JP5167464B2 - Genes and polypeptides associated with hepatocellular carcinoma or colorectal cancer - Google Patents

Genes and polypeptides associated with hepatocellular carcinoma or colorectal cancer Download PDF

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Description

本出願は、2002年6月6日に提出された米国特許出願第60/386,985号（これは参照として本明細書に組み入れられる）に関する。   This application is related to US Patent Application No. 60 / 386,985, filed June 6, 2002, which is incorporated herein by reference.

技術分野
本発明は生物科学の分野に関し、より具体的には癌研究の分野に関する。特に、本発明は、細胞の増殖機構に関与する新規遺伝子WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1、ならびにこれらの遺伝子によってコードされるポリペプチドに関する。本発明の遺伝子およびポリペプチドは、例えば、細胞増殖性疾患の診断に、および、疾患に対する薬剤を開発するための標的分子として、用いることができる。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to the field of biological science, and more specifically to the field of cancer research. In particular, the present invention relates to novel genes WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, and APCDD1, which are involved in cell growth mechanisms, and polypeptides encoded by these genes. The genes and polypeptides of the present invention can be used, for example, in the diagnosis of cell proliferative diseases and as target molecules for developing drugs against the diseases.

背景技術
肝細胞癌（HCC）および結腸直腸癌は世界的に癌による死亡の主な原因となっている（Akriviadisら、Br J Surg 85(10)：1319-31 (1998)）。近年、診断および治療の戦略が進歩しているにもかかわらず、現在も数多くの患者は進行期になってから癌と診断されており、彼らを疾患から完全に治癒させることは差し迫った懸念事項である。腫瘍抑制遺伝子および/または癌遺伝子の変化が発癌に関与していることが最近の分子学的研究の進歩によって明らかになってきたが、その厳密な機序は依然として不明である。 BACKGROUND ART Hepatocellular carcinoma (HCC) and colorectal cancer are the leading causes of cancer death worldwide (Akriviadis et al., Br J Surg 85 (10): 1319-31 (1998)). Despite recent advances in diagnosis and treatment strategies, many patients are still diagnosed with cancer at an advanced stage, and it is an urgent concern to cure them completely from the disease It is. Although recent advances in molecular studies have revealed that changes in tumor suppressor genes and / or oncogenes are involved in carcinogenesis, the exact mechanism remains unclear.

最近の分子生物学の進歩により、肝臓癌の発生には、結腸腫瘍の発生および進行の場合と同じく、多段階プロセスが根底にあることが示唆されている。これらのプロセスは、さまざまな遺伝子産物の質的および量的な変化を伴う。βカテニン/Tcfシグナル伝達経路は、発生時の形態形成に関与することが報告されている（WodarzおよびNusse、Annu Rev Cell Dev Biol 14：59-88 (1998)；Polakis、Genes Dev 14：1837-51 (2000)；BienzおよびClevers、Cell 103：311-20 (2000)）。最近の癌研究の進歩により、結腸、肝臓、前立腺、胃、脳、子宮内膜またはそれ以外のいずれに生じるかにかかわらず、ヒト腫瘍の発生におけるシグナル伝達経路の重要性が強調されている（BullionsおよびLevine、Curr Opin Oncol 10：81-7 (1998)）。腫瘍抑制因子の1つである大腸腺腫様ポリポーシス（Adenomatous polysis coli）（APC）は、βカテニン、アキシン（Axin）、コンダクチン（conductin）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β（GSK-3β）と相互作用し、ユビキチン-プロテオソーム系を介してβカテニンの分解を促す（Polakis、Genes Dev 14：1837-51 (2000)）。ほとんどの散発性結腸直腸腫瘍ではAPC、AXIN1もしくはAXIN2（コンダクチン）における不活性化変異、またはCTNNB1（βカテニン）における安定化発癌性変異により、βカテニンが細胞質および/または核に蓄積し、その結果としてβカテニン/Tcf転写複合体の構成的活性化がもたらされる（Polakis、Genes Dev 14：1837-51 (2000)；Korinekら、Science 275：1784-7 (1997)）。その結果、この複合体はc-myc、サイクリンD1、マトリリシン（MMP-1）、c-jun、fra-1、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（uPAR）、コネキシン43、CD44、PPAR-∂、AF-17およびENC-1などの標的遺伝子を活性化する（Heら、Science 281：1509-12 (1998)；Shtutmanら、Proc Natl Acad Sci USA 96：5522-7 (1999)；Brabletzら、Am J Pathol 155：1033-1038 (1999)；Crawfordら、Oncogene 18：2883-91 (1999)；Mannら、Proc Natl Acad Sci USA 96：1603-8 (1999)；van der Heydenら、J Cell Sci 111：1741-9 (1998)；Wielengaら、Am J Pathol 154：515-23 (1999)；Heら、Cell 99：335-45 (1999)；Linら、Cancer Res 61：6345-9 (2001)；Fujitaら、Cancer Res 61：7722-6 (2001)）。しかし、結腸直腸癌におけるこの経路の活性化による腫瘍発生の厳密な機序はまだ解明されていない。   Recent advances in molecular biology suggest that the development of liver cancer is based on a multi-step process, as is the case with the development and progression of colon tumors. These processes involve qualitative and quantitative changes in various gene products. The β-catenin / Tcf signaling pathway has been reported to be involved in morphogenesis during development (Wodarz and Nusse, Annu Rev Cell Dev Biol 14: 59-88 (1998); Polakis, Genes Dev 14: 1837- 51 (2000); Bienz and Clevers, Cell 103: 311-20 (2000)). Recent advances in cancer research emphasize the importance of signaling pathways in the development of human tumors, whether they occur in the colon, liver, prostate, stomach, brain, endometrium or otherwise ( Bullions and Levine, Curr Opin Oncol 10: 81-7 (1998)). Adenomatous polysis coli (APC), one of the tumor suppressors, interacts with β-catenin, Axin, conductin and glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) It promotes the degradation of β-catenin via the ubiquitin-proteosome system (Polakis, Genes Dev 14: 1837-51 (2000)). In most sporadic colorectal tumors, inactivating mutations in APC, AXIN1 or AXIN2 (conductin), or stabilizing carcinogenic mutations in CTNNB1 (βcatenin) result in the accumulation of β-catenin in the cytoplasm and / or nucleus Resulting in constitutive activation of the β-catenin / Tcf transcription complex (Polakis, Genes Dev 14: 1837-51 (2000); Korinek et al., Science 275: 1784-7 (1997)). As a result, this complex is c-myc, cyclin D1, matrilysin (MMP-1), c-jun, fra-1, urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR), connexin 43, CD44, PPAR-標的 Activates target genes such as AF-17 and ENC-1 (He et al., Science 281: 1509-12 (1998); Shtutman et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 5522-7 (1999); Brabletz et al. Am J Pathol 155: 1033-1038 (1999); Crawford et al., Oncogene 18: 2883-91 (1999); Mann et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 1603-8 (1999); van der Heyden et al., J Cell Sci 111: 1741-9 (1998); Wielenga et al., Am J Pathol 154: 515-23 (1999); He et al., Cell 99: 335-45 (1999); Lin et al., Cancer Res 61: 6345-9 (2001) ); Fujita et al., Cancer Res 61: 7722-6 (2001)). However, the exact mechanism of tumor development by activation of this pathway in colorectal cancer has not yet been elucidated.

もう1つのタンパク質であるスタスミン（stathmin）も広範囲の癌と関係していることが知られている（Hanashら、J Biol Chem 263：12813-5 (1988)；Roosら、Leukemia 7：1538-46 (1993)；Nylanderら、Histochem J 27：155-60 (1995)；Friedrichら、Prostate 27：102-9 (1995)；Biecheら、Br J Cancer 78：701-9 (1998)）。スタスミン（Sobelら、J Biol Chem 264：3765-72 (1989)；Sobelら、Trends Biol Sci 16：301-5 (1991)）は148アミノ酸残基（19kD）からなるサイトゾル性リンタンパク質であり、p19、プロゾリン（prosolin）、Lap18、腫瘍性タンパク質18、メタブラスチン（metablastin）およびOp 18とも呼ばれている。スタスミンの発現は、種々の多能性胚性癌細胞において、およびマウス胚盤胞の内部細胞塊の多能性細胞において極めて高度であることがわかっている（Doyeら、Differentiation 50：89-96 (1992)）。スタスミンは複数の非リン酸化型およびリン酸化型として細胞内に存在し、多くの生体システムにおいてそのパターンは細胞の増殖、分化または活性化の状態に依存する（Sobelら、Trends Biol Sci 16：301-5 (1991)）。さらに、スタスミンの微小管脱重合活性はそのリン酸化レベルの変化によって調節されることが知られており、スタスミンの微小管脱分極活性は、細胞周期の種々の時期における微小管の動的不安定性の調節に決定的な役割を果たすことが報告されている（Marklundら、EMBO J15：5290-8 (1996)；Horwitzら、J Biol Chem 272：8129-31 (1997)）。有糸***時にはスタスミンの大規模なリン酸化が起こり（Strahlerら、Biochem Biophy Res Commun 185：197-203 (1992)；Luoら、J Biol Chem 269：10312-8 (1994)；Brattsandら、Eur J Biochem 220：359-68 (1994)）、これは細胞周期の進行に必須であるように思われる。しかし、スタスミンのリン酸化の厳密な機序およびその癌化との関係はまだ解明されていない。   Another protein, stathmin, is also known to be associated with a wide range of cancers (Hanash et al., J Biol Chem 263: 12813-5 (1988); Roos et al., Leukemia 7: 1538-46. (1993); Nylander et al., Histochem J 27: 155-60 (1995); Friedrich et al., Prostate 27: 102-9 (1995); Bieche et al., Br J Cancer 78: 701-9 (1998)). Stathmin (Sobel et al., J Biol Chem 264: 3765-72 (1989); Sobel et al., Trends Biol Sci 16: 301-5 (1991)) is a cytosolic phosphoprotein consisting of 148 amino acid residues (19 kD), Also called p19, prosolin, Lap18, oncoprotein 18, metablastin and Op18. Expression of stathmin has been found to be extremely high in various pluripotent embryonic cancer cells and in pluripotent cells of the inner cell mass of mouse blastocysts (Doye et al., Differentiation 50: 89-96 (1992)). Stathmin exists in cells as multiple unphosphorylated and phosphorylated forms, and in many biological systems the pattern depends on the state of cell proliferation, differentiation or activation (Sobel et al., Trends Biol Sci 16: 301). -5 (1991)). Furthermore, it is known that microtubule depolymerization activity of stathmin is regulated by changes in its phosphorylation level, and microtubule depolarization activity of stathmin is related to dynamic instability of microtubules at various stages of the cell cycle It has been reported to play a critical role in the regulation of (Marklund et al., EMBO J15: 5290-8 (1996); Horwitz et al., J Biol Chem 272: 8129-31 (1997)). Massive phosphorylation of stathmin occurs during mitosis (Strahler et al., Biochem Biophy Res Commun 185: 197-203 (1992); Luo et al., J Biol Chem 269: 10312-8 (1994); Brattsand et al., Eur J Biochem 220: 359-68 (1994)), which appears to be essential for cell cycle progression. However, the exact mechanism of stathmin phosphorylation and its relationship to canceration have not yet been elucidated.

cDNAマイクロアレイ技術により、正常細胞および悪性細胞における遺伝子発現の包括的プロファイルを得ることが可能になった（Okabeら、Cancer Res 61: 2129-37 (2001)；Linら、Oncogene 21: 4120-8 (2002)；Hasegawaら、Cancer Res 62: 7012-7 (2002)）。このアプローチは癌細胞の複雑な性質を明らかにすることを可能にし、発癌の機序を解明する一助となる。腫瘍において脱制御される遺伝子の同定は、個々の癌のより正確で間違いのない診断、および新規な治療標的の開発につながる可能性がある（BienzおよびClevers、Cell 103: 311-20 (2000)）。腫瘍の基礎をなす機序を全ゲノム的な観点から解明するため、ならびに診断および新規治療薬の開発のための標的分子を探索するために、本発明者らは、23040種の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイを用いて腫瘍細胞の発現プロファイルを分析してきた（Okabeら、Cancer Res 61: 2129-37 (2001)；Kitaharaら、Cancer Res 61: 3544-9 (2001)；Linら、Oncogene 21: 4120-8 (2002)；Hasegawaら、Cancer Res 62: 7012-7 (2002)）。   cDNA microarray technology has made it possible to obtain a comprehensive profile of gene expression in normal and malignant cells (Okabe et al., Cancer Res 61: 2129-37 (2001); Lin et al., Oncogene 21: 4120-8 ( 2002); Hasegawa et al., Cancer Res 62: 7012-7 (2002)). This approach makes it possible to elucidate the complex nature of cancer cells and helps to elucidate the mechanism of carcinogenesis. Identification of genes that are deregulated in tumors may lead to a more accurate and error-free diagnosis of individual cancers and the development of new therapeutic targets (Bienz and Clevers, Cell 103: 311-20 (2000) ). In order to elucidate the underlying mechanisms of tumors from a genome-wide perspective, and to explore target molecules for the development of diagnostics and novel therapeutics, we have cDNA containing 23040 genes. Tumor cell expression profiles have been analyzed using microarrays (Okabe et al., Cancer Res 61: 2129-37 (2001); Kitahara et al., Cancer Res 61: 3544-9 (2001); Lin et al., Oncogene 21: 4120- 8 (2002); Hasegawa et al., Cancer Res 62: 7012-7 (2002)).

発癌の機序を明らかにする目的で設計された研究により、抗腫瘍薬の分子標的を同定することは既に容易である。例えば、Ras（その活性化は翻訳後ファルネシル化に依存する）が関係する増殖シグナル伝達経路を阻害するために当初開発されたファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）は、動物モデルにおけるRas依存性腫瘍の治療に有効であった（Heら、Cell 99: 335-45 (1999)）。抗癌剤と抗HER2モノクローナル抗体トラスツズマブ（trastuzumab）を併用したヒトに対する臨床試験がプロト癌遺伝子受容体HER2/neuの拮抗を目的として実施されており、乳癌患者の臨床効果および全般的な生存率の改善が達成されている（Linら、Cancer Res 61: 6345-9 (2001)）。bcr-abl融合タンパク質を選択的に不活性化するチロシンキナーゼ阻害剤STI-571は、bcr-ablチロシンキナーゼの構成的活性化が白血球のトランスフォーメーションに決定的な役割を果たす、慢性骨髄性白血病の治療を目的として開発された。これらの種類の薬剤は、特定の遺伝子産物の発癌活性を抑制する目的で設計されている（Fujitaら、Cancer Res 61: 7722-6 (2001)）。   It is already easy to identify molecular targets for antitumor drugs by studies designed to elucidate the mechanisms of carcinogenesis. For example, a farnesyltransferase inhibitor (FTI), originally developed to inhibit growth signaling pathways involving Ras, whose activation depends on post-translational farnesylation, is a treatment for Ras-dependent tumors in animal models. (He et al., Cell 99: 335-45 (1999)). Clinical trials in humans using anticancer drugs and anti-HER2 monoclonal antibody trastuzumab in combination with proto-oncogene receptor HER2 / neu have been conducted to improve clinical efficacy and overall survival of breast cancer patients It has been achieved (Lin et al., Cancer Res 61: 6345-9 (2001)). The tyrosine kinase inhibitor STI-571, which selectively inactivates the bcr-abl fusion protein, is used in chronic myeloid leukemia where constitutive activation of the bcr-abl tyrosine kinase plays a crucial role in leukocyte transformation. Developed for therapeutic purposes. These types of drugs are designed to suppress the carcinogenic activity of specific gene products (Fujita et al., Cancer Res 61: 7722-6 (2001)).

発明の概要
本発明の1つの目的は、肝細胞癌または結腸直腸癌細胞の増殖機構に関与する新規タンパク質、これらのタンパク質をコードする遺伝子、さらにはこれらを生産して肝細胞癌（HCC）または結腸直腸癌の診断および治療に用いるための方法を提供することである。 SUMMARY OF THE INVENTION One object of the present invention is to provide novel proteins involved in the mechanism of proliferation of hepatocellular carcinoma or colorectal cancer cells, genes encoding these proteins, and further producing them to produce hepatocellular carcinoma (HCC) or It is to provide a method for use in the diagnosis and treatment of colorectal cancer.

肝細胞癌および結腸直腸癌の発生機序を解明するため、ならびにこれらの腫瘍の治療用の新規診断マーカーおよび/または薬剤標的を同定するために、本発明者らは、23040種の遺伝子を含むゲノム全域のcDNAマイクロアレイを用いて、肝細胞癌および結腸直腸癌の発生における遺伝子の発現プロファイルを分析した。薬理学的な観点からは、発癌シグナルを抑制する方が腫瘍抑制効果の活性化を行うよりも現実的には容易である。このため、本発明者らは、肝細胞癌および結腸直腸癌の発生に際して上方制御される遺伝子を探索した。   In order to elucidate the pathogenesis of hepatocellular carcinoma and colorectal cancer and to identify novel diagnostic markers and / or drug targets for the treatment of these tumors, we include 23040 genes Genome-wide cDNA microarrays were used to analyze gene expression profiles in the development of hepatocellular carcinoma and colorectal cancer. From a pharmacological point of view, it is actually easier to suppress the carcinogenic signal than to activate the tumor suppressive effect. For this reason, the inventors searched for genes that are up-regulated during the development of hepatocellular carcinoma and colorectal cancer.

