TACT427タンパク質との結合活性を有する領域としては、例えば、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列の第282番目〜第356番目が挙げられる。
Hereinafter, TACT427 protein or its partial peptide or salt thereof, simply TACT427 protein, FLNA protein or its partial peptide or salt thereof, simply FLNA protein, FLNB protein or its partial peptide or salt thereof, simply FLNB protein, FLNC protein or partial peptide or salt thereof, simply FLNC protein, NAV2 protein or partial peptide or salt thereof, simply NAV2 protein, BTBD2 protein or partial peptide or salt thereof, simply BTBD2 protein, RAB3IL1 protein Alternatively, the partial peptide or a salt thereof is simply abbreviated as RAB3IL1 protein.
A complex containing one or more selected from (a) TACT427 protein and (b) FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein is abbreviated as the complex of the present invention. Sometimes.
In addition to TACT427 protein, FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or (and) RAB3IL1 protein, the complex of the present invention includes proteins, peptides, RNA, nucleic acids, lipids, saccharides, amide groups other than the above. And may contain a phosphate group or the like. For example, TACT427 protein, FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein may be amidated, may contain phosphorylated amino acids, and may be lipids (eg, myristic acid). Etc.) It may contain linked amino acids and is not limited to any post-translational modification. Examples of the region subjected to post-translational modification include a region corresponding to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45.
Examples of the complex of the present invention include (a) a cytoplasmic domain of TACT427 protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45) and (b) FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, A complex containing one or more selected from NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein, for example, (a) cytoplasmic domain of TACT427 protein (eg, having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45) Peptide) and (b) a complex in which one or more selected from FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein are bound. Specific examples include (1) a complex in which the cytoplasmic domain of TACT427 protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45) and FLNA protein are bound, and (2) TACT427 protein A complex in which a cytoplasmic domain (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45) and the FLNB protein are bound, (3) a cytoplasmic domain of the TACT427 protein (eg, SEQ ID NO: 45) A complex in which a FLNC protein is bound to a peptide having an amino acid sequence represented by (4) a cytoplasmic domain of the TACT427 protein (eg, a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45); (5) a cytoplasmic domain of TACT427 protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45) (6) a cytoplasmic domain of the TACT427 protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45) and the RAB3IL1 protein And the like.
Examples of the region of the FLNA protein having the binding activity to the TACT427 protein include, for example, the 2162st to 2412th, 2206th to 2355th, or 2141st to 2141th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46. The 2351st is mentioned.
Examples of the region of the FLNB protein having the binding activity to the TACT427 protein include, for example, the 1960th to 2299th, 2156th to 2314th, or 2174th to 2nd of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47. The 2565th is mentioned.
Examples of the region of the FLNC protein having the binding activity to the TACT427 protein include the 2295th to 2705th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 48.
Examples of the region of the NAV2 protein having the binding activity to the TACT427 protein include the 68th to 286th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 49.
Examples of the region of the BTBD2 protein having the binding activity to the TACT427 protein include the 201st to 525th amino acids and the 215th to 506th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50.
Examples of the region of the RAB3IL1 protein having the binding activity to the TACT427 protein include the 282nd to 356th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 51.
本発明の複合体の形成を阻害または促進する活性を有するTACT427タンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略称することもある）は、本発明の複合体の形成を阻害または促進する活性を有し、TACT427タンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明の抗体は、TACT427タンパク質を抗原（以下、抗原タンパク質と略することもある）として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
さらに、本発明の複合体を認識する抗体も本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
抗原タンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Nature、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
An antibody against TACT427 protein having an activity of inhibiting or promoting the formation of the complex of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) has an activity of inhibiting or promoting the formation of the complex of the present invention. Any antibody that can recognize the TACT427 protein may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
The antibody of the present invention can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se using TACT427 protein as an antigen (hereinafter sometimes abbreviated as antigen protein).
Furthermore, an antibody that recognizes the complex of the present invention can also be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se, using the protein of the present invention as an antigen.
[Production of monoclonal antibodies]
(A) Production of Monoclonal Antibody-Producing Cells Antigen proteins are administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible by administration, or together with carriers and diluents. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, select an individual with a recognized antibody titer from a warm-blooded animal immunized with an antigen, such as a mouse, and collect the spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization. Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells to be fused with myeloma cells of the same or different species. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus. Preferably, PEG is used.
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
Examples of myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then a radioactive substance or An anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or the like (when the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A, and a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase; Examples include a method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase on which a globulin antibody or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As the selection and breeding medium, any medium may be used as long as it can grow a hybridoma. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1-10% fetal bovine serum, or serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から抗原タンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
(B) Purification of monoclonal antibody Separation and purification of the monoclonal antibody can be performed by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange method. Absorption / desorption method by body (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase, or an antibody-active adsorbent such as protein A or protein G. Purification method].
[Preparation of polyclonal antibody]
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immune antigen (protein antigen) itself or a complex of it and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above monoclonal antibody production method. It can be produced by collecting and performing antibody separation and purification.
Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used to immunize warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are effective for antibodies against hapten immunized by cross-linking to carrier. As long as it is possible, any substance may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin and the like are about 0.1 to 20, preferably about 1 with respect to
In addition, various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, but active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the above method.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the antiserum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明の抗体、および本発明の複合体などの用途を説明する。
〔１〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
TACT427タンパク質は癌組織で発現が亢進しており、さらに、TACT427タンパク質の機能（活性、発現など）を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こす。
また、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質は、TACT427タンパク質の細胞質側ドメインに結合し、TACT427タンパク質の機能を担っていると考えられる。
従って、本発明の複合体の形成を阻害する化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）、例えば、（a）TACT427タンパク質と（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質から選ばれる一または二種以上による複合体の形成を阻害する化合物、好ましくは、（a）TACT427タンパク質と（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質から選ばれる一または二種以上との結合〔例、（1）TACT427タンパク質とFLNAタンパク質との結合、（2）TACT427タンパク質とFLNBタンパク質との結合、（3）TACT427タンパク質とFLNCタンパク質との結合、（4）TACT427タンパク質とNAV2タンパク質との結合、（5）TACT427タンパク質とBTBD2タンパク質との結合、（6）TACT427タンパク質とRAB3IL1タンパク質との結合など〕を阻害する化合物またはその塩は、癌細胞のアポトーシス誘導作用を有し、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などとして使用することができる。
本発明の複合体の形成を促進する化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）、例えば、（a）TACT427タンパク質と（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質から選ばれる一または二種以上による複合体の形成を促進する化合物、好ましくは、（a）TACT427タンパク質と（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質およびRAB3IL1タンパク質から選ばれる一または二種以上との結合〔例、（1）TACT427タンパク質とFLNAタンパク質との結合、（2）TACT427タンパク質とFLNBタンパク質との結合、（3）TACT427タンパク質とFLNCタンパク質との結合、（4）TACT427タンパク質とNAV2タンパク質との結合、（5）TACT427タンパク質とBTBD2タンパク質との結合、（6）TACT427タンパク質とRAB3IL1タンパク質との結合など〕を促進する化合物またはその塩は、神経細胞のアポトーシス抑制作用を有し、例えば、神経変性疾患（例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）などの予防・治療剤、神経細胞のアポトーシス阻害（抑制）剤などとして使用することができる。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明の複合体の形成を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明の複合体の形成〔例、上記（1）〜（6）の結合〕を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法には、本発明のタンパク質が用いられ、さらには、TACT427タンパク質の細胞質側ドメインに相当するペプチドが用いられてもよい。また、本発明のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞（好ましくは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体（例、酵母、動物細胞などの細胞など））が用いられてもよい。該細胞としては、例えば、（a）TACT427タンパク質をコードするＤＮＡ（例、TACT427タンパク質の細胞質側ドメインに相当するペプチドをコードするＤＮＡ）および（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体が用いられる。
The protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), the DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the DNA of the present invention) The use of the antibody of the present invention and the complex of the present invention will be described.
[1] Screening of drug candidate compounds for disease
The expression of TACT427 protein is increased in cancer tissues. Further, inhibition of the function (activity, expression, etc.) of TACT427 protein causes cancer cells to undergo apoptosis.
In addition, FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein are considered to bind to the cytoplasmic domain of TACT427 protein and to carry out the function of TACT427 protein.
Therefore, compounds that inhibit the formation of the complex of the present invention (eg, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.) For example, (a) a compound that inhibits the formation of a complex by one or more selected from TACT427 protein and (b) FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein, Binding of (a) TACT427 protein to (b) one or more selected from (b) FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein [eg, (1) between TACT427 protein and FLNA protein Binding, (2) binding between TACT427 protein and FLNB protein, (3) binding between TACT427 protein and FLNC protein (4) binding of TACT427 protein to NAV2 protein, (5) binding of TACT427 protein to BTBD2 protein, (6) binding of TACT427 protein to RAB3IL1 protein, etc.) Has apoptosis-inducing action, such as cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, ovary Cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) and the like, and can be used as an apoptosis promoter for cancer cells.
Compounds that promote the formation of the complex of the present invention (eg, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.), for example A compound that promotes the formation of a complex by one or more selected from (a) TACT427 protein and (b) FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein, preferably (a ) Binding of TACT427 protein to (b) FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein and RAB3IL1 protein, or binding thereof (eg, (1) binding of TACT427 protein to FLNA protein, (2) TACT427 protein and FLNB protein binding, (3) TACT427 protein and FLNC protein binding, (4) T ACT427 protein binding to NAV2 protein, (5) TACT427 protein binding to BTBD2 protein, (6) TACT427 protein binding to RAB3IL1 protein, etc.) For example, it is used as a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), neuronal apoptosis inhibitor (suppression), etc. can do.
Therefore, the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the formation of the complex of the present invention.
That is, the present invention is a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the formation of the complex of the present invention (eg, the binding of (1) to (6) above), which comprises using the protein of the present invention. I will provide a.
In the screening method of the present invention, the protein of the present invention is used, and further, a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of TACT427 protein may be used. In addition, the screening method of the present invention comprises a cell having the ability to produce the protein of the present invention (preferably, a transformant transformed with a DNA encoding the protein of the present invention (eg, cells such as yeast and animal cells). Etc.)) may be used. Examples of the cells include (a) DNA encoding TACT427 protein (eg, DNA encoding a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of TACT427 protein) and (b) FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, A transformant transformed with DNA encoding BTBD2 protein or RAB3IL1 protein is used.
〔１ａ〕In vitro結合試験によるスクリーニング
FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質を、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質に対する抗体を用いて、固相（例、EIAプレート）に固定化するか、または、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質を、Tagタンパク質（例、His-Tag、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）等）と融合させた後、固相に固定化する。
FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質として、該タンパク質の部分ペプチドを用いる場合には、好ましくはTACT427タンパク質との結合活性を有する部分ペプチド（例、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の第2162番目〜第2412番目、第2206番目〜第2355番目または第2141番目〜第2351番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列の第1960番目〜第2299番目、第2156番目〜第2314番目または第2174番目〜第2565番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の第2295番目〜第2705番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列の第68番目〜第286番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の第201番目〜第525番目または第215番目〜第506番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列の第282番目〜第356番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチドなど）などが用いられる。
Tag付きタンパク質の固相への固定に際しては、His-Tagであればニッケル、GSTであればグルタチオンが用いられる。
（i）標識剤（例、ビオチンなど）で標識したTACT427タンパク質（例、細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドなど））を、固相化したFLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質に接触させる場合の結合量と、（ii）標識剤（例、ビオチンなど）で標識したTACT427タンパク質（例、細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド（例、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドなど））および試験化合物を、固相化したFLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質に同時に接触させる場合の結合量とを測定し、比較する。
結合量は、公知の方法、例えば、固相化されたTACT427タンパク質またはその部分ペプチドを、標識剤（例、ビオチンなど）を検出する市販のキットまたはTACT427タンパク質に対する抗体を用いて、測定する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。
例えば、上記（ii）の場合における結合量が上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少させる試験化合物を、本発明の複合体の形成を阻害する化合物（以下、結合阻害剤と略記する場合がある）として、上記（ii）の場合における活性が上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上増加させる試験化合物を、本発明の複合体の形成を促進する化合物（以下、結合促進剤と略記する場合がある）として選択する。
[1a] Screening by in vitro binding test
FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, solid phase (eg, EIA plate) using antibodies against FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein Or fused with FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein with Tag protein (eg, His-Tag, GST (glutathione-S-transferase), etc.) Thereafter, it is immobilized on a solid phase.
When a partial peptide of the protein is used as the FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, the partial peptide having a binding activity to the TACT427 protein (eg, SEQ ID NO: 46) A partial peptide having the amino acid sequence from 2162 to 2412, from 2206 to 2355, or from 2141 to 2351 of the amino acid sequence represented, 1960 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 The 2nd to 2299th, 2156th to 2314th or 2174th to 2565th amino acid sequences, and the 2295th to 2705th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 A partial peptide having the amino acid sequence of positions 68 to 286 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 A partial peptide having the 201st to 525th or 215th to 506th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50, the 282nd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 To a partial peptide having the 356th amino acid sequence, etc.).
When immobilizing a tagged protein on a solid phase, nickel is used for His-Tag and glutathione is used for GST.
(I) A TACT427 protein (eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain (eg, a partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45)) labeled with a labeling agent (eg, biotin) is immobilized. Binding amount when contacting with phased FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, and (ii) TACT427 protein (eg, cytoplasm side) labeled with a labeling agent (eg, biotin) A partial peptide corresponding to a domain (eg, a partial peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45) and a test compound are immobilized on a FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or The amount of binding when contacting with RAB3IL1 protein simultaneously is measured and compared.
The amount of binding is measured by a known method, for example, using a commercially available kit for detecting a labeling agent (for example, biotin) or an antibody against TACT427 protein for immobilized TACT427 protein or a partial peptide thereof.
Examples of the test compound include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like.
For example, a test compound in which the amount of binding in the case of (ii) is reduced by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of (i), As a compound that inhibits body formation (hereinafter sometimes abbreviated as a binding inhibitor), the activity in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30%, compared to the case (i). As mentioned above, the test compound which increases more preferably about 50% or more is selected as a compound which accelerates | stimulates formation of the composite_body | complex of this invention (henceforth abbreviated as a coupling | bonding promoter).
また、TACT427タンパク質（例、TACT427タンパク質の細胞質側ドメインに相当する部分ペプチドなど）を固相に固定化し、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質を接触させ、同様に結合量を測定してもよい。TACT427タンパク質を固相へ固定化する際には、標識剤（例、ビオチンなど）で標識されたTACT427タンパク質またはその部分ペプチド、およびアビジンで標識された固相（例、プレート）が好ましく用いられる。
（iii）固相化したTACT427タンパク質に、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質を接触させる場合の結合量と、（iv）固相化したTACT427タンパク質またはその部分ペプチドに、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質および試験化合物を同時に接触させる場合の結合量とを、測定し、比較する。
結合量は、公知の方法、例えば、固相化されたFLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質を、該タンパク質に対する抗体を用いて、測定する。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。
この方法において、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質は、Tagタンパク質と融合させたタンパク質を用いてもよく、その際には、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質を、該タンパク質に対する抗体で検出、定量してもよく、またTagタンパク質に対する抗体で検出、定量してもよい。
例えば、上記（iv）の場合における結合量が上記（iii）の場合に比べて、約２０％
以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少させる試験化合物を本発明の複合体の形成を阻害する化合物（以下、結合阻害剤と略記する場合がある）として、上記（iv）の場合における活性が上記（iii）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上増加させる試験化合物を結合促進剤として選択する。
In addition, TACT427 protein (eg, partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of TACT427 protein) is immobilized on a solid phase and contacted with FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, and so on The amount of binding may be measured. When TACT427 protein is immobilized on a solid phase, a TACT427 protein labeled with a labeling agent (eg, biotin or the like) or a partial peptide thereof, and a solid phase (eg, plate) labeled with avidin are preferably used.
(Iii) Binding amount when contacting the FLACT protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein with the immobilized TACT427 protein, and (iv) the immobilized TACT427 protein or its partial peptide In addition, the binding amount when the FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein and the test compound are simultaneously contacted is measured and compared.
The amount of binding is measured by a known method, for example, solid-phased FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein using an antibody against the protein.
Examples of the test compound include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like.
In this method, FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein may be a protein fused with Tag protein, in which case FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein may be detected and quantified with an antibody against the protein, or with an antibody against Tag protein.
For example, the binding amount in the case of (iv) is about 20% as compared with the case of (iii).
Above, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more test compound as a compound that inhibits the formation of the complex of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as binding inhibitor) (iv) In this case, a test compound that increases the activity in the case of (iii) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more is selected as a binding promoter.
〔１ｂ〕ツーハイブリッド法によるスクリーニング
〔１ｂ−１〕酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニング
（a）TACT427タンパク質の細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド（例えば、配列番号：４５で表わされるアミノ酸配列を含有する部分ペプチド）にレポーター遺伝子結合ドメインを融合させたキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質にレポーター遺伝子転写活性化ドメインを融合させたキメラタンパク質をコードするＤＮＡを酵母（例、Saccharomyces cerevisiae、より好ましくはS. cerevisiae Y190株）において同時に発現させると、ツーハイブリッドの作用により、レポーター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子およびヒスチジン合成系遺伝子HIS3の表現型が発現する。この酵母株を試験化合物の存在下、一定時間培養し、酵母株のβ−ガラクトシダーゼ活性を減少させるか、または酵母株をヒスチジン要求性に転換させる試験化合物を、結合阻害剤として選択する。
該酵母株は、上記した宿主が酵母である形質転換体の培養と同様に培養できる。β−ガラクトシダーゼの活性は、X-Gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside）、ONPG（o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside）またはCPRG（chlorophenyl red-β-D-galactopyranoside）を基質として公知の方法に従って測定することができる。HIS3表現型の発現は、ヒスチジン欠損の最小培地で酵母を培養することにより測定することができる。
選択された化合物のうち、細胞毒性のある化合物、およびレポーター遺伝子産物との相互作用などでレポーター遺伝子産物自身の活性を阻害する化合物などは、擬陽性化合物として除外する。
[1b] Screening by two-hybrid method [1b-1] Screening by yeast two-hybrid method (a) Partial peptide corresponding to cytoplasmic domain of TACT427 protein (for example, partial peptide containing amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45) ) DNA encoding a chimeric protein fused with a reporter gene binding domain, and (b) a chimera fused with a reporter gene transcription activation domain to FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein When DNA encoding a protein is simultaneously expressed in yeast (eg, Saccharomyces cerevisiae, more preferably S. cerevisiae strain Y190), the reporter gene β-galactosidase gene and The phenotype of histidine synthesis gene HIS3 is expressed. This yeast strain is cultured in the presence of the test compound for a certain period of time, and a test compound that reduces the β-galactosidase activity of the yeast strain or converts the yeast strain to histidine requirement is selected as a binding inhibitor.
The yeast strain can be cultured in the same manner as the culture of the transformant whose host is yeast. The activity of β-galactosidase is X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), ONPG (o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside) or CPRG (chlorophenyl red-β-D -galactopyranoside) can be measured according to a known method. Expression of the HIS3 phenotype can be measured by culturing yeast in a minimal medium lacking histidine.
Among the selected compounds, compounds that are cytotoxic, compounds that inhibit the activity of the reporter gene product itself due to interaction with the reporter gene product, and the like are excluded as false positive compounds.
〔１ｂ−２〕動物細胞ツーハイブリッド法によるスクリーニング
動物細胞（例、CHO細胞など）にレポーター遺伝子（例、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子など）を導入する。レポーター遺伝子の転写調節領域は、例えば動物細胞で機能するプロモーター（例、アデノウイルスE1b由来の最小プロモーター（TATA box）など）の下流に、例えばGAL1の転写活性化配列（UAS）を結合したものを用い、酵母ツーハイブリッドシステムのGAL4-GAL1の転写調節系を動物細胞内に導入し、動物細胞内でレポーター遺伝子の発現が誘導されるようにする。得られる細胞に対し、（a）TACT427タンパク質の細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド（例えば、配列番号：４５で表わされるアミノ酸配列を含有する部分ペプチド）にGAL4-DNA結合ドメインを融合させたキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および（b）FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質に単純ヘルペスウイルス由来VP16タンパク質を融合させたキメラタンパク質をコードするＤＮＡを同時に発現させると、ツーハイブリッドの作用により、レポーター遺伝子が発現する動物細胞株が得られる。この細胞株を試験化合物の存在下、一定時間培養し、レポーター遺伝子産物の活性を測定し、活性を減少させる化合物を、結合阻害剤として選択する。
該動物細胞株は、上記した宿主が動物細胞である形質転換体の培養と同様に培養できる。レポーター遺伝子産物（例、CAT、ルシフェラーゼなど）の活性は、公知の方法に従って、市販のキットを用いて測定できる。
選択された化合物のうち、細胞毒性のある化合物、およびレポーター遺伝子産物との相互作用などでレポーター遺伝子産物自身の活性を阻害する化合物などは、擬陽性化合物として除外する。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。
[1b-2] Screening by animal cell two-hybrid method A reporter gene (eg, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene, firefly luciferase gene, etc.) is introduced into animal cells (eg, CHO cells). The transcriptional regulatory region of the reporter gene is, for example, a GAL1 transcriptional activation sequence (UAS) downstream of a promoter that functions in animal cells (eg, adenovirus E1b-derived minimal promoter (TATA box)). The yeast two-hybrid system GAL4-GAL1 transcriptional regulatory system is introduced into animal cells so that expression of the reporter gene is induced in the animal cells. A chimeric protein in which a GAL4-DNA binding domain is fused to (a) a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of the TACT427 protein (for example, a partial peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45). When (b) DNA encoding a chimeric protein in which herpes simplex virus-derived VP16 protein is fused to FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, By the action of the hybrid, an animal cell line expressing the reporter gene is obtained. This cell line is cultured in the presence of a test compound for a certain period of time, the activity of the reporter gene product is measured, and a compound that decreases the activity is selected as a binding inhibitor.
The animal cell line can be cultured in the same manner as the transformant in which the host is an animal cell. The activity of the reporter gene product (eg, CAT, luciferase, etc.) can be measured using a commercially available kit according to a known method.
Among the selected compounds, compounds that are cytotoxic, compounds that inhibit the activity of the reporter gene product itself due to interaction with the reporter gene product, and the like are excluded as false positive compounds.
Examples of the test compound include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like.
本発明のスクリーニング用キットは、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質を含有し、さらにTACT427タンパク質またはその部分ペプチド（例、細胞質側ドメインに相当する部分ペプチドなど）を含有していてもよい。また、本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞（好ましくは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体（例、酵母、動物細胞などの細胞））を含有する。該細胞は、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質をコードするＤＮＡ、およびTACT427タンパク質（例、細胞質側ドメインに相当する部分ペプチドなど）をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体であってもよい。 The screening kit of the present invention contains FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, and further contains TACT427 protein or a partial peptide thereof (eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain). You may contain. Further, the screening kit of the present invention comprises a cell having the ability to produce the protein of the present invention (preferably, a transformant transformed with a DNA encoding the protein of the present invention (eg, yeast, animal cell etc. Cells)). The cells are transformed with DNA encoding FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein, and DNA encoding TACT427 protein (eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain). It may be a transformant.
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記試験化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）から選ばれた化合物であり、例えば、TACT427タンパク質と、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質との結合を阻害または促進する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明の複合体の形成を阻害する化合物は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）などの予防・治療剤として、または癌細胞のアポトーシス促進剤として有用である。
本発明の複合体の形成を促進する化合物は、例えば、神経変性疾患（例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）などの予防・治療剤として、または神経細胞のアポトーシス阻害（抑制）剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
The compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is the same as the test compound (eg, peptide, protein, antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract). Compound that inhibits or promotes the binding of TACT427 protein to FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein. It is.
As the salt of the compound, the same salt as the protein salt of the present invention described above can be used.
Compounds that inhibit the formation of the complex of the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterus. Cancer, testicular cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) or as a cancer cell apoptosis promoter.
The compound that promotes the formation of the complex of the present invention is, for example, a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.), etc. It is useful as an agent for inhibiting (suppressing) apoptosis of nerve cells.
When the compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is used as the aforementioned preventive / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
For example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like. Such a composition is produced by a method known per se, and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
As a composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, intraarticular injections. Includes dosage forms such as agents. Such an injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above compound or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. A suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-mentioned compound or a salt thereof with an ordinary suppository base.
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物（好ましくは結合阻害剤）またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
The above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of the dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for injections, Other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above compound.
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as undesirable interactions are not caused by blending with the above compounds.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans or warm-blooded animals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc. ) Orally or parenterally.
The dose of the compound (preferably binding inhibitor) or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound is administered orally for the purpose of treating breast cancer In general, in an adult (with a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound or a salt thereof is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of treating breast cancer, the compound is usually administered in the form of an injection (for example, an adult) In the case of 60 kg body weight), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound or a salt thereof per day is injected into a cancerous lesion. It is convenient to administer. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
〔２〕本発明の複合体の定量
本発明の複合体を特異的に認識する抗体は、被検液中の本発明の複合体の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（i）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明の複合体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明の複合体の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の複合体の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の複合体の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、２種類の抗体が本発明の複合体の異なる部位を認識する抗体であることが望ましい。
[2] Quantification of the complex of the present invention The antibody specifically recognizing the complex of the present invention can be used for quantification of the complex of the present invention in a test solution, particularly quantification by sandwich immunoassay. it can.
That is, the present invention
(I) Competitively reacting the antibody of the present invention with the test solution and the labeled complex of the present invention, and measuring the ratio of the labeled complex of the present invention bound to the antibody (Ii) the test solution and the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled another antibody of the present invention simultaneously or Provided is a method for quantifying the complex of the present invention in a test solution, wherein the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier is measured after continuous reaction.
In the quantification method (ii) above, it is desirable that the two types of antibodies are antibodies that recognize different sites of the complex of the present invention.
また、本発明の複合体に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用い本発明の複合体の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2 、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の複合体の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
In addition to quantification of the complex of the present invention using a monoclonal antibody against the complex of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The method for quantifying the complex of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (for example, protein) in the solution to be measured. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method in which the amount is detected by a chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. As the enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明の複合体量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明の複合体の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明の複合体の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、TACT427のＣ端部によって形成されている複合体部分を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはその部位以外、例えばTACT427のＮ端部によって形成されている複合体部分を認識する抗体が用いられる。
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then on the insolubilized carrier. By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the complex of the present invention in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilization method can be the same as those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.
In the method for measuring the complex of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site of the complex of the present invention. It is done. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is used in the primary reaction when, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the complex part formed by the C-terminal part of TACT427. The antibody is preferably an antibody that recognizes a complex part formed by, for example, the N-terminal part of TACT427 other than the site.
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
The monoclonal antibody of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like.
In the competition method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of labeling of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or As the first antibody, a soluble method is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Are reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の複合体の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明の複合体を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明の複合体の濃度を定量することによって、本発明の複合体の濃度の増加が検出された場合、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）などである、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。一方、本発明の抗体を用いて本発明の複合体の濃度を定量することによって、本発明の複合体の濃度の低下が検出された場合、例えば神経変性疾患（例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）などである、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明の複合体を検出するために使用することができる。また、本発明の複合体を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明の複合体の検出、被検細胞内における本発明の複合体の挙動の分析などのために使用することができる。
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system of the composite_body | complex of this invention, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like.
For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Sequel Radioimmunoassay” (published in Kodansha, 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. 53), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (2nd edition) (Medical Shoin, published in 1982), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (3rd edition) (Medical Shoin, Showa) 62), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Id.Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Id. Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Id. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid. )) (From Academic Press ) And the like can be referred to.
As described above, the complex of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
Furthermore, when an increase in the concentration of the complex of the present invention is detected by quantifying the concentration of the complex of the present invention using the antibody of the present invention, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) or in the future It can be diagnosed that there is a high possibility of being affected. On the other hand, when a decrease in the concentration of the complex of the present invention is detected by quantifying the concentration of the complex of the present invention using the antibody of the present invention, for example, a neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer Disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.) or is likely to be affected in the future.
Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the complex of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue. In addition, production of an antibody column used for purifying the complex of the present invention, detection of the complex of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the complex of the present invention in a test cell, etc. Can be used for.
〔３〕本発明の抗体を含有する医薬
本発明の複合体の形成を阻害する活性を有するTACT427タンパク質に対する抗体は、アポトーシス促進作用を有し、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）などの予防・治療剤として、また、癌細胞のアポトーシス促進剤として使用することもできる。
一方、本発明の複合体の形成を促進する活性を有するTACT427タンパク質に対する抗体は、アポトーシス抑制作用を有し、例えば神経変性疾患（例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）などの予防・治療剤として、また、神経細胞のアポトーシス阻害（抑制）剤として使用することもできる。
上記の本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤、促進剤、阻害剤などは低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。ワクチンとして定法に従って投与することもできる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、ワクチン等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防・治療剤、促進剤、阻害剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
〔４〕本発明の複合体の用途
TACT427タンパク質は癌組織で発現が亢進しており、さらに、TACT427タンパク質の機能（活性、発現など）を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こす。また、FLNAタンパク質、FLNBタンパク質、FLNCタンパク質、NAV2タンパク質、BTBD2タンパク質またはRAB3IL1タンパク質は、TACT427タンパク質の細胞質側ドメインに結合し、TACT427タンパク質の機能を担っていると考えられる。
従って、本発明の複合体は、例えば癌組織での発現亢進など、癌や神経変性疾患などでの発現変動が予想されるため、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）、神経変性疾患（例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）の診断マーカーとして利用することが出来る。
[3] Pharmaceutical containing the antibody of the present invention The antibody against TACT427 protein having the activity of inhibiting the formation of the complex of the present invention has a pro-apoptotic action, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate) Cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) It can also be used as an apoptosis promoter for cancer cells.
On the other hand, an antibody against TACT427 protein having the activity of promoting the formation of the complex of the present invention has an inhibitory effect on apoptosis, such as neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic). It can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for such as Alzheimer's disease) and as an inhibitor (suppressor) of neuronal apoptosis.
The above-mentioned preventive / therapeutic agents, promoters, inhibitors, etc. for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention have low toxicity, and are used as solutions or as pharmaceutical compositions of appropriate dosage forms as humans or mammals (eg, , Rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.) or or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.). It can also be administered according to a standard method as a vaccine.
The antibody of the present invention may be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention and a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such pharmaceutical compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
As a composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories, vaccines and the like are used. Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. Dosage forms may be included. Such an injection can be prepared according to a known method. As a method for preparing an injection, for example, the antibody of the present invention or a salt thereof can be prepared by dissolving, suspending or emulsifying in an aseptic aqueous liquid or oily liquid usually used for injection. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and appropriate solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule. A suppository used for rectal administration may be prepared by mixing the above-described antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base.
Compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), and syrups. Agents, emulsions, suspensions and the like. Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field. As the carrier and excipient for tablets, for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
The above parenteral or oral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of the dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories. The content of the antibody is preferably about 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, particularly about 5 to 100 mg for injections, and about 10 to 250 mg for other dosage forms.
The dose of the prophylactic / therapeutic agent, promoter, or inhibitor containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., for example, for the treatment / prevention of breast cancer in adults When used in the above, the antibody of the present invention as a single dose is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably 0.1 to 5 mg / kg. It is convenient to administer the body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
The antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
[4] Use of the composite of the present invention
The expression of TACT427 protein is increased in cancer tissues. Further, inhibition of the function (activity, expression, etc.) of TACT427 protein causes cancer cells to undergo apoptosis. In addition, FLNA protein, FLNB protein, FLNC protein, NAV2 protein, BTBD2 protein or RAB3IL1 protein are considered to bind to the cytoplasmic domain of TACT427 protein and to carry out the function of TACT427 protein.
Therefore, the complex of the present invention is expected to change in expression in cancer or neurodegenerative diseases such as enhanced expression in cancer tissues, and thus cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer). , Stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.), neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (family) It can be used as a diagnostic marker for primary Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ ：エチレングリコール-ビス-（ベータアミノエチルエーテル）四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ ：セレノシステイン（selenocysteine）
In this specification, when a base, an amino acid, or the like is indicated by an abbreviation, it is based on an abbreviation by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or an abbreviation commonly used in the field, and examples thereof are described below. In addition, when there is an optical isomer with respect to an amino acid, the L form is shown unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine tri Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EGTA: Ethylene glycol-bis- (beta amino ethyl ether) tetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate Gly: Glycine Ala: Alan Val: Valine Leu : Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: Threonine Cys: Cysteine Met: Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspa Laginic acid Lys: Lysine Arg: Arginine His: Histidine Phe: Phenylalanine Tyr: Tyrosine Trp: Tryptophan Pro: Proline Asn: Asparagine Gln: Glutamine pGlu: Pyroglutamic acid Sec: cysteine
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Cl2-Bzl ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
In addition, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Me: methyl group Et: ethyl group Bu: butyl group Ph: phenyl group TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group Tos: p-toluenesulfonyl CHO: formyl Bzl: benzyl
Cl 2 -Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Bom: benzyloxymethyl Z: benzyloxycarbonyl Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl Boc: t-butoxycarbonyl DNP: dinitro Phenyl Trt: Trityl Bum: t-Butoxymethyl Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOBt: 1-hydroxybenztriazole HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-
1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
FLJ20539のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するFLJ20539をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
FLJ20539をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
hCP50177のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するhCP50177をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
hCP50177をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
hCP1762319のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するhCP1762319をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
hCP1762319をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
FLJ13515のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有するFLJ13515をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
FLJ13515をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
参考例２、参考例１９、参考例２０および参考例２１で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
参考例２、参考例１９、参考例２０および参考例２１で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
TACT427-Aのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を有するTACT427-AをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
TACT427-A2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を有するTACT427-A2をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
TACT427-AおよびTACT427-A2をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
TACT427-Bのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を有するTACT427-BをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
TACT427-B2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を有するTACT427-B2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
TACT427-BおよびTACT427-B2をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
TACT427-Cのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するTACT427-CをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
TACT427-C2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２８〕
配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を有するTACT427-C2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
TACT427-CおよびTACT427-C2をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
参考例３で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
参考例３で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
参考例４で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
参考例４で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
参考例５で用いられたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
参考例５で用いられたプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
参考例６、参考例７、参考例８、および参考例２０で用いられたプライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
参考例６、参考例７、参考例８、および参考例２０で用いられたプライマー８の塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
参考例６、参考例７、参考例８、および参考例２０で用いられたTaqManプローブ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
参考例１０で用いられたプライマー９の塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
参考例１０で用いられたプライマー１０の塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
参考例１１で用いられたペプチド１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４２〕
参考例１１で用いられたペプチド２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
参考例１１で用いられたペプチド３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４４〕
参考例１９、参考例２０および参考例２１で用いられたセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
TACT427-Aのアミノ酸配列中、第956番目〜第1024番目のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４６〕
ヒトFLNAのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４７〕
ヒトFLNBのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４８〕
ヒトFLNCのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４９〕
ヒトNAV2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５０〕
ヒトBTBD2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５１〕
ヒトRAB3IL1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５２〕
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を有するFLNAをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：５３〕
配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を有するFLNBをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を有するFLNCをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を有するNAV2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を有するBTBD2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を有するRAB3IL1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
参考例２６で用いられたプライマー１１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
参考例２６で用いられたプライマー１２の塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
参考例２６で用いられたプライマー１３の塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
参考例２６で用いられたプライマー１４の塩基配列を示す。
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
The amino acid sequence of FLJ20539 is shown.
[SEQ ID NO: 2]
This shows the base sequence of DNA encoding FLJ20539 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 3]
The base sequence of DNA containing the full-length gene encoding FLJ20539 is shown.
[SEQ ID NO: 4]
The amino acid sequence of hCP50177 is shown.
[SEQ ID NO: 5]
This shows the base sequence of DNA encoding hCP50177 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
[SEQ ID NO: 6]
The base sequence of DNA containing the full-length gene encoding hCP50177 is shown.
[SEQ ID NO: 7]
The amino acid sequence of hCP1762319 is shown.
[SEQ ID NO: 8]
This shows the base sequence of DNA encoding hCP1762319 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
[SEQ ID NO: 9]
The base sequence of DNA containing the full-length gene encoding hCP1762319 is shown.
[SEQ ID NO: 10]
The amino acid sequence of FLJ13515 is shown.
[SEQ ID NO: 11]
This shows the base sequence of DNA encoding FLJ13515 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
[SEQ ID NO: 12]
The base sequence of DNA containing the full-length gene encoding FLJ13515 is shown.
[SEQ ID NO: 13]
The base sequence of the antisense oligonucleotide used in Reference Example 2, Reference Example 19, Reference Example 20 and Reference Example 21 is shown.
[SEQ ID NO: 14]
The base sequence of the antisense oligonucleotide used in Reference Example 2, Reference Example 19, Reference Example 20 and Reference Example 21 is shown.
[SEQ ID NO: 15]
The amino acid sequence of TACT427-A is shown.
[SEQ ID NO: 16]
This shows the base sequence of DNA encoding TACT427-A having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
[SEQ ID NO: 17]
The amino acid sequence of TACT427-A2 is shown.
[SEQ ID NO: 18]
This shows the base sequence of DNA encoding TACT427-A2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
[SEQ ID NO: 19]
The base sequence of DNA containing the full-length gene encoding TACT427-A and TACT427-A2 is shown.
[SEQ ID NO: 20]
The amino acid sequence of TACT427-B is shown.
[SEQ ID NO: 21]
This shows the base sequence of DNA encoding TACT427-B having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20.
[SEQ ID NO: 22]
This shows the amino acid sequence of TACT427-B2.
[SEQ ID NO: 23]
This shows the base sequence of DNA encoding TACT427-B2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22.
[SEQ ID NO: 24]
The base sequence of DNA containing the full-length gene encoding TACT427-B and TACT427-B2 is shown.
[SEQ ID NO: 25]
The amino acid sequence of TACT427-C is shown.
[SEQ ID NO: 26]
This shows the base sequence of DNA encoding TACT427-C having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25.
[SEQ ID NO: 27]
The amino acid sequence of TACT427-C2 is shown.
[SEQ ID NO: 28]
This shows the base sequence of DNA encoding TACT427-C2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27.
[SEQ ID NO: 29]
The base sequence of DNA containing the full-length gene encoding TACT427-C and TACT427-C2 is shown.
[SEQ ID NO: 30]
The base sequence of
[SEQ ID NO: 31]
The base sequence of primer 2 used in Reference Example 3 is shown.
[SEQ ID NO: 32]
The base sequence of primer 3 used in Reference Example 4 is shown.
[SEQ ID NO: 33]
The base sequence of primer 4 used in Reference Example 4 is shown.
[SEQ ID NO: 34]
The base sequence of primer 5 used in Reference Example 5 is shown.
[SEQ ID NO: 35]
The base sequence of primer 6 used in Reference Example 5 is shown.
[SEQ ID NO: 36]
The base sequence of the primer 7 used in Reference Example 6, Reference Example 7, Reference Example 8, and Reference Example 20 is shown.
[SEQ ID NO: 37]
The base sequence of the primer 8 used in Reference Example 6, Reference Example 7, Reference Example 8, and Reference Example 20 is shown.
[SEQ ID NO: 38]
The base sequence of the
[SEQ ID NO: 39]
The base sequence of primer 9 used in Reference Example 10 is shown.
[SEQ ID NO: 40]
The base sequence of the primer 10 used in Reference Example 10 is shown.
[SEQ ID NO: 41]
The amino acid sequence of the
[SEQ ID NO: 42]
The amino acid sequence of the peptide 2 used in Reference Example 11 is shown.
[SEQ ID NO: 43]
1 shows the amino acid sequence of peptide 3 used in Reference Example 11.
[SEQ ID NO: 44]
The base sequence of the sense oligonucleotide used in Reference Example 19, Reference Example 20 and Reference Example 21 is shown.
[SEQ ID NO: 45]
In the amino acid sequence of TACT427-A, the 956th to 1024th amino acid sequences are shown.
[SEQ ID NO: 46]
The amino acid sequence of human FLNA is shown.
[SEQ ID NO: 47]
The amino acid sequence of human FLNB is shown.
[SEQ ID NO: 48]
The amino acid sequence of human FLNC is shown.
[SEQ ID NO: 49]
The amino acid sequence of human NAV2 is shown.
[SEQ ID NO: 50]
The amino acid sequence of human BTBD2 is shown.
[SEQ ID NO: 51]
The amino acid sequence of human RAB3IL1 is shown.
[SEQ ID NO: 52]
This shows the base sequence of DNA encoding FLNA having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46.
[SEQ ID NO: 53]
This shows the base sequence of DNA encoding FLNB having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47.
[SEQ ID NO: 54]
This shows the base sequence of DNA encoding FLNC having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48.
[SEQ ID NO: 55]
This shows the base sequence of DNA encoding NAV2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49.
[SEQ ID NO: 56]
This shows the base sequence of DNA encoding BTBD2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50.
[SEQ ID NO: 57]
This shows the base sequence of DNA encoding RAB3IL1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51.
[SEQ ID NO: 58]
The base sequence of the primer 11 used in Reference Example 26 is shown.
[SEQ ID NO: 59]
The base sequence of the primer 12 used in Reference Example 26 is shown.
[SEQ ID NO: 60]
The base sequence of the primer 13 used in Reference Example 26 is shown.
[SEQ ID NO: 61]
The base sequence of the primer 14 used in Reference Example 26 is shown.
後述の参考例４で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/47427A/pCR-BluntII-TOPOは、2002年12月3日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8253として寄託されている。
後述の参考例４で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/47427B/pCR-BluntII-TOPOは、2002年12月3日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8254として寄託されている。
後述の参考例５で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/47427C/pCR-BluntII-TOPOは、2002年12月3日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8255として寄託されている。
The transformant Escherichia coli TOP10 / 47427A / pCR-BluntII-TOPO obtained in Reference Example 4 to be described later is from 1 December 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from December 3, 2002. ) Of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), deposited with the Patent Biological Deposit Center as deposit number FERM BP-8253.
The transformant Escherichia coli TOP10 / 47427B / pCR-BluntII-TOPO obtained in Reference Example 4 to be described later is from 1 December 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from December 3, 2002. ) Is deposited with the Patent Biological Depositary at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as deposit number FERM BP-8254.
The transformant Escherichia coli TOP10 / 47427C / pCR-BluntII-TOPO obtained in Reference Example 5 to be described later is from 1 December 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from December 3, 2002. ) Is deposited with the Patent Biological Depositary at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-8255.
以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、Molecular cloning, 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989年に記載の方法に準じて行った。 The present invention will be described more specifically with reference to the following reference examples and examples, but the present invention is not limited thereto. The gene manipulation using Escherichia coli, Molecular cloning, 2 nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, was conducted according to the process described in 1989.