肝細胞癌において高頻度に上方制御される転写物の中から、新規ヒト遺伝子WDRPUH（WD40 repeat protein up-regulated in HCC）およびKRZFPUH（Kruppel-type zinc finger protein up-regulated in HCC）がそれぞれ染色体バンド17p13および16p11に同定された。WDRPUHまたはKRZFPUHの遺伝子導入は細胞の増殖を促進した。さらに、特異的なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドのトランスフェクションによるWDRPUHまたはKRZFPUHの発現低下はHCC細胞の増殖を阻害した。DNAおよび/またはRNA合成の阻害剤、代謝抑制物質ならびにおよびDNAインターカレーターといった多くの抗癌剤は、癌細胞のみならず、正常に増殖している細胞に対しても毒性を示す。しかし、WDRPUHおよびKRZFPUHの発現を抑制する薬剤は、これらの遺伝子の通常の発現がそれぞれ精巣、ならびに胎盤および精巣に限局しているため、他の臓器には有害な影響を及ぼさないと考えられ、このため、癌の治療に非常に重要となる可能性がある。   Among the transcripts that are frequently up-regulated in hepatocellular carcinoma, the novel human genes WDRPUH (WD40 repeat protein up-regulated in HCC) and KRZFPUH (Kruppel-type zinc finger protein up-regulated in HCC) are each chromosomal bands. Identified at 17p13 and 16p11. Gene transfer of WDRPUH or KRZFPUH promoted cell proliferation. Furthermore, reduced expression of WDRPUH or KRZFPUH by transfection with specific antisense S-oligonucleotides inhibited HCC cell proliferation. Many anti-cancer agents such as inhibitors of DNA and / or RNA synthesis, metabolic inhibitors and DNA intercalators are toxic not only to cancer cells but also to normally proliferating cells. However, drugs that suppress the expression of WDRPUH and KRZFPUH are thought to have no detrimental effects on other organs because normal expression of these genes is confined to the testis and placenta and testis, respectively. This can be very important for the treatment of cancer.

さらに、結腸直腸癌において高頻度に上方制御される転写物の中から、染色体バンド6p21.1に指定された遺伝子PPIL1（Peptidyl prolyl isomerase-like 1）が同定された。その上、免疫沈降アッセイにより、PPIL1タンパク質が、ビタミンD受容体の転写活性に関与するタンパク質であるSNW1（SKI相互作用タンパク質）、および、細胞周期の進行に関与するサイトゾル性リンタンパク質であるスタスミンと会合することが明らかになった。本発明者らは、肝臓癌および結腸直腸癌で異常に上方制御されるβカテニン/Tcf4複合体を調節する遺伝子も検索し、染色体バンド18p11.2に指定された新規遺伝子APCDD1（Down-regulated by adenomatosis polyposis coli）を同定した。その発現は野生型APCの形質導入によって減少し、大半の結腸癌組織では上昇した。PPIL1またはAPCDD1の遺伝子導入により、これらの遺伝子のいずれかの内因性発現が欠損した細胞の増殖が促進した。さらに、PPIL1またはAPCDD1に対する特異的アンチセンスS-オリゴヌクレオチドのトランスフェクションによるPPIL1またはAPCDD1の発現低下は、結腸直腸癌細胞の増殖を抑制した。   Furthermore, the gene PPIL1 (Peptidyl prolyl isomerase-like 1) specified in chromosome band 6p21.1 was identified among transcripts that are frequently up-regulated in colorectal cancer. Moreover, by immunoprecipitation assay, PPIL1 protein was found to be SNW1 (SKI-interacting protein), a protein involved in vitamin D receptor transcriptional activity, and stathmine, a cytosolic phosphoprotein involved in cell cycle progression. It became clear to meet with. The present inventors also searched for a gene that regulates the β-catenin / Tcf4 complex that is abnormally up-regulated in liver cancer and colorectal cancer, and a novel gene APCDD1 (Down-regulated by adenomatosis polyposis coli) was identified. Its expression was reduced by transduction with wild-type APC and increased in most colon cancer tissues. Gene transfer of PPIL1 or APCDD1 promoted the growth of cells lacking endogenous expression of either of these genes. Furthermore, decreased expression of PPIL1 or APCDD1 by transfection of specific antisense S-oligonucleotides to PPIL1 or APCDD1 suppressed the growth of colorectal cancer cells.

したがって、本発明は、癌の診断マーカーの候補であるとともに、診断のための新たな戦略および有効な抗癌剤を開発するための有望な標的候補でもある、単離された新規遺伝子WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1を提供する。さらに、本発明は、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのほか、その生産および使用も提供する。より具体的には、本発明は以下を提供する。   Thus, the present invention is an isolated novel gene WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 that is a candidate for a diagnostic marker for cancer as well as a promising target candidate for developing new strategies and effective anticancer agents for diagnosis. And provide APCDD1. In addition, the present invention provides polypeptides encoded by these genes, as well as their production and use. More specifically, the present invention provides the following.

本出願は、新規ヒトポリペプチドWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1、または細胞増殖を促進し、HCCおよび結腸直腸癌などの細胞増殖性疾患において上方制御されるそれらの機能的同等物を提供する。   The present application provides novel human polypeptides WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, and APCDD1, or their functional equivalents that promote cell proliferation and are upregulated in cell proliferative diseases such as HCC and colorectal cancer.

1つの好ましい態様において、WDRPUHポリペプチドは、配列番号：1のオープンリーディングフレームによってコードされる11個のWD40反復ドメインを有する推定620アミノ酸のタンパク質を含む。WDRPUHポリペプチドは、好ましくは、配列番号：2に示されたアミノ酸配列を含む。本出願はまた、WDRPUHポリヌクレオチド配列の少なくとも一部により、または配列番号：1に示された配列に対して少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる、単離されたタンパク質も提供する。   In one preferred embodiment, the WDRPUH polypeptide comprises a putative 620 amino acid protein having 11 WD40 repeat domains encoded by the open reading frame of SEQ ID NO: 1. The WDRPUH polypeptide preferably comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. The application also includes a single encoded by a polynucleotide sequence that is encoded by at least a portion of the WDRPUH polynucleotide sequence or at least 15%, more preferably at least 25% complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Separated proteins are also provided.

一方、1つの好ましい態様において、KRZFPUHポリペプチドは、ラット遺伝子ジンクフィンガータンパク質HIT-39（GenBankアクセッション番号AF277902）に対する相同性を有し、配列番号：3のオープンリーディングフレームによってコードされるクルッペル（Krupple）型ジンクフィンガードメイン（KRAB）を含む、推定500アミノ酸のタンパク質を含む。KRZFPUHポリペプチドは、好ましくは、配列番号：4に示されたアミノ酸配列を含む。本出願はまた、KRZFPUHポリヌクレオチド配列の少なくとも一部により、または配列番号：3に示された配列に対して少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる、単離されたタンパク質も提供する。   On the other hand, in one preferred embodiment, the KRZFPUH polypeptide has homology to the rat gene zinc finger protein HIT-39 (GenBank accession number AF277902) and is encoded by the open reading frame of SEQ ID NO: 3 (Krupple). ) Contains a putative 500 amino acid protein containing a type zinc finger domain (KRAB). The KRZFPUH polypeptide preferably comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. The application also includes a single encoded by a polynucleotide sequence that is encoded by at least a portion of the KRZFPUH polynucleotide sequence or by at least 15%, more preferably at least 25% complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Separated proteins are also provided.

さらに、1つの好ましい態様において、PPIL1ポリペプチドは、Ppil1に対して98.1％、PPIAに対して41.6％、Cyp2に対して57.4％、CypEに対して50％の同一性を示し、配列番号：5のオープンリーディングフレームによってコードされる、推定166アミノ酸のタンパク質を含む。PPIL1ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：6に示されたアミノ酸配列を含む。本出願はまた、PPIL1ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部により、または配列番号：5に示された配列に対して少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる単離されたタンパク質も提供する。   Further, in one preferred embodiment, the PPIL1 polypeptide exhibits 98.1% identity to Ppil1, 41.6% to PPIA, 57.4% to Cyp2, and 50% identity to CypE, SEQ ID NO: 5 It contains a putative 166 amino acid protein encoded by an open reading frame. The PPIL1 polypeptide preferably comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. The application also provides an isolation encoded by at least a portion of the PPIL1 polynucleotide sequence or by a polynucleotide sequence that is at least 15%, more preferably at least 25% complementary to the sequence shown in SEQ ID NO: 5. Provided proteins are also provided.

さらに、1つの好ましい態様において、APCDD1ポリペプチドは、サーモバシラス・キシラニリチカス（Thermobacillus xylanilyticus）のエンド-1,4-βキシラナーゼに対して31％の同一性を示し、配列番号：7のオープンリーディングフレームによってコードされる推定514アミノ酸のタンパク質を含む。APCDD1ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：8に示されたアミノ酸配列を含む。本出願はまた、APCDD1ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部により、または配列番号：7に示された配列に対して少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチド配列によりコードされる単離されたタンパク質も提供する。   Furthermore, in one preferred embodiment, the APCDD1 polypeptide exhibits 31% identity to the Thermobacillus xylanilyticus endo-1,4-β xylanase and is represented by the open reading frame of SEQ ID NO: 7. Contains the predicted 514 amino acid protein encoded. The APCDD1 polypeptide preferably comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. The application also provides an isolation encoded by at least a portion of the APCDD1 polynucleotide sequence or by a polynucleotide sequence that is at least 15%, more preferably at least 25% complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 7. Provided proteins are also provided.

本発明はさらに、対応する非癌肝組織に比べてHCCの大半でその発現が顕著に上昇している新規ヒト遺伝子WDRPUHおよびKRZFPUHも提供する。単離されたWDRPUH遺伝子は、配列番号：1に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。具体的には、WDRPUH cDNAは、1860ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2152ヌクレオチドを含む。本発明はさらに、WDRPUHタンパク質またはそれらの機能的同等物をコードする限りは、配列番号：1に示されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：1の縮重物および対立遺伝子変異体である。一方、単離されたKRZFPUH遺伝子は、配列番号：3に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。具体的には、KRZFPUH cDNAは、1500ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2744ヌクレオチドを含む。本発明はさらに、KRZFPUHタンパク質またはそれらの機能的同等物をコードする限りは、配列番号：3に示されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：3の縮重物および対立遺伝子変異体である。   The present invention further provides novel human genes WDRPUH and KRZFPUH whose expression is significantly elevated in the majority of HCCs compared to the corresponding non-cancerous liver tissue. The isolated WDRPUH gene comprises the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Specifically, the WDRPUH cDNA contains 2152 nucleotides that contain an open reading frame of 1860 nucleotides. The present invention further hybridizes to the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 as long as it encodes the WDRPUH protein or functional equivalent thereof, and at least 15%, more preferably at least 25% complementary poly. Also includes nucleotides. Examples of such polynucleotides are the degenerate and allelic variants of SEQ ID NO: 1. On the other hand, the isolated KRZFPUH gene comprises the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Specifically, the KRZFPUH cDNA contains 2744 nucleotides including an open reading frame of 1500 nucleotides. The present invention further hybridizes to the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 as long as it encodes the KRZFPUH protein or functional equivalent thereof, and is a poly at least 15%, more preferably at least 25% complementary. Also includes nucleotides. Examples of such polynucleotides are the degenerate and allelic variants of SEQ ID NO: 3.

さらに、本発明は、対応する非癌組織に比べて結腸直腸癌の大半でその発現が顕著に上昇している新規ヒト遺伝子PPIL1も提供する。単離されたPPIL1遺伝子は、配列番号：5に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。具体的には、PPIL1 cDNAは、498ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む1734ヌクレオチドを含む。本発明はさらに、PPIL1タンパク質またはそれらの機能的同等物をコードする限りは、配列番号：5に示されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：5の縮重物および対立遺伝子変異体である。   Furthermore, the present invention also provides a novel human gene PPIL1 whose expression is markedly elevated in most colorectal cancers compared to corresponding non-cancerous tissues. The isolated PPIL1 gene comprises the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5. Specifically, the PPIL1 cDNA contains 1734 nucleotides containing an open reading frame of 498 nucleotides. The present invention further hybridizes to the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and, as long as it encodes a PPIL1 protein or functional equivalent thereof, a polynucleotide that is 15%, more preferably at least 25% complementary. Including. Examples of such polynucleotides are the degenerate and allelic variants of SEQ ID NO: 5.

さらに、本発明は、対応する非癌組織に比べて原発性結腸癌の大半でその発現が顕著に上昇しており、結腸癌細胞への野生型APC1の形質導入に応答して下方制御される、新規ヒト遺伝子APCDD1も提供する。単離されたAPCDD1遺伝子は、配列番号：7に記載されたポリヌクレオチド配列を含む。具体的には、APCDD1 cDNAは、1542ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2607ヌクレオチドを含む。本発明はさらに、APCDD1タンパク質またはそれらの機能的同等物をコードする限りは、配列番号：7に示されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも15％、より好ましくは少なくとも25％相補的なポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号：7の縮重物および対立遺伝子変異体である。   Furthermore, the present invention has a markedly elevated expression in the majority of primary colon cancer compared to the corresponding non-cancerous tissue and is down-regulated in response to transduction of wild type APC1 into colon cancer cells. A new human gene, APCDD1, is also provided. The isolated APCDD1 gene comprises the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7. Specifically, the APCDD1 cDNA contains 2607 nucleotides containing an open reading frame of 1542 nucleotides. The present invention further hybridizes to a polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 as long as it encodes an APCDD1 protein or functional equivalent thereof, and is at least 15%, more preferably at least 25% complementary poly. Also includes nucleotides. Examples of such polynucleotides are the degenerate and allelic variants of SEQ ID NO: 7.

本明細書で用いる場合、単離された遺伝子とは、その構造が、どの天然のポリヌクレオチドの構造とも同一でなく、別個の3つ以上の遺伝子にわたる天然のゲノムポリヌクレオチドのいかなる断片の構造とも同一でない、ポリヌクレオチドのことである。このため、この用語には、例えば（a）天然の生物のゲノム中に存在し、天然のゲノムDNA分子の部分配列を有するDNA、（b）結果として生じる分子がどの天然のベクターまたはゲノムDNAとも同一でないような様式で、ベクター中または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み入れられたポリヌクレオチド、（c）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生じた断片または制限断片などの独立した分子、および（d）ハイブリッド遺伝子の部分である組換えヌクレオチド配列、すなわち融合ポリペプチドをコードする遺伝子、が含まれる。   As used herein, an isolated gene is not the structure of any natural polynucleotide, but the structure of any fragment of a natural genomic polynucleotide spanning three or more distinct genes. Polynucleotides that are not identical. For this reason, this term includes, for example, (a) DNA that is present in the genome of a natural organism and has a partial sequence of the natural genomic DNA molecule, and (b) any natural vector or genomic DNA that results in the molecule. Such as polynucleotides incorporated in vectors or in prokaryotic or eukaryotic genomic DNA, (c) cDNA, genomic fragments, polymerase chain reaction (PCR) generated fragments or restriction fragments, etc. in a manner that is not identical Independent molecules and (d) a recombinant nucleotide sequence that is part of a hybrid gene, ie, a gene encoding a fusion polypeptide.

したがって、1つの局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：1、3、5、または7に示されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一なヌクレオチド配列を含むことが好ましい。単離された核酸分子は、配列番号：1、3、5、または7に示されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上同一であることがより好ましい。単離されたポリヌクレオチドが参照配列、例えば配列番号：1、3、5、または7よりも長いか長さの等しい場合には、参照配列の完全長との比較が行われる。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、例えば配列番号：1、3、5、または7よりも短い場合には、同じ長さ（相同性の算出に必要なループは除外して）の参照配列のセグメントとの比較が行われる。   Accordingly, in one aspect, the present invention provides an isolated polynucleotide that encodes a polypeptide described herein or a fragment thereof. Preferably, the isolated polynucleotide comprises a nucleotide sequence that is at least 60% identical to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7. The isolated nucleic acid molecule has at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92% of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more are more preferred. If the isolated polynucleotide is longer or equal in length to a reference sequence, eg, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, a comparison with the full length of the reference sequence is performed. If the isolated polynucleotide is shorter than the reference sequence, eg shorter than SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, it is the same length (excluding the loops necessary for calculating homology) A comparison is made with a segment of the reference sequence.

本発明はまた、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を用いて宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換を行うこと、およびそのポリヌクレオチド配列を発現させることによる、タンパク質の産生方法も提供する。加えて、本発明は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、およびWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する宿主細胞も提供する。このようなベクターおよび宿主細胞は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の産生のために用いることができる。   The present invention also provides a method for producing a protein by transfection or transformation of a host cell with a polynucleotide sequence encoding a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein and expressing the polynucleotide sequence. Also provide. In addition, the present invention also provides a host cell carrying a vector comprising a nucleotide sequence encoding a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein, and a polynucleotide encoding a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein. Such vectors and host cells can be used for the production of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 proteins.

WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質を認識する抗体も、本出願によって提供される。一部には、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスDNA）、リボザイムおよびsiRNA（低分子干渉RNA）も提供される。   Antibodies that recognize WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 proteins are also provided by this application. Some also provide antisense polynucleotides (eg, antisense DNA), ribozymes and siRNA (small interfering RNA) of the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene.

本発明はさらに、標本の生物試料における遺伝子の発現レベルを決定する段階、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルを正常試料におけるものと比較する段階、および、試料におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の高い発現レベルを癌などの細胞増殖性疾患を有するものとして定義する段階を含む、細胞増殖性疾患の診断のための方法を提供する。WDRPUHまたはKRZFPUHの発現レベルによって診断される疾患は好適には肝細胞癌である；PPIL1またはAPCDD1の発現レベルによって検出される疾患には結腸直腸癌がある。   The invention further includes determining the expression level of the gene in the biological sample of the specimen, comparing the expression level of the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene with that in a normal sample, and WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1 in the sample Or providing a method for diagnosis of a cell proliferative disease, comprising defining a high expression level of the APCDD1 gene as having a cell proliferative disease such as cancer. The disease diagnosed by the expression level of WDRPUH or KRZFPUH is preferably hepatocellular carcinoma; the disease detected by the expression level of PPIL1 or APCDD1 is colorectal cancer.