参考例１
遺伝子発現解析
乳癌組織および肺癌組織で特異的に発現亢進している遺伝子群を明らかにするため、乳癌組織8例、正常***組織4例から抽出されたtotal RNA（表１）、および肺癌組織4例、正常肺組織5例から抽出されたtotal RNA（表３）を材料とし、oligonucleotide microarray (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E;Affymetrix社) を用いて遺伝子発現解析を行った。
実験方法は、Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。その結果、乳癌組織（lot.0009-192-00101、lot.0009-192-00120、lot.0009-192-00153、lot.0009-192-00178）および肺癌組織（lot.0009-192-00122、lot.0011-192-01293、lot.0011-192-01297）においてそれぞれ正常***組織、正常肺組織に比べ、（1）FLJ20539遺伝子（配列番号：２）、FLJ20539関連遺伝子であるhCP50177遺伝子（配列番号：５）、FLJ20539関連遺伝子であるhCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、および（2）後述の参考例４または参考例５で得られたTACT427-A遺伝子（配列番号：１６）、TACT427-A2遺伝子（配列番号：１８）、TACT427-B遺伝子（配列番号：２１）、TACT427-B2遺伝子（配列番号：２３）、TACT427-C遺伝子（配列番号：２６）ならびにTACT427-C2遺伝子（配列番号：２８）の発現亢進が検出された（表２および表４）。
[表１]
RNAを抽出した組織 販売元
乳がん組織（lot.0009-192-00101） BioClinical Partners 社
乳がん組織（lot.0009-192-00120） BioClinical Partners 社
乳がん組織（lot.0009-192-00153） BioClinical Partners 社
乳がん組織（lot.0009-192-00155） BioClinical Partners 社
乳がん組織（lot.0009-192-00157） BioClinical Partners 社
乳がん組織（lot.0009-192-00178） BioClinical Partners 社
乳がん組織（lot.0011-192-01284） BioClinical Partners 社
乳がん組織（lot.0011-192-01287） BioClinical Partners 社
正常***組織（lot.0008-192-00404） BioClinical Partners 社
正常***組織（lot.0008-192-00422） BioClinical Partners 社
正常***組織（lot.0009-192-00153） BioClinical Partners 社
正常***組織（lot.0011-192-01286） BioClinical Partners 社
[表２]
組織 遺伝子発現量
乳がん組織（lot.0009-192-00101） 3.7
乳がん組織（lot.0009-192-00120） 9.0
乳がん組織（lot.0009-192-00153） 2.1
乳がん組織（lot.0009-192-00155） ND
乳がん組織（lot.0009-192-00157） 0.54
乳がん組織（lot.0009-192-00178） 2.1
乳がん組織（lot.0011-192-01284） ND
乳がん組織（lot.0011-192-01287） ND
正常***組織（lot.0008-192-00404） ND
正常***組織（lot.0008-192-00422） ND
正常***組織（lot.0009-192-00153） 1.6
正常***組織（lot.0011-192-01286） 1.2
遺伝子発現量は、oligonucleotide microarrayで発現が
検出された全遺伝子の発現量の中央値を1として標準化した。
ND; not detected
[表３]
RNAを抽出した組織 販売元
肺がん組織（lot.0009-192-00122） BioClinical Partners 社
肺がん組織（lot.0011-192-01285） BioClinical Partners 社
肺がん組織（lot.0011-192-01293） BioClinical Partners 社
肺がん組織（lot.0011-192-01297） BioClinical Partners 社
正常肺組織（lot.0009-192-00150） BioClinical Partners 社
正常肺組織（lot.0009-192-00168） BioClinical Partners 社
正常肺組織（lot.0011-192-01283） BioClinical Partners 社
正常肺組織（lot.0011-192-01285） BioClinical Partners 社
正常肺組織（lot.0011-192-01297） BioClinical Partners 社
[表４]
組織 遺伝子発現量
肺がん組織（lot.0009-192-00122） 2.8
肺がん組織（lot.0011-192-01285） 0.67
肺がん組織（lot.0011-192-01293） 1.3
肺がん組織（lot.0011-192-01297） 1.5
正常肺組織（lot.0009-192-00150） ND
正常肺組織（lot.0009-192-00168） 0.38
正常肺組織（lot.0011-192-01283） ND
正常肺組織（lot.0011-192-01285） ND
正常肺組織（lot.0011-192-01297） ND
遺伝子発現量は、oligonucleotide microarrayで発現が
検出された全遺伝子の発現量の中央値を1として標準化した。
ND; not detected
Reference example 1
Gene expression analysis To clarify the genes that are specifically up-regulated in breast and lung cancer tissues, total RNA extracted from 8 breast cancer tissues, 4 normal breast tissues (Table 1), and lung cancer tissues 4 For example, gene RNA was analyzed using an oligonucleotide microarray (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; Affymetrix) using total RNA extracted from 5 normal lung tissues (Table 3) as a material.
The experiment method was in accordance with the Affymetrix experiment manual (Expression analysis technical manual). As a result, breast cancer tissue (lot.0009-192-00101, lot.0009-192-00120, lot.0009-192-00153, lot.0009-192-00178) and lung cancer tissue (lot.0009-192-00122, lot.0011-192-01293 and lot.0011-192-01297) compared to normal breast tissue and normal lung tissue, respectively (1) FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), hCP50177 gene (SEQ ID NO: 2) which is a FLJ20539-related gene 5) hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (SEQ ID NO: 11), which are FLJ20539-related genes, and (2) TACT427-A gene (sequence) obtained in Reference Example 4 or Reference Example 5 described later No. 16), TACT427-A2 gene (SEQ ID NO: 18), TACT427-B gene (SEQ ID NO: 21), TACT427-B2 gene (SEQ ID NO: 23), TACT427-C gene (SEQ ID NO: 26) and TACT427 Increased expression of the -C2 gene (SEQ ID NO: 28) was detected (Tables 2 and 4).
[Table 1]
Tissue from which RNA was extracted
Breast Cancer Tissue (lot.0009-192-00101) BioClinical Partners Breast Cancer Tissue (lot.0009-192-00120) BioClinical Partners Breast Cancer Tissue (lot.0009-192-00153) BioClinical Partners Breast Cancer Tissue (lot.0009-192 -00155) BioClinical Partners Breast Cancer Tissue (lot.0009-192-00157) BioClinical Partners Breast Cancer Tissue (lot.0009-192-00178) BioClinical Partners Breast Cancer Tissue (lot.0011-192-01284) BioClinical Partners Breast Cancer Tissue (Lot.0011-192-01287) BioClinical Partners normal breast tissue (lot.0008-192-00404) BioClinical Partners normal breast tissue (lot.0008-192-00422) BioClinical Partners normal breast tissue (lot.0009- 192-00153) BioClinical Partners
Normal breast tissue (lot.0011-192-01286) BioClinical Partners
[Table 2]
Tissue Gene expression level
Breast cancer tissue (lot.0009-192-00101) 3.7
Breast cancer tissue (lot.0009-192-00120) 9.0
Breast cancer tissue (lot.0009-192-00153) 2.1
Breast cancer tissue (lot.0009-192-00155) ND
Breast cancer tissue (lot.0009-192-00157) 0.54
Breast cancer tissue (lot.0009-192-00178) 2.1
Breast cancer tissue (lot.0011-192-01284) ND
Breast cancer tissue (lot.0011-192-01287) ND
Normal breast tissue (lot.0008-192-00404) ND
Normal breast tissue (lot.0008-192-00422) ND
Normal breast tissue (lot.0009-192-00153) 1.6
Normal breast tissue (lot.0011-192-01286) 1.2
The gene expression level was normalized by setting the median expression level of all genes whose expression was detected by oligonucleotide microarray as 1.
ND; not detected
[Table 3]
Tissue from which RNA was extracted
Lung cancer tissue (lot.0009-192-00122) BioClinical Partners lung cancer tissue (lot.0011-192-01285) BioClinical Partners lung cancer tissue (lot.0011-192-01293) BioClinical Partners lung cancer tissue (lot.0011-192 -01297) BioClinical Partners normal lung tissue (lot.0009-192-00150) BioClinical Partners normal lung tissue (lot.0009-192-00168) BioClinical Partners normal lung tissue (lot.0011-192-01283) BioClinical Partners Normal lung tissue (lot.0011-192-01285) BioClinical Partners
Normal lung tissue (lot.0011-192-01297) BioClinical Partners
[Table 4]
Tissue Gene expression level
Lung cancer tissue (lot.0009-192-00122) 2.8
Lung cancer tissue (lot.0011-192-01285) 0.67
Lung cancer tissue (lot.0011-192-01293) 1.3
Lung cancer tissue (lot.0011-192-01297) 1.5
Normal lung tissue (lot.0009-192-00150) ND
Normal lung tissue (lot.0009-192-00168) 0.38
Normal lung tissue (lot.0011-192-01283) ND
Normal lung tissue (lot.0011-192-01285) ND
Normal lung tissue (lot.0011-192-01297) ND
The gene expression level was normalized by setting the median expression level of all genes whose expression was detected by oligonucleotide microarray as 1.
ND; not detected
参考例２
ヒト肺癌細胞株のアポトーシス誘発
TACT427タンパク質遺伝子の発現を抑制することにより、ヒト肺癌細胞株のアポトーシスが誘発されるか否かを調べた。
まず、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）より購入したヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H460を、RPMI-1640培地（25mM HEPES含有）（Invitrogen社）に牛胎仔血清（ATCC）を10％加えた培地で懸濁し、１ウェル当たり4000個の細胞密度で96穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、（1）FLJ20539遺伝子（配列番号：２）、FLJ20539関連遺伝子であるhCP50177遺伝子（配列番号：５）、FLJ20539関連遺伝子であるhCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、および（2）後述の参考例４または参考例５で得られたTACT427-A遺伝子（配列番号：１６）、TACT427-A2遺伝子（配列番号：１８）、TACT427-B遺伝子（配列番号：２１）、TACT427-B2遺伝子（配列番号：２３）、TACT427-C遺伝子（配列番号：２６）ならびにTACT427-C2遺伝子（配列番号：２８）のタンパク質コード領域配列または３’非翻訳領域にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：１３）を設計後、phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する）。コントロールとしては、配列番号：１３で示される塩基配列のリバース配列（配列番号：１４）を同様にphosphorothioate化し、HPLC精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチドと略する）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを、Opti-MEM（Invitrogen社）で希釈し、さらにFuGENE6試薬（Roche Diagnostics社）を4倍量（4μL/μgオリゴヌクレオチド）の割合で加えた混合液を室温で30分間放置した。このオリゴヌクレオチド溶液を、１ウェル当たり40μLの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は140nMとなるよう調整した。上記の条件で更に3日間培養した後、Cell Death Detection ELISAPLUSキット（Roche Diagnostics社）を用いて、添付プロトコールに従い上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、約2.8倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（P=0.0005）を示した（表５）。
Induction of apoptosis in human lung cancer cell lines
It was examined whether or not apoptosis of the human lung cancer cell line was induced by suppressing the expression of the TACT427 protein gene.
First, human non-small cell lung cancer cell line NCI-H460 purchased from American Type Culture Collection (ATCC), RPMI-1640 medium (containing 25 mM HEPES) (Invitrogen) plus 10% fetal calf serum (ATCC) And seeded in a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) at a density of 4000 cells per well. After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, the antisense oligonucleotide was transfected.
Specifically, (1) FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5) which is a FLJ20539 related gene, hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (SEQ ID NO: 8) which are FLJ20539 related genes 11) and (2) TACT427-A gene (SEQ ID NO: 16), TACT427-A2 gene (SEQ ID NO: 18), TACT427-B gene (SEQ ID NO: 16) obtained in Reference Example 4 or Reference Example 5 described later 21), the TACT427-B2 gene (SEQ ID NO: 23), the TACT427-C gene (SEQ ID NO: 26) and the TACT427-C2 gene (SEQ ID NO: 28) protein coding region sequence or 3 ′ untranslated region After designing the antisense oligonucleotide sequence (SEQ ID NO: 13), a phosphorothioated oligonucleotide was synthesized, purified by HPLC, and used for the introduction experiment (hereinafter, antisense oligonucleotide). Substantially and soil). As a control, the reverse sequence (SEQ ID NO: 14) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 was similarly phosphorthiolated and used after HPLC purification (hereinafter abbreviated as control oligonucleotide).
Dilute the antisense oligonucleotide or control oligonucleotide with Opti-MEM (Invitrogen), and add a mixture of FuGENE6 reagent (Roche Diagnostics) at a volume of 4 (4 μL / μg oligonucleotide) at room temperature. Left for 30 minutes. This oligonucleotide solution was added to the plate at a rate of 40 μL per well. The final oligonucleotide concentration was adjusted to 140 nM. After further culturing for 3 days under the above conditions, the apoptosis-inducing activity of the oligonucleotide was measured using the Cell Death Detection ELISA PLUS kit (Roche Diagnostics) according to the attached protocol.
As a result, the antisense oligonucleotide showed about 2.8-fold apoptosis-inducing activity as compared to the control oligonucleotide used as a negative control, and showed a statistically significant difference (P = 0.0005) (Table 5).
参考例３
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるNCI-H460のアポトーシス誘導
アンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、（1）FLJ20539遺伝子（配列番号：２）、FLJ20539関連遺伝子であるhCP50177遺伝子（配列番号：５）、FLJ20539関連遺伝子であるhCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、および（2）後述の参考例４または参考例５で得られたTACT427-A遺伝子（配列番号：１６）、TACT427-A2遺伝子（配列番号：１８）、TACT427-B遺伝子（配列番号：２１）、TACT427-B2遺伝子（配列番号：２３）、TACT427-C遺伝子（配列番号：２６）ならびにTACT427-C2遺伝子（配列番号：２８）の発現量が低下するか否か調べた。
参考例２で用いたヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H460を参考例２と同じ培地に懸濁し、1ウェル当たり24,000個の細胞密度で24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドとコントロールオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。オリゴヌクレオチド溶液の添加量は1ウェル当たり390μLとし、オリゴヌクレオチドの終濃度は200nMとなるよう調整した。トランスフェクション後、5％炭酸ガス気流中、37℃で24時間培養を継続した後にRNeasy Mini Total RNA Kit（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを抽出した。約400 ngのトータルRNAを鋳型として、TaqMan Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応を行った。トータルRNAにして10 ngに相当するcDNAを鋳型とし、２種類のプライマー〔プライマー１（配列番号：３０）およびプライマー２（配列番号：３１）〕とSYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用いて、（1）FLJ20539遺伝子（配列番号：２）、FLJ20539関連遺伝子であるhCP50177遺伝子（配列番号：５）、FLJ20539関連遺伝子であるhCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、および（2）後述の参考例４で得られたTACT427-A遺伝子（配列番号：１６）、TACT427-A2遺伝子（配列番号：１８）、TACT427-B遺伝子（配列番号：２１）、TACT427-B2遺伝子（配列番号：２３）、TACT427-C遺伝子（配列番号：２６）ならびにTACT427-C2遺伝子（配列番号：２８）の発現コピー数を測定した。
同量の鋳型cDNA中に含まれるβ-アクチン遺伝子発現量をTaqMan β-actin Control Reagents（Applied Biosystems社）を用いて測定し内部標準とした。アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合には、上記10遺伝子の発現量はβ-アクチン遺伝子の発現量の0.10％であったのに対し、配列番号：１３で示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与群では0.046％であり統計学的に有意（P≦0.05）な発現量低下が認められた。一方、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）投与群では0.088％であり非トランスフェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。この結果より、上記10遺伝子の発現量の低下によりヒト肺癌細胞株のアポトーシスが誘発されたことが示された。
Reference example 3
Induction of apoptosis of NCI-H460 by introduction of antisense oligonucleotide (1) FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), FLJ20539 related gene hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5), FLJ20539 related gene by antisense oligonucleotide administration hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (SEQ ID NO: 11), and (2) TACT427-A gene (SEQ ID NO: 16) and TACT427-A2 gene obtained in Reference Example 4 or Reference Example 5 described later (SEQ ID NO: 18), TACT427-B gene (SEQ ID NO: 21), TACT427-B2 gene (SEQ ID NO: 23), TACT427-C gene (SEQ ID NO: 26) and TACT427-C2 gene (SEQ ID NO: 28) It was investigated whether the expression level of γ decreased.
The human non-small cell lung cancer cell line NCI-H460 used in Reference Example 2 was suspended in the same medium as in Reference Example 2, and seeded on a 24-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) at a cell density of 24,000 cells per well. . After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, the antisense oligonucleotide and the control oligonucleotide were transfected. The addition amount of the oligonucleotide solution was 390 μL per well, and the final concentration of the oligonucleotide was adjusted to 200 nM. After transfection, culturing was continued at 37 ° C. for 24 hours in a 5% carbon dioxide gas stream, and then total RNA was extracted using RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN). About 400 ng of total RNA was used as a template, reverse transcription reaction was performed using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems) according to the attached protocol. Using cDNA corresponding to 10 ng as total RNA as a template, using two types of primers [Primer 1 (SEQ ID NO: 30) and Primer 2 (SEQ ID NO: 31)] and SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) (1) FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), FLJ20539-related gene hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5), FLJ20539-related gene hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (SEQ ID NO: 11) And (2) TACT427-A gene (SEQ ID NO: 16), TACT427-A2 gene (SEQ ID NO: 18), TACT427-B gene (SEQ ID NO: 21), TACT427-B2 obtained in Reference Example 4 described later The expression copy numbers of the gene (SEQ ID NO: 23), TACT427-C gene (SEQ ID NO: 26) and TACT427-C2 gene (SEQ ID NO: 28) were measured.
The expression level of β-actin gene contained in the same amount of template cDNA was measured using TaqMan β-actin Control Reagents (Applied Biosystems) and used as an internal standard. In the case where the antisense oligonucleotide was not transfected, the expression level of the 10 genes was 0.10% of the expression level of the β-actin gene, whereas in the antisense oligonucleotide administration group represented by SEQ ID NO: 13, It was 0.046%, and a statistically significant (P ≦ 0.05) decrease in the expression level was observed. On the other hand, it was 0.088% in the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) administration group, and no statistically significant decrease in expression level was observed compared to the non-transfection group. From this result, it was shown that apoptosis of the human lung cancer cell line was induced by a decrease in the expression level of the 10 genes.
参考例４
ヒト脳由来タンパク質TACT427-A、TACT427-A2、TACT427-BおよびTACT427-B2をコードするcDNAのクローニングと塩基配列の決定
ヒト脳Marathon-Ready cDNA（CLONTECH社）を鋳型とし、2種のプライマー〔プライマー３（配列番号：３２）およびプライマー４（配列番号：３３）〕を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成は、上記cDNA1μlを鋳型として使用し、PfuTurbo DNA Polymerase（STRATAGENE社）6.25U、プライマー３（配列番号：３２）およびプライマー４（配列番号：３３）を各1.0μM、dNTPsを200μM、およびPfu Buffer（STRATAGENE社）を5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の後、95℃・10秒、55℃・30秒、72℃・6分のサイクルを40回繰り返した。該PCR反応産物をPCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。これをZero Blunt TOPO PCRクローニングキット（Invitrogen社）の処方に従いプラスミドベクターpCR-BluntII-TOPO（Invitrogen社）へサブクローニングした。これを大腸菌TOP10に導入し、cDNAを持つクローンをカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、配列番号：１６および配列番号：２１で表されるcDNAの塩基配列をそれぞれ得た。
配列番号：３で表されるFLJ20539全長遺伝子塩基配列の1〜160番目および2483〜2755番目の塩基配列を、配列番号：１６で表される塩基配列の5’端および3’端にそれぞれ付加した塩基配列を、配列番号：１９に示す。
配列番号：３で表されるFLJ20539全長遺伝子塩基配列の1〜160番目および2483〜2755番目の塩基配列を、配列番号：２１で表される塩基配列の5’端および3’端にそれぞれ付加した塩基配列を、配列番号：２４に示す。
配列番号：１６で表される塩基配列を有するDNA断片を有するプラスミドをTACT427-A/pCR-BluntII-TOPOと、配列番号：２１で表される塩基配列を有するDNA断片を有するプラスミドをTACT427-B/pCR-BluntII-TOPOと名付けた。
配列番号：１６で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：１５）を含有するタンパク質をTACT427-Aと命名した。
配列番号：２１で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：２０）を含有するタンパク質をTACT427-Bと命名した。
さらに、プラスミドTACT427-A/pCR-BluntII-TOPOが導入された形質転換体をEscherichia coli TOP10/47427A/pCR-BluntII-TOPOと、プラスミドTACT427-B/pCR-BluntII-TOPOが導入された形質転換体をEscherichia coli TOP10/47427B/pCR-BluntII-TOPOとそれぞれ命名した。
TACT427-Bのアミノ酸配列（配列番号：２０）では、TACT427-Aのアミノ酸配列（配列番号：１５）の278番目のArgがGlnに、825番目のGluがLysに、826番目のAlaがProに、970番目のValがAlaにそれぞれ置換され、340番目のSerが欠失している。
TACT427-BをコードするDNAの塩基配列（配列番号：２１）では、TACT427-AをコードするDNAの塩基配列（配列番号：１６）の833番目のgがaに、1482番目のgがcに、1590番目のaがgに、2473番目のgがaに、2476番目のgがcに、2909番目のtがcにそれぞれ置換され、1015〜1017番目のagcが欠失している。
TACT427-Aのアミノ酸配列の1〜4番目のアミノ酸配列が欠失している配列を配列番号：１７に示す。配列番号：１７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をTACT427-A2と命名する。TACT427-A2をコードするDNAの塩基配列を配列番号：１８に示す。
TACT427-Bのアミノ酸配列の1〜4番目のアミノ酸配列が欠失している配列を配列番号：２２に示す。配列番号：２２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をTACT427-B2と命名する。TACT427-B2をコードするDNAの塩基配列を配列番号：２３に示す。
TACT427-AをコードするDNAの塩基配列（配列番号：１６）は、ヒトではFLJ20539をコードするDNAの塩基配列（配列番号：２）に最も高い相同性を示した。配列番号：１６で表される塩基配列の1〜138番目および889〜3072番目の塩基配列に対しては、配列番号：２で表される塩基配列の1〜138番目および139〜2322番目の塩基配列が対応し、各部分配列において、99.3％および100％の相同性をそれぞれ示す。FLJ20539をコードするDNAの塩基配列（配列番号：２）は、TACT427-AをコードするDNAの塩基配列（配列番号：１６）の139〜888番目に相当する塩基配列を欠いていることより、この配列はTACT427-Aに特異的な配列である。
TACT427-A2、TACT427-BおよびTACT427-B2についても、TACT427-Aと同様に、FLJ20539に最も高い相同性を示し、かつ、同様な塩基置換および塩基配列の欠失を有する。
TACT427-Aのアミノ酸配列（配列番号：１５）の735〜792番目までのアミノ酸配列、TACT427-A2のアミノ酸配列（配列番号：１７）の731〜788番目までのアミノ酸配列、TACT427-Bのアミノ酸配列（配列番号：２０）の734〜791番目までのアミノ酸配列、およびTACT427-B2のアミノ酸配列（配列番号：２２）の730〜787番目までのアミノ酸配列は、ともにアミノ酸ドメインモチーフ検索サイトSMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）での検索で、クロロパーオキシダーゼモチーフを有することからクロロパーオキシダーゼ活性を持つと考えられる。
TACT427-Aの疎水性プロット図を〔図１〕に、TACT427-A2の疎水性プロット図を〔図２〕に、TACT427-Bの疎水性プロット図を〔図３〕に、TACT427-B2の疎水性プロット図を〔図４〕にそれぞれ示す。
参考例５
Reference example 4
Cloning of cDNA encoding human brain-derived proteins TACT427-A, TACT427-A2, TACT427-B, and TACT427-B2 and determination of the nucleotide sequence. 3 (SEQ ID NO: 32) and primer 4 (SEQ ID NO: 33)]. The composition of the reaction solution in the reaction was 1 μl of the above cDNA as a template, PfuTurbo DNA Polymerase (STRATAGENE) 6.25U, Primer 3 (SEQ ID NO: 32) and Primer 4 (SEQ ID NO: 33) each 1.0 μM,
The
The 1st to 160th and 2483 to 2755th base sequences of the FLJ20539 full-length gene represented by SEQ ID NO: 3 were added to the 5 'end and 3' end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21, respectively. The base sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
A plasmid having a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 is TACT427-A / pCR-BluntII-TOPO, and a plasmid having a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 is TACT427-B. I named it / pCR-BluntII-TOPO.
A protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 15) encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 was named TACT427-A.
A protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 was named TACT427-B.
Furthermore, transformants into which plasmid TACT427-A / pCR-BluntII-TOPO was introduced were transformed into Escherichia coli TOP10 / 47427A / pCR-BluntII-TOPO and plasmid TACT427-B / pCR-BluntII-TOPO. Were named Escherichia coli TOP10 / 47427B / pCR-BluntII-TOPO, respectively.
In the amino acid sequence of TACT427-B (SEQ ID NO: 20), the 278th Arg of the amino acid sequence of TACT427-A (SEQ ID NO: 15) is Gln, the 825th Glu is Lys, and the 826th Ala is Pro. , 970th Val is replaced by Ala, and 340th Ser is deleted.
In the base sequence of DNA encoding TACT427-B (SEQ ID NO: 21), the 833rd g of the DNA sequence (SEQ ID NO: 16) encoding TACT427-A is a, and the 1482th g is c. , 1590th a is replaced with g, 2473th g is replaced with a, 2476th g is replaced with c, 2909th t is replaced with c, and 1015 to 1017th agc is deleted.
A sequence in which the first to fourth amino acid sequences of TACT427-A are deleted is shown in SEQ ID NO: 17. The protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is named TACT427-A2. The nucleotide sequence of DNA encoding TACT427-A2 is shown in SEQ ID NO: 18.
SEQ ID NO: 22 shows a sequence in which the first to fourth amino acid sequences of TACT427-B are deleted. The protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is named TACT427-B2. The nucleotide sequence of DNA encoding TACT427-B2 is shown in SEQ ID NO: 23.
The DNA base sequence (SEQ ID NO: 16) encoding TACT427-A showed the highest homology to the DNA base sequence (SEQ ID NO: 2) encoding FLJ20539 in humans. For the 1st to 138th and 889th to 3072th base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, the 1st to 138th and 139th to 2232nd bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 The sequences correspond and show 99.3% and 100% homology in each subsequence, respectively. The base sequence of DNA encoding FLJ20539 (SEQ ID NO: 2) lacks the base sequence corresponding to positions 139 to 888 of the base sequence of DNA encoding TACT427-A (SEQ ID NO: 16). The sequence is a sequence specific to TACT427-A.
Similarly to TACT427-A, TACT427-A2, TACT427-B, and TACT427-B2 show the highest homology to FLJ20539, and have similar base substitutions and deletions of base sequences.
Amino acid sequence from 735 to 792 of the amino acid sequence of TACT427-A (SEQ ID NO: 15), Amino acid sequence from 731 to 788 of the amino acid sequence of TACT427-A2 (SEQ ID NO: 17), Amino acid sequence of TACT427-B The amino acid sequence from 734 to 791 of (SEQ ID NO: 20) and the amino acid sequence from 730 to 787 of TACT427-B2 (SEQ ID NO: 22) are both amino acid domain motif search site SMART (http: //smart.embl-heidelberg.de/), it is considered to have chloroperoxidase activity because it has a chloroperoxidase motif.
Fig. 1 shows the hydrophobicity plot of TACT427-A, Fig. 2 shows the hydrophobicity plot of TACT427-A2, Fig. 3 shows the hydrophobicity plot of TACT427-B, and Fig. 3 shows the hydrophobicity of TACT427-B2. The sex plot is shown in FIG.
Reference Example 5
ヒト肺癌細胞株NCI-H522由来タンパク質TACT427-CおよびTACT427-C2をコードするcDNAのクローニングと塩基配列の決定
ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H522（ATCCより購入）をRPMI-1640培地（Invitrogen社）に牛胎仔血清を10％加えた培地で培養し、RNeasy Mini Total RNA Kit（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを抽出した。トータルRNAを鋳型として、TaqMan Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応しcDNAを得た。ここで得られたcDNAを鋳型とし、2種のプライマー〔プライマー５（配列番号：３４）およびプライマー６（配列番号：３５）〕を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成は上記cDNAを鋳型として使用し、PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase（STRATAGENE社）2.5 U、プライマー５（配列番号：３４）およびプライマー６（配列番号：３５）を各1.0μM、dNTPsを200μM、およびGC BufferI（TaKaRa社）を10μl加え、20μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の後、95℃・30秒、60℃・20秒、72℃・3分のサイクルを35回繰り返した。該PCR反応産物をアガロースゲルにて電気泳動後、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。これをZero Blunt TOPO PCRクローニングキット（Invitrogen社）の処方に従いプラスミドベクターpCR-BluntII-TOPO（Invitrogen社）へサブクローニングした。これを大腸菌TOP10に導入し、cDNAを持つクローンをカナマイシンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、配列番号：２６で表されるcDNAの塩基配列を得た。
配列番号：３で表されるFLJ20539全長遺伝子塩基配列の1〜160番目および2483〜2755番目の塩基配列を、配列番号：２６で表される塩基配列の5’端および3’端にそれぞれ付加した塩基配列を、配列番号２９：に示す。
配列番号：２６で表される塩基配列を有するDNA断片を有するプラスミドをTACT427-C/pCR-BluntII-TOPOと名付けた。
配列番号：２６で表されるDNAの塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：２５）を含有するタンパク質をTACT427-Cと命名した。
プラスミドTACT427-C/pCR-BluntII-TOPOが導入された形質転換体を、Escherichia coli TOP10/47427C/pCR-BluntII-TOPOと命名した。
TACT427-Cのアミノ酸配列（配列番号：２５）では、TACT427-Aのアミノ酸配列（配列番号：１５）の491番目のValがMetに、825番目のGluがLysに、826番目のAlaがProに、970番目のValがAlaにそれぞれ置換され、340番目のSerが欠失している。
TACT427-CをコードするDNAの塩基配列（配列番号：２６）では、TACT427-AをコードするDNAの塩基配列（配列番号：１６）の504番目のaがcに、939番目のaがgに、1471番目のgがaに、1482番目のgがcに、1590番目のaがgに、2473番目のgがaに、2476番目のgがcに、2909番目のtがcにそれぞれ置換され、1015〜1017番目のagcが欠失している。
TACT427-Cのアミノ酸配列の1〜4番目のアミノ酸配列が欠失している配列を配列番号：２７に示す。配列番号：２７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をTACT427-C2と命名する。TACT427-C2をコードするDNAの塩基配列を配列番号：２８に示す。
TACT427-CをコードするDNAの塩基配列（配列番号：２６）は、ヒトではFLJ20539をコードするDNAの塩基配列（配列番号：２）に最も高い相同性を示した。配列番号：２６で表される塩基配列の1〜138番目および886〜3069番目のDNA塩基配列に対しては、配列番号：２で表される塩基配列の1〜138番目および139番目〜2322番目の塩基配列が対応し、各部分配列において、99.3％および99.5％の相同性をそれぞれ示す。FLJ20539コードするDNAの塩基配列（配列番号：２）は、TACT427-C（配列番号：２６）で表される139〜885番目に相当するDNA塩基配列を欠いていることより、この配列は、TACT427-Cに特異的な配列である。TACT427-C2についても、TACT427-Cと同様にFLJ20539に最も高い相同性を示し、かつ同様な塩基配列の欠失を有する。
TACT427-Cのアミノ酸配列（配列番号：２５）の734〜791番目までの配列およびTACT427-C2のアミノ酸配列（配列番号：２７）の730〜787番目までの配列は、ともにアミノ酸ドメインモチーフ検索サイトSMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）での検索でクロロパーオキシダーゼモチーフを有することからクロロパーオキシダーゼ活性を持つと考えられる。
TACT427-Cの疎水性プロット図を〔図５〕に、TACT427-Cの疎水性プロット図を〔図６〕に示す。
Cloning and sequencing of cDNAs encoding human lung cancer cell line NCI-H522 derived proteins TACT427-C and TACT427-C2 Human non-small cell lung cancer cell line NCI-H522 (purchased from ATCC) in RPMI-1640 medium (Invitrogen) ) Was cultured in a medium supplemented with 10% fetal calf serum and total RNA was extracted using RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN). Using total RNA as a template, cDNA was obtained by reverse transcription using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems) according to the attached protocol. Using the cDNA obtained here as a template, PCR reaction was performed using two kinds of primers [primer 5 (SEQ ID NO: 34) and primer 6 (SEQ ID NO: 35)]. The composition of the reaction solution used in the reaction was the above cDNA as a template, PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE) 2.5 U, primer 5 (SEQ ID NO: 34) and primer 6 (SEQ ID NO: 35) each 1.0 μM,
The 1st to 160th and 2483 to 2755th base sequences of the FLJ20539 full-length gene represented by SEQ ID NO: 3 were added to the 5 'end and 3' end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, respectively. The base sequence is shown in SEQ ID NO: 29.
A plasmid having a DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 was named TACT427-C / pCR-BluntII-TOPO.
A protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) encoded by the base sequence of the DNA represented by SEQ ID NO: 26 was named TACT427-C.
The transformant into which the plasmid TACT427-C / pCR-BluntII-TOPO was introduced was named Escherichia coli TOP10 / 47427C / pCR-BluntII-TOPO.
In the amino acid sequence of TACT427-C (SEQ ID NO: 25), the 491st Val in the amino acid sequence of TACT427-A (SEQ ID NO: 15) is Met, the 825th Glu is Lys, and the 826th Ala is Pro. , 970th Val is replaced by Ala, and 340th Ser is deleted.
In the base sequence of the DNA encoding TACT427-C (SEQ ID NO: 26), the 504th a in the base sequence of the DNA encoding TACT427-A (SEQ ID NO: 16) is c, and the 939th a is g. 1471st g replaced with a, 1482th g replaced with c, 1590th a replaced with g, 2473th g replaced with a, 2476th g replaced with c, 2909th t replaced with c The 1015th to 1017th agc is deleted.
A sequence in which the first to fourth amino acid sequences of TACT427-C are deleted is shown in SEQ ID NO: 27. The protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is named TACT427-C2. The nucleotide sequence of DNA encoding TACT427-C2 is shown in SEQ ID NO: 28.
The DNA base sequence (SEQ ID NO: 26) encoding TACT427-C showed the highest homology to the DNA base sequence (SEQ ID NO: 2) encoding FLJ20539 in humans. With respect to the 1st to 138th and 886 to 3069th DNA base sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, the 1st to 138th and 139th to 2322th positions of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 The base sequences correspond to each other, and show 99.3% and 99.5% homology in each partial sequence. Since the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of DNA encoding FLJ20539 lacks the DNA sequence corresponding to the 139th to 885th positions represented by TACT427-C (SEQ ID NO: 26), this sequence is TACT427. -C specific sequence. Similarly to TACT427-C, TACT427-C2 shows the highest homology to FLJ20539 and has a similar nucleotide sequence deletion.
Both the amino acid sequence of TACT427-C (SEQ ID NO: 25) from 734 to 791 and the amino acid sequence of TACT427-C2 (SEQ ID NO: 27) from 730 to 787 are both amino acid domain motif search site SMART Since it has a chloroperoxidase motif in a search at (http://smart.embl-heidelberg.de/), it is considered to have chloroperoxidase activity.
The hydrophobicity plot of TACT427-C is shown in [FIG. 5], and the hydrophobicity plot of TACT427-C is shown in [FIG. 6].
参考例６
以下の参考例において、TACT427-A遺伝子（配列番号：１６）、TACT427-A2遺伝子（配列番号：１８）、TACT427-B遺伝子（配列番号：２１）、TACT427-B2遺伝子（配列番号：２３）、TACT427-C遺伝子（配列番号：２６）およびTACT427-C2遺伝子（配列番号：２８）をまとめてTACT427遺伝子と略記することもある。
以下の参考例において、TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）、TACT427-A2タンパク質（配列番号：１７）、TACT427-Bタンパク質（配列番号：２０）、TACT427-B2タンパク質（配列番号：２２）、TACT427-Cタンパク質（配列番号：２５）およびTACT427-C2タンパク質（配列番号：２７）をまとめてTACT427タンパク質と略記することもある。
ヒト癌組織における遺伝子発現量の検討（その１）
ヒト癌患者組織（乳癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、卵巣癌）由来のMatched Tumor/Normal cDNA Pair（CLONTECH社）を鋳型として、FAM標識したTaqManプローブを用いた定量的PCR反応を行うことにより、癌組織と正常組織でのFLJ20539遺伝子（配列番号：２）、hCP50177遺伝子（配列番号：５）、hCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、および参考例４または参考例５で得られたTACT427遺伝子の発現量を測定した。
該反応における反応液の組成は、上記cDNA 1μlを鋳型として使用し、TaqManTM Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を7.5μl、プライマー７（配列番号：３６）およびプライマー８（配列番号：３７）を各0.5μM、TaqManプローブ１（配列番号：３８）を100nMとなるよう加え、15μlの液量とした。PCR反応は、50℃・2分、95℃・10分の後、95℃・15秒、60℃・1分のサイクルを40回繰り返した。
その結果、上記遺伝子の総量は、ヒト乳癌組織4例中2例で周辺正常組織に比べそれぞれ約7倍、約16倍の、ヒト肺癌組織3例中2例で周辺正常組織に比べそれぞれ約3倍、約2倍の、ヒト大腸癌組織5例中4例で周辺正常組織に比べそれぞれ約2倍、約8倍、約3倍、約4倍の、ヒト直腸癌組織3例中2例で周辺正常組織に比べ約10倍、約5倍の、ヒト卵巣癌組織5例中2例で周辺正常組織に比べそれぞれ約3倍、約20倍の発現量を示した。
これより、上記遺伝子の総量は、癌組織において顕著に発現上昇していることがわかる。
Reference Example 6
In the following reference examples, TACT427-A gene (SEQ ID NO: 16), TACT427-A2 gene (SEQ ID NO: 18), TACT427-B gene (SEQ ID NO: 21), TACT427-B2 gene (SEQ ID NO: 23), The TACT427-C gene (SEQ ID NO: 26) and the TACT427-C2 gene (SEQ ID NO: 28) may be collectively abbreviated as TACT427 gene.
In the following reference examples, TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15), TACT427-A2 protein (SEQ ID NO: 17), TACT427-B protein (SEQ ID NO: 20), TACT427-B2 protein (SEQ ID NO: 22), TACT427-C protein (SEQ ID NO: 25) and TACT427-C2 protein (SEQ ID NO: 27) may be collectively abbreviated as TACT427 protein.
Examination of gene expression level in human cancer tissue (1)
By performing quantitative PCR reaction using FAM-labeled TaqMan probe using Matched Tumor / Normal cDNA Pair (CLONTECH) from human cancer patient tissues (breast cancer, lung cancer, colon cancer, rectal cancer, ovarian cancer) as a template , FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5), hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (SEQ ID NO: 11) in cancer tissue and normal tissue, and Reference Example 4 or Reference The expression level of the TACT427 gene obtained in Example 5 was measured.
The composition of the reaction solution in the reaction was 1 μl of the above cDNA as a template, 7.5 μl of TaqMan ™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), primer 7 (SEQ ID NO: 36) and primer 8 (SEQ ID NO: 37). Were added to a concentration of 0.5 μM and TaqMan probe 1 (SEQ ID NO: 38) to a concentration of 100 nM to make a volume of 15 μl. In the PCR reaction, a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute was repeated 40 times after 50 ° C. for 2 minutes and 95 ° C. for 10 minutes.
As a result, the total amount of the above genes was about 7 times and about 16 times in 2 cases in 4 cases of human breast cancer tissue, and about 3 times in each case of 2 cases in 3 cases of human lung cancer tissue. 2 out of 3 cases of human rectal cancer tissue, 4 times out of 5 cases of human colon cancer tissue, about 2 times, about 2 times, about 8 times, about 3 times, about 4 times of the surrounding normal tissue In 2 out of 5 human ovarian cancer tissues, about 10 times and 5 times that of the surrounding normal tissues, the expression levels were about 3 times and about 20 times that of the surrounding normal tissues, respectively.
From this, it can be seen that the total amount of the gene is remarkably increased in cancer tissues.
参考例７
ヒト癌組織における遺伝子発現量の検討（その２）
ヒト肺癌組織（Direct Clinical Access社、およびBioClinical Partners社より購入）より調製したcDNAを鋳型として参考例６と同様の方法により、癌組織、および正常組織における参考例６で用いた遺伝子の発現量の比較を行った。
該反応における反応液の組成は上記cDNA 1μlを鋳型として使用し、参考例６と同一条件でPCR反応を行った。並行してTaqManTM Human β-actin Control Reagents（Applied Biosystems社）を用いて上記cDNA 1μlに含まれるβ-アクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。β-アクチン遺伝子発現量で標準化した場合、上記遺伝子の総量は、DirectClinical Access社のサンプルでは、正常肺組織に比べてヒト肺癌組織10例中8例で約144倍、約3倍、約5倍、約4倍、約4倍、約13倍、約3倍、約19倍に増加しており、ヒト肺癌組織における顕著な発現上昇がみられた。
また、BioClinical Partners社のサンプルでは、上記遺伝子の総量がβ-アクチン遺伝子発現量の1％を超えるものが、正常肺組織では7例中1例であったのに対し、ヒト肺癌組織では11例中5例と高頻度に認められた。
これより、上記遺伝子がヒト肺癌組織において顕著に発現上昇していることが示された。
Reference Example 7
Examination of gene expression level in human cancer tissue (Part 2)
Using the cDNA prepared from human lung cancer tissue (purchased from Direct Clinical Access and BioClinical Partners) as a template, the expression level of the gene used in Reference Example 6 in cancer tissue and normal tissue was determined in the same manner as in Reference Example 6. A comparison was made.
The composition of the reaction solution in the reaction was the PCR reaction using the
In the BioClinical Partners sample, the total amount of the above genes exceeded 1% of the expression level of β-actin gene was 1 in 7 cases in normal lung tissue, but 11 cases in human lung cancer tissue. The incidence was high in 5 cases.
From this, it was shown that the expression of the above gene is remarkably increased in human lung cancer tissues.
参考例８
ヒト培養細胞株における遺伝子発現量の検討
以下で使用される脳腫瘍細胞株SK-N-MC、SK-N-AS、SK-N-BE、SK-N-DZ、SK-N-FI、SK-N-SH、D341Med、Daoy、DBTRG-05MG、U-118 MG、U-87 MG、CCF-STTG1およびSW 1088；ヒト乳癌細胞株HCC1937、ZR-75-1、AU565、MCF-7およびMDA-MB-231；ヒト大腸癌細胞株Caco-2、COLO201、COLO 205、COLO 320DM、HCT-8、HT-29、LoVo、LS123、SNU-C1、SK-CO-1、SW 403、SW 48、SW480、SW 620、SW 837およびSW 948；ヒト胎児腎臓細胞株HEK293；ヒト小細胞肺癌細胞株NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H889、NCI-H1672、NCI-H1836、NCI-H2227、NCI-N417およびSHP-77；ヒト非小細胞肺癌細胞株A549、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H358、NCI-H460、NCI-H522、NCI-H661、NCI-H810、NCI-H1155、NCI-H1299、NCI-H1395、NCI-H1417、NCI-H1435、NCI-H1581、NCI-H1651、NCI-H1703、NCI-H1793、NCI-H1963、NCI-H2073、NCI-H2085、NCI-H2106、NCI-H2228、NCI-H2342およびNCI-H2347；ヒト卵巣癌細胞株ES-2、Caov-3、MDAH2774、NIH:OVCAR3、OV-90、SK-OV-3、TOV-112DおよびTOV-21G；ヒト膵臓癌細胞株PANC-1、MIA-PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3、Capan-1およびCapan-2；ヒト前立腺癌細胞株DU145；ヒト網膜芽腫細胞株WERI-Rb-1およびY79；ヒト精巣癌細胞株Cates-1Bの８６株は、ATCCより購入した。ヒト正常気道上皮細胞SAECおよびヒト正常前立腺上皮細胞HPrECは、Clonetics社より購入した。ヒト大腸癌細胞株COCM1、ヒト非小細胞肺癌細胞株VMRC-LCDおよびヒト前立腺癌細胞株PC3は、JCRBより購入した。これら細胞株は参考例９以降の参考例でも用いることがある。
上記記載の細胞株91株よりRNeasy Mini Total RNA Kit（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを調製した。このトータルRNAを鋳型としてTaqMan Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社）の添付プロトコールに従い、ランダムプライマーを用いた逆転写反応でcDNAを調製した。このcDNAを鋳型として定量的PCR反応を行うことにより、遺伝子FLJ20539遺伝子（配列番号：２）、hCP50177遺伝子（配列番号：５）、hCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、およびTACT427遺伝子の発現量の検討を行った。
該反応は上記トータルRNA 5 ngより得られたcDNAを鋳型として使用し、参考例６と同様の方法により行った。並行してTaqManTM Human β-actin Control Reagents（Applied Biosystems社）を用いて上記トータルRNA 1 ngに含まれるβ-アクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。
上記遺伝子全体の発現量を、β-アクチン遺伝子発現量で標準化した相対的発現率を〔表６〕および〔表７〕に示す。
上記遺伝子発現量の総量がβ-アクチン遺伝子発現量の1％を超える癌細胞株が13株見出され、上記遺伝子の癌細胞株における高発現が認められた。
Examination of gene expression level in cultured human cell lines Brain tumor cell lines SK-N-MC, SK-N-AS, SK-N-BE, SK-N-DZ, SK-N-FI, SK- N-SH, D341Med, Daoy, DBTRG-05MG, U-118 MG, U-87 MG, CCF-STTG1 and SW 1088; human breast cancer cell lines HCC1937, ZR-75-1, AU565, MCF-7 and MDA-MB -231; human colon cancer cell lines Caco-2, COLO201, COLO205, COLO320DM, HCT-8, HT-29, LoVo, LS123, SNU-C1, SK-CO-1, SW403, SW48, SW480, SW 620, SW 837 and SW 948; human fetal kidney cell line HEK293; human small cell lung cancer cell lines NCI-H187, NCI-H378, NCI-H526, NCI-H889, NCI-H1672, NCI-H1836, NCI-H2227, NCI-N417 and SHP-77; human non-small cell lung cancer cell lines A549, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H358, NCI-H460, NCI-H522, NCI-H661, NCI-H810, NCI-H1155, NCI -H1299, NCI-H1395, NCI-H1417, NCI-H1435, NCI-H1581, NCI-H1651, NCI-H1703, NCI-H1793, NCI-H1963, NCI-H2073, NCI-H2085, NCI-H2106, NCI-H2228 , NCI-H2342 and NCI-H2347; human ovarian cancer cells Strain ES-2, Caov-3, MDAH2774, NIH: OVCAR3, OV-90, SK-OV-3, TOV-112D and TOV-21G; human pancreatic cancer cell lines PANC-1, MIA-PaCa-2, AsPC- 1, BxPC-3, Capan-1 and Capan-2; human prostate cancer cell line DU145; human retinoblastoma cell line WERI-Rb-1 and Y79; 86 strains of human testicular cancer cell line Cates-1B from ATCC Purchased. Human normal airway epithelial cells SAEC and human normal prostate epithelial cells HPrEC were purchased from Clonetics. Human colon cancer cell line COCM1, human non-small cell lung cancer cell line VMRC-LCD, and human prostate cancer cell line PC3 were purchased from JCRB. These cell lines may also be used in Reference Examples after Reference Example 9.