さらに、細胞増殖性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法も提供される。本方法は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを被験化合物と接触させる段階、およびWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドと結合する被験化合物を選択する段階を含む。   Further provided are methods of screening for compounds for treating cell proliferative diseases. The method includes contacting a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polypeptide with a test compound, and selecting a test compound that binds to the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polypeptide.

本発明はさらに、細胞増殖性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法であって、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを被験化合物と接触させる段階、およびWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドの発現レベルまたは生物学的活性を抑制する被験化合物を選択する段階を含む方法も提供する。   The present invention further provides a method for screening a compound for treating a cell proliferative disorder, comprising contacting a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polypeptide with a test compound, and a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polyp Also provided is a method comprising selecting a test compound that suppresses the expression level or biological activity of the peptide.

細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法であって、被験化合物、βカテニン/Tcf 4複合体およびレポーター遺伝子を、2つのTcf/LEF結合モチーフを含むAPCDD1の転写調節領域を持つレポーター遺伝子の発現に適した条件下で、接触させる段階、ならびにレポーター遺伝子の発現を阻害する被験化合物を選択する段階を含む方法も提供される。   A screening method for a compound for treating a cell proliferative disease, comprising a test compound, a β-catenin / Tcf 4 complex and a reporter gene, a reporter having a transcriptional regulatory region of APCDD1 containing two Tcf / LEF binding motifs Also provided is a method comprising contacting under conditions suitable for gene expression, and selecting a test compound that inhibits expression of the reporter gene.

さらに、本発明は、細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法であって、PPIL1とスタスミンまたはSNW1とを被験化合物の存在下で接触させる段階、および、PPIL1とスタスミンまたはSNW1との結合を阻害する被験化合物を選択する段階を含む方法も提供する。   Furthermore, the present invention provides a screening method for a compound for treating a cell proliferative disease, comprising contacting PPIL1 with stathmin or SNW1 in the presence of a test compound, and PPIL1 and stathmin or SNW1. Also provided is a method comprising selecting a test compound that inhibits binding.

本出願はまた、癌などの細胞増殖性疾患を治療するための薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は、例えば抗癌剤であってよい。薬学的組成物は、それぞれ配列番号：1、3、5、または7に提示および記載されたWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリヌクレオチド配列のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドまたはsiRNAの少なくとも一部として記載することができる。適したアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、配列番号：16、37、44、または89の群より選択されるヌクレオチド配列を含む。配列番号：16のヌクレオチド配列を有するものを含む、WDRPUHアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、肝臓癌および胃癌の治療に好適に使用でき；配列番号：37のヌクレオチド配列を有するものを含む、KRZFPUHのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、肝臓癌、胃癌および肺癌の治療に好適に使用でき；配列番号：44のヌクレオチド配列を有するものを含む、PPIL1のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、結腸癌の治療に好適に使用でき；ならびに、配列番号：89のヌクレオチド配列を有するものを含む、APCDD1のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは、結腸直腸癌の治療に好適に使用できる。
薬学的組成物は、細胞増殖性疾患の治療のための化合物に関する本スクリーニング方法によって選択された化合物を含むものであってもよい。 The application also provides pharmaceutical compositions for treating cell proliferative diseases such as cancer. The pharmaceutical composition may be, for example, an anticancer agent. The pharmaceutical composition is described as at least part of an antisense S-oligonucleotide or siRNA of the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polynucleotide sequence presented and described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, respectively. can do. Suitable antisense S-oligonucleotides comprise a nucleotide sequence selected from the group of SEQ ID NO: 16, 37, 44, or 89. WDRPUH antisense S-oligonucleotides, including those having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, can be suitably used for the treatment of liver cancer and gastric cancer; anti-KRZFPUH, including those having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 Sense S-oligonucleotides can be suitably used for the treatment of liver cancer, gastric cancer and lung cancer; PPIL1 antisense S-oligonucleotides, including those having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 44, are suitable for the treatment of colon cancer As well as antisense S-oligonucleotides of APCDD1, including those having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 89, can be suitably used for the treatment of colorectal cancer.
The pharmaceutical composition may comprise a compound selected by the present screening method for a compound for the treatment of a cell proliferative disorder.

薬学的組成物の作用経路は癌細胞の増殖を阻害するものであることが望ましい。薬学的組成物は、ヒトおよび家畜を含む、哺乳動物に対して適用しうる。   Desirably, the route of action of the pharmaceutical composition is one that inhibits the growth of cancer cells. The pharmaceutical composition can be applied to mammals, including humans and livestock.

本発明はさらに、本発明によって提供される薬学的組成物を用いて細胞増殖性疾患を治療するための方法を提供する。   The present invention further provides a method for treating a cell proliferative disorder using the pharmaceutical composition provided by the present invention.

さらに、本発明は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを投与する段階を含む、癌の治療または予防のための方法も提供する。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドの投与により、抗腫瘍免疫が誘導されると考えられる。したがって、本発明は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを投与する段階を含む、抗腫瘍免疫を誘導するための方法、ならびにWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1ポリペプチドを含む、癌の治療または予防のための薬学的組成物も提供する。   Furthermore, the present invention also provides a method for treating or preventing cancer comprising administering a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polypeptide. It is believed that anti-tumor immunity is induced by administration of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polypeptide. Accordingly, the present invention provides a method for inducing anti-tumor immunity comprising administering a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polypeptide, and a cancer treatment comprising a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 polypeptide. Alternatively, a pharmaceutical composition for prevention is also provided.

本発明の前記の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであって、本発明または本発明のその他の代替的な態様を制限するものではないことが理解される。   It is understood that both the foregoing summary of the invention and the following detailed description are of preferred embodiments and do not limit the invention or other alternative embodiments of the invention.

発明の詳細な説明
本明細書で用いる「1つの（a）」「1つの（an）」および「その（the）」という用語は、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION As used herein, the terms “a”, “an” and “the” mean “at least one” unless otherwise specified. .

本出願では，対応する非癌肝組織に比べてHCCでその発現が顕著に上昇している新規ヒト遺伝子WDRPUHおよびKRZFPUHを同定する。WDRPUH cDNAは、配列番号：1に示された1860ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2152ヌクレオチドからなる。このオープンリーディングフレームは、11個のWD40反復ドメインを有する推定620アミノ酸のタンパク質をコードする。このため、このタンパク質はWDRPUH（WD40 repeats protein up-regulated in HCCs）と命名された。一方、KRZFPUH cDNAは、配列番号：3に示された1500ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2744ヌクレオチドからなる。このオープンリーディングフレームは、Kruppel型ジンクフィンガードメインを含む推定500アミノ酸のタンパク質をコードする。このため、このタンパク質はKRZFPUH（Krupple-type zinc finger protein up-regulated in HCCs）と命名された。   In this application, we identify novel human genes WDRPUH and KRZFPUH whose expression is significantly elevated in HCC compared to the corresponding non-cancerous liver tissue. The WDRPUH cDNA consists of 2152 nucleotides including the 1860 nucleotide open reading frame shown in SEQ ID NO: 1. This open reading frame encodes a putative 620 amino acid protein with 11 WD40 repeat domains. For this reason, this protein was named WDRPUH (WD40 repeats protein up-regulated in HCCs). On the other hand, KRZFPUH cDNA consists of 2744 nucleotides including the 1500 nucleotide open reading frame shown in SEQ ID NO: 3. This open reading frame encodes a putative 500 amino acid protein containing a Kruppel-type zinc finger domain. For this reason, this protein was named KRZFPUH (Krupple-type zinc finger protein up-regulated in HCCs).

さらに、本発明は、対応する非癌組織に比べて結腸直腸癌でその発現が顕著に上昇している新規ヒト遺伝子PPIL1およびAPCDD1も含む。PPIL1 cDNAは、配列番号：5に示された498ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む1734ヌクレオチドからなる。このオープンリーディングフレームは、推定166アミノ酸のタンパク質をコードする。PPIL1は、ビタミンD受容体の転写活性に関与するタンパク質であるSKI相互作用タンパク質（SNW1）および細胞周期の進行に関与するサイトゾル性リンタンパク質であるスタスミンと直接会合する。一方、APCDD1 cDNAは、配列番号：7に示された1542ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2607ヌクレオチドからなる。このオープンリーディングフレームは、既知のモチーフを含まない推定514アミノ酸のタンパク質をコードする。この遺伝子はAPCDD1（down-regulated by APC1）と命名された。さらに、APCDD1の発現はβカテニン/Tcf 4複合体とAPCDD1の転写調節領域内の2つのTcf/LEF結合モチーフとの結合によって増強される。   Furthermore, the present invention also includes novel human genes PPIL1 and APCDD1 whose expression is markedly elevated in colorectal cancer compared to the corresponding non-cancerous tissue. PPIL1 cDNA consists of 1734 nucleotides comprising the 498 nucleotide open reading frame shown in SEQ ID NO: 5. This open reading frame encodes a putative 166 amino acid protein. PPIL1 directly associates with SKI-interacting protein (SNW1), a protein involved in vitamin D receptor transcriptional activity, and stathmin, a cytosolic phosphoprotein involved in cell cycle progression. On the other hand, APCDD1 cDNA consists of 2607 nucleotides including the open reading frame of 1542 nucleotides shown in SEQ ID NO: 7. This open reading frame encodes a putative 514 amino acid protein that does not contain a known motif. This gene was named APCDD1 (down-regulated by APC1). Furthermore, APCDD1 expression is enhanced by the binding of the β-catenin / Tcf4 complex to two Tcf / LEF binding motifs within the transcriptional regulatory region of APCDD1.

細胞におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の外因性発現は常に細胞増殖の亢進をもたらし、一方、アンチセンスS-オリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNA（siRNA）によるその発現の抑制は癌細胞の顕著な増殖阻害をもたらした。これらの所見は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1が癌細胞に発癌活性を与えること、およびこれらのタンパク質の活性の阻害が癌の治療のための有望な戦略となりうることを示唆する。   Exogenous expression of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 in cells always results in increased cell proliferation, while suppression of its expression by antisense S-oligonucleotides or small interfering RNA (siRNA) is prominent in cancer cells Inhibited growth. These findings suggest that WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, and APCDD1 confer oncogenic activity to cancer cells and that inhibition of the activity of these proteins can be a promising strategy for the treatment of cancer.

本発明は、配列番号：1に記載されたポリヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子WDRPUHのほか、その縮重物および変異体も、それらが配列番号：2に示されたアミノ酸配列を含むWDRPUHタンパク質またはその機能的同等物をコードする範囲で含む。WDRPUHと機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトWDRPUHタンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトWDRPUHタンパク質の変異体が含まれる。   In addition to the novel human gene WDRPUH comprising the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the present invention also includes degenerates and variants thereof of the WDRPUH protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or To the extent that it encodes its functional equivalent. Examples of polypeptides functionally equivalent to WDRPUH include, for example, homologous proteins of other organisms corresponding to human WDRPUH protein, as well as variants of human WDRPUH protein.

本発明はまた、配列番号：3に記載されたポリヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子KRZFPUHのほか、その縮重物および変異体も、それらが配列番号：4に示されたアミノ酸配列を含むKRZFPUHタンパク質またはその機能的同等物をコードする範囲で含む。KRZFPUHと機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトKRZFPUHタンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトKRZFPUHタンパク質の変異体が含まれる。   The present invention also includes a novel human gene KRZFPUH comprising the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, as well as degenerates and variants thereof, which are KRZFPUH proteins comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. Or within the scope of coding functional equivalents thereof. Examples of polypeptides functionally equivalent to KRZFPUH include, for example, homologous proteins of other organisms corresponding to human KRZFPUH protein, as well as variants of human KRZFPUH protein.

さらに、本発明は、配列番号：5に記載されたポリヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子PPIL1のほか、その縮重物および変異体も、それらが配列番号：6に示されたアミノ酸配列を含むPPIL1タンパク質またはその機能的同等物をコードする範囲で含む。PPIL1と機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトPPIL1タンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトPPIL1タンパク質の変異体が含まれる。   In addition to the novel human gene PPIL1 comprising the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the present invention also includes degenerates and variants thereof, PPIL1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. To the extent that it encodes a protein or functional equivalent thereof. Examples of polypeptides that are functionally equivalent to PPIL1 include, for example, homologous proteins of other organisms corresponding to human PPIL1 protein, as well as variants of human PPIL1 protein.

本発明においてはさらに、配列番号：7に記載されたポリヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子APCDD1のほか、その縮重物および変異体も、配列番号：8に示されたアミノ酸配列を含むAPCDD1タンパク質またはその機能的同等物をコードする限りは含まれる。APCDD1と機能的に同等なポリペプチドの例には、例えば、ヒトAPCDD1タンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトAPCDD1タンパク質の変異体が含まれる。   In the present invention, in addition to the novel human gene APCDD1 comprising the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the degenerate products and variants thereof also include the APCDD1 protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, It is included as long as it encodes its functional equivalent. Examples of polypeptides that are functionally equivalent to APCDD1 include, for example, homologous proteins of other organisms corresponding to human APCDD1 protein, as well as variants of human APCDD1 protein.

本発明において、「機能的に同等な」という用語は、対象ポリペプチドが、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のように細胞増殖を促進するとともに癌細胞に発癌活性を付与する活性を有することを意味する。対象ポリペプチドが細胞増殖活性を有するか否かは、対象ポリペプチドをコードするDNAをそれぞれのポリペプチドを発現する細胞に導入し、細胞の増殖の促進またはコロニー形成活性の上昇を検出することによって判定される。このような細胞には、例えば、WDRPUHに対してはNIH3T3細胞、SNU475細胞、およびHepG2細胞；ならびに、KRZFPUHに対してはCOS7細胞、およびAlexander細胞；PPIL1に対してはNIH3T3細胞、HCT116細胞、SW480細胞、SNU-C4細胞、およびSNU-C5細胞；ならびにAPCDD1に対してはLoVo細胞およびSW480細胞が含まれる。または、対象ポリペプチドが、PPIL1と機能的に同等であるか否かを、そのSNW1またはスタスミン（stathmin）との結合能を検出することによって判定することもできる。   In the present invention, the term “functionally equivalent” means that the subject polypeptide has an activity of promoting cell proliferation and conferring oncogenic activity to cancer cells, such as WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein. Means. Whether or not the target polypeptide has cell proliferating activity is determined by introducing DNA encoding the target polypeptide into cells expressing each polypeptide and detecting the promotion of cell proliferation or the increase in colony forming activity. Determined. Such cells include, for example, NIH3T3 cells, SNU475 cells, and HepG2 cells for WDRPUH; and COS7 cells and Alexander cells for KRZFPUH; NIH3T3 cells, HCT116 cells, SW480 for PPIL1 Cells, SNU-C4 cells, and SNU-C5 cells; and for APCDD1, LoVo cells and SW480 cells are included. Alternatively, whether or not the subject polypeptide is functionally equivalent to PPIL1 can also be determined by detecting its ability to bind to SNW1 or stathmin.

所定のタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを作製するための方法は当業者に周知であり、これにはタンパク質に変異を導入する既知の方法が含まれる。例えば、当業者は、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドを、これらのタンパク質のいずれかのアミノ酸配列に部位特異的突然変異誘発法によって適切な変異を導入することによって作製することができる（Hashimoto-Gotohら、Gene 152: 271-275 (1995)；ZollerおよびSmith、Methods Enzymol 100: 468-500 (1983)；Kramerら、Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)；KramerおよびFritz、Methods Enzymol 154: 350-367 (1987)；Kunkel、Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-492 (1985)；Kunkel、Methods Enzymol 85: 2763-2766 (1988)）。アミノ酸変異は自然下でも起こりうる。その結果生じる変異ポリペプチドがヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等であるという前提で、1つまたは複数のアミノ酸が変異したヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が本発明のポリペプチドに含まれる。このような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般に10アミノ酸またはそれ未満、好ましくは6アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは3アミノ酸またはそれ未満である。   Methods for producing polypeptides that are functionally equivalent to a given protein are well known to those of skill in the art and include known methods for introducing mutations into proteins. For example, those skilled in the art introduce polypeptides that are functionally equivalent to the human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein by site-directed mutagenesis into the amino acid sequence of any of these proteins. (Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152: 271-275 (1995); Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456) (1984); Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-367 (1987); Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-492 (1985); Kunkel, Methods Enzymol 85: 2763-2766 (1988)). Amino acid mutations can occur naturally. The amino acid sequence of the human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein with one or more amino acids mutated, provided that the resulting mutant polypeptide is functionally equivalent to the human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein The polypeptide of the present invention is included in the polypeptide of the present invention. The number of amino acids to be mutated in such variants is generally 10 amino acids or less, preferably 6 amino acids or less, more preferably 3 amino acids or less.

変異タンパク質、またはある特定のアミノ酸配列の1つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/もしくは付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である改変タンパク質は、元の生物学的活性を保つことが知られている（Markら、Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-5666 (1984)；ZollerおよびSmith、Nucleic Acids Res 10: 6487-6500 (1982)；Dalbadie-McFarlandら、Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。   A modified protein that is a mutant protein or a protein having an amino acid sequence modified by substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or more amino acid residues of a particular amino acid sequence is the original biological Known to preserve activity (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-5666 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-6500 (1982); Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)).