Total RNA was prepared from 91 cell lines described above using RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN). Using this total RNA as a template, cDNA was prepared by reverse transcription using random primers according to the attached protocol of TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems). By performing quantitative PCR reaction using this cDNA as a template, the genes FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5), hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (SEQ ID NO: 11) And, the expression level of TACT427 gene was examined.
The reaction was performed in the same manner as in Reference Example 6 using the cDNA obtained from 5 ng of the above total RNA as a template. In parallel, the number of copies of β-actin gene contained in 1 ng of the total RNA was calculated using TaqMan ™ Human β-actin Control Reagents (Applied Biosystems) as an internal standard.
[Table 6] and [Table 7] show the relative expression rates obtained by standardizing the expression level of the entire gene with the β-actin gene expression level.
Thirteen cancer cell lines were found in which the total gene expression level exceeded 1% of the β-actin gene expression level, and high expression of the above gene in the cancer cell lines was observed.
参考例９
組換え型完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築（その１）
TACT427-Aタンパク質およびTACT427-Bタンパク質のＣ末端に3xFLAGタグを融合したタンパク質を発現する動物細胞用発現ベクターを構築した。
参考例４で得たTACT427-A/pCR-BluntII-TOPO、TACT427-B/pCR-BluntII-TOPO、およびp3xFLAG-CMV-14（Sigma社）を制限酵素EcoRIおよびXbaIにて処理し、アガロースゲル電気泳動で分離後、TACT427-A、TACT427-Bおよびp3xFLAG-CMV-14に相当するDNA断片を回収し、Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。それぞれのDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2（Takara Bio社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌TOP10に導入し、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）、およびTACT427-Bタンパク質（配列番号：２０）をコードするcDNA配列を有する動物細胞用発現ベクターp3xFLAG-TACT427-A、およびp3xFLAG-TACT427-Bを得た。
Reference Example 9
Construction of expression vector for animal cells of recombinant full-length protein (Part 1)
An expression vector for animal cells expressing a protein in which a 3xFLAG tag was fused to the C terminus of TACT427-A protein and TACT427-B protein was constructed.
TACT427-A / pCR-BluntII-TOPO, TACT427-B / pCR-BluntII-TOPO and p3xFLAG-CMV-14 (Sigma) obtained in Reference Example 4 were treated with restriction enzymes EcoRI and XbaI, and agarose gel electricity After separation by electrophoresis, DNA fragments corresponding to TACT427-A, TACT427-B and p3xFLAG-CMV-14 were recovered and purified using Gel Extraction Kit (QIAGEN). Each DNA fragment was subjected to a ligation reaction using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio), then introduced into E. coli TOP10 and selected in an LB agar medium containing ampicillin. As a result of analyzing the sequence of each clone, expression vector p3xFLAG-TACT427-A for animal cells having a cDNA sequence encoding TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15) and TACT427-B protein (SEQ ID NO: 20), And p3xFLAG-TACT427-B was obtained.
参考例１０
組換え型完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築（その２）
TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）を発現する動物細胞用発現ベクターを構築した。
参考例９で得られたp3xFLAG-TACT427-Aを鋳型とし、プライマー９（配列番号：３９）およびプライマー１０（配列番号：４０）を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成はp3xFLAG-TACT427-A200 ngを鋳型として使用し、Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase（STRATAGENE社）を2.5 U、プライマー９（配列番号：３９）およびプライマー１０（配列番号：４０）を各1μM、dNTPsを200μM、およびGC Buffer I（Takara Bio社）を25μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の後、95℃・15秒、60℃・15秒、72℃・3分のサイクルを25回繰り返し行った。次にPCR Purification Kit（QIAGEN社）にて該PCR反応産物を精製した後、制限酵素XbaIおよびEcoRIにて処理した。pcDNA3.1(+)（Invitrogen社）も制限酵素XbaIおよびEcoRIにて処理した。これらをアガロースゲル電気泳動で分離後、TACT427-Aタンパク質をコードする塩基配列を含むDNA断片とpcDNA3.1(+)に相当するDNA断片をそれぞれ回収し、Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。それぞれのDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2（Takara Bio社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌TOP10に導入し、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、TACT427-Aタンパク質をコードするcDNA配列を有する動物細胞用発現ベクターpcDNA3.1(+)-TACT427-Aを得た。
Reference Example 10
Construction of expression vector for animal cells of recombinant full-length protein (Part 2)
An animal cell expression vector expressing TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15) was constructed.
Using p3xFLAG-TACT427-A obtained in Reference Example 9 as a template, PCR reaction was performed using primer 9 (SEQ ID NO: 39) and primer 10 (SEQ ID NO: 40). The composition of the reaction solution in this reaction was p3xFLAG-TACT427-A200 ng as a template, Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE) 2.5 U, primer 9 (SEQ ID NO: 39) and primer 10 (SEQ ID NO: 40) 1 μM each,
参考例１１
ペプチド抗体の作製と精製
TACT427タンパク質のアミノ酸配列に基づき、15アミノ酸からなる以下の3種のペプチド（ペプチド１〜３）をFmoc固相合成法を用いて合成した。
ペプチド１のアミノ酸配列〔Gly-Ser-Gly-Glu-Glu-Asn-Asp-Pro-Gly-Glu-Gln-Ala-Leu-Pro-Cys（配列番号：４１）〕は、TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）の220番目から233番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Cysを付加した配列である。
ペプチド２〔Gly-Pro-Ala-Glu-Gly-Pro-Ala-Glu-Pro-Ala-Ala-Glu-Ala-Ser-Cys（配列番号：４２）〕のアミノ酸配列は、TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）の517番目から530番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Cysを付加した配列である。
ペプチド３のアミノ酸配列〔Gly-Ser-Val-Gly-Gly-Asn-Thr-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Phe-Glu-Cys（配列番号：４３）〕は、TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）の800番目から813番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Cysを付加した配列である。
上記ペプチド１、ペプチド２およびペプチド３のそれぞれのペプチドに、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）をキャリアータンパク質として結合させ抗原とし、以下のように、ウサギポリクローナル抗体を作製した。
免疫動物は雄性ウサギＫＢＬ:ＪＷ（１１週齢、オリエンタル酵母）一羽を用い、初回感作は完全フロインドアジュバンド（Difco社）懸濁液、2回目以降は不完全フロインドアジュバンド（Difco社）懸濁液を用いた。感作は背部皮下注射により行い、1回の感作には各抗原0.5mgを用い、初回感作後14日毎に3回繰り返した。初回感作後52日目に麻酔下頚動脈採血を行い、血清約50mlを得た。このようにして得られた血清を硫酸アンモニウム塩析法により濃縮し、得られた粗IgG画分全量をプロテインAアフィニティーカラム（Amersham-Bioscience社）により精製し、ペプチド１、ペプチド２またはペプチド３を免疫したウサギから、それぞれ約223mg、約495 mgおよび約390 mgの精製IgGを得た。さらにペプチド１に対する精製IgG 111mg、ペプチド２に対する精製IgG 248mgおよびペプチド３に対する精製IgG195mgを材料として、各々の免疫源ペプチドを固定化したカラムに結合するIgG画分を取得した。固定化には各ペプチドのＣ末端のCysを利用し、ホウ酸緩衝液を用いてセファロースカラム（Amersham-Bioscience社）にカップリングした。カラムからの溶出には8M尿素／リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を用いた。溶出液をPBSに対して透析して尿素を除いた後、限外濃縮、フィルターろ過滅菌することにより、ペプチド１、ペプチド２およびペプチド３に対するアフィニティー精製抗体AS-2480、AS-2481およびAS-2482を、約3.7mg、約0.69 mgおよび約17 mgずつ取得した。
Reference Example 11
Production and purification of peptide antibodies
Based on the amino acid sequence of the TACT427 protein, the following three peptides (
The amino acid sequence of peptide 1 [Gly-Ser-Gly-Glu-Glu-Asn-Asp-Pro-Gly-Glu-Gln-Ala-Leu-Pro-Cys (SEQ ID NO: 41)] is the TACT427-A protein (sequence No. 15) is a sequence in which Cys is added to the C-terminus of the amino acid sequence from position 220 to position 233.
The amino acid sequence of peptide 2 [Gly-Pro-Ala-Glu-Gly-Pro-Ala-Glu-Pro-Ala-Ala-Glu-Ala-Ser-Cys (SEQ ID NO: 42)] is the TACT427-A protein (sequence) No. 15) is a sequence in which Cys is added to the C-terminal of the amino acid sequence from 517th to 530th.
The amino acid sequence of peptide 3 [Gly-Ser-Val-Gly-Gly-Asn-Thr-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Phe-Glu-Cys (SEQ ID NO: 43)] is the TACT427-A protein (sequence) No. 15) is a sequence obtained by adding Cys to the C-terminal of the amino acid sequence from the 800th position to the 813rd position.
Keyhole limpet hemocyanin (KLH) was bound as a carrier protein to each of the
The immunized animal is a single male rabbit KBL: JW (11 weeks old, Oriental yeast), the first sensitization is a complete Freund adjuvant (Difco) suspension, the second and subsequent incomplete Freund adjuvant (Difco) A suspension was used. Sensitization was performed by subcutaneous injection at the back, and 0.5 mg of each antigen was used for one sensitization and repeated three times every 14 days after the first sensitization. On day 52 after the first sensitization, blood was collected from the carotid artery under anesthesia to obtain about 50 ml of serum. The serum thus obtained is concentrated by ammonium sulfate salting-out, and the total amount of the obtained crude IgG fraction is purified by a protein A affinity column (Amersham-Bioscience) to immunize
参考例１２
ウサギペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティング
TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）の検出は、参考例１１で作製したペプチド抗体を含むウサギ血清を用いて行った。ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞1.0×106個を10％牛胎仔血清（JRH社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Invitrogen社）9 mlに懸濁し、直径10cmのぺトリディッシュに播種した。5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、予めFuGene6トランスフェクション試薬18μl（Roche Diagnostics社）およびOPTI-MEM I（Invitrogen社）と混合し室温で15分間放置しておいたp3xFLAG-TACT427-A 6μgを添加し同条件で培養を継続した。2日後に細胞をPBSで洗浄後、氷冷したRIPA緩衝液〔50mMトリス・塩酸緩衝液、pH 7.5、150 mM 塩化ナトリウム、1％Triton X-100、0.1％SDS、1％デオキシコール酸、CompleteTMタブレット（Roche Diagnostics社）、Phosphatase Inhibitor Cocktail-2（Sigma社）〕800μlを添加し4℃で15分間放置した。このRIPA緩衝液を回収し、15,000rpmで20分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液とし、20μlを7.5％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブロットP膜（ATTO社）に転写した後、ブロッキング溶液（トリス緩衝化生理食塩水、0.1％Tween-20、5％スキムミルク）中に１時間室温放置した。次に参考例１１で作製したペプチド抗体AS-2480、AS-2481またはAS-2482を含む3種類のウサギ血清を、ブロッキング溶液中で各々100倍に希釈して加え、4℃にて一晩インキュベートし、続いてHRP標識抗ウサギIgG抗体（Amersham-Bioscience社）をブロッキング溶液で10万倍に希釈した2次抗体溶液中で1時間室温放置した。検出はECL plus（Amersham-Bioscience社）の添付プロトコールに従い行った。
ペプチド抗体AS-2480、AS-2481またはAS-2482を含む3種類のウサギ血清のいずれを用いても、分子量150kD近傍の位置にTACT427-Aタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
Reference Example 12
Western blotting using rabbit peptide antibody
Detection of TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15) was performed using rabbit serum containing the peptide antibody prepared in Reference Example 11. 1.0 × 10 6 HEK293 cells derived from human fetal kidney were suspended in 9 ml of Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and seeded in a Petri dish having a diameter of 10 cm. After incubating overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide stream, p3xFLAG- was mixed with 18 µl of FuGene6 transfection reagent (Roche Diagnostics) and OPTI-MEM I (Invitrogen) and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. 6 μg of TACT427-A was added and cultivation was continued under the same conditions. Two days later, the cells were washed with PBS and then ice-cooled RIPA buffer [50 mM Tris / HCl buffer, pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% deoxycholic acid, Complete TM tablet (Roche Diagnostics), Phosphatase Inhibitor Cocktail-2 (Sigma)] 800 μl was added and left at 4 ° C. for 15 minutes. The RIPA buffer solution was collected and centrifuged at 15,000 rpm for 20 minutes to obtain a cell-free extract, and 20 μl was subjected to SDS-PAGE on 7.5% acrylamide gel. The separated proteins were transferred to a clear blot P membrane (ATTO) according to a conventional method, and then left in a blocking solution (Tris-buffered saline, 0.1% Tween-20, 5% skim milk) for 1 hour at room temperature. Next, three types of rabbit sera containing peptide antibodies AS-2480, AS-2481 or AS-2482 prepared in Reference Example 11 were each diluted 100-fold in blocking solution and incubated overnight at 4 ° C. Subsequently, the HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Amersham-Bioscience) was allowed to stand at room temperature for 1 hour in a secondary antibody solution diluted 100,000 times with a blocking solution. Detection was performed according to the attached protocol of ECL plus (Amersham-Bioscience).
A specific band derived from the TACT427-A protein was observed at a position near the molecular weight of 150 kD using any of the three types of rabbit sera containing the peptide antibodies AS-2480, AS-2481, or AS-2482.
参考例１３
ペプチド抗体を用いた免疫沈降
参考例１１で作製したペプチド抗体を用いて、TACT427-Aタンパク質に対する免疫沈降を非変性状態にて行った。
参考例９で得たp3xFLAG-TACT427-Aを用いて参考例１２と同様の操作で調製した無細胞抽出液1mlに、Protein G-Sepharose 4FF（Amersham-Bioscience社）懸濁液（等容量のRIPA緩衝液で懸濁したもの）50μlとウサギ血清3μlとを加え、4℃にて一晩撹拌を行った。ウサギ血清としては、参考例１１で作製したペプチド抗体AS-2480、AS-2481またはAS-2482を含む3種類のウサギ血清のいずれかを用いた。ProteinG-Sepharose 4FF共沈殿画分をRIPA緩衝液にて洗浄後、1％ 2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー（Bio Rad社）50μlに懸濁し95℃で5分間加熱した後、20μｌを7.5％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。検出は参考例１２に記載の方法に準じた。但し一次抗体としてマウス抗FLAGM2抗体（Sigma社）をブロッキング溶液で10μg/mlとなるよう希釈したもの、二次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体（Amersham-Bioscience社）をブロッキング溶液で5万倍に希釈したものを用いた。ペプチド抗体AS-2480、AS-2481またはAS-2482を含む3種類のウサギ血清のいずれを用いて免疫沈降を行った場合にも、分子量150kD近傍にTACT427-Aタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
これより、ペプチド抗体AS-2480、AS-2481およびAS-2482は、未変性のTACT427-Aタンパク質と結合することが明らかとなった。
Reference Example 13
Immunoprecipitation using peptide antibody Using the peptide antibody prepared in Reference Example 11, immunoprecipitation against TACT427-A protein was performed in a non-denaturing state.
To 1 ml of cell-free extract prepared by the same procedure as in Reference Example 12 using p3xFLAG-TACT427-A obtained in Reference Example 9, a suspension of Protein G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) (equal volume of RIPA) (Suspended in buffer) 50 μl and rabbit serum 3 μl were added and stirred at 4 ° C. overnight. As the rabbit serum, any of the three types of rabbit sera containing the peptide antibodies AS-2480, AS-2481 or AS-2482 prepared in Reference Example 11 was used. The ProteinG-Sepharose 4FF coprecipitate fraction was washed with RIPA buffer, suspended in 50 μl of SDS-PAGE sample buffer (Bio Rad) containing 1% 2-mercaptoethanol, heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 20 μl. Was subjected to SDS-PAGE on a 7.5% acrylamide gel. Detection was in accordance with the method described in Reference Example 12. However, a mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) diluted as a primary antibody to 10 μg / ml with a blocking solution, and an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Amersham-Bioscience) as a secondary antibody was increased 50,000 times with a blocking solution. The diluted one was used. When immunoprecipitation was performed using any of the three types of rabbit sera containing peptide antibody AS-2480, AS-2481, or AS-2482, a specific band derived from the TACT427-A protein was found in the vicinity of a molecular weight of 150 kD. Admitted.
This revealed that peptide antibodies AS-2480, AS-2481 and AS-2482 bind to the native TACT427-A protein.
参考例１４
癌細胞株におけるTACT427タンパク質の発現検討
直径10cmのぺトリディッシュに播種した肺癌細胞株A549、NCI-H226ならびにNCI-H522および乳癌細胞株ZR-75-1をPBSで洗浄後、参考例１２に記載の方法に従い無細胞抽出液を作製した。A549、NCI-H226、NCI-H522およびZR-75-1の無細胞抽出液各々1mlに、ProteinG-Sepharose 4FF（Amersham-Bioscience社）懸濁液（等容量のRIPA緩衝液で懸濁したもの）50μlと、参考例１１で作製したペプチド抗体AS-2482を3μg加え、4℃にて一晩撹拌を行った。ProteinG-Sepharose 4FF共沈殿画分をRIPA緩衝液にて洗浄後、1％ 2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー（Bio Rad社）50μlに懸濁し95℃で5分間加熱した後、20μlを7.5％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。ペプチド抗体AS-2482を用いて参考例１２に記載の方法に準じて検出を行った。
A549、NCI-H226、NCI-H522およびZR-75-1のいずれにおいても、分子量150kD近傍に、TACT427タンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
これより、上記タンパク質が上記5種類の癌細胞株で発現していることが明らかとなった。
Reference Example 14
Examination of TACT427 protein expression in cancer cell lines Lung cancer cell lines A549, NCI-H226 and NCI-H522 and breast cancer cell line ZR-75-1 seeded in a 10 cm diameter Petri dish were washed with PBS and described in Reference Example 12 A cell-free extract was prepared according to the above method. Protein G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) suspension in 1 ml each of cell-free extracts of A549, NCI-H226, NCI-H522 and ZR-75-1 (suspended in an equal volume of RIPA buffer) 50 μl and 3 μg of peptide antibody AS-2482 prepared in Reference Example 11 were added, and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight. The ProteinG-Sepharose 4FF coprecipitate fraction was washed with RIPA buffer, suspended in 50 μl of SDS-PAGE sample buffer (Bio Rad) containing 1% 2-mercaptoethanol, heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 20 μl. Was subjected to SDS-PAGE on a 7.5% acrylamide gel. Detection was performed according to the method described in Reference Example 12 using peptide antibody AS-2482.
In any of A549, NCI-H226, NCI-H522 and ZR-75-1, a specific band derived from TACT427 protein was observed in the vicinity of a molecular weight of 150 kD.
This revealed that the protein was expressed in the five types of cancer cell lines.
参考例１５
TACT427-Aタンパク質の局在性検討（細胞染色）
ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞1×105個を10％牛胎仔血清（JRH社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Invitrogen社）に懸濁し、2ウェル ポリ-D-リジンコートカルチャースライド（BDファルコン社）に播種した。同様に5×104個のヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H460を10％牛胎仔血清（JRH社）を含むRPMI1640培地（Invitrogen社）に懸濁し2ウェル ポリ-D-リジンコートカルチャースライド（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、予めFuGene6トランスフェクション試薬5.3μl（Roche Diagnostics社）およびOPTI-MEM Ｉ（Invitrogen社）と混合し室温で15分間放置しておいたp3xFLAG-TACT427-A 1.33μgを添加し同条件で培養を継続した。2日後に細胞をPBSで洗浄後、10％中性ホルマリン緩衝液を加え室温で30分間固定した。その後PBSで0.1％に希釈したTritonX-100を加え室温で5分放置した後、再びPBSで洗浄し、更に1％ BSAを含むPBSを加え4℃で24時間放置し、抗体の非特異的結合サイトをブロックした。次に1％ BSAを含むPBSで10μg/mlとなるよう希釈したマウス抗FLAG M2抗体（Sigma社）を加え、室温で45分間反応させてからPBSで洗浄し、続いて1％ BSAを含むPBSで10μg/mlとなるよう希釈したAlexa488標識抗マウスIgG抗体（Molecular Probes社）を加えた。再び室温で45分間反応させてからPBSで洗浄した後、蛍光顕微鏡により観察した。
その結果、TACT427-Aタンパク質は、HEK293、NCI-H460のいずれにおいても細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
また同様の方法でHEK293細胞に、pcDNA3.1(+)-TACT427-Aプラスミドを導入し、10μg/mlのAS-2480、AS-2481およびAS-2482を一次抗体として、10μg/mlのAlexa488標識抗ウサギIgG抗体（MolecularProbes社）を二次抗体として用いて、TACT427-Aタンパク質の局在性を調べたところ、同じく細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
Reference Example 15
Localization of TACT427-A protein (cell staining)
1 x 10 5 human fetal kidney-derived HEK293 cells are suspended in Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), and a 2-well poly-D-lysine-coated culture slide (BD Falcon) Sowing). Similarly, 5 × 10 4 human non-small cell lung cancer cell line NCI-H460 is suspended in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and 2-well poly-D-lysine coated culture slide ( BD Falcon). After incubating overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide stream, p3xFLAG was mixed with 5.3 µl of FuGene6 transfection reagent (Roche Diagnostics) and OPTI-MEM I (Invitrogen) and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. -1.33 μg of TACT427-A was added and cultivation was continued under the same conditions. Two days later, the cells were washed with PBS, 10% neutral formalin buffer was added, and fixed at room temperature for 30 minutes. Then add TritonX-100 diluted to 0.1% with PBS, let stand at room temperature for 5 minutes, then wash again with PBS, add PBS with 1% BSA and leave at 4 ° C for 24 hours to allow non-specific antibody binding Blocked the site. Next, mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) diluted to 10 μg / ml with PBS containing 1% BSA was added, reacted at room temperature for 45 minutes, washed with PBS, and then PBS containing 1% BSA. Then, Alexa488-labeled anti-mouse IgG antibody (Molecular Probes) diluted to 10 μg / ml was added. After reacting again at room temperature for 45 minutes, the plate was washed with PBS and then observed with a fluorescence microscope.