変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存される別のアミノ酸に変異させることが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られる方法）。アミノ酸側鎖の特性の例には、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、および、以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖がある：脂肪族側鎖（G、A、V、L、I、P）；水酸基含有側鎖（S、T、Y）；硫黄原子含有側鎖（C、M）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（D、N、E、Q）；塩基含有側鎖（R、K、H）；および芳香族含有側鎖（H、F、Y、W）。括弧内の文字はアミノ酸の一文字略号を示すことに注意されたい。   The amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain (a method known as conservative amino acid substitution). Examples of amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T) and side chains having the following functional groups or characteristics in common: aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P); hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y); sulfur atom-containing side chains (C, M); carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q); base-containing side chains (R, K, H); Group-containing side chains (H, F, Y, W). Note that letters in parentheses indicate single letter abbreviations for amino acids.

ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のアミノ酸配列に1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドの一例は、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質を含む融合タンパク質である。融合タンパク質とは、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と他のペプチドまたはタンパク質との融合物のことであり、これは本発明に含まれる。融合タンパク質は、本発明のヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするDNAを他のペプチドまたはタンパク質をコードするDNAとフレームが合致するように連結し、この融合DNAを発現ベクターに挿入して、それを宿主において発現させるといった当業者に周知の技法によって作製しうる。本発明のタンパク質と融合させるペプチドまたはタンパク質には制限はない。   An example of a polypeptide in which one or more amino acid residues are added to the amino acid sequence of human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein is a fusion protein containing human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein. A fusion protein is a fusion of a human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein with another peptide or protein, and is included in the present invention. The fusion protein is obtained by ligating DNA encoding the human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein of the present invention in frame with DNA encoding another peptide or protein, and inserting the fusion DNA into an expression vector. And can be produced by techniques well known to those skilled in the art, such as expressing it in a host. There is no limitation on the peptide or protein to be fused with the protein of the present invention.

本発明のタンパク質と融合させるペプチドとして用いうる既知のペプチドには、例えば、FLAG（Hoppら、Biotechnology 6: 1204-1210 (1988)）、6個のHis（ヒスチジン）残基を含む6xHis、10xHis、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-myc断片、VSP-GP断片、p18HIV断片、T7タグ、HSVタグ、Eタグ、SV40T抗原断片、lckタグ、α-チューブリン断片、Bタグ、プロテインC断片などが含まれる。本発明のタンパク質と融合させうるタンパク質の例には、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（HA）、免疫グロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）などが含まれる。   Known peptides that can be used as peptides to be fused with the protein of the present invention include, for example, FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-1210 (1988)), 6xHis, 6xHis containing 6 His (histidine) residues, Influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSP-GP fragment, p18HIV fragment, T7 tag, HSV tag, E tag, SV40T antigen fragment, lck tag, α-tubulin fragment, B tag, protein C fragment, etc. Is included. Examples of proteins that can be fused with the protein of the present invention include GST (glutathione-S-transferase), influenza agglutinin (HA), immunoglobulin constant region, β-galactosidase, MBP (maltose binding protein) and the like.

融合タンパク質は、上に考察したように融合ペプチドまたはタンパク質をコードする市販のDNAと、本発明のポリペプチドをコードするDNAとを融合させ、作製された融合DNAを発現させることによって作製しうる。   A fusion protein can be made by fusing a commercially available DNA encoding a fusion peptide or protein with a DNA encoding a polypeptide of the present invention and expressing the prepared fusion DNA, as discussed above.

機能的に同等なポリペプチドを単離するための当技術分野で知られた代替的な方法には、例えば、ハイブリダイゼーション法を用いる方法がある（Sambrookら、「Molecular Cloning」第2版、9.47-9.58、Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)）。当業者は、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするDNA配列（すなわち、配列番号：1、3、5、または7）の全体または部分に対して高い相同性を有するDNAを容易に単離して、単離されたDNAからヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドを単離することができる。本発明のポリペプチドには、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするDNA配列の全体または部分とハイブリダイズするDNAによってコードされ、そしてヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、ヒト由来のタンパク質に対応する哺乳動物相同体（例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシの遺伝子によってコードされるポリペプチド）が含まれる。ヒトWDRPUHタンパク質をコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、精巣からの組織を用いることが特に好ましい。また、ヒトKRZFPUHをコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、胎盤または精巣からの組織を用いることが特に好ましい。さらに、ヒトPPIL1タンパク質をコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、心臓、骨格筋、精巣、甲状腺、または副腎からの組織を用いることが特に好ましく；ヒトAPCDD1タンパク質をコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、心臓、膵臓、前立腺、卵巣、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、または末梢白血球からの組織を用いることが好ましく、特に好適には、心臓、膵臓、前立腺、または卵巣からの組織が用いられる。   Alternative methods known in the art for isolating functionally equivalent polypeptides include, for example, those using hybridization methods (Sambrook et al., “Molecular Cloning” 2nd edition, 9.47. -9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)). One skilled in the art can readily generate DNA with high homology to all or part of a DNA sequence encoding human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein (ie, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7). Once isolated, a polypeptide functionally equivalent to the human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein can be isolated from the isolated DNA. Polypeptides of the invention are encoded by DNA that hybridizes with all or part of the DNA sequence encoding human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein and are functional with human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein Equivalent polypeptides are included. These polypeptides include mammalian homologues corresponding to human-derived proteins (eg, polypeptides encoded by monkey, rat, rabbit, and bovine genes). When isolating a cDNA highly homologous to DNA encoding human WDRPUH protein from an animal, it is particularly preferable to use tissue from the testis. In addition, when a cDNA highly homologous to DNA encoding human KRZFPUH is isolated from an animal, it is particularly preferable to use tissue from placenta or testis. Furthermore, it is particularly preferred to use tissue from the heart, skeletal muscle, testis, thyroid or adrenal gland when isolating a cDNA highly homologous to the DNA encoding human PPIL1 protein from animals; human APCDD1 When isolating cDNAs that are highly homologous to protein-encoding DNA from animals, tissue from the heart, pancreas, prostate, ovary, lung, liver, kidney, spleen, thymus, colon, or peripheral leukocytes It is preferred to use, particularly preferably tissue from the heart, pancreas, prostate or ovary.

ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって慣行的に選択されうる。例えば、30分間またはそれ以上にわたる68℃でのプレハイブリダイゼーションを「Rapid-hyb緩衝液」（アマシャムライフサイエンス（Amersham LIFE SCIENCE））を用いて行い、標識したプローブを添加した上で、1時間またはそれ以上にわたって68℃で加温することによって、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。それに続く洗浄段階は、例えば、低ストリンジェント条件下で行いうる。低ストリンジェント条件とは、例えば、42℃、2X SSC、0.1％SDS、または好ましくは50℃、2X SSC、0.1％SDSのことである。より好ましくは、高ストリンジェント条件を用いる。高ストリンジェント条件とは、例えば、室温の2X SSC、0.01％SDS中での20分間の洗浄を3回行った後に、37℃の1x SSC、0.1％SDS中での20分間の洗浄を3回行い、50℃の1x SSC、0.1％SDS中での20分間の洗浄を2回行うことである。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼすと考えられ、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要因を適切に選択することができる。   Hybridization conditions for isolating DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to the human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein can be routinely selected by those skilled in the art. For example, prehybridization at 68 ° C. for 30 minutes or longer is performed using “Rapid-hyb buffer” (Amersham LIFE SCIENCE) for 1 hour or after adding a labeled probe. Hybridization may be performed by heating at 68 ° C. for more than that. Subsequent washing steps can be performed, for example, under low stringent conditions. Low stringency conditions are, for example, 42 ° C, 2X SSC, 0.1% SDS, or preferably 50 ° C, 2X SSC, 0.1% SDS. More preferably, high stringency conditions are used. High stringency conditions include, for example, three 20-minute washes in 2X SSC and 0.01% SDS at room temperature, followed by three 20-minute washes in 1x SSC and 0.1% SDS at 37 ° C. Perform two 20 minute washes in 1x SSC, 0.1% SDS at 50 ° C. However, several factors such as temperature and salt concentration are thought to affect the stringency of hybridization and those skilled in the art can appropriately select these factors to obtain the required stringency.

ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを、タンパク質をコードするDNAの配列情報（配列番号：1、3、5、または7）に基づいて合成したプライマーを用いて単離するために用いることもできる。   Instead of hybridization, gene amplification methods, such as the polymerase chain reaction (PCR) method, can be used to convert a DNA encoding a polypeptide functionally equivalent to the human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein to the DNA encoding the protein. It can also be used to isolate using primers synthesized based on sequence information (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7).

以上のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法によって単離されたDNAによってコードされる、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドは、通常、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは一般に、40％またはそれ以上、好ましくは60％またはそれ以上、より好ましくは80％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を指す。ポリペプチドの相同性は、「WilburおよびLipman、Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-730 (1983)」中のアルゴリズムに従って決定することができる。   Polypeptides functionally equivalent to human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein encoded by DNA isolated by the above hybridization method or gene amplification method are usually human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or High homology to the amino acid sequence of APCDD1 protein. “High homology” generally refers to a homology of 40% or higher, preferably 60% or higher, more preferably 80% or higher, even more preferably 95% or higher. Polypeptide homology can be determined according to the algorithm in “Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-730 (1983)”.

本発明のポリペプチドは、その産生のために用いる細胞もしくは宿主または用いる精製方法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に関して差異があってもよい。しかし、それが本発明のヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質のポリペプチドと同等な機能を有する限り、それは本発明の範囲に含まれる。   The polypeptides of the present invention may differ in terms of amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence or absence of sugar chains, or form, depending on the cell or host used for production or the purification method used. However, as long as it has a function equivalent to the polypeptide of human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein of the present invention, it is within the scope of the present invention.

本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法により、組換えタンパク質として調製することもでき、または天然タンパク質として調製することもできる。組換えタンパク質は、本発明のポリペプチドをコードするDNA（例えば、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列を含むDNA）を適切な発現ベクターに挿入し、そのベクターを適切な宿主細胞に導入して抽出物を入手した上で、抽出物をクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、もしくは本発明のタンパク質に対する抗体を固定したカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにかけることによって、または上述のカラムの複数を組み合わせることによってポリペプチドを精製することにより、調製することができる。   The polypeptides of the present invention can be prepared as recombinant proteins or natural proteins by methods well known to those skilled in the art. The recombinant protein is obtained by inserting DNA encoding the polypeptide of the present invention (for example, DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) into an appropriate expression vector, and inserting the vector into an appropriate host After obtaining the extract by introduction into cells, the extract is subjected to chromatography, such as ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration, or affinity chromatography using a column immobilized with an antibody against the protein of the present invention. It can be prepared by purifying the polypeptide by applying or by combining a plurality of the above-mentioned columns.

同様に、本発明のポリペプチドを宿主細胞（例えば、動物細胞および大腸菌）の内部でグルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、または多数のヒスチジンを追加した組換えタンパク質として発現させる場合には、発現した組換えタンパク質をグルタチオンカラムまたはニッケルカラムを用いて精製することができる。また、本発明のポリペプチドをc-myc、多数のヒスチジン、またはFLAGで標識したタンパク質として発現させる場合には、それぞれc-myc、His、またはFLAGに対する抗体を用いてそれを検出して精製することができる。   Similarly, when expressing the polypeptide of the present invention as a fusion protein with a glutathione-S-transferase protein in a host cell (eg, animal cell and E. coli) or as a recombinant protein supplemented with a large number of histidines. The expressed recombinant protein can be purified using a glutathione column or a nickel column. In addition, when the polypeptide of the present invention is expressed as a protein labeled with c-myc, many histidines, or FLAG, it is detected and purified using an antibody against c-myc, His, or FLAG, respectively. be able to.

融合タンパク質を精製した後に、必要に応じてトロンビンまたは第Xa因子で切断することにより、目的のポリペプチド以外の領域を除外することも可能である。   After purifying the fusion protein, it is possible to exclude regions other than the target polypeptide by cleaving with thrombin or factor Xa as necessary.

天然のタンパク質は、当業者に知られた方法によって、例えば、下記のWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と結合する抗体を結合させたアフィニティーカラムを、本発明のポリペプチドを発現する組織または細胞の抽出物と接触させることによって単離することができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。   The natural protein can be obtained by a method known to those skilled in the art, for example, by adding an affinity column bound with an antibody that binds to the following WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein to a tissue or cell expressing the polypeptide of the present invention. Can be isolated by contact with an extract of The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.

本発明はまた、本発明のポリペプチドの部分（partial）ペプチドも含む。部分ペプチドは、本発明のポリペプチドに対して特異的なアミノ酸配列を有し、少なくとも7アミノ酸、好ましくは8アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは9アミノ酸またはそれ以上からなる。部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体を作製するために、本発明のポリペプチドと結合する化合物をスクリーニングするために、および本発明のポリペプチドの促進物質または阻害物質をスクリーニングするために、用いることができる。   The present invention also includes partial peptides of the polypeptides of the present invention. The partial peptide has an amino acid sequence specific to the polypeptide of the present invention, and consists of at least 7 amino acids, preferably 8 amino acids or more, more preferably 9 amino acids or more. The partial peptide is used, for example, to produce an antibody against the polypeptide of the present invention, to screen for a compound that binds to the polypeptide of the present invention, and to screen for a promoter or inhibitor of the polypeptide of the present invention. Can be used.

本発明の部分ペプチドは、遺伝子操作により、既知のペプチド合成方法により、または本発明のポリペプチドを適切なペプチダーゼで消化することにより、作製可能である。ペプチド合成のためには、例えば、固相合成または液相合成を用いうる。   The partial peptide of the present invention can be produced by genetic manipulation, by a known peptide synthesis method, or by digesting the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidase. For peptide synthesis, for example, solid phase synthesis or liquid phase synthesis can be used.

さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドは、上記のように本発明のポリペプチドのインビボもしくはインビトロでの産生のために用いることができ、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的異常に起因する疾患に対する遺伝子治療のために用いることもできる。mRNA、RNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成されたポリヌクレオチドを含む、本発明のポリヌクレオチドのいかなる形態を、それが本発明のポリペプチドをコードする限りは、用いることができる。本発明のポリヌクレオチドには、所定のヌクレオチド配列を含むDNAのほかに、その縮重配列も、結果として生じるDNAが本発明のポリペプチドをコードする限りは、含まれる。   Furthermore, the present invention also provides a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention. The polynucleotide of the present invention can be used for in vivo or in vitro production of the polypeptide of the present invention as described above, or a gene for a disease caused by a genetic abnormality of a gene encoding the protein of the present invention. It can also be used for treatment. Any form of the polynucleotide of the present invention can be used, including mRNA, RNA, cDNA, genomic DNA, chemically synthesized polynucleotides, as long as it encodes a polypeptide of the present invention. In addition to DNA containing a predetermined nucleotide sequence, the polynucleotide of the present invention includes its degenerate sequence as long as the resulting DNA encodes the polypeptide of the present invention.

本発明のポリヌクレオチドは、当業者に知られた方法によって作製することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを発現する細胞からcDNAライブラリーを作製し、本発明のDNA（例えば、配列番号：1、3、5、または7）の部分配列をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行うことによって作製することができる。cDNAライブラリーは、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載された方法によって作製しうる；または、市販のcDNAライブラリーを用いてもよい。cDNAライブラリーは、本発明のポリペプチドを発現する細胞からRNAを抽出し、本発明のDNA（例えば、配列番号：1、3、5、または7）の配列に基づいてオリゴDNAを合成し、オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、そして本発明のタンパク質をコードするcDNAを増幅することによって作製することもできる。   The polynucleotide of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, for the polynucleotide of the present invention, a cDNA library is prepared from cells expressing the polypeptide of the present invention, and a partial sequence of the DNA of the present invention (eg, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) is probed. And can be prepared by performing hybridization. A cDNA library can be prepared, for example, by the method described in Sambrook et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); or a commercially available cDNA library may be used. A cDNA library extracts RNA from cells expressing the polypeptide of the present invention, synthesizes oligo DNA based on the sequence of the DNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7), It can also be prepared by performing PCR using oligo DNA as a primer and amplifying cDNA encoding the protein of the present invention.

さらに、得られたcDNAのヌクレオチドのシークエンシングを行うことにより、cDNAによりコードされる翻訳領域を慣行的に決定し、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を容易に得ることができる。その上、得られたcDNAまたはその部分を用いてゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。   Furthermore, by sequencing the nucleotide of the obtained cDNA, the translation region encoded by the cDNA can be routinely determined, and the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention can be easily obtained. Moreover, genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA or a portion thereof.

より具体的には、mRNAをまず、本発明の対象ポリペプチドが発現される細胞、組織または臓器（例えば、WDRPUHの場合は精巣；KRZFPUHの場合は胎盤または精巣；PPIL1の場合は心臓、骨格筋、精巣、甲状腺または副腎；そしてAPCDD1の場合は心臓、膵臓、前立腺、卵巣、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸または末梢白血球、好ましくは心臓、膵臓、前立腺または卵巣）から調製する。mRNAの単離には既知の方法が使用でき；例えば、全RNAはグアニジン超遠心（Chirgwinら、Biochemistry 18：5294-5299 (1979)）またはAGPC法（ChomczynskiおよびSacchi、Anal Biochem 162：156-159 (1987)）によって調製できる。さらに、mRNAをmRNA精製キット（ファルマシア（Pharmacia））などを用いて全RNAから精製する、またはmRNAをQuickPrep mRNA精製キット（ファルマシア）によって直接精製することもできる。   More specifically, mRNA is first converted into cells, tissues or organs in which the polypeptide of the present invention is expressed (eg, testis in the case of WDRPUH; placenta or testis in the case of KRZFPUH; heart, skeletal muscle in the case of PPIL1) Testis, thyroid or adrenal gland; and in the case of APCDD1, heart, pancreas, prostate, ovary, lung, liver, kidney, spleen, thymus, colon or peripheral leukocytes, preferably heart, pancreas, prostate or ovary). Known methods can be used to isolate mRNA; for example, total RNA can be obtained from guanidine ultracentrifugation (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294-5299 (1979)) or AGPC method (Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem 162: 156-159). (1987)). Furthermore, mRNA can be purified from total RNA using an mRNA purification kit (Pharmacia) or the like, or mRNA can be directly purified using a QuickPrep mRNA purification kit (Pharmacia).