As a result, it was revealed that the TACT427-A protein is expressed on the cytoplasmic membrane in both HEK293 and NCI-H460.
In the same manner, pcDNA3.1 (+)-TACT427-A plasmid was introduced into HEK293 cells and labeled with 10 μg / ml Alexa488 using 10 μg / ml AS-2480, AS-2481 and AS-2482 as primary antibodies. When the localization of the TACT427-A protein was examined using an anti-rabbit IgG antibody (MolecularProbes) as a secondary antibody, it was found that it was also expressed on the cytoplasmic membrane.
参考例１６
TACT427-Aタンパク質の局在性検討（ビオチン標識）
参考例１２と同様の方法で、HEK293細胞にp3xFLAG-TACT427-Aプラスミドを導入し、48時間後に細胞表層上に露出したタンパク質をCellular Labeling and Immunoprecipitation Kit（Roche Diagnostics社）を用いてビオチン標識を行った。さらに参考例１２の方法に従い調製した無細胞抽出液1mlとマウス抗FLAG M2抗体（Sigma社）3μgとを用いて参考例１３の方法に従って免疫沈降しSDS-PAGEを行った。HRP標識したストレプトアビジン（Amersham-Bioscience社）を用いて検出したところ、分子量150kD近傍にTACT427-Aタンパク質に由来するバンドが認められ、TACT427-Aタンパク質が細胞質膜上に発現することが明らかとなった。
Reference Example 16
Localization of TACT427-A protein (biotin labeling)
In the same manner as in Reference Example 12, the p3xFLAG-TACT427-A plasmid was introduced into HEK293 cells, and the proteins exposed on the cell surface after 48 hours were labeled with biotin using Cellular Labeling and Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics). It was. Furthermore, immunoprecipitation was performed according to the method of Reference Example 13 using 1 ml of cell-free extract prepared according to the method of Reference Example 12 and 3 μg of mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma), and SDS-PAGE was performed. When detected using HRP-labeled streptavidin (Amersham-Bioscience), a band derived from TACT427-A protein was observed in the vicinity of a molecular weight of 150 kD, revealing that TACT427-A protein is expressed on the cytoplasmic membrane. It was.
参考例１７
TACT427タンパク質の局在性検討（ビオチン標識）
直径10cmのぺトリディッシュに播種したヒト非小細胞肺癌細胞株A549、NCI-H226およびNCI-H522の細胞表層上に露出しているタンパク質をCellular Labeling and Immunoprecipitation Kit（Roche Diagnostics社）を用いてビオチン標識を行った。さらに参考例１２の方法に従い調製した無細胞抽出液1mlとウサギペプチド抗体AS-2482 3μgとを用いて参考例１３の方法に従って免疫沈降しSDS-PAGEを行った。HRP標識したストレプトアビジン（Amersham-Bioscience社）を用いて検出したところ、A549、NCI-H226およびNCI-H522のいずれにおいても、分子量150kD近傍にTACT427-Aタンパク質、TACT427-A2タンパク質、TACT427-Bタンパク質、TACT427-B2タンパク質、TACT427-Cタンパク質およびTACT427-C2タンパク質に由来するバンドが認められた。
これより、TACT427タンパク質が細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
Reference Example 17
Localization of TACT427 protein (biotin labeling)
Proteins exposed on the cell surface of human non-small cell lung cancer cell lines A549, NCI-H226, and NCI-H522 seeded in a 10 cm diameter Petri dish are biotinylated using Cellular Labeling and Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics) Labeling was performed. Furthermore, immunoprecipitation was performed according to the method of Reference Example 13 using 1 ml of cell-free extract prepared according to the method of Reference Example 12 and 3 μg of rabbit peptide antibody AS-2482, and SDS-PAGE was performed. When detected using HRP-labeled streptavidin (Amersham-Bioscience), TACT427-A protein, TACT427-A2 protein, and TACT427-B protein have a molecular weight of about 150 kD in any of A549, NCI-H226, and NCI-H522. Bands derived from TACT427-B2 protein, TACT427-C protein and TACT427-C2 protein were observed.
This revealed that the TACT427 protein was expressed on the cytoplasmic membrane.
参考例１８
TACT427タンパク質の局在性検討（FACS解析）
直径10cmのペトリディッシュに播種しサブコンフルエントにまで培養したヒト非小細胞肺癌細胞株A549をPBSで洗浄後、3％BSAおよび5mM EDTAを含むPBSを加え室温で15分間放置しA549細胞を分散した。次に緩衝液A〔2％牛胎仔血清（JRH社）および0.1％アジ化ナトリウムを含むHBSS（Hanks’Balanced Salt Solutions、Invitrogen社）〕で1×106個/mlの濃度になるようにA549細胞を懸濁し、終濃度5μg/mlとなるようにAS-2482または非免疫ウサギIgG（Jackson社）を加え、氷上に5時間放置した。続いて緩衝液Aで細胞を洗浄した後、10μg/mlのAlexa488標識抗ウサギIgG抗体（Molecular Probes社）を含む緩衝液Aで懸濁し、氷上にて1.5時間放置した。緩衝液Aで再び洗浄後、FACScan（BDバイオサイエンス社）にて解析した。その結果、ウサギペプチド抗体AS-2482特異的にA549細胞が染色され、TACT427-Aタンパク質、TACT427-A2タンパク質、TACT427-Bタンパク質、TACT427-B2タンパク質、TACT427-Cタンパク質およびTACT427-C2タンパク質が細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
Reference Example 18
Localization of TACT427 protein (FACS analysis)
Human non-small cell lung cancer cell line A549 seeded in a petri dish with a diameter of 10 cm and cultured to sub-confluence was washed with PBS, then PBS containing 3% BSA and 5 mM EDTA was added and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to disperse A549 cells. . Next, A549 with buffer A (HBSS (Hanks' Balanced Salt Solutions, Invitrogen) containing 2% fetal bovine serum (JRH) and 0.1% sodium azide) to a concentration of 1 × 10 6 cells / ml The cells were suspended, AS-2482 or non-immune rabbit IgG (Jackson) was added to a final concentration of 5 μg / ml, and left on ice for 5 hours. Subsequently, the cells were washed with buffer A, suspended in buffer A containing 10 μg / ml Alexa488-labeled anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes), and left on ice for 1.5 hours. After washing again with buffer A, analysis was performed with FACScan (BD Bioscience). As a result, A549 cells were stained specifically for the rabbit peptide antibody AS-2482, and TACT427-A protein, TACT427-A2 protein, TACT427-B protein, TACT427-B2 protein, TACT427-C protein and TACT427-C2 protein were cytoplasmic membranes. It was revealed that it was expressed above.
参考例１９
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226のアポトーシス誘導
参考例２に記載のNCI-H460以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検討した。
ヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226（いずれもATCCより購入）を、それぞれKaighn's改変F-12 Nutrient Mixture（Invitrogen社）および25mM HEPES含有RPMI-1640培地（Invitrogen社）に牛胎仔血清（JRH社）を10％加えた培地で懸濁し、1ウェル当たり1×104個の細胞密度で96穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドを導入した。
以下に述べる参考例１９、２０および２１で用いたセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４４）は、参考例２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）に相補的な配列を有するように設計し、phosphorothioate化した後、HPLC精製して用いた（以下、センスオリゴヌクレオチドと略する）。
具体的には、A549細胞の場合には、参考例２で得られたアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）、およびセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４４）、それぞれ0.05μgをリポフェクトアミン2000（Invitrogen社）0.8μlと共に、OPTI-MEMＩ（Invitrogen社）50μlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM I（Invitrogen社）50μlに培地交換しておいたA549細胞に該混合液中を全量添加し、更に3時間培養を継続した後、10％牛胎仔血清（JRH社）を含むKaighn's改変F-12Nutrient Mixture（Invitrogen社）100μlに培地交換した。
NCI-H226細胞の場合では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）、およびセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４４）のそれぞれ0.13μgを、オリゴフェクトアミン（Invitrogen社）0.8μlと共に、OPTI-MEMＩ（Invitrogen社）50μｌと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM I（Invitrogen社）50μlに培地交換しておいたNCI-H226細胞に該混合液を全量添加し、更に3時間培養を継続した後、30％牛胎仔血清（JRH社）を含む25mM HEPES含有RPMI-1640培地（Invitrogen社）50μlを添加した。
オリゴヌクレオチドを導入して更に2日間培養した後、Cell Death Detection ELISAPLUS(Roche Diagnostics社)の添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、両細胞株においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドに比べ、それぞれ1.65倍および3.03倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（P≦0.01）を示した。
Reference Example 19
Induction of apoptosis of human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI-H226 by introduction of antisense oligonucleotide Apoptosis is induced by introduction of antisense oligonucleotide in human non-small cell lung cancer cell lines other than NCI-H460 described in Reference Example 2 It was examined whether or not.
Human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI-H226 (both purchased from ATCC) were added to Kaighn's modified F-12 Nutrient Mixture (Invitrogen) and 25 mM HEPES-containing RPMI-1640 medium (Invitrogen) respectively. JRH) was suspended in a medium supplemented with 10%, and seeded in a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) at a density of 1 × 10 4 cells per well. After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, the oligonucleotide was introduced.
The sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) used in Reference Examples 19, 20 and 21 described below is designed to have a sequence complementary to the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) described in Reference Example 2. After phosphorthiolation, HPLC purification was used (hereinafter abbreviated as sense oligonucleotide).
Specifically, in the case of A549 cells, the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13), the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) obtained in Reference Example 2 Each 0.05 μg was mixed with 0.8 μl of Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 50 μl of OPTI-MEMI (Invitrogen) and left at room temperature for 20 minutes. After adding the entire amount of the mixture to A549 cells that had been changed to 50 μl of OPTI-MEM I (Invitrogen) in advance, and further continuing the culture for 3 hours, Kaighn's containing 10% fetal calf serum (JRH) The medium was replaced with 100 μl of modified F-12 Nutrient Mixture (Invitrogen).
In the case of NCI-H226 cells, 0.13 μg each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13), the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) was added to the oligofectamine (Invitrogen The product was mixed with 50 μl of OPTI-MEMI (Invitrogen) together with 0.8 μl and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. Add the entire volume of the mixture to NCI-H226 cells whose medium has been changed to 50 μl of OPTI-MEM I (Invitrogen) in advance, and continue to culture for 3 hours, and then contain 30% fetal calf serum (JRH) 50 μl of RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 25 mM HEPES was added.
After introducing the oligonucleotide and further culturing for 2 days, the apoptosis-inducing activity of the oligonucleotide was measured according to the attached protocol of Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics).
As a result, in both cell lines, the antisense oligonucleotide showed 1.65 times and 3.03 times the apoptosis-inducing activity as compared to the control oligonucleotide and the sense oligonucleotide used as negative targets, respectively, and a statistically significant difference (P ≦ 0.01).
参考例２０
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226におけるFLJ20539遺伝子（配列番号：２）、hCP50177遺伝子（配列番号：５）、hCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、およびTACT427遺伝子のmRNA発現量低下
参考例３に記載のNCI-H460以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、上記遺伝子のmRNA発現量が低下するか否か調べた。
ヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226をそれぞれ参考例１９と同じ培地に懸濁し、1ウェル当たりA549細胞株では7.5×104個、NCI-H226細胞株では5×104個の細胞密度で24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的に、A549細胞株では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）、およびセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４４）のそれぞれ0.84μgをリポフェクトアミン2000（Invitrogen社）3.2μlと共に、Opti-MEMＩ（Invitrogen社）200μlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM Ｉ（Invitrogen社）200μｌに培地交換しておいたA549細胞に該混合液を全量添加し、更に3時間培養を継続した後、10％牛胎仔血清（JRH社）を含むKaighn's改変F-12Nutrient Mixture（Invitrogen社）500μｌに培地交換した。
NCI-H226細胞の場合では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）、およびセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４４）のそれぞれ0.13μgを、オリゴフェクトアミン（Invitrogen社）2μlと共にOpti-MEMＩ（Invitrogen社）125μlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM Ｉ（Invitrogen社）125μlに培地交換しておいたNCI-H226細胞に該混合液を全量添加し、更に4時間培養を継続した後、30％牛胎仔血清（JRH社）を含む25mM HEPES含有RPMI-1640培地（Invitrogen社）125μlを加えた。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクションし、更に16時間培養を継続した後に、RNeasyMini Total RNA Kit（QIAGEN社）を用いてA549細胞およびNCI-H226細胞からトータルRNAを抽出した。TaqManTM Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社）の添付プロトコールに従い、ランダムプライマーを用いた逆転写反応によってトータルRNAからcDNAを調製した。トータルRNA5 ngから調製したcDNAを鋳型とし、参考例６と同様の方法によりFLJ20539遺伝子（配列番号：２）、hCP50177遺伝子（配列番号：５）、hCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、およびTACT427遺伝子の発現量を測定した。同量の鋳型cDNA中に含まれるβ-アクチン遺伝子発現量をTaqManTM β-actin Control Reagents（Applied Biosystems社）を用いて測定し内部標準とした。
β-アクチン遺伝子発現量に対する上記遺伝子の相対的発現量比率（％）は、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）またはセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４４）を導入した場合に比べて、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）を導入した場合に顕著に低下しており、統計学的に有意（P≦0.01）な発現量低下が認められた（表８）。
この結果より、ヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226においても、FLJ20539遺伝子（配列番号：２）、hCP50177遺伝子（配列番号：５）、hCP1762319遺伝子（配列番号：８）ならびにFLJ13515遺伝子（配列番号：１１）、およびTACT427遺伝子のmRNA発現量低下により、アポトーシスが誘発されたことが示された。
FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5), hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (sequence) in human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI-H226 by introduction of antisense oligonucleotides No. 11) and decrease in the mRNA expression level of the TACT427 gene In the human non-small cell lung cancer cell lines other than NCI-H460 described in Reference Example 3, can the mRNA expression level of the above gene be reduced by antisense oligonucleotide administration? I examined it.
Human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI-H226 were suspended in the same medium as in Reference Example 19, respectively, and 7.5 × 10 4 cells per well and 5 × 10 4 cells per well in the A549 cell line A 24-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) was seeded at a density. After overnight culture at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, the oligonucleotide was transfected.
Specifically, in the A549 cell line, 0.84 μg of each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13), the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) was added to Lipofectamine 2000 ( Invitrogen) (3.2 μl) and Opti-MEMI (Invitrogen) (200 μl) were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. Add the entire amount of the mixture to A549 cells whose medium has been changed to 200 µl of OPTI-MEM I (Invitrogen) in advance, and continue culture for 3 hours, followed by Kaighn's modification containing 10% fetal calf serum (JRH) The medium was replaced with 500 μl of F-12 Nutrient Mixture (Invitrogen).
In the case of NCI-H226 cells, 0.13 μg each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13), the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) was added to the oligofectamine (Invitrogen 2) μl together with 125 μl of Opti-MEMI (Invitrogen) and left at room temperature for 20 minutes. Add the entire volume of the mixture to NCI-H226 cells whose medium has been changed to 125 µl of OPTI-MEM I (Invitrogen) in advance, and continue culture for 4 hours, followed by 30% fetal calf serum (JRH) 125 μl of RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 25 mM HEPES was added.
After transfection with the oligonucleotide and further culturing for 16 hours, total RNA was extracted from A549 cells and NCI-H226 cells using RNeasyMini Total RNA Kit (QIAGEN). In accordance with the attached protocol of TaqMan ™ Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems), cDNA was prepared from total RNA by reverse transcription reaction using random primers. Using the cDNA prepared from 5 ng of total RNA as a template, the FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5), hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (sequence) were prepared in the same manner as in Reference Example 6. No. 11) and the expression level of the TACT427 gene were measured. The expression level of β-actin gene contained in the same amount of template cDNA was measured using TaqMan ™ β-actin Control Reagents (Applied Biosystems) as an internal standard.
The relative expression ratio (%) of the above gene relative to the expression level of β-actin gene is compared to the case where the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) or sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) used as a negative control was introduced. When the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) was introduced, the expression level decreased significantly, and a statistically significant (P ≦ 0.01) expression level decrease was observed (Table 8).
From these results, in human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI-H226, FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5), hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 gene (sequence) No. 11) and a decrease in the mRNA expression level of the TACT427 gene showed that apoptosis was induced.
参考例２１
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるA549およびNCI-H226におけるTACT427タンパク質の発現量低下
ヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226をそれぞれ参考例１９と同じ培地に懸濁し、A549細胞株では2.25×106個、NCI-H226細胞株では1.45×106個の細胞を直径10cmのぺトリディッシュ（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、A549細胞株では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）およびセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４４）のそれぞれ5.8μgを、リポフェクトアミン2000（Invitrogen社）96μlと共に、Opti-MEM Ｉ（Invitrogen社）6 mlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM Ｉ（Invitrogen社）6 mlに培地交換しておいたA549細胞に該混合液を全量添加し、更に3時間培養を継続した後、10％牛胎仔血清（JRH社）を含むKaighn's改変F-12 Nutrient Mixture(Invitrogen社)15 mlに培地交換した。
NCI-H226細胞株では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）およびセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４４）のそれぞれ9.7μgを、オリゴフェクトアミン（Invitrogen社）60μlと共にOpti-MEMＩ（Invitrogen社）3.75 mlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM Ｉ（Invitrogen社）3.75 mlに培地交換しておいたNCI-H226細胞に該混合液を全量添加し、更に4時間培養を継続した後、30％牛胎仔血清（JRH社）を含む25mM HEPES含有RPMI-1640培地（Invitrogen社）3.75 mlを加えた。
トランスフェクション後、更に24時間、48時間、72時間培養を継続した後に、参考例１２の方法に従い無細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液のタンパク質濃度をBCAProtein Assay Kit（Pierce社）にて測定し、各無細胞抽出液中のタンパク質濃度をそろえた。A549細胞株の無細胞抽出液100μg、およびNCI-H226細胞株の無細胞抽出液140μgを、参考例１２の方法に準じてSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングをそれぞれ行った。一次抗体として参考例１１で作製したAS-2482を3μg/mlの濃度で、二次抗体としてHRP標識抗ウサギIgG抗体（Amersham-Bioscience社）を用いた。検出はSuperSignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate（Pierce社）を用いて添付のマニュアルに従った。
その結果、両細胞株ともアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した場合にのみ、TACT427タンパク質がほぼ消失しているのが確認され、かつ、該タンパク質の消失は24時間で認められた。また、同時にサイトケラチン8タンパク質の発現量を抗ヒトサイトケラチン8抗体（Oncogene社）を用いたウエスタンブロッティング法で調べたが、いずれのオリゴヌクレオチド処理でも発現量減少は認められなかった。これより、TACT427タンパク質発現量の特異的低下により、ヒト肺癌細胞株のアポトーシスが誘発されたことが示された。
Reference Example 21
Reduced expression level of TACT427 protein in A549 and NCI-H226 by introduction of antisense oligonucleotide Human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI-H226 were suspended in the same medium as in Reference Example 19, respectively, and 2.25 × 10 6 in the A549 cell line. In the NCI-H226 cell line, 1.45 × 10 6 cells were seeded in a Petri dish (BD Falcon) having a diameter of 10 cm. After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, the oligonucleotide was transfected.
Specifically, in the A549 cell line, 5.8 μg each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13), the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) was added to Lipofectamine 2000. (Invitrogen) 96 μl was mixed with 6 ml of Opti-MEM I (Invitrogen) and left at room temperature for 20 minutes. After adding the entire amount of the mixture to A549 cells whose medium had been changed to 6 ml of OPTI-MEM I (Invitrogen) in advance, and further continuing the culture for 3 hours, Kaighn's containing 10% fetal calf serum (JRH) The medium was changed to 15 ml of modified F-12 Nutrient Mixture (Invitrogen).
In the NCI-H226 cell line, 9.7 μg of each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13), the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) was added to Oligofectamine (Invitrogen). 60 μl was mixed with 3.75 ml of Opti-MEMI (Invitrogen) and left at room temperature for 20 minutes. Add the entire amount of the mixture to NCI-H226 cells whose medium has been changed to 3.75 ml beforehand in OPTI-MEM I (Invitrogen), and further continue the culture for 4 hours, and then add 30% fetal calf serum (JRH). 3.75 ml of 25 mM HEPES-containing RPMI-1640 medium (Invitrogen) was added.
After transfection, the cells were further cultured for 24 hours, 48 hours, and 72 hours, and then a cell-free extract was prepared according to the method of Reference Example 12. The protein concentration of the obtained cell-free extract was measured with BCAProtein Assay Kit (Pierce), and the protein concentration in each cell-free extract was prepared. According to the method of Reference Example 12, SDS-PAGE and Western blotting were performed on 100 μg of the cell-free extract of A549 cell line and 140 μg of the cell-free extract of NCI-H226 cell line, respectively. AS-2482 prepared in Reference Example 11 was used as the primary antibody at a concentration of 3 μg / ml, and HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Amersham-Bioscience) was used as the secondary antibody. Detection was performed according to the attached manual using SuperSignal ™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce).