得られたmRNAは、逆転写酵素を用いてcDNAを合成するために用いられる。cDNAは、AMV逆転写酵素第一鎖cDNA合成キット（生化学工業（Seikagaku Kogyo））などの市販のキットを用いて精製しうる。または、本明細書に記載のプライマー等、5'-Ampli FINDER RACEキット（クロンテック（Clontech））、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる5'-RACE法（Frohmanら、Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988)；Belyavskyら、Nucleic Acids Res 17: 2919-2932 (1989)）に従って、cDNAの合成および増幅を行うこともできる。   The obtained mRNA is used to synthesize cDNA using reverse transcriptase. cDNA can be purified using a commercially available kit such as an AMV reverse transcriptase first strand cDNA synthesis kit (Seikagaku Kogyo). Alternatively, the primers described herein, 5′-Ampli FINDER RACE kit (Clontech), and 5′-RACE method using polymerase chain reaction (PCR) (Frohman et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky et al., Nucleic Acids Res 17: 2919-2932 (1989)) can also be used to synthesize and amplify cDNA.

所望のDNA断片をPCR産物から調製し、ベクターDNAと連結する。この組換えベクターを大腸菌などの形質転換に用い、選択したコロニーから所望の組換えベクターを調製する。所望のDNAのヌクレオチド配列を、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（dideoxynucleotide chain termination）などの従来の方法によって検証する。   A desired DNA fragment is prepared from the PCR product and ligated with vector DNA. This recombinant vector is used for transformation of E. coli and the like, and a desired recombinant vector is prepared from the selected colony. The nucleotide sequence of the desired DNA is verified by conventional methods such as dideoxynucleotide chain termination.

本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、発現のために用いる宿主におけるコドン使用頻度を考慮に入れることにより、より効率的に発現されるように設計することもできる（Granthamら、Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981)）。本発明のポリヌクレオチドの配列を、市販のキットまたは従来の方法によって改変することもできる。例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドもしくは適切なポリヌクレオチド断片の挿入、リンカーの付加、または開始コドン（ATG）および/もしくは終止コドン（TAA、TGAまたはTAG）の挿入によって配列を改変することができる。   The nucleotide sequence of the polynucleotides of the invention can also be designed to be expressed more efficiently by taking into account the codon usage in the host used for expression (Grantham et al., Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981)). The sequence of the polynucleotide of the present invention can also be modified by a commercially available kit or a conventional method. For example, modifying the sequence by digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides or appropriate polynucleotide fragments, addition of linkers, or insertion of start codons (ATG) and / or stop codons (TAA, TGA or TAG) it can.

具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列を含むDNAを含む。   Specifically, the polynucleotide of the present invention comprises DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7.

さらに、本発明は、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記の本発明のWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。当業者はストリンジェントな条件を適切に選択してよい。例えば、低ストリンジェント条件を用いることができる。より好ましくは、高ストリンジェント条件を用いる。これらの条件は上記のものと同じである。上記のハイブリダイズさせるDNAはcDNAまたは染色体DNAであることが好ましい。   Furthermore, the present invention relates to a WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein of the present invention that hybridizes with a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 under stringent conditions. A polynucleotide encoding a polypeptide functionally equivalent to is provided. Those skilled in the art may appropriately select stringent conditions. For example, low stringency conditions can be used. More preferably, high stringency conditions are used. These conditions are the same as described above. The DNA to be hybridized is preferably cDNA or chromosomal DNA.

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが内部に挿入されたベクターも提供する。本発明のベクターは、宿主細胞において本発明のポリヌクレオチド、特にDNAに本発明のポリペプチドを発現させるため、または本発明のポリヌクレオチドを遺伝子治療の目的で投与するために有用である。   The present invention also provides a vector having the polynucleotide of the present invention inserted therein. The vector of the present invention is useful for expressing the polypeptide of the present invention in the polynucleotide of the present invention, particularly DNA, in a host cell, or for administering the polynucleotide of the present invention for the purpose of gene therapy.

大腸菌が宿主細胞であって、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blue）の内部で大量に増幅および産生させる場合には、ベクターは、大腸菌内で増幅させるための「ori」、および、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤によって選択される薬剤抵抗性遺伝子）を有する必要がある。例えば、M13シリーズのベクター、pUCシリーズのベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどを用いることができる。さらに、上記のベクター同様、pGEM-T、pDIRECT、およびpT7も、cDNAのサブクローニングおよび抽出のために用いることができる。本発明のタンパク質の産生のためにベクターを用いる場合には、発現ベクターが特に有用である。例えば、大腸菌内で発現させようとする発現ベクターは、大腸菌内で増幅させるための上記の特徴を有する必要がある。JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blueなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現しうるプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら、Nature 341: 544-546 (1989)；FASEB J 6: 2422-2427 (1992)）、araBプロモーター（Betterら、Science 240: 1041-1043 (1988)）、またはT7プロモーターなどを有する必要がある。その点に関しては、例えば、pGEX-5X-1（ファルマシア）、「QIAexpressシステム」（キアゲン（Qiagen））、pEGFPおよびpET（この場合、宿主はT7RNAポリメラーゼを発現するBL21であることが好ましい）を上記のベクターの代わりに用いてもよい。さらに、ベクターは、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列をも含みうる。大腸菌の周辺質（periplasm）へのポリペプチド分泌を指令するシグナル配列の一例は、pelBシグナル配列（Leiら、J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入するための手段には、例えば、塩化カルシウム法および電気穿孔法が含まれる。   If E. coli is the host cell and the vector is amplified and produced in large quantities within E. coli (eg, JM109, DH5α, HB101, or XL1Blue), the vector is “ori” for amplification in E. coli, In addition, it is necessary to have a marker gene (for example, a drug resistance gene selected by a drug such as ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol) for selecting transformed E. coli. For example, M13 series vectors, pUC series vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like can be used. Furthermore, like the above vectors, pGEM-T, pDIRECT, and pT7 can also be used for cDNA subcloning and extraction. Expression vectors are particularly useful when using vectors for the production of the proteins of the invention. For example, an expression vector to be expressed in E. coli must have the above characteristics for amplification in E. coli. When E. coli such as JM109, DH5α, HB101, or XL1Blue is used as a host cell, the vector can be a promoter that can efficiently express a desired gene in E. coli, such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature 341: 544). -546 (1989); FASEB J 6: 2422-2427 (1992)), araB promoter (Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988)), or T7 promoter. In this regard, for example, pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP and pET (in this case, preferably the host is BL21 expressing T7 RNA polymerase). It may be used in place of the vector. In addition, the vector may include a signal sequence for polypeptide secretion. An example of a signal sequence that directs polypeptide secretion into the periplasm of E. coli is the pelB signal sequence (Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Means for introducing the vector into the target host cell include, for example, the calcium chloride method and the electroporation method.

大腸菌以外に、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（インビトロジェン（Invitrogen）)およびpEGF-BOS（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Bac-to-Bacバキュロウイルス発現系」（ギブコBRL（GIBCO BRL））、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えば、pMH1、pMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia発現キット」（インビトロジェン）、pNV11、SP-Q01）、および枯草菌（Bacillus subtilis）由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）を、本発明のポリペプチドの産生のために用いることもできる。   In addition to E. coli, for example, mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (Invitrogen) and pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18 (17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), insect cell-derived Expression vectors (eg, “Bac-to-Bac baculovirus expression system” (Gibco BRL (GIBCO BRL)), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIpneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression Kit” (Invitrogen), pNV11, SP-Q01), and Bacillus subtilis Derived expression vectors (eg, pPL608, pKTH50) can also be used for production of the polypeptides of the invention.

ベクターをCHO細胞、COS細胞またはNIH3T3細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターは、この種の細胞における発現のために必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター（Mulliganら、Nature 277: 108 (1979)）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら、Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、CMVプロモーターなどを有する必要があるほか、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬剤（例えば、ネオマイシン、G418）によって選択される薬剤抵抗性遺伝子）を有することが好ましい。これらの特徴を備えた既知のベクターの例には、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。   In order for a vector to be expressed in animal cells such as CHO cells, COS cells or NIH3T3 cells, the vector must be a promoter required for expression in this type of cell, eg the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), MMLV-LTR promoter, EF1α promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), CMV promoter and the like, and a marker gene for selecting a transformant (for example, It is preferable to have a drug (for example, a drug resistance gene selected by neomycin, G418). Examples of known vectors with these characteristics include, for example, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.

さらに、本方法を、遺伝子を安定的に発現させるため、およびそれと同時に、細胞内の遺伝子のコピー数を増幅するために用いることもできる。例えば、相補的DHFR遺伝子を含むベクター（例えば、pCHO I）を、核酸合成経路が欠失したCHO細胞に導入した後に、メトトレキサート（MTX）によって増幅することができる。さらに、遺伝子の一過性発現の場合には、SV40の複製起点を含むベクター（pcDなど）を、SV40T抗原を発現する遺伝子を染色体上に含むCOS細胞に形質転換導入する方法を用いることができる。   Furthermore, the method can also be used to stably express a gene and at the same time to amplify the copy number of the gene in the cell. For example, a vector containing a complementary DHFR gene (eg, pCHO I) can be amplified by methotrexate (MTX) after introduction into a CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway. Furthermore, in the case of transient expression of a gene, a method of transforming a vector containing an SV40 origin of replication (such as pcD) into COS cells containing a gene expressing the SV40T antigen on the chromosome can be used. .

以上のようにして得られた本発明のポリペプチドは、宿主細胞の内部または外部（培地など）から単離して、実質的に純粋な均一なポリペプチドとして精製することができる。所定のポリペプチドに言及して本明細書で用いられる「実質的に純粋な」とは、そのポリペプチドが他の生体高分子から実質的に遊離していることを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量にして純度が少なくとも75％（例えば、少なくとも80、85、95または99％）である。純度は任意の適切な標準的方法により、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定しうる。ポリペプチドの単離および精製のための方法は何らかの特定の方法には限定されない；実際には任意の標準的な方法を用いうる。   The polypeptide of the present invention obtained as described above can be isolated from the inside or outside of a host cell (such as a medium) and purified as a substantially pure homogeneous polypeptide. “Substantially pure” as used herein with reference to a given polypeptide means that the polypeptide is substantially free from other biopolymers. A substantially pure polypeptide is at least 75% pure (eg, at least 80, 85, 95 or 99%) by dry weight. Purity can be measured by any appropriate standard method, for example, by column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, or HPLC analysis. Methods for polypeptide isolation and purification are not limited to any particular method; in practice any standard method may be used.

例えば、カラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、および再結晶化を適切に選択し、組み合わせて、ポリペプチドの単離および精製を行ってもよい。   For example, appropriate selection of column chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, and recrystallization In combination, the polypeptide may be isolated and purified.

クロマトグラフィーの例には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual」、Daniel R. Marshakら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。これらのクロマトグラフィーを、HPLCおよびFPLCなどの液体クロマトグラフィーによって行ってもよい。したがって、本発明は、以上の方法によって調製された高純度のポリペプチドを提供する。   Examples of chromatography include, for example, affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. ("Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual ", edited by Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). These chromatographies may be performed by liquid chromatography such as HPLC and FPLC. Therefore, the present invention provides a high purity polypeptide prepared by the above method.

本発明のポリペプチドを、精製の前または後に適切なタンパク質修飾酵素でそれを処理することにより、随意に改変すること、または部分的に欠失させることも可能である。有用なタンパク質修飾酵素には、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、タンパク質キナーゼ、グルコシダーゼなどが非制限的に含まれる。   The polypeptide of the invention can optionally be altered or partially deleted by treating it with an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. Useful protein modifying enzymes include, but are not limited to, trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase and the like.

本発明は、本発明のポリペプチドと結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、これにはウサギなどの動物を本発明のポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えによって作製されたヒト化抗体が含まれる。   The present invention provides antibodies that bind to the polypeptides of the present invention. The antibodies of the present invention can be used in any form such as monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, including antisera obtained by immunizing animals such as rabbits with the polypeptides of the present invention, all classes of polyclonals. Antibodies and monoclonal antibodies, human antibodies, and humanized antibodies produced by genetic recombination are included.

抗体を得るための抗原として用いられる本発明のポリペプチドは、任意の動物種に由来するものでよいが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のポリペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチドまたはアミノ酸配列から入手しうる。   The polypeptide of the present invention used as an antigen for obtaining an antibody may be derived from any animal species, but is preferably derived from a mammal such as a human, mouse, or rat, more preferably from a human. Human-derived polypeptides can be obtained from the nucleotide or amino acid sequences disclosed herein.

本発明によれば、免疫化抗原として用いるポリペプチドは、完全タンパク質でもよく、またはタンパク質の部分ペプチドでもよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドのアミノ（N）末端またはカルボキシ（C）末端断片を含みうる。本明細書において、抗体は、本発明のポリペプチドの完全長または断片のいずれかと反応するタンパク質として定義される。   According to the present invention, the polypeptide used as the immunizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein. The partial peptide can include, for example, an amino (N) -terminal or carboxy (C) -terminal fragment of the polypeptide of the present invention. As used herein, an antibody is defined as a protein that reacts with either the full length or a fragment of a polypeptide of the invention.

本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を既知の発現ベクターに挿入し、その後に本明細書に記載したような宿主細胞の形質転換に用いてもよい。所望のポリペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法によって宿主細胞の内部または外部から回収し、後に抗原として用いることができる。または、ポリペプチドを発現する細胞全体もしくはその可溶化物、または化学合成したポリペプチドを抗原として用いてもよい。   A gene encoding the polypeptide of the present invention or a fragment thereof may be inserted into a known expression vector and subsequently used for transformation of a host cell as described herein. The desired polypeptide or fragment thereof can be recovered from the inside or outside of the host cell by any standard method and later used as an antigen. Alternatively, whole cells expressing the polypeptide or a lysate thereof, or a chemically synthesized polypeptide may be used as the antigen.

いかなる哺乳動物も抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯類（Rodentia）、ウサギ目（Lagomorpha）、または霊長類（Primate）の動物が用いられる。齧歯類の動物には、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長類の動物には、例えば、狭鼻猿類（Catarrhini）（旧世界サル）のサル、カニクイザル（Macaca fascicularis）、アカゲザル、マントヒヒ（sacred baboon）およびチンパンジーが含まれる。   Any mammal can be immunized with the antigen, but preferably the compatibility with the parental cell used for cell fusion is taken into account. In general, rodent, Lagomorpha, or primate animals are used. Rodent animals include, for example, mice, rats, and hamsters. Rabbit eyes include, for example, rabbits. Primate animals include, for example, the Catarrhini (Old World monkey) monkey, Macaca fascicularis, rhesus monkey, sacred baboon and chimpanzee.

動物を抗原で免疫するための方法は当技術分野で周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物の免疫化のための標準的な方法である。より具体的に述べると、抗原を希釈して適切な量のリン酸緩衝食塩水（PBS）、生理食塩水などの中に懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適切な量の標準的アジュバントと混合して乳濁液とした上で哺乳動物に対して投与してもよい。その後に、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原の投与を4〜21日毎に数回行うことが好ましい。適切な担体を免疫化のために用いてもよい。上記のような免疫化の後に、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法によって検討する。   Methods for immunizing animals with antigens are well known in the art. Intraperitoneal or subcutaneous injection of antigen is a standard method for immunization of mammals. More specifically, the antigen is diluted and suspended in an appropriate amount of phosphate buffered saline (PBS), physiological saline or the like. If desired, the antigen suspension may be mixed with an appropriate amount of a standard adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, to give an emulsion and administered to the mammal. Thereafter, administration of the antigen mixed with an appropriate amount of Freund's incomplete adjuvant is preferably performed several times every 4 to 21 days. A suitable carrier may be used for immunization. Following immunization as described above, sera are examined by standard methods for increasing amounts of the desired antibody.

本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を、血清中の所望の抗体の増加に関して検討した免疫後の哺乳動物から血液を採取し、従来の任意の方法によって血液から血清を分離することによって調製することもできる。ポリクローナル抗体にはポリクローナル抗体を含む血清が含まれ、ポリクローナル抗体を含む画分を血清から単離することもできる。免疫グロブリンGまたはMは、本発明のポリペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のポリペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインAカラムまたはプロテインGカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。   Polyclonal antibodies against the polypeptides of the present invention can also be prepared by collecting blood from immunized mammals examined for an increase in the desired antibody in the serum and separating the serum from the blood by any conventional method. it can. Polyclonal antibodies include serum containing polyclonal antibodies, and fractions containing polyclonal antibodies can also be isolated from the serum. Immunoglobulin G or M is obtained from a fraction that recognizes only the polypeptide of the present invention.For example, after using an affinity column to which the polypeptide of the present invention is bound, this fraction is divided into a protein A column or a protein G column. And can be further purified and prepared.

モノクローナル抗体を調製するためには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を収集し、上記の通りに血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は脾臓から入手することが好ましい。上記の免疫細胞と融合させるためのその他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞の選択のための獲得特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。   In order to prepare a monoclonal antibody, immune cells are collected from a mammal immunized with an antigen, checked for increased levels of the desired antibody in serum as described above, and subjected to cell fusion. Immune cells used for cell fusion are preferably obtained from the spleen. Other preferred parent cells for fusing with the above immune cells include, for example, mammalian myeloma cells, more preferably myeloma cells with acquired properties for selection of fusion cells with drugs.

上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、既知の方法、例えば、Milsteinら（GalfreおよびMilstein、Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って融合させることができる。   The above immune cells and myeloma cells can be fused according to known methods, for example, the method of Milstein et al. (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択しうる。細胞培養は通常、HAT培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である、数日間から数週間にわたって続けられる。その後に、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングおよびクローニングのために標準的な限界希釈を行う。   The resulting hybridomas by cell fusion can be selected by culturing them in a standard selective medium such as HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine). Cell culture is usually continued in HAT medium for days to weeks, a period sufficient for all other cells (non-fused cells) except the desired hybridoma to die. This is followed by standard limiting dilution for screening and cloning of hybridoma cells producing the desired antibody.

ハイブリドーマ調製用に非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、EBウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ポリペプチド、ポリペプチド発現細胞、またはそれらの可溶化物によりインビトロで免疫することもできる。続いて、免疫後のリンパ球を、無限に***しうるU266などのヒト由来の骨髄腫細胞と融合させ、ポリペプチドと結合しうる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭63-17688号）。   In addition to the above method of immunizing non-human animals with antigens for hybridoma preparation, human lymphocytes such as lymphocytes infected with EB virus are immunized in vitro with polypeptides, polypeptide-expressing cells, or lysates thereof. You can also Subsequently, lymphocytes after immunization can be fused with human-derived myeloma cells such as U266, which can divide indefinitely, to obtain hybridomas that produce the desired human antibody that can bind to the polypeptide (Japanese Patent Application Laid-Open (JP-A) No. 1993-263). Sho 63-17688).

得られたハイブリドーマを続いてマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインAもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のポリペプチドを結合させたアフィニティーカラムによって精製しうる。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても用いることができる。さらに、この抗体を、本発明のポリペプチドと関連のある疾患に対する抗体療法に適用することもできる。得られた抗体を人体に対して投与する場合には（抗体療法）、免疫原性を抑えるためにヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。   The obtained hybridoma is subsequently transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites is extracted. The obtained monoclonal antibody can be purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A or protein G column, DEAE ion exchange chromatography, or an affinity column to which the polypeptide of the present invention is bound. The antibody of the present invention can be used not only for purification and detection of the polypeptide of the present invention, but also as a candidate for agonists and antagonists of the polypeptide of the present invention. Furthermore, this antibody can also be applied to antibody therapy for diseases associated with the polypeptide of the present invention. When the obtained antibody is administered to the human body (antibody therapy), a human antibody or a humanized antibody is preferable in order to suppress immunogenicity.

例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物は、ポリペプチド、ポリペプチド発現細胞、またはそれらの可溶化物から選択される抗原で免疫することができる。続いて、抗体産生細胞を動物から採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、そのハイブリドーマからポリペプチドに対するヒト抗体を調製することができる（国際公開公報第92-03918号、国際公開公報第93-2227号、国際公開公報第94-02602号、国際公開公報第94-25585号、国際公開公報第96-33735号、および国際公開公報第96-34096号を参照のこと）。   For example, transgenic animals having a repertoire of human antibody genes can be immunized with an antigen selected from polypeptides, polypeptide-expressing cells, or lysates thereof. Subsequently, antibody-producing cells are collected from the animal, fused with myeloma cells to obtain a hybridoma, and a human antibody against the polypeptide can be prepared from the hybridoma (International Publication No. 92-03918, International Publication No. No. 93-2227, International Publication No. 94-02602, International Publication No. 94-25585, International Publication No. 96-33735, and International Publication No. 96-34096).

または、免疫したリンパ球のような、抗体を産生する免疫細胞を、癌遺伝子によって不死化させ、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。   Alternatively, immune cells that produce antibodies, such as immunized lymphocytes, can be immortalized by oncogenes and used to prepare monoclonal antibodies.

このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技術を用いて組換えにより調製してもよい（例えば、BorrebaeckおよびLarrick、「Therapeutic Monoclonal Antibodies」、MacMillan Publishers LTD（英国）より刊行(1990)、を参照）。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫リンパ球などの免疫細胞からクローニングして適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入し、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製した組換え抗体も提供する。   Monoclonal antibodies thus obtained may be prepared recombinantly using genetic engineering techniques (eg Borrebaeck and Larrick, “Therapeutic Monoclonal Antibodies”, published by MacMillan Publishers LTD (UK) (1990)). reference). For example, a DNA encoding an antibody can be cloned from an immune cell such as an antibody-producing hybridoma or immune lymphocyte, inserted into an appropriate vector, and introduced into a host cell to prepare a recombinant antibody. . The present invention also provides a recombinant antibody prepared as described above.

さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの1つまたは複数と結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはH鎖およびL鎖由来のFv断片を適切なリンカーによって連結した一本鎖Fv（scFv）であってもよい（Hustonら、Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-5883 (1988)）。より具体的に述べると、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって抗体断片を作製することもできる。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築して発現ベクターに挿入した上で、適切な宿主細胞において発現させてもよい（例えば、Coら、J Immunol 152: 2968-2976 (1994)；BetterおよびHorwitz、Methods Enzymol 178: 476-496 (1989)；PluckthunおよびSkerra、Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi、Methods Enzymol 121: 652-663 (1986)；Rousseauxら、Methods Enzymol 121: 663-669 (1986)；BirdおよびWalker、Trends Biotechnol 9: 132-137 (1991)を参照されたい）。 Furthermore, the antibody of the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody as long as it binds to one or more of the polypeptides of the present invention. For example, the antibody fragment may be a single chain Fv (scFv) in which Fab, F (ab ′) 2 , Fv, or Fv fragments derived from H and L chains are linked by an appropriate linker (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-5883 (1988)). More specifically, antibody fragments can be prepared by treating an antibody with an enzyme such as papain or pepsin. Alternatively, a gene encoding the antibody fragment may be constructed and inserted into an expression vector and expressed in a suitable host cell (eg, Co et al., J Immunol 152: 2968-2976 (1994); Better and Horwitz , Methods Enzymol 178: 476-496 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-663 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-669 (1986); see Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-137 (1991)).

抗体を、ポリエチレングリコール（PEG）などの種々の分子と結合させることによって修飾することもできる。本発明は、このような修飾抗体を提供する。修飾抗体は抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾方法は当技術分野で慣例的である。   Antibodies can also be modified by conjugation with various molecules such as polyethylene glycol (PEG). The present invention provides such modified antibodies. The modified antibody can be obtained by chemically modifying the antibody. These modification methods are routine in the art.

または、本発明の抗体を、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体の定常領域とのキメラ抗体として、または、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）および定常領域を含むヒト化抗体として入手することもできる。このような抗体は、既知の技術を用いて調製可能である。   Alternatively, the antibody of the present invention can be used as a chimeric antibody of a variable region derived from a non-human antibody and a constant region of a human antibody, or a complementarity determining region (CDR) derived from a non-human antibody, a framework region derived from a human antibody ( FR) and constant regions can also be obtained as humanized antibodies. Such antibodies can be prepared using known techniques.

以上のようにして得られた抗体を均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体を、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って分離および精製することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動など（しかし、これらには限定されない）を適切に選択・組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（「A Laboratory Manual」、HarlowおよびDavid Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムはアフィニティーカラムとして用いうる。用いられるプロテインAカラムの例には、例えば、ハイパーD、POROSおよびセファロースF.F.（ファルマシア）が含まれる。   The antibody obtained as described above may be purified to homogeneity. For example, antibodies can be separated and purified according to separation and purification methods used for common proteins. For example, column chromatography such as affinity chromatography, filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. (but not limited to) are appropriately selected and combined. Antibodies can be separated and isolated ("A Laboratory Manual", edited by Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Protein A columns and protein G columns can be used as affinity columns. Examples of protein A columns used include, for example, Hyper D, POROS and Sepharose F.F. (Pharmacia).

クロマトグラフィーの例には、アフィニティークロマトグラフィーを除いて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual」、Daniel R. Marshakら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィーの手順を、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって行うこともできる。   Examples of chromatography, excluding affinity chromatography, include, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. ("Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual ", edited by Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Chromatographic procedures can also be performed by liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.

本発明の抗体の抗原結合活性を測定するには、例えば、吸光度、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、酵素免疫アッセイ法（EIA）、放射免疫アッセイ法（RIA）および/または免疫蛍光検査法を用いうる。ELISAの場合には、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のポリペプチドをプレートに対して添加した後に、抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。続いて、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄の後に、p-ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加して、試料の抗原結合活性を評価するために吸光度を測定する。C末端断片またはN末端断片といったポリペプチドの断片を、ポリペプチドとして用いてもよい。BIAcore（ファルマシア）を、本発明による抗体の活性の評価に用いてもよい。   To measure the antigen binding activity of the antibody of the present invention, for example, absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA) and / or immunofluorescence test Can be used. In the case of ELISA, the antibody of the present invention is immobilized on a plate, the polypeptide of the present invention is added to the plate, and then a sample containing a desired antibody such as a culture supernatant of antibody-producing cells or a purified antibody is added. To do. Subsequently, a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase is added, and the plate is incubated. Next, after washing, an enzyme substrate such as p-nitrophenyl phosphate is added to the plate and the absorbance is measured to assess the antigen binding activity of the sample. Fragments of polypeptides such as C-terminal fragments or N-terminal fragments may be used as polypeptides. BIAcore (Pharmacia) may be used to assess the activity of the antibody according to the invention.

以上の方法は、本発明の抗体を本発明のポリペプチドを含むと想定される試料に対して曝露させ、抗体およびポリペプチドによって形成された免疫複合体を検出または測定することにより、本発明のポリペプチドの検出または測定を可能にする。   In the above method, the antibody of the present invention is exposed to a sample assumed to contain the polypeptide of the present invention, and the immune complex formed by the antibody and the polypeptide is detected or measured. Allows detection or measurement of polypeptides.

本発明によるポリペプチドの検出または測定の方法はポリペプチドを特異的に検出または測定することが可能であるため、本方法はポリペプチドが用いられる種々の実験に有用と思われる。   Since the method for detecting or measuring a polypeptide according to the present invention can specifically detect or measure a polypeptide, this method seems to be useful for various experiments in which the polypeptide is used.

本発明はまた、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号：1、3、5、または7）またはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするDNAと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが好ましい。本明細書で用いる「特異的にハイブリダイズする」という用語は、他のタンパク質のコードするDNAとのクロスハイブリダイゼーションが、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、顕著には起こらないことを意味する。このようなポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードするDNAまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズする、プローブ、プライマー、ヌクレオチド、およびヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム）が含まれる。さらに、このようなポリヌクレオチドをDNAチップの調製のために利用することもできる。   The present invention also includes a polynucleotide that hybridizes to a human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) or a complementary strand thereof and that comprises at least 15 nucleotides. provide. The polynucleotide of the present invention is preferably a polynucleotide that specifically hybridizes with DNA encoding the polypeptide of the present invention. As used herein, the term “specifically hybridizes” means that cross-hybridization with DNA encoded by other proteins is prominent under normal hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions. Means that it doesn't happen. Such polynucleotides include probes, primers, nucleotides, and nucleotide derivatives (eg, antisense oligonucleotides and ribozymes) that specifically hybridize to the DNA encoding the polypeptide of the invention or its complementary strand. It is. Furthermore, such polynucleotides can also be used for the preparation of DNA chips.

本発明は、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列の内部のいずれかの部位とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列のうち少なくとも15個の連続したヌクレオチドに対するものであることが好ましい。上記の少なくとも15個の連続したヌクレオチド中に1つの開始コドンを含む、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに好ましい。より具体的に述べると、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドには、WDRPUHの発現を抑制する目的で配列番号：16のヌクレオチド配列を；KRZFPUHの場合には配列番号：37のヌクレオチド配列を；PPIL1の場合には配列番号：44のヌクレオチド配列を；APCDD1の場合には配列番号：89のヌクレオチド配列を含むものが含まれる。   The present invention includes antisense oligonucleotides that hybridize to any site within the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7. Preferably, the antisense oligonucleotide is for at least 15 contiguous nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7. More preferred are antisense oligonucleotides as described above comprising one start codon in the at least 15 consecutive nucleotides. More specifically, such an antisense oligonucleotide has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 for the purpose of suppressing the expression of WDRPUH; the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 in the case of KRZFPUH; In the case of APCDD1, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 89.

アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることもできる。このような修飾産物の例には、メチルホスホネート型またはエチルホスホネート型などの低級アルキルホスホネート修飾物、ホスホロチオエート修飾物、およびホスホロアミデート修飾物が含まれる。   Derivatives or modified products of antisense oligonucleotides can also be used as antisense oligonucleotides. Examples of such modified products include lower alkyl phosphonate modifications such as methyl phosphonate or ethyl phosphonate types, phosphorothioate modifications, and phosphoramidate modifications.

本明細書で用いる「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、DNAまたはmRNAの特定領域を構成するものに対応するヌクレオチドが完全に相補的であるものだけでなく、1つまたは複数のヌクレオチドにミスマッチがあるものも、そのDNAまたはmRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズしうる限りは含まれる。   As used herein, the term “antisense oligonucleotide” refers to a mismatch in one or more nucleotides as well as those in which the nucleotides corresponding to those constituting a particular region of DNA or mRNA are completely complementary. Some are included so long as the DNA or mRNA and antisense oligonucleotide can specifically hybridize to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7.

このようなポリヌクレオチドは、「少なくとも15個の連続したヌクレオチド配列の領域」内に、少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を有するものとして含まれる。相同性の決定には本明細書に述べるアルゴリズムを用いうる。このようなポリヌクレオチドは、以下の実施例の項で述べるように、本発明のポリペプチドをコードするDNAの単離もしくは検出のためのプローブとして、または増幅用のプライマーとして有用である。   Such polynucleotides are within a “region of at least 15 contiguous nucleotide sequences”, at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably Included as having 95% or more homology. The algorithms described herein can be used to determine homology. Such polynucleotides are useful as probes for the isolation or detection of DNA encoding the polypeptides of the invention, or as primers for amplification, as described in the Examples section below.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ポリペプチドをコードするDNAまたはmRNAと結合し、その転写または翻訳を阻害して、mRNAの分解を促進し、本発明のポリペプチドの発現を阻害して、それによってポリペプチドの機能を阻害することにより、本発明のポリペプチドを産生する細胞に対して作用する。   The antisense oligonucleotide derivative of the present invention binds to DNA or mRNA encoding a polypeptide, inhibits its transcription or translation, promotes the degradation of mRNA, inhibits the expression of the polypeptide of the present invention, It thus acts on cells producing the polypeptide of the present invention by inhibiting the function of the polypeptide.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、誘導体に対して活性のない適した基材と混合することにより、リニメント剤または湿布剤などの外用製剤の形にすることができる。   The antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be formed into an external preparation such as a liniment or a poultice by mixing with a suitable base material that is not active against the derivative.

同様に、必要に応じて、誘導体を、賦形剤、等張剤、溶解補助剤、安定剤、保存料、鎮痛薬などを添加することにより、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻薬および凍結乾燥製剤として製剤化することもできる。これらは通常の方法に従って調製可能である。   Similarly, tablets, powders, granules, capsules, liposome capsules can be added as necessary by adding excipients, isotonic agents, solubilizers, stabilizers, preservatives, analgesics, etc. It can also be formulated as an agent, injection, liquid, nasal drop and lyophilized preparation. These can be prepared according to conventional methods.

アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、罹患部位に対して直接外用することにより、またはそれが罹患部位に到達するように血管内に注入することにより、患者に対して投与される。持続性および膜透過性を高めるためにアンチセンス用封入剤を用いることもできる。その例には、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチンまたはこれらの誘導体がある。   The antisense oligonucleotide derivative is administered to the patient either by topical application directly to the affected site or by infusion into the blood vessel so that it reaches the affected site. Antisense encapsulants can also be used to increase durability and membrane permeability. Examples include liposomes, poly-L-lysine, lipids, cholesterol, lipofectin or their derivatives.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に従って適切に調整した上で、望ましい量を用いることができる。例えば、0.1〜100mg/kg、好ましくは0.1〜50mg/kgの範囲の用量を投与することができる。   The dosage of the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be adjusted appropriately according to the patient's condition, and a desired amount can be used. For example, a dose in the range of 0.1-100 mg / kg, preferably 0.1-50 mg / kg can be administered.

本発明はまた、配列番号：1、3、5、または7のヌクレオチド配列のセンス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせを含む、低分子干渉RNA（siRNA）も含む。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子のことを指す。siRNAを細胞に導入するためには、RNAを転写するための鋳型としてDNAを用いることを含む、標準的な技法が用いられる。このsiRNAは、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質をコードするポリペプチド（配列番号：1、3、5、または7）のセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。siRNAは、例えばヘアピンのように、単一の転写物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を有するように構築される。   The invention also includes small interfering RNA (siRNA) comprising a combination of sense and antisense strand nucleic acids of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7. The term “siRNA” refers to a double-stranded RNA molecule that prevents translation of a target mRNA. Standard techniques are used to introduce siRNA into cells, including using DNA as a template to transcribe RNA. The siRNA includes a sense nucleic acid sequence and an antisense nucleic acid sequence of a polypeptide (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) encoding a human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein. siRNAs are constructed so that a single transcript has both a sense sequence and a complementary antisense sequence from the target gene, such as a hairpin.