As a result, it was confirmed that the TACT427 protein almost disappeared only when the antisense oligonucleotide was introduced into both cell lines, and the disappearance of the protein was observed in 24 hours. At the same time, the expression level of cytokeratin 8 protein was examined by Western blotting using an anti-human cytokeratin 8 antibody (Oncogene), but no decrease in the expression level was observed with any oligonucleotide treatment. From this, it was shown that apoptosis of the human lung cancer cell line was induced by the specific decrease in the expression level of TACT427 protein.
参考例２２
組換え型完全長タンパク質の安定発現細胞株の樹立
TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）のＣ末端に3xFLAGタグを融合したタンパク質を構成的に発現する細胞株の樹立をマウス胎仔由来線維芽細胞株Balb3T3-A31（以後、A31細胞と略記する）を用いて行った。A31細胞1.25×105個を10％牛胎仔血清（JRH社）および50μｇ/mlゲンタマイシン（Invitrogen社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Invitrogen社）2.5 mlに懸濁し、6穴プレートの1ウェルに播種した後、5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した。さらに同じ培地2.5mlに培地交換し4時間培養を継続した後、予めFuGENE6トランスフェクション試薬3.8μl（Roche Diagnostics社）およびOPTI-MEM I（Invitrogen社）93.3μlと混合し室温で15分間放置しておいたプラスミドp3xFLAG-TACT427-A1.25μgを添加し培養を継続した。翌日にトリプシン・EDTA（Invitrogen社）を用いて細胞を回収し、0.5 mg/mlのG418（Promega社）を含む上記培地（G418選択培地）10mlに懸濁し、直径10 cmのペトリディッシュに播種した。G418選択培地で培養を継続し2回継代培養した後、1ウェルあたり細胞100個（培地容量0.1 ml）の割合から始まる2倍希釈系列を12系列作成し96穴プレートにそれぞれ播種し、3日ごとにG418選択培地を交換しながら培養を継続した。ウェルあたり0.8個〜3.2個の細胞が増殖しコロニーを形成したウェルから11日後に細胞を回収し、24穴プレートの2ウェルに等しく播種した。G418選択培地でコンフルエントになるまで培養を継続した後、1ウェル分の細胞をスクレイパーで回収し、1％ 2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー（Bio Rad社）40μlに懸濁した。95℃で5分間加熱処理した後、12μlを10％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。参考例１３で記載した方法に準じ、マウス抗FLAGM2抗体（Sigma社、1000倍希釈）を用いてウエスタンブロッティングを行い、TACT427-Aタンパク質（配列番号：１５）のC末端に3xFLAGタグが付加したタンパク質を構成的に発現する細胞株TACT-1を得た。
Reference Example 22
Establishment of cell lines that stably express recombinant full-length proteins
Establishment of a mouse embryo-derived fibroblast cell line Balb3T3-A31 (hereinafter abbreviated as A31 cells) for establishment of a cell line that constitutively expresses a protein in which a 3xFLAG tag is fused to the C-terminus of the TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15) It was performed using. Suspend 1.25 × 10 5 A31 cells in 2.5 ml of Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and 50 μg / ml gentamicin (Invitrogen), and add 1 well of a 6-well plate. And then cultured overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream. Furthermore, after changing the medium to 2.5 ml of the same medium and continuing the culture for 4 hours, it was mixed with 3.8 μl of FuGENE6 transfection reagent (Roche Diagnostics) and 93.3 μl of OPTI-MEM I (Invitrogen) in advance and left at room temperature for 15 minutes. 1.25 μg of the added plasmid p3xFLAG-TACT427-A was added, and the culture was continued. The next day, cells were collected using trypsin EDTA (Invitrogen), suspended in 10 ml of the above medium (G418 selective medium) containing 0.5 mg / ml G418 (Promega), and seeded in a Petri dish having a diameter of 10 cm. . After culturing in G418 selective medium and subcultured twice, 12 series of 2-fold dilutions starting from the rate of 100 cells per well (medium volume 0.1 ml) were prepared and seeded in 96-well plates. The culture was continued while changing the G418 selection medium every day. Cells were harvested 11 days after the wells in which 0.8 to 3.2 cells per well grew and formed colonies and were seeded equally in 2 wells of a 24-well plate. The culture was continued until it became confluent with G418 selective medium, and then cells for 1 well were collected with a scraper and suspended in 40 μl of SDS-PAGE sample buffer (Bio Rad) containing 1% 2-mercaptoethanol. After heat treatment at 95 ° C. for 5 minutes, 12 μl was subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel. In accordance with the method described in Reference Example 13, Western blotting was performed using a mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma, diluted 1000 times), and a protein having a 3xFLAG tag added to the C-terminus of the TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15) The cell line TACT-1 that constitutively expresses was obtained.
参考例２３
TACT-1のアポトーシス耐性能の評価
参考例２２で得られたTACT-1およびその親株A31細胞を10％牛胎仔血清（JRH社）および50μg/mlゲンタマイシン（Invitrogen社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Invitrogen社）0.1mlに懸濁し1ウェルあたり6×103個になるようそれぞれ組織培養用96穴プレートに播種した。5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、トポイソメラーゼI阻害剤カンプトテシン（WakoPure Chemical社）あるいはタンパク質合成阻害剤アニソマイシン（Wako Pure Chemical社）を種々の濃度になるよう添加した上記培地に交換し培養を継続した。24時間後にCell Death Detection ELISAPLUS （Roche Diagnostics社）を用いてアポトーシスを検出した。終濃度1μg/mlのカンプトテシン添加によりTACT-1に誘発されたアポトーシスは、同じ条件でA31に認められたアポトーシスの56％にとどまった。また終濃度1μg/mlのアニソマイシン添加によりTACT-1に誘発されたアポトーシスは、同じ条件でA31に認められたアポトーシスの69％にとどまった。以上の結果は、カンプトテシンやアニソマイシンによって誘発されるアポトーシスに対し、TACT-1細胞が耐性になっていることを示しており、TACT427-A強制発現によりアポトーシス耐性能を獲得することが明らかとなった。
Reference Example 23
Evaluation of apoptosis resistance of TACT-1 Dulbecco's modified Eagle minimal containing 10% fetal calf serum (JRH) and 50 μg / ml gentamicin (Invitrogen) TACT-1 obtained in Reference Example 22 and its parent strain A31 cells It was suspended in 0.1 ml of a medium (Invitrogen) and seeded in a 96-well plate for tissue culture so that it was 6 × 10 3 per well. After culturing overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas stream, the above-mentioned medium supplemented with various concentrations of topoisomerase I inhibitor camptothecin (WakoPure Chemical) or protein synthesis inhibitor anisomycin (Wako Pure Chemical) The culture was continued. Apoptosis was detected 24 hours later using Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics). Apoptosis induced by TACT-1 by addition of camptothecin at a final concentration of 1 μg / ml was only 56% of the apoptosis observed in A31 under the same conditions. Apoptosis induced by TACT-1 by addition of anisomycin at a final concentration of 1 μg / ml was only 69% of the apoptosis observed in A31 under the same conditions. The above results indicate that TACT-1 cells are resistant to apoptosis induced by camptothecin and anisomycin, and it is clear that TACT427-A forced expression can acquire apoptosis resistance performance. It was.
参考例２４
TACT-1におけるERK1/2リン酸化増強
参考例２３で記載したTACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムを調べる一環として、抗アポトーシス作用に関与するMAPキナーゼ、即ちERK1/2タンパク質のリン酸化をA31細胞株と比較した。A31細胞には10％牛胎仔血清（JRH社）および50μg/mlゲンタマイシン（Invitrogen社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地(Invitrogen社)を用い、TACT-1細胞には同培地に更に0.6 mg/mlG418（Promega社）を添加したものを用いて、直径10 cmのペトリディッシュ(BD ファルコン社)で5％炭酸ガス気流中、37℃で培養した。細胞密度が約80％コンフルエントになった時点で、1μg/mlアニソマイシン（Wako Pure Chemical社）を含む上記培地に交換し、37℃で1時間、4時間および8時間培養を続けた。アニソマイシン処理前の細胞も含めて、これらそれぞれの細胞を氷冷したPBS(Ca、Mg不含)10mlで2回洗浄し、0.5 mlの細胞溶解用緩衝液〔1％ Triton X-100、1％ デオキシコール酸、0.05％ SDS、5.25mM EGTA、EDTA不含CompleteTMタブレット（Roche Diagnostics社）、Phosphatase inhibitor cocktail-2（Sigma社）、150mM 塩化ナトリウムを含む50mMトリス・塩酸緩衝液、pH7.5〕を加えて4℃で20分間放置した。スクレイパーを用いて細胞破砕液を回収し、4℃、15000回転で20分間遠心分離して沈殿物を除去した。この細胞破砕液80μlに10％ 2-メルカプトエタノールを含む5倍濃縮SDS-PAGE用サンプルバッファー（Bio Rad社）を20μl加え、95℃で5分間加熱した。なお、5μl細胞破砕液を蒸留水で10倍希釈し、Micro BCA protein assay reagent(Pierce社)の処方に準じてタンパク質濃度を測定し、2％ 2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー（BioRad社）で適宜希釈してタンパク質濃度を揃えた。総タンパク質24μgを7.5％ ポリアクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した後、PVDF膜に転写した。転写した膜は5％スキムミルクを含むTTBS（0.1％Tween 20を含むTBS）で室温、1時間ブロッキングした後、10分間のTTBS洗浄を2回行った。その後、抗ERK1/2抗体（Cell signaling社）または抗リン酸化ERK1/2抗体（Cell signaling社）を5％ BSA（Sigma社）を含むTTBSでそれぞれ5000倍または1000倍に希釈した一次抗体液を用いて4℃で一晩反応させた後、10分間のTTBS洗浄を4回行った。次に、5％スキムミルクを含むTTBSで10000倍に希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(Amersham Bioscience社)を添加し室温で1時間保温した後、10分間のTTBS洗浄を4回行った。ECLplus試薬（Amersham Bioscience社）を用いてERK1/2タンパク質およびリン酸化ERK1/2タンパク質に相当するバンドを検出した結果、TACT-1細胞株ではA31細胞株と比べ、アニソマイシン添加で誘導されるERK1/2タンパク質のリン酸化、即ち活性化が増強されていた。TACT-1細胞におけるERK1/2活性化亢進程度を求めるため、現像したフィルムをルミノイメージアナライザーLAS-1000plus（FUJIFILM社）で画像として読み取り、付属のイメージゲージソフトウェアを用いてリン酸化ERK1とリン酸化ERK2のバンド強度をそれぞれ数値化した。アニソマイシン処理時間（2時間、4時間および8時間）毎に、A31細胞のバンド強度を100％としてTACT-1細胞のリン酸化亢進率を算出したところ、TACT-1細胞におけるERK1のリン酸化亢進率は164％、150％および158％、ERK2のリン酸化亢進率は130％、137％および172％であった。
この結果から、TACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムの一つがERK1/2の活性化増強作用であることが明らかとなった。
Reference Example 24
Enhancement of ERK1 / 2 phosphorylation in TACT-1 As part of investigating the mechanism of apoptosis resistance phenomenon of TACT-1 cell line described in Reference Example 23, phosphorylation of MAP kinase involved in anti-apoptotic action, ie, ERK1 / 2 protein Compared to the A31 cell line. Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and 50 μg / ml gentamicin (Invitrogen) is used for A31 cells, and 0.6 mg / ml is added to the same medium for TACT-1 cells. Using the one to which mlG418 (Promega) was added, the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream in a Petri dish (BD Falcon) having a diameter of 10 cm. When the cell density was about 80% confluent, the medium was replaced with the above medium containing 1 μg / ml anisomycin (Wako Pure Chemical), and the culture was continued at 37 ° C. for 1, 4, and 8 hours. These cells, including those before anisomycin treatment, were washed twice with 10 ml of ice-cold PBS (without Ca and Mg) and 0.5 ml of cell lysis buffer [1% Triton X-100, 1 % Deoxycholic acid, 0.05% SDS, 5.25 mM EGTA, EDTA-free Complete TM tablet (Roche Diagnostics), Phosphatase inhibitor cocktail-2 (Sigma), 50 mM Tris / HCl buffer containing 150 mM sodium chloride, pH 7.5 ] And left at 4 ° C for 20 minutes. The cell lysate was collected using a scraper and centrifuged at 4 ° C. and 15000 rpm for 20 minutes to remove the precipitate. 20 μl of 5-fold concentrated SDS-PAGE sample buffer (Bio Rad) containing 10% 2-mercaptoethanol was added to 80 μl of this cell lysate and heated at 95 ° C. for 5 minutes. In addition, 5 μl cell lysate was diluted 10-fold with distilled water, protein concentration was measured according to the prescription of Micro BCA protein assay reagent (Pierce), and sample buffer for SDS-PAGE containing 2% 2-mercaptoethanol ( The protein concentration was adjusted by appropriate dilution with BioRad). 24 μg of total protein was subjected to SDS-PAGE on 7.5% polyacrylamide gel and then transferred to a PVDF membrane. The transferred film was blocked with TTBS containing 5% skim milk (TBS containing 0.1% Tween 20) for 1 hour at room temperature, and then washed twice for 10 minutes with TTBS. Then, the primary antibody solution obtained by diluting anti-ERK1 / 2 antibody (Cell signaling) or anti-phosphorylated ERK1 / 2 antibody (Cell signaling) 5000 times or 1000 times with TTBS containing 5% BSA (Sigma), respectively. The mixture was reacted at 4 ° C. overnight, and then washed with TTBS for 10 minutes four times. Next, an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Amersham Bioscience) diluted 10000-fold with TTBS containing 5% skim milk was added and incubated at room temperature for 1 hour, followed by 10-minute TTBS washing 4 times. As a result of detecting bands corresponding to ERK1 / 2 protein and phosphorylated ERK1 / 2 protein using ECLplus reagent (Amersham Bioscience), ERK1 induced by addition of anisomycin in TACT-1 cell line compared to A31 cell line / 2 Protein phosphorylation, ie activation, was enhanced. To determine the degree of enhanced ERK1 / 2 activation in TACT-1 cells, the developed film is read as an image with the Lumino Image Analyzer LAS-1000plus (FUJIFILM), and phosphorylated ERK1 and phosphorylated ERK2 using the attached image gauge software Each band intensity was quantified. When the rate of phosphorylation of TACT-1 cells was calculated for each anisomycin treatment time (2 hours, 4 hours, and 8 hours) with the band intensity of A31 cells as 100%, ERK1 phosphorylation was enhanced in TACT-1 cells. The rates were 164%, 150% and 158%, and ERK2 phosphorylation rates were 130%, 137% and 172%.
From this result, it became clear that one of the mechanisms of apoptosis resistance phenomenon of TACT-1 cell line is ERK1 / 2 activation enhancing action.
参考例２５
TACT-1におけるp38MAPKリン酸化促進
参考例２３で記載したTACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムを調べる一環として、p38MAPKのリン酸化をA31細胞株と比較した。
8×105個のA31細胞またはTACT-1細胞を、10％牛胎仔血清（JRH社）および50μg/mlゲンタマイシン（Invitrogen社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Invitrogen社）5 mlに懸濁し、直径6 cmのペトリディッシュ(BD ファルコン社)に播種した。5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、終濃度1μg/mlとなるようアニソマイシン（Wako Pure Chemical社）を添加し直ちに培養を継続した。アニソマイシン添加前あるいは添加後15分、30分および60分後の細胞を1mMオルトバナジン(V)酸ナトリウム（Wako Pure Chemical社）を含むPBS 5 mlで1回洗浄した後、参考例１２に記載のRIPA緩衝液にPhosphatase Inhibitor Cocktail-1を加えた細胞溶解用緩衝液を0.2 ml添加し4℃で15分間放置した。スクレイパーで細胞破砕液を回収し4℃、15000回転で5分間遠心分離して沈殿物を除去した。この細胞破砕液80μlに5％ 2-メルカプトエタノールを含む5倍濃縮SDS-PAGE用サンプルバッファー（Bio Rad社）を20μl加え、95℃で5分間加熱した。なお、上記細胞溶解用緩衝液を蒸留水で20倍に希釈した溶液で細胞破砕液15μlを20倍希釈し、Micro BCA protein assay reagent（Pierce社)の処方に準じてタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度がほぼ揃っていることを確認した。総タンパク質約14μgを5％−20％ポリアクリルアミドグラジエントゲルでのSDS-PAGEに供した後、PVDF膜に転写した。転写した膜は5％スキムミルクを含むTTBS（0.1％ Tween 20を含むTBS）で室温、1時間ブロッキングした後、5分間のTTBS洗浄を3回行った。その後、抗p38MAPK抗体（Cell signaling社）または抗リン酸化p38MAPK抗体（Cell signaling社）を5％ BSA（Sigma社）を含むTTBSで1000倍に希釈した一次抗体液を用いて4℃で一晩反応させた。続いて、5分間のTTBS洗浄を3回行った後に、5％スキムミルクを含むTTBSで5000倍に希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(Amersham Bioscience社)を添加し室温で1時間保温した。再び、5分間のTTBS洗浄を3回行い、過剰量の抗体を取り去った後に、ECL plus試薬（Amersham Bioscience社）を用いてp38MAPKタンパク質およびリン酸化p38MAPKタンパク質に相当するバンドを検出した。A31細胞ではp38MAPKタンパク質のリン酸化はアニソマイシン添加後30分でようやく微かに認められたのに対し、TACT-1細胞ではアニソマイシン添加後15分で明らかに強く認められ、p38MAPKタンパク質のリン酸化、即ち活性化が速やかに誘導されることが判明した。
この結果から、TACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムの一端をp38MAPKの活性化増強作用が担っていることが示唆された。
参考例２６
NAV2タンパク質（配列番号：４９）を発現する動物細胞用発現ベクターの構築を行った。ヒト脳Marathon-Ready cDNA（CLONTECH社）を鋳型とし、2種のプライマー〔プライマー１１（配列番号：５２）およびプライマー１２（配列番号：５３）〕を用いてPCR反応を行い、NAV2（配列番号：４９）の１番目から１８８９番目までのアミノ酸配列をコードするcDNAのクローニングを行った。該反応における反応液の組成は、上記cDNA1μlを鋳型として使用し、PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase（STRATAGENE社）2.5U、プライマー１１（配列番号：５８）およびプライマー１２（配列番号：５９）を各1.0μM、dNTPsを200μM、および2xGC Buffer I（TaKaRa Bio社）を25μL加え、50μLの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、94℃・20秒、58℃・15秒、72℃・10分のサイクルを40回繰り返し、続けて72℃・10分の反応を行った。該PCR反応産物をアガロースゲルにて電気泳動後、Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。これをプラスミドベクターpCR4Blunt-TOPO（Invitrogen社）へサブクローニングし、大腸菌TOP10（Invitrogen社）に導入後、cDNAを持つクローンをカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、NAV2タンパク質（配列番号：４９）の１番目から１８８９番目までのアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を得た。ここで得られたプラスミドベクターをpCR4Blunt-TOPO-NAV2-5'と命名した。
次に、ヒト脳Marathon-Ready cDNA（CLONTECH社）を鋳型とし、2種のプライマー〔プライマー１３（配列番号：６０）およびプライマー１４（配列番号：６１）〕を用いてPCR反応を行い、NAV2（配列番号：４９）の１７９６番目から２４２９番目までのアミノ酸配列をコードするcDNAのクローニングを行った。該反応における反応液の組成は、上記cDNA1μlを鋳型として使用し、PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase（STRATAGENE社）2.5U、プライマー１３（配列番号：６０）およびプライマー１４（配列番号：６１）を各1.0μM、dNTPsを200μM、および2xGC Buffer I（TaKaRa Bio社）を25μL加え、50μLの液量とした。PCR反応は、94℃・1分の後、94℃・20秒、58℃・15秒、72℃・10分のサイクルを40回繰り返し、続いて72℃・10分の反応を行った。該PCR反応産物をアガロースゲルにて電気泳動後、Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。これをプラスミドベクターpCR4Blunt-TOPO（Invitrogen社）へサブクローニングし、大腸菌TOP10（Invitrogen社）に導入後、cDNAを持つクローンをカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、NAV2タンパク質（配列番号：４９）の１７９６番目から２４２９番目までのアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を得た。ここで得られたプラスミドベクターをpCR4Blunt-TOPO-NAV2-3'と命名した。
次に、pCR4Blunt-TOPO-NAV2-3'、およびp3XFLAG-CMV-14（Sigma社）を制限酵素EcoRV、およびXbaIにて処理した。それぞれのDNA断片をアガロースゲルにて電気泳動後、Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。次に、ここで得られたDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2（TaKaRa Bio社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌TOP10(Invitrogen社)に導入し、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、NAV2タンパク質（配列番号：４９）の１７９６番目から２４２９番目までのアミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を有するベクターp3XFLAG-CMV-14-NAV2-3'を得た。
次に、pCR4Blunt-TOPO-NAV2-5'、およびp3XFLAG-CMV-14-NAV2-3'を制限酵素NotI、およびEcoRVにて処理した。それぞれのDNA断片をアガロースゲルにて電気泳動後、Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。ここで得られたDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2（TaKaRa Bio社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌TOP10(Invitrogen社)に導入し、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、NAV2タンパク質（配列番号：４９）をコードするcDNAの塩基配列を有する動物細胞用発現ベクターp3XFLAG-CMV-14-NAV2を得た。
Reference Example 25
Promotion of p38MAPK phosphorylation in TACT-1 As part of investigating the mechanism of the apoptosis resistance phenomenon of the TACT-1 cell line described in Reference Example 23, phosphorylation of p38MAPK was compared with the A31 cell line.