本方法は、例えば細胞の悪性トランスフォーメーションの結果、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現が上方制御されている細胞における遺伝子発現を変化させるために用いられる。標的細胞におけるsiRNAとWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1転写物との結合は、細胞によるタンパク質産生の減少を引き起こす。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然の転写物程度の長さであってもよい。オリゴヌクレオチドは19〜25ヌクレオチド長であることが好ましい。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは75、50、または25ヌクレオチド長である。哺乳動物細胞における発現を阻害するWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1 siRNAオリゴヌクレオチドの例には、配列番号：93〜103のいずれかを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの配列はそれぞれ、以下のsiRNA配列の標的配列である。
配列番号：93、配列番号：24、および25（WDRPUH）；
配列番号：94、配列番号：26、および27（WDRPUH）；
配列番号：95、配列番号：28、および29（WDRPUH）；
配列番号：96、配列番号：30、および31（WDRPUH）；
配列番号：97、配列番号：104、および105（KRZFPUH）；
配列番号：98、配列番号：106、および107（KRZFPUH）；
配列番号：99、配列番号：108、および109（KRZFPUH）；
配列番号：100、配列番号：110、および111（KRZFPUH）；
配列番号：101、配列番号：47、および48（PPIL1）；
配列番号：102、配列番号：49、および50（PPIL1）；ならびに
配列番号：103、配列番号：51、および52（PPIL1）。 This method is used, for example, to alter gene expression in cells in which the expression of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 is upregulated as a result of malignant transformation of the cells. Binding of siRNA to WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 transcript in the target cell causes a decrease in protein production by the cell. The length of the oligonucleotide is at least 10 nucleotides and may be as long as a natural transcript. The oligonucleotide is preferably 19-25 nucleotides in length. Most preferably, the oligonucleotide is 75, 50, or 25 nucleotides in length. Examples of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 siRNA oligonucleotides that inhibit expression in mammalian cells include oligonucleotides comprising any of SEQ ID NOs: 93-103. Each of these sequences is a target sequence of the following siRNA sequences.
SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 24, and 25 (WDRPUH);
SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 26, and 27 (WDRPUH);
SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 28, and 29 (WDRPUH);
SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 30, and 31 (WDRPUH);
SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 104, and 105 (KRZFPUH);
SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 106, and 107 (KRZFPUH);
SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 108, and 109 (KRZFPUH);
SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, and 111 (KRZFPUH);
SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 47, and 48 (PPIL1);
SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 49, and 50 (PPIL1); and SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 51, and 52 (PPIL1).

これらのsiRNAのヌクレオチド配列は、アンビオン社（Ambion）のウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から入手可能なsiRNA設計用のコンピュータプログラムを用いて設計することができる。siRNAに関するヌクレオチド配列は、コンピュータプログラムにより、以下のプロトコールに基づいて選択される。   The nucleotide sequence of these siRNAs is designed using a computer program for siRNA design available from the Ambion website (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) be able to. The nucleotide sequence for siRNA is selected by a computer program based on the following protocol.

siRNA標的部位の選択：
1．目的の転写物のAUG開始コドンから開始して、AAジヌクレオチド配列に関して下流へとスキャンする。各AAおよび3'側に隣接した19ヌクレオチドの出現率をsiRNA標的の可能性がある部位として記録する。Tuschlらは、siRNAを5'および3'非翻訳領域（UTR）ならびに開始コドン付近（75塩基内）の領域に対しては設計しないように推奨しており、これは、これらの領域には調節タンパク質の結合部位が多く含まれる可能性があるためである。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる可能性がある。
2．標的の可能性がある部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列と明らかな相同性を有するどの標的領域も検討から除外する。相同性検索はBLASTを用いて行うことができ、これはNCBIのサーバー：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上にある。
3．合成用の適格な標的配列を選択する。アンビオン社では、遺伝子の全長に沿っていくつかの標的配列を評価用に選択することができる。 siRNA target site selection:
1． Starting downstream from the AUG start codon of the transcript of interest, it is scanned downstream for the AA dinucleotide sequence. Record the occurrence of each AA and the 3 'adjacent 19 nucleotides as potential siRNA target sites. Tuschl et al. Recommend that siRNAs not be designed for the 5 'and 3' untranslated regions (UTR) and the region near the start codon (within 75 bases), which is regulated in these regions This is because there may be many protein binding sites. UTR binding proteins and / or translation initiation complexes may interfere with the binding of the siRNA endonuclease complex.
2． The potential target sites are compared to the human genome database and any target regions with apparent homology with other coding sequences are excluded from consideration. Homology searches can be performed using BLAST, which is on the NCBI server: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
3． Select a qualified target sequence for synthesis. Ambion can select several target sequences for evaluation along the entire length of the gene.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは本発明のポリペプチドの発現を阻害し、そのため、本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制するのに有用である。同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む発現阻害物質も、それらが本発明のポリペプチドの生物学的活性を阻害しうるという点で有用である。このため、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む組成物は癌などの細胞増殖性疾患の治療に有用である。   The antisense oligonucleotide or siRNA of the present invention inhibits the expression of the polypeptide of the present invention and is therefore useful for suppressing the biological activity of the polypeptide of the present invention. Similarly, expression inhibitors comprising the antisense oligonucleotides or siRNAs of the invention are also useful in that they can inhibit the biological activity of the polypeptides of the invention. Therefore, the composition containing the antisense oligonucleotide or siRNA of the present invention is useful for the treatment of cell proliferative diseases such as cancer.

さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの発現レベルを診断マーカーとして利用して、細胞増殖性疾患を診断するための方法も提供する。   Furthermore, the present invention also provides a method for diagnosing a cell proliferative disease using the expression level of the polypeptide of the present invention as a diagnostic marker.

この診断方法は、（a）本発明のWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルを検出する段階、および（b）発現レベルの上昇を癌などの細胞増殖性疾患と関連づける段階を含む。   This diagnostic method includes the steps of (a) detecting the expression level of the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene of the present invention, and (b) associating the increased expression level with a cell proliferative disease such as cancer.

個々の標本におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルは、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、もしくはAPCDD1遺伝子に対応するmRNA、またはWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、もしくはAPCDD1遺伝子によってコードされるタンパク質を定量することによって評価することができる。mRNAの定量法は当業者に周知である。例えば、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子に対応するmRNAのレベルは、ノーザンブロット分析またはRT-PCRによって評価しうる。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の完全長ヌクレオチド配列は配列番号：1、3、5、または7に示されているため、当業者はいずれも、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子を定量するためのプローブまたはプライマーのヌクレオチド配列を設計することができる。   The expression level of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene in individual specimens quantifies mRNA corresponding to WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene, or protein encoded by WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene Can be evaluated. Methods for quantifying mRNA are well known to those skilled in the art. For example, the level of mRNA corresponding to the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene can be assessed by Northern blot analysis or RT-PCR. Since the full-length nucleotide sequence of the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene is shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, any person skilled in the art quantifies the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene The nucleotide sequence of the probe or primer can be designed.

WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルは、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または量に基づいて分析することもできる。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の量を決定するための方法は以下に示されている。例えば、免疫アッセイ法は、生物材料におけるタンパク質の決定に有用である。いかなる生物材料も、タンパク質またはその活性の決定に有用な可能性がある。例えば、血液試料は、血清マーカーによってコードされるタンパク質の評価を目的として分析される。一方、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を決定するためには、分析しようとする各タンパク質の活性に応じて適した方法が選択されうる。   The expression level of the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene can also be analyzed based on the activity or amount of the protein encoded by the gene. Methods for determining the amount of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein are shown below. For example, immunoassays are useful for the determination of proteins in biological materials. Any biological material can be useful in determining a protein or its activity. For example, a blood sample is analyzed for the purpose of evaluating proteins encoded by serum markers. On the other hand, in order to determine the activity of the protein encoded by WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene, a suitable method can be selected depending on the activity of each protein to be analyzed.

標本（被験試料）におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルを評価し、正常試料における発現レベルと比較する。このような比較によって標的遺伝子の発現レベルが正常試料における発現レベルよりも高いことが示された場合には、その対象は細胞増殖性疾患に罹患していると判断される。正常試料由来および対象由来の標本におけるWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子の発現レベルは同時に決定してもよい。または、あらかじめ対照群から採取しておいた標本の遺伝子発現レベルを分析することで得た結果に基づく統計学的方法によって、発現レベルの正常範囲を決定することもできる。対象の試料をその正常範囲と比較する；その結果が正常範囲内に収まらない場合には、対象は細胞増殖性疾患に罹患していると判断される。本発明において、診断しようとする細胞増殖性疾患は、好ましくは癌である。より好ましくは、WDRPUHまたはKRZFPUH遺伝子の発現レベルを評価し、正常試料におけるものと比較する場合、診断しようとする細胞増殖性疾患は肝細胞癌である；ならびに、PPIL1またはAPCDD1遺伝子をその発現レベルに関して評価する場合には、診断しようとする疾患は結腸直腸癌である。さらに、KRZFPUH遺伝子の発現レベルを評価し、正常試料におけるものと比較する場合、診断しようとする細胞増殖性疾患は肝細胞癌に加え胃癌または肺癌でもよい。   The expression level of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene in the specimen (test sample) is evaluated and compared with the expression level in a normal sample. If the comparison shows that the expression level of the target gene is higher than the expression level in the normal sample, it is determined that the subject is suffering from a cell proliferative disease. The expression level of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 gene in specimens from normal samples and subjects may be determined simultaneously. Or the normal range of an expression level can also be determined by the statistical method based on the result obtained by analyzing the gene expression level of the sample extract | collected from the control group previously. A subject's sample is compared to its normal range; if the result does not fall within the normal range, the subject is determined to have a cell proliferative disorder. In the present invention, the cell proliferative disease to be diagnosed is preferably cancer. More preferably, when the expression level of the WDRPUH or KRZFPUH gene is assessed and compared to that in a normal sample, the cell proliferative disorder to be diagnosed is hepatocellular carcinoma; and the PPIL1 or APCDD1 gene is related to its expression level When assessed, the disease to be diagnosed is colorectal cancer. Further, when the expression level of the KRZFPUH gene is evaluated and compared with that in a normal sample, the cell proliferative disease to be diagnosed may be gastric cancer or lung cancer in addition to hepatocellular carcinoma.

本発明においては、肝細胞癌および結腸直腸癌を含む癌などの細胞増殖性疾患を診断するための診断薬も提供される。本発明の診断薬は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと結合する化合物を含む。本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、または本発明のポリペプチドと結合する抗体をこのような化合物として用いることが好ましい。   In the present invention, a diagnostic agent for diagnosing cell proliferative diseases such as cancer including hepatocellular carcinoma and colorectal cancer is also provided. The diagnostic agent of the present invention includes a compound that binds to the polynucleotide or polypeptide of the present invention. Oligonucleotides that hybridize with the polynucleotides of the present invention or antibodies that bind to the polypeptides of the present invention are preferably used as such compounds.

さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを用いる、細胞増殖性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法の1つの態様には、（a）被験化合物を本発明のポリペプチドと接触させる段階、（b）本発明のポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階、および（c）本発明のポリペプチドと結合する化合物を選択する段階が含まれる。   Furthermore, the present invention provides a method for screening a compound for treating a cell proliferative disease using the polypeptide of the present invention. One embodiment of this screening method includes (a) contacting the test compound with the polypeptide of the present invention, (b) detecting the binding activity between the polypeptide of the present invention and the test compound, and (c) A step of selecting a compound that binds to the polypeptide of the present invention is included.

スクリーニングに用いる本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドでも天然のタンパク質でもよく、またはそれらの部分ペプチドでもよい。任意の被験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵性微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物（synthetic micromolecular compound）、および天然化合物を用いることができる。被験化合物と接触させる本発明のポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質でありうる。   The polypeptide of the present invention used for screening may be a recombinant polypeptide, a natural protein, or a partial peptide thereof. Any test compound, eg, cell extract, cell culture supernatant, fermentable microbial product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein, peptide, non-peptide compound, synthetic micromolecular compound ( synthetic micromolecular compounds) and natural compounds can be used. The polypeptide of the present invention to be contacted with a test compound can be, for example, a purified polypeptide, a soluble protein, a form bound to a carrier, or a fusion protein fused to another polypeptide.

本発明のポリペプチドを用いて、タンパク質、例えば本発明のポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降方法により、具体的には以下の様式で行うことができる。pSV2neo、pcDNA IおよびpCD8といった外来遺伝子用の発現ベクターに対して遺伝子を挿入することにより、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を動物細胞などで発現させる。発現のために用いるプロモーターは一般に用いうる任意のプロモーターでよく、これには例えば、SV40初期プロモーター（Rigby、Williamson（編）、「Genetic Engineering」第3巻、Academic Press、London、83-141 (1982)）、EF-1αプロモーター（Kimら、Gene 91: 217-223 (1990)）、CAGプロモーター（Niwaら、Gene 108: 193-200 (1991)）、RSV LTRプロモーター（Cullen、Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)）、SRαプロモーター（Takebeら、Mol Cell Biol 8: 466 (1988)）、CMV最初期プロモーター（SeedおよびAruffo、Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-3369 (1987)）、SV40後期プロモーター（GheysenおよびFiers、J Mol Appl Genet 1: 385-394 (1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufmanら、Mol Cell Biol 9: 946 (1989)）、HSV TKプロモーターなどが含まれる。外来遺伝子を発現させるための動物細胞への遺伝子の導入は任意の方法に従って行うことができ、これには例えば、電気穿孔法（Chuら、Nucleic Acids Res 15: 1311-1326 (1987)）、リン酸カルシウム法（ChenおよびOkayama、Mol Cell Biol 7: 2745-2752 (1987)）、DEAEデキストラン法（Lopataら、Nucleic Acids Res 12: 5707-5717 (1984)；SussmanおよびMilman、Mol Cell Biol 4: 1642-1643 (1985)）、リポフェクチン法（Derijard、B Cell 7: 1025-1037 (1994)；Lambら、Nature Genetics 5: 22-30 (1993)：Rabindranら、Science 259: 230-234 (1993)）などがある。本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドのN末端またはC末端に対する特異性が判明しているモノクローナル抗体のエピトープを導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ-抗体系を用いることもできる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。例えばβ-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）などとの融合タンパク質を、マルチクローニングサイトを用いることによって発現させうるベクターが市販されている。   As a method for screening a protein, for example, a protein that binds to the polypeptide of the present invention using the polypeptide of the present invention, many methods well known to those skilled in the art can be used. Such screening can be performed by, for example, an immunoprecipitation method, specifically in the following manner. By inserting a gene into an expression vector for a foreign gene such as pSV2neo, pcDNA I and pCD8, the gene encoding the polypeptide of the present invention is expressed in an animal cell or the like. The promoter used for expression may be any commonly used promoter, such as the SV40 early promoter (Rigby, Williamson (eds.), “Genetic Engineering”, Volume 3, Academic Press, London, 83-141 (1982 )), EF-1α promoter (Kim et al., Gene 91: 217-223 (1990)), CAG promoter (Niwa et al., Gene 108: 193-200 (1991)), RSV LTR promoter (Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)), SRα promoter (Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466 (1988)), CMV early promoter (Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-3369 (1987)), SV40 Late promoters (Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-394 (1982)), adenovirus late promoters (Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946 (1989)), HSV TK promoter and the like are included. Introduction of a gene into an animal cell for expressing a foreign gene can be performed according to any method, such as electroporation (Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-1326 (1987)), calcium phosphate. Method (Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-2752 (1987)), DEAE dextran method (Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-5717 (1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1642-1643 (1985)), Lipofectin method (Derijard, B Cell 7: 1025-1037 (1994); Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran et al., Science 259: 230-234 (1993)) is there. The polypeptide of the present invention is expressed as a fusion protein containing a monoclonal antibody recognition site (epitope) by introducing an epitope of a monoclonal antibody whose specificity to the N-terminus or C-terminus of the polypeptide of the present invention is known. Can be made. A commercially available epitope-antibody system can also be used (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)). For example, vectors that can express a fusion protein with β-galactosidase, maltose-binding protein, glutathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP) and the like by using a multiple cloning site are commercially available.

融合によって本発明のポリペプチドの性質を変えないように数個〜十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって作製された融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Hisタグ）、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7遺伝子10タンパク質（T7タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSVタグ）、Eタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープ、およびそれらを認識するモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ-抗体系として用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。   A fusion protein produced by introducing only a small epitope consisting of several to a dozen amino acids so as not to change the properties of the polypeptide of the present invention by fusion has also been reported. Polyhistidine (His tag), influenza agglutinin HA, human c-myc, FLAG, vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-GP), T7 gene 10 protein (T7 tag), human herpes simplex virus glycoprotein (HSV tag) , Epitopes such as E-tags (epitopes on monoclonal phage), and monoclonal antibodies that recognize them can be used as an epitope-antibody system for screening proteins that bind to the polypeptides of the invention (Experimental Medicine 13 : 85-90 (1995)).

免疫沈降の場合には、適切な界面活性剤を用いて調製した細胞可溶化物にこれらの抗体を添加することにより、免疫複合体を形成させる。免疫複合体は、本発明のポリペプチド、そのポリペプチドとの結合能があるポリペプチド、および抗体からなる。以上のエピトープに対する抗体を用いることに加えて、免疫沈降を本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて行うこともでき、これらの抗体は上記の通りに調製することができる。   In the case of immunoprecipitation, an immune complex is formed by adding these antibodies to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant. The immune complex consists of the polypeptide of the present invention, a polypeptide capable of binding to the polypeptide, and an antibody. In addition to using antibodies against the above epitopes, immunoprecipitation can also be performed using antibodies against the polypeptides of the present invention, and these antibodies can be prepared as described above.

免疫複合体は、抗体がマウスIgG抗体であれば、例えばプロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースによって沈降させることができる。本発明のポリペプチドをGSTなどのエピトープとの融合蛋白質として作製する場合には、これらのエピトープと特異的に結合する基質、例えばグルタチオン-セファロース4Bを用いて、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる時と同じ様式で免疫複合体を形成させることができる。   If the antibody is a mouse IgG antibody, the immune complex can be precipitated by, for example, protein A sepharose or protein G sepharose. When the polypeptide of the present invention is produced as a fusion protein with an epitope such as GST, an antibody against the polypeptide of the present invention is used using a substrate that specifically binds to these epitopes, such as glutathione-sepharose 4B. Immune complexes can be formed in the same manner as time.