8 × 10 5 A31 cells or TACT-1 cells are suspended in 5 ml of Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and 50 μg / ml gentamicin (Invitrogen). The seeds were sown in a Petri dish (BD Falcon) having a diameter of 6 cm. After overnight culture at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, anisomycin (Wako Pure Chemical) was added to a final concentration of 1 μg / ml, and the culture was continued immediately. Cells described before or after addition of anisomycin, 15 minutes, 30 minutes and 60 minutes after addition were washed once with 5 ml of PBS containing 1 mM sodium orthovanadate (V) (Wako Pure Chemical), and then described in Reference Example 12. 0.2 ml of the cell lysis buffer prepared by adding Phosphatase Inhibitor Cocktail-1 to the RIPA buffer was added and left at 4 ° C. for 15 minutes. The cell lysate was collected with a scraper and centrifuged at 4 ° C. and 15000 rpm for 5 minutes to remove the precipitate. 20 μl of 5-fold concentrated SDS-PAGE sample buffer (Bio Rad) containing 5% 2-mercaptoethanol was added to 80 μl of this cell lysate and heated at 95 ° C. for 5 minutes. In addition, 15 μl of the cell disruption solution was diluted 20-fold with a solution obtained by diluting the cell lysis buffer 20 times with distilled water, and the protein concentration was measured according to the prescription of Micro BCA protein assay reagent (Pierce). It was confirmed that the concentrations were almost uniform. About 14 μg of total protein was subjected to SDS-PAGE on a 5% -20% polyacrylamide gradient gel and then transferred to a PVDF membrane. The transferred membrane was blocked with TTBS containing 5% skim milk (TBS containing 0.1% Tween 20) at room temperature for 1 hour, and then washed with TTBS for 5 minutes three times. Then, react overnight at 4 ° C using a primary antibody solution diluted anti-p38MAPK antibody (Cell signaling) or anti-phosphorylated p38MAPK antibody (Cell signaling) 1000 times with TTBS containing 5% BSA (Sigma). I let you. Subsequently, after washing with TTBS for 5 minutes three times, an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Amersham Bioscience) diluted 5000 times with TTBS containing 5% skim milk was added and incubated at room temperature for 1 hour. Again, 5 minutes of TTBS washing was performed 3 times to remove excess amount of antibody, and then bands corresponding to p38MAPK protein and phosphorylated p38MAPK protein were detected using ECL plus reagent (Amersham Bioscience). In A31 cells, phosphorylation of p38MAPK protein was only slightly observed 30 minutes after addition of anisomycin, whereas in TACT-1 cells, it was clearly observed 15 minutes after addition of anisomycin, and phosphorylation of p38MAPK protein, That is, it has been found that activation is rapidly induced.
These results suggested that p38MAPK activation-enhancing action plays a part in the mechanism of apoptosis resistance phenomenon of TACT-1 cell line.
Reference Example 26
An expression vector for animal cells that expresses NAV2 protein (SEQ ID NO: 49) was constructed. Using human brain Marathon-Ready cDNA (CLONTECH) as a template, PCR reaction was performed using two primers [Primer 11 (SEQ ID NO: 52) and Primer 12 (SEQ ID NO: 53)], and NAV2 (SEQ ID NO: 49) The cDNA encoding the amino acid sequence from the 1st to the 1889th was cloned. The composition of the reaction solution in the reaction was 1 μl of the above cDNA as a template, PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE) 2.5 U, primer 11 (SEQ ID NO: 58) and primer 12 (SEQ ID NO: 59) each 1.0 μM, 200 μM dNTPs and 25 μL of 2 × GC Buffer I (TaKaRa Bio) were added to make a volume of 50 μL. The PCR reaction was performed at 94 ° C. for 1 minute, followed by 40 cycles of 94 ° C. for 20 seconds, 58 ° C. for 15 seconds, 72 ° C. for 10 minutes, followed by 72 ° C. for 10 minutes. The PCR reaction product was electrophoresed on an agarose gel and then purified using Gel Extraction Kit (QIAGEN). This was subcloned into plasmid vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen), introduced into E. coli TOP10 (Invitrogen), and a clone having cDNA was selected in an LB agar medium containing kanamycin. As a result of analyzing the sequence of each clone, the base sequence of cDNA encoding the amino acid sequence from the 1st to the 1889th of the NAV2 protein (SEQ ID NO: 49) was obtained. The plasmid vector obtained here was named pCR4Blunt-TOPO-NAV2-5 ′.
Next, using human brain Marathon-Ready cDNA (CLONTECH) as a template, PCR reaction was performed using two kinds of primers [Primer 13 (SEQ ID NO: 60) and Primer 14 (SEQ ID NO: 61)], and NAV2 ( CDNA encoding the amino acid sequence from position 1796 to position 2429 of SEQ ID NO: 49) was cloned. The composition of the reaction solution in the reaction was 1 μl of the above cDNA as a template, PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE) 2.5 U, primer 13 (SEQ ID NO: 60) and primer 14 (SEQ ID NO: 61) each 1.0 μM, 200 μM dNTPs and 25 μL of 2 × GC Buffer I (TaKaRa Bio) were added to make a volume of 50 μL. The PCR reaction was performed at 94 ° C for 1 minute, followed by 40 cycles of 94 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 10 minutes, followed by 72 ° C for 10 minutes. The PCR reaction product was electrophoresed on an agarose gel and then purified using Gel Extraction Kit (QIAGEN). This was subcloned into plasmid vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen), introduced into E. coli TOP10 (Invitrogen), and a clone having cDNA was selected in an LB agar medium containing kanamycin. As a result of analyzing the sequence of each clone, the base sequence of cDNA encoding the amino acid sequence from the 1796th position to the 2429th position of the NAV2 protein (SEQ ID NO: 49) was obtained. The plasmid vector obtained here was named pCR4Blunt-TOPO-NAV2-3 ′.
Next, pCR4Blunt-TOPO-NAV2-3 ′ and p3XFLAG-CMV-14 (Sigma) were treated with restriction enzymes EcoRV and XbaI. Each DNA fragment was electrophoresed on an agarose gel and then purified using Gel Extraction Kit (QIAGEN). Next, the DNA fragment obtained here was subjected to a ligation reaction using DNA Ligation Kit ver.2 (TaKaRa Bio), then introduced into E. coli TOP10 (Invitrogen), and in an LB agar medium containing ampicillin. Selected. As a result of analyzing the sequence of each clone, a vector p3XFLAG-CMV-14-NAV2-3 ′ having a cDNA base sequence encoding the amino acid sequence from 1796 to 2429 of NAV2 protein (SEQ ID NO: 49) was obtained. It was.
Next, pCR4Blunt-TOPO-NAV2-5 ′ and p3XFLAG-CMV-14-NAV2-3 ′ were treated with restriction enzymes NotI and EcoRV. Each DNA fragment was electrophoresed on an agarose gel and then purified using Gel Extraction Kit (QIAGEN). The DNA fragment obtained here was subjected to a ligation reaction using DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Bio), then introduced into E. coli TOP10 (Invitrogen) and selected in an LB agar medium containing ampicillin. As a result of analyzing the sequence of each clone, an animal cell expression vector p3XFLAG-CMV-14-NAV2 having a cDNA base sequence encoding NAV2 protein (SEQ ID NO: 49) was obtained.
以下は、公知の酵母ツーハイブリッド法(The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press, Bartel and Fields, 1997年等)に準じて行った。
配列番号：４５で示されるアミノ酸配列からなるベイトタンパク質をコードするcDNAは、上記参考例で得られたプラスミドp3xFLAG-TACT427-AからPCR法を用いて増幅した。得られたcDNAを、組み換えによって、酵母の発現ベクターpGBT.Qに導入した。pGBT.Qは、pGBT.Cに近縁の誘導体 (Nat. Genet. 12巻、72-77頁、1996年)であり、ポリリンカー部位を修飾してシークエンス用M13プライマーを挿入したものである。この新しいコンストラクトを、トリプトファン合成能力の有無により、酵母のPNY200 株中で直接選択した（この株の遺伝型：MATα trp 1-901 leu2-3, 112 ura3-52 his3-200 ade2 gal4Δ gal80Δ）。この酵母細胞中で、ベイトタンパク質は、転写因子 Gal4 タンパク質（GenBank NP_015076）のDNA結合ドメイン（アミノ酸1番目〜147番目）のC末端側に結合した融合タンパク質として産生された。プレイライブラリーを、酵母のBK100株（この株の遺伝型：MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200 gal4Δ gal80Δ LYS2::GAL-HIS3 GAL2-ADE2 met2::GAL7-lacZ ）に形質転換し、ロイシンを合成させる能力の有無によって選択した。この酵母細胞中では、各cDNAは転写因子 Gal4タンパク質（GenBank NP_015076）の転写促進ドメイン（アミノ酸768番目〜881番目）のC末端側に結合した融合タンパク質として産生された。次いで、ベイトタンパク質を発現するPNY200 細胞（接合型MATα）を、プレイライブラリー中のプレイタンパク質を発現するBK100細胞（接合型 MATa）と接合させた。その結果得られる、ベイトタンパク質と相互作用するプレイタンパク質を発現する二倍体の酵母細胞を、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジンおよびアデニンの合成能力によって選択した。それぞれのクローンからDNAを調製し、エレクトロポレーション法によって大腸菌のKC8株に形質転換し、次いで細胞を、トリプトファンを含まない（ベイトプラスミド選択用）、またはロイシンを含まない（プレイライブラリーのプラスミド選択用）アンピシリン含有培地上で選択した。両プラスミドのDNAを調製し、ジデオキシヌクレオチド・チェーンターミネーション法で配列を決定した。ベイトcDNAインサートの同一性を確認し、プレイライブラリーのプラスミドから得られるcDNAインサートを、公知のヌクレオチドおよびタンパク質データベースと照合調査するBLASTプログラムを使用して同定した。
結果を以下に記載する。
ヒト乳癌細胞株とヒト前立腺癌細胞株の混合cDNAライブラリーより、FLNA（配列番号：４６）の2206番目〜2355番目または2141番目〜2351番目までのアミノ酸配列をコードするcDNA断片を、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからはFLNA（配列番号：４６）の2162番目〜2412番目のアミノ酸配列をコードするcDNA断片が得られた。
ヒト乳癌細胞株とヒト前立腺癌細胞株の混合cDNAライブラリーより、FLNB（配列番号：４７）の1960番目〜2299番目または2156番目〜2314番目までのアミノ酸配列をコードするcDNA断片が、ヒト海馬cDNAライブラリーより、FLNB（配列番号：４７）の2174番目〜2565番目のアミノ酸配列をコードするcDNA断片が得られた。
ヒト海馬cDNAライブラリーより、FLNC（配列番号：４８）の2295番目〜2705番目までのアミノ酸配列をコードするcDNA断片が得られた。
ヒト海馬cDNAライブラリーより、NAV2（配列番号：４９）の68番目〜286番目までのアミノ酸配列をコードするcDNA断片が得られた。
ヒト乳癌細胞株とヒト前立腺癌細胞株の混合cDNAライブラリーより、BTBD2（配列番号：５０）の201番目〜525番目までのアミノ酸配列をコードするcDNA断片が、ヒト海馬cDNAライブラリーより、BTBD2（配列番号：５０）の215番目〜506番目までのアミノ酸配列をコードするcDNA断片が得られた。
ヒト乳癌細胞株とヒト前立腺癌細胞株の混合cDNAライブラリーより、RAB3IL1（配列番号：５１）の282番目〜356番目までのアミノ酸配列をコードするcDNA断片が得られた。
The following was performed according to a known yeast two-hybrid method (The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press, Bartel and Fields, 1997, etc.).
A cDNA encoding a bait protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 was amplified from the plasmid p3xFLAG-TACT427-A obtained in the above Reference Example using the PCR method. The obtained cDNA was introduced into the yeast expression vector pGBT.Q by recombination. pGBT.Q is a derivative closely related to pGBT.C (Nat. Genet. 12, 72-77, 1996), in which the polylinker site is modified and an M13 primer for sequencing is inserted. This new construct was selected directly in the PNY200 strain of yeast by the presence or absence of tryptophan synthesis ability (genetic type of this strain: MATα trp 1-901 leu2-3, 112 ura3-52 his3-200 ade2 gal4Δgal80Δ). In this yeast cell, the bait protein was produced as a fusion protein bound to the C-terminal side of the DNA binding domain (
The results are described below.
From a mixed cDNA library of a human breast cancer cell line and a human prostate cancer cell line, a cDNA fragment encoding the amino acid sequence from 2206 to 2355 or from 2141 to 2351 of FLNA (SEQ ID NO: 46) is obtained as human hippocampal cDNA. A cDNA fragment encoding the amino acid sequence from 2162 to 2412 of FLNA (SEQ ID NO: 46) was obtained from the library.
From a mixed cDNA library of human breast cancer cell line and human prostate cancer cell line, a cDNA fragment encoding the amino acid sequence from 1960 to 2299 or 2156 to 2314 of FLNB (SEQ ID NO: 47) is human hippocampal cDNA. A cDNA fragment encoding the 2174th to 2565th amino acid sequences of FLNB (SEQ ID NO: 47) was obtained from the library.
A cDNA fragment encoding the amino acid sequence from the 2295th to the 2705th of FLNC (SEQ ID NO: 48) was obtained from a human hippocampal cDNA library.
A cDNA fragment encoding the amino acid sequence from the 68th to the 286th of NAV2 (SEQ ID NO: 49) was obtained from a human hippocampal cDNA library.
From a mixed cDNA library of human breast cancer cell line and human prostate cancer cell line, a cDNA fragment encoding the amino acid sequence from 201st to 525th of BTBD2 (SEQ ID NO: 50) was transferred from human hippocampal cDNA library to BTBD2 ( A cDNA fragment encoding the amino acid sequence from position 215 to position 506 of SEQ ID NO: 50) was obtained.
From a mixed cDNA library of human breast cancer cell line and human prostate cancer cell line, a cDNA fragment encoding the amino acid sequence from 282nd to 356th of RAB3IL1 (SEQ ID NO: 51) was obtained.
TACT427-Aタンパク質、およびNAV2タンパク質の局在性検討（細胞染色）
ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞1.5×106個を10％牛胎仔血清（JRH社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Invitrogen社）9 mlに懸濁し、直径10cmのぺトリディッシュに播種した。5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、予めFuGene6トランスフェクション試薬18μl（Roche Diagnostics社）およびOPTI-MEM I（Invitrogen社）と混合し室温で15分間放置しておいたpcDNA3.1(+)-TACT427-A 3μg、および p3XFLAG-CMV-14-NAV2 3μgを添加し同条件で培養を継続した。1日後に細胞5×103個を8ウェル ポリ-D-リジンコートカルチャースライド（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、細胞をPBSで洗浄し、10％中性ホルマリン緩衝液を加え室温で30分間固定した。その後PBSで0.1％に希釈したTritonX-100を加え室温で5分放置した後、再びPBSで洗浄し、更に1％ BSAを含むPBSを加え4℃で24時間放置した。次に1％ BSAを含むPBSで10μg/mlとなるよう希釈したAS-2482（参考例１１にて作製）、およびマウス抗FLAG M2抗体（Sigma社）を加え、室温で45分間反応させた。その後、PBSで洗浄し、続いて1％ BSAを含むPBSで10μg/mlとなるよう希釈したAlexa488標識抗ウサギIgG抗体（Molecular Probes社）、およびAlexa546標識抗マウスIgG抗体（Molecular Probes社）を加え、室温で45分間反応させてからPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡により観察した。
その結果、TACT427-Aタンパク質、およびNAV2タンパク質の細胞内局在が一致していることが明らかとなった。
Localization of TACT427-A protein and NAV2 protein (cell staining)
1.5 × 10 6 HEK293 cells derived from human fetal kidney were suspended in 9 ml of Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and seeded in a Petri dish having a diameter of 10 cm. PcDNA3. Incubated overnight at 37 ° C in a 5% CO2 gas stream, then mixed with 18 µl FuGene6 transfection reagent (Roche Diagnostics) and OPTI-MEM I (Invitrogen) and left at room temperature for 15 minutes. Cultivation was continued under the same conditions by adding 3 μg of 1 (+)-TACT427-A and 3 μg of p3XFLAG-CMV-14-NAV2. One day later, 5 × 10 3 cells were seeded on an 8-well poly-D-lysine-coated culture slide (BD Falcon). After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, the cells were washed with PBS, 10% neutral formalin buffer was added, and fixed at room temperature for 30 minutes. Thereafter, Triton X-100 diluted to 0.1% with PBS was added and allowed to stand at room temperature for 5 minutes, then washed again with PBS, further added with PBS containing 1% BSA, and allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours. Next, AS-2482 (prepared in Reference Example 11) diluted to 10 μg / ml with PBS containing 1% BSA and mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) were added and reacted at room temperature for 45 minutes. Then, after washing with PBS, add Alexa488-labeled anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes) diluted with PBS containing 1% BSA to 10 μg / ml, and Alexa546-labeled anti-mouse IgG antibody (Molecular Probes). The mixture was reacted at room temperature for 45 minutes, washed with PBS, and observed with a fluorescence microscope.
As a result, it was revealed that the intracellular localization of the TACT427-A protein and the NAV2 protein are consistent.
TACT427-Aタンパク質、およびFLNタンパク質の局在性検討（細胞染色）
ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞1.5×106個を10％牛胎仔血清（JRH社）を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地（Invitrogen社）9 mlに懸濁し、直径10cmのぺトリディッシュに播種した。5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、予めFuGene6トランスフェクション試薬18μl（Roche Diagnostics社）およびOPTI-MEM I（Invitrogen社）と混合し室温で15分間放置しておいたpcDNA3.1(+)-TACT427-A 6μgを添加し同条件で培養を継続した。1日後に細胞5×103個を8ウェル ポリ-D-リジンコートカルチャースライド（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、細胞をPBSで洗浄し、10％中性ホルマリン緩衝液を加え室温で30分間固定した。その後PBSで0.1％に希釈したTritonX-100を加え室温で5分放置した後、再びPBSで洗浄し、更に1％ BSAを含むPBSを加え4℃で24時間放置した。次に1％ BSAを含むPBSで10μg/mlとなるよう希釈したAS-2482（参考例１１にて作製）、およびマウス抗FLN抗体（CHEMICON社）を加え、室温で45分間反応させた。その後、PBSで洗浄し、続いて1％ BSAを含むPBSで10μg/mlとなるよう希釈したAlexa488標識抗ウサギIgG抗体（Molecular Probes社）、およびAlexa546標識抗マウスIgG抗体（Molecular Probes社）を加え、室温で45分間反応させてからPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡により観察した。
その結果、TACT427-Aタンパク質、およびFLNタンパク質の細胞内局在が一致していることが明らかとなった。
Localization of TACT427-A protein and FLN protein (cell staining)
1.5 × 10 6 HEK293 cells derived from human fetal kidney were suspended in 9 ml of Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and seeded in a Petri dish having a diameter of 10 cm. PcDNA3. Incubated overnight at 37 ° C in a 5% CO2 gas stream, then mixed with 18 µl FuGene6 transfection reagent (Roche Diagnostics) and OPTI-MEM I (Invitrogen) and left at room temperature for 15 minutes. 1 (+)-TACT427-A 6 μg was added and the culture was continued under the same conditions. One day later, 5 × 10 3 cells were seeded on an 8-well poly-D-lysine-coated culture slide (BD Falcon). After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, the cells were washed with PBS, 10% neutral formalin buffer was added, and fixed at room temperature for 30 minutes. Thereafter, Triton X-100 diluted to 0.1% with PBS was added and allowed to stand at room temperature for 5 minutes, then washed again with PBS, further added with PBS containing 1% BSA, and allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours. Next, AS-2482 (prepared in Reference Example 11) diluted with PBS containing 1% BSA to 10 μg / ml and a mouse anti-FLN antibody (CHEMICON) were added and reacted at room temperature for 45 minutes. Then, wash with PBS, then add Alexa488-labeled anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes) diluted with PBS containing 1% BSA to 10 μg / ml, and Alexa546-labeled anti-mouse IgG antibody (Molecular Probes) The mixture was reacted at room temperature for 45 minutes, washed with PBS, and observed with a fluorescence microscope.
As a result, it was revealed that the intracellular localization of TACT427-A protein and FLN protein was consistent.
〔配列番号：３０〕参考例３で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕参考例３で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕参考例４で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕参考例４で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕参考例５で用いられたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕参考例５で用いられたプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕参考例６、参考例７、参考例８、および参考例２０で用いられたプライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕参考例６、参考例７、参考例８、および参考例２０で用いられたプライマー８の塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕参考例６、参考例７、参考例８、および参考例２０で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕参考例１０で用いられたプライマー９の塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕参考例１０で用いられたプライマー１０の塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕参考例１１で用いられたペプチド１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４２〕参考例１１で用いられたペプチド２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕参考例１１で用いられたペプチド３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５８〕参考例２６で用いられたプライマー１１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕参考例２６で用いられたプライマー１２の塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕参考例２６で用いられたプライマー１３の塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕参考例２６で用いられたプライマー１４の塩基配列を示す。
[SEQ ID NO: 30] This shows the base sequence of
[SEQ ID NO: 31] This shows the base sequence of primer 2 used in Reference Example 3.
[SEQ ID NO: 32] This shows the base sequence of primer 3 used in Reference Example 4.
[SEQ ID NO: 33] This shows the base sequence of primer 4 used in Reference Example 4.
[SEQ ID NO: 34] This shows the base sequence of primer 5 used in Reference Example 5.
[SEQ ID NO: 35] This shows the base sequence of primer 6 used in Reference Example 5.
[SEQ ID NO: 36] This shows the base sequence of primer 7 used in Reference Example 6, Reference Example 7, Reference Example 8, and Reference Example 20.
[SEQ ID NO: 37] This shows the base sequence of primer 8 used in Reference Example 6, Reference Example 7, Reference Example 8, and Reference Example 20.
[SEQ ID NO: 38] This shows the base sequence of the probe used in Reference Example 6, Reference Example 7, Reference Example 8, and Reference Example 20.
[SEQ ID NO: 39] This shows the base sequence of primer 9 used in Reference Example 10.
[SEQ ID NO: 40] This shows the base sequence of primer 10 used in Reference Example 10.
[SEQ ID NO: 41] This shows the amino acid sequence of
[SEQ ID NO: 42] This shows the amino acid sequence of peptide 2 used in Reference Example 11.
[SEQ ID NO: 43] This shows the amino acid sequence of peptide 3 used in Reference Example 11.
[SEQ ID NO: 58] This shows the base sequence of primer 11 used in Reference Example 26.
[SEQ ID NO: 59] This shows the base sequence of primer 12 used in Reference Example 26.
[SEQ ID NO: 60] This shows the base sequence of primer 13 used in Reference Example 26.
[SEQ ID NO: 61] This shows the base sequence of primer 14 used in Reference Example 26.
Claims (25)
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