免疫沈降は、例えば、文献中に記載された方法に倣ってまたは従って行うことができる（HarlowおよびLane、「Antibodies」、511-52、Cold Spring Harbor Laboratory publications、New York (1988)）。   Immunoprecipitation can be performed, for example, following or following methods described in the literature (Harlow and Lane, “Antibodies”, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)).

SDS-PAGEは免疫沈降したタンパク質の分析に一般に用いられており、結合したタンパク質はゲルを適切な濃度で用いてタンパク質の分子量によって分析することができる。本発明のポリペプチドと結合したタンパク質をクーマシー染色または銀染色などの一般的な染色法によって検出することは困難であるため、タンパク質に関する検出感度は、放射性同位体である35S-メチオニンまたは35S-システインを含む培養液中で細胞を培養し、細胞内のタンパク質を標識した上でタンパク質を検出することによって改善することができる。タンパク質の分子量がわかっている場合には、標的タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲルから直接精製して、その配列を決定することができる。 SDS-PAGE is commonly used for analysis of immunoprecipitated proteins, and bound proteins can be analyzed by protein molecular weight using a gel at an appropriate concentration. Since it is difficult to detect a protein bound to the polypeptide of the present invention by a general staining method such as Coomassie staining or silver staining, the detection sensitivity for the protein is the radioactive isotope 35 S-methionine or 35 S -It can be improved by culturing cells in a culture solution containing cysteine, labeling the protein in the cell and detecting the protein. If the molecular weight of the protein is known, the target protein can be purified directly from an SDS-polyacrylamide gel and its sequence determined.

本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を、本ポリペプチドを用いてスクリーニングするための方法としては、例えば、ウエスト-ウエスタンブロット分析（Skolnikら、Cell 65：83-90 (1991)）を用いることができる。具体的には、細胞、組織、臓器（例えば、WDRPUHと結合するタンパク質のスクリーニングのためには精巣；KRZFPUHと結合するタンパク質のスクリーニングのためには精巣および胎盤；PPIL1と結合するタンパク質のスクリーニングのためには心臓、骨格筋、精巣、甲状腺、および副腎；ならびにAPCDD1と結合するものに関しては心臓、膵臓、前立腺、卵巣、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、および末梢白血球、などの組織）または本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現すると予想される培養細胞から、ファージベクター（例えば、ZAP）を用いてcDNAライブラリーを作製し、タンパク質をLBアガロース上で発現させ、発現したタンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識がなされた本発明のポリペプチドを上記のフィルターと反応させ、かつ本発明のポリペプチドに結合したタンパク質を発現しているプラークを標識によって検出することで、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンの結合を利用することにより、または本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体、または本発明のポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えば、GST）を利用することにより標識できる。放射性同位体または蛍光などを用いる方法を使用してもよい。   As a method for screening a protein that binds to the polypeptide of the present invention using the polypeptide, for example, West-Western blot analysis (Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)) can be used. it can. Specifically, cells, tissues, organs (eg, testis for screening for proteins that bind to WDRPUH; testes and placenta for screening for proteins that bind to KRZFPUH; for screening for proteins that bind to PPIL1 For the heart, skeletal muscle, testis, thyroid, and adrenal gland; and for those that bind to APCDD1, tissues such as heart, pancreas, prostate, ovary, lung, liver, kidney, spleen, thymus, colon, and peripheral leukocytes) Alternatively, from a cultured cell expected to express a protein that binds to the polypeptide of the present invention, a cDNA library is prepared using a phage vector (for example, ZAP), the protein is expressed on LB agarose, and the expressed protein is The polypeptide of the present invention immobilized on a filter, purified and labeled is mixed with the above filter. It is allowed, and the plaques expressing proteins bound to the polypeptide of the present invention by detecting the label, it is possible to obtain a protein binding to the polypeptide of the present invention. The polypeptide of the present invention can be obtained by utilizing the binding of biotin and avidin, or an antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention, or a peptide or polypeptide fused with the polypeptide of the present invention (for example, GST) It can be labeled by using. A method using a radioisotope or fluorescence may be used.

または、本発明のスクリーニング方法のもう1つの態様において、細胞を利用する2-ハイブリッド系を用いることもできる（「MATCHMAKER 2-ハイブリッド系（MATCHMAKER Two-Hybrid system）」「哺乳動物MATCHMAKER 2-ハイブリッドアッセイキット（Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit）」「MATCHMAKER 1-ハイブリッド系（MATCHMAKER one-Hybrid system）」（クロンテック）；「HybriZAP 2-ハイブリッドベクター系（HybriZAP Two-Hybrid Vector System）」（ストラタジーン（Stratagene））；参考文献「DaltonおよびTreisman、Cell 68: 597-612 (1992)」「FieldsおよびSternglanz、Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）。   Alternatively, in another embodiment of the screening method of the present invention, a cell-based two-hybrid system can be used (“MATCHMAKER Two-Hybrid system”) “Mammalian MATCHMAKER two-hybrid assay”. Kit (Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit) “MATCHMAKER one-Hybrid system” (Clontech); “HybriZAP Two-Hybrid Vector System” (Stratagene) )); References “Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)” “Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)”).

2-ハイブリッド系では、本発明のポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて、酵母細胞で発現させる。本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現すると予想される細胞から、ライブラリーが発現した場合にVP16またはGAL4転写活性化領域と融合させるように、cDNAライブラリーを作成する。続いてcDNAライブラリーを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリーに由来するcDNAを単離する（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を酵母細胞で発現させる場合には、この2つの結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出されるようになる）。cDNAによってコードされるタンパク質は、以上のようにして単離したcDNAを大腸菌に導入してタンパク質を発現させることによって調製しうる。   In the two-hybrid system, the polypeptide of the present invention is fused to the SRF-binding region or GAL4-binding region and expressed in yeast cells. A cDNA library is prepared from cells expected to express a protein that binds to the polypeptide of the present invention so that when the library is expressed, it is fused with a VP16 or GAL4 transcriptional activation region. Subsequently, the cDNA library is introduced into the above yeast cell, and the cDNA derived from the library is isolated from the detected positive clone (when the protein that binds to the polypeptide of the present invention is expressed in the yeast cell, The combination of these two activates the reporter gene and allows positive clones to be detected). A protein encoded by cDNA can be prepared by introducing the cDNA isolated as described above into E. coli to express the protein.

レポーター遺伝子としては、HIS3遺伝子のほかに、例えば、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを用いることができる。   As the reporter gene, for example, Ade2 gene, lacZ gene, CAT gene, luciferase gene and the like can be used in addition to the HIS3 gene.

本発明のポリペプチドと結合する化合物を、アフィニティークロマトグラフィーを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化し、本発明のポリペプチドと結合しうるタンパク質を含む被験化合物をカラムに対して適用してもよい。本明細書における被験化合物は、例えば、細胞抽出物、細胞可溶化物などであってよい。被験化合物のローディング後に、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。   Compounds that bind to the polypeptides of the invention can also be screened using affinity chromatography. For example, the polypeptide of the present invention may be immobilized on a carrier of an affinity column, and a test compound containing a protein that can bind to the polypeptide of the present invention may be applied to the column. The test compound in this specification may be, for example, a cell extract or a cell lysate. After loading the test compound, the column can be washed to prepare a compound bound to the polypeptide of the present invention.

被験化合物がタンパク質である場合には、得られたタンパク質のアミノ酸配列を分析して、その配列に基づいてオリゴDNAを合成し、そのオリゴDNAを、タンパク質をコードするDNAを得るためのプローブとして用いて、cDNAライブラリーをスクリーニングする。   When the test compound is a protein, the amino acid sequence of the obtained protein is analyzed, an oligo DNA is synthesized based on the sequence, and the oligo DNA is used as a probe for obtaining a DNA encoding the protein. To screen the cDNA library.

表面プラスモン共鳴現象を利用するバイオセンサーを、結合した化合物の検出または定量のための手段として本発明に用いることもできる。このようなバイオセンサーを用いると、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、標識を行わずに、本発明のポリペプチドと被験化合物との相互作用を表面プラスモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる（例えば、BIAcore、ファルマシア）。このため、BIAcoreなどのバイオセンサーを用いて、本発明のポリペプチドと被験化合物との結合を評価することが可能である。   A biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can also be used in the present invention as a means for detecting or quantifying the bound compound. When such a biosensor is used, the interaction between the polypeptide of the present invention and the test compound can be observed in real time as a surface plasmon resonance signal using only a very small amount of polypeptide and without labeling. Yes (eg BIAcore, Pharmacia). For this reason, it is possible to evaluate the binding between the polypeptide of the present invention and the test compound using a biosensor such as BIAcore.

本発明の固定化されたポリペプチドを合成化合物、または天然物バンク、またはランダムなファージペプチドディスプレイライブラリーに対して曝露させた場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、本発明のタンパク質と結合するタンパク質だけでなく化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、コンビナトリアル化学に基づくハイスループット技法を用いたスクリーニング方法（Wrightonら、Science 273: 458-64 (1996)；Verdine、Nature 384: 11-13 (1996)；Hogan、Nature 384: 17-9 (1996)）は当業者に周知である。   Methods for screening molecules that bind when the immobilized polypeptides of the invention are exposed to synthetic compounds, natural product banks, or random phage peptide display libraries, and bind to proteins of the invention Screening methods using combinatorial chemistry-based high-throughput techniques to isolate not only the proteins that do (including agonists and antagonists) (Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)) are well known to those skilled in the art.

このスクリーニングによって単離される化合物は、例えば、癌などの細胞増殖性疾患に起因する疾患の治療または予防を目的として、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する薬剤の候補である。本発明のポリペプチドに対する結合活性を有する、本スクリーニング方法によって得られた化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。   The compound isolated by this screening is a candidate for a drug that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention for the purpose of treating or preventing a disease caused by a cell proliferative disease such as cancer. A compound having a binding activity to the polypeptide of the present invention, wherein a part of the structure of the compound obtained by this screening method is converted by addition, deletion and / or substitution is obtained by the screening method of the present invention. Included in compounds.

さらにもう1つの態様において、本発明は、細胞増殖性疾患の治療において標的となる可能性のある候補物質をスクリーニングするための方法を提供する。以上に詳細に考察したように、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現レベルを制御することにより、癌の発症または進行を制御することが可能である。このため、細胞増殖性疾患の治療における標的の可能性がある候補物質を、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現レベルおよび活性を指標として用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明の状況において、このようなスクリーニングには、例えば、
a）候補化合物を、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1を発現する細胞と接触させる段階；および
b）WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階が含まれていてもよい。 In yet another embodiment, the present invention provides a method for screening candidate substances that may be targeted in the treatment of cell proliferative disorders. As discussed in detail above, it is possible to control the onset or progression of cancer by controlling the expression level of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1. Therefore, candidate substances that may be targets in the treatment of cell proliferative diseases can be identified by screening using the expression level and activity of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 as indicators. In the context of the present invention, such screening includes, for example:
a) contacting the candidate compound with a cell expressing WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1; and
b) selecting a compound that reduces the expression level of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 compared to the expression level detected in the absence of the test compound.

WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1のうち少なくとも1つを発現する細胞には、例えば、HCCまたは結腸直腸癌から樹立された細胞株が含まれる；このような細胞は本発明の上記のスクリーニングのために用いることができる。発現レベルは当業者に周知の方法によって評価しうる。このスクリーニング方法では、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1のうち少なくとも1つの発現レベルを低下させる化合物を候補薬剤として選択することができる。   Cells expressing at least one of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 include, for example, cell lines established from HCC or colorectal cancer; such cells are for the above screening of the present invention. Can be used. Expression levels can be assessed by methods well known to those skilled in the art. In this screening method, a compound that decreases the expression level of at least one of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 can be selected as a candidate drug.

本発明の細胞増殖性疾患を治療するための化合物のスクリーニング方法のもう1つの態様において、本方法は、本発明のポリペプチドの生物学的活性を指標として用いる。本発明のWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1タンパク質は細胞増殖を促進する活性を有するため、本発明のこれらのタンパク質のいずれかのこの活性を促進または阻害する化合物を、この活性を指標として用いてスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法は、（a）被験化合物を本発明のポリペプチドと接触させる段階、（b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階、および（c）被験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較してポリペプチドの生物学的活性を抑制する化合物を選択する段階を含む。   In another embodiment of the method for screening a compound for treating a cell proliferative disease of the present invention, the method uses the biological activity of the polypeptide of the present invention as an indicator. Since the WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, and APCDD1 proteins of the present invention have the activity of promoting cell proliferation, a compound that promotes or inhibits this activity of any of these proteins of the present invention is used as an index. Can be screened. This screening method comprises the steps of (a) contacting a test compound with the polypeptide of the present invention, (b) detecting the biological activity of the polypeptide of step (a), and (c) absence of the test compound. Selecting a compound that inhibits the biological activity of the polypeptide relative to the biological activity detected below.

いかなるポリペプチドも、それらがWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の生物学的活性を有する限り、スクリーニングに用いることができる。このような生物学的活性には、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の細胞増殖活性、PPIL1のSNW1またはスタスミンと結合する活性が含まれる。例えば、ヒトWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを用いることもできる。このようなポリペプチドは細胞によって内因性に発現させても外因性に発現させてもよい。   Any polypeptides can be used for screening as long as they have the biological activity of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein. Such biological activities include cell proliferative activity of human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein, PPIL1 SNW1 or stathmin binding activity. For example, human WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein can be used, and polypeptides functionally equivalent to these proteins can also be used. Such a polypeptide may be expressed endogenously or exogenously by the cell.

任意の被験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵性微生物の産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物、または天然化合物を用いることができる。   Any test compound, e.g., cell extract, cell culture supernatant, fermentable microbial product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein, peptide, non-peptide compound, synthetic micromolecular compound, or Natural compounds can be used.

このスクリーニングによって単離される化合物は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、本発明のポリペプチドの機能を、そのポリペプチドとの結合によって活性化する分子を指す。同様に、「アンタゴニスト」という用語は、本発明のポリペプチドの機能を、そのポリペプチドとの結合によって阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のポリペプチドと分子（DNAおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補でもある。   The compound isolated by this screening is a candidate agonist or antagonist of the polypeptide of the present invention. The term “agonist” refers to a molecule that activates the function of a polypeptide of the invention by binding to the polypeptide. Similarly, the term “antagonist” refers to a molecule that inhibits the function of a polypeptide of the invention by binding to the polypeptide. In addition, compounds isolated by this screening are also candidates for compounds that inhibit in vivo interactions between the polypeptides of the invention and molecules (including DNA and proteins).

本方法において検出しようとする生物学的活性が細胞増殖である場合には、実施例の項に記載のように、例えば、本発明のポリペプチドを発現する細胞を作製し、細胞を被験化合物の存在下で培養して、細胞増殖の速度を評価し、細胞周期などを測定することにより、さらにはコロニー形成活性を測定することにより、生物学的活性を検出することができる。   When the biological activity to be detected in the present method is cell proliferation, as described in the Examples section, for example, a cell expressing the polypeptide of the present invention is prepared, and the cell is used as a test compound. Biological activity can be detected by culturing in the presence, assessing the rate of cell growth, measuring cell cycle, etc., and further measuring colony forming activity.

以上のスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のポリペプチドの活性を阻害する薬剤の候補であり、本発明のポリペプチドと関連のある疾患、例えば、癌を含む細胞増殖性疾患の治療に応用することができる。より具体的には、WDRPUHまたはKRZFPUHタンパク質の生物学的活性を指標とした場合には、本方法によってスクリーニングされた化合物は肝細胞癌の治療のための薬剤の候補としての役を果たす。また、KRZFPUHタンパク質の生物学的活性を指標とした場合には、本方法によってスクリーニングされた化合物は肝細胞癌のほか、胃癌または肺癌の治療のための薬剤の候補としての役を果たす。一方、PPIL1またはAPCDD1タンパク質の生物学的活性を指標とした場合には、本方法によってスクリーニングされた化合物は結腸直腸癌の治療のための薬剤の候補としての役を果たす。   The compound isolated by the above screening is a candidate drug that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention, and is used for the treatment of diseases associated with the polypeptide of the present invention, for example, cell proliferative diseases including cancer. Can be applied. More specifically, when the biological activity of WDRPUH or KRZFPUH protein is used as an indicator, the compound screened by this method serves as a drug candidate for the treatment of hepatocellular carcinoma. In addition, when the biological activity of the KRZFPUH protein is used as an index, the compound screened by this method serves as a candidate drug for the treatment of gastric cancer or lung cancer in addition to hepatocellular carcinoma. On the other hand, when the biological activity of PPIL1 or APCDD1 protein is used as an indicator, the compound screened by this method serves as a drug candidate for the treatment of colorectal cancer.

さらに、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質の活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物も、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。   Furthermore, a compound in which a part of the structure of a compound that inhibits the activity of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein is converted by addition, deletion, and / or substitution is also converted into a compound obtained by the screening method of the present invention. included.

または、本発明のスクリーニング方法は、
a）1つまたは複数のマーカー遺伝子がWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1からなる群より選択され、この1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域および転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞に、候補化合物を接触させる段階；
b）前記レポーター遺伝子の活性を測定する段階；ならびに
c）前記レポーター遺伝子の発現レベルを対照と比較して低下させる化合物を選択する段階を含みうる。 Alternatively, the screening method of the present invention comprises:
a) one or more marker genes selected from the group consisting of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, and APCDD1, and a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region and transcriptional regulatory region of the one or more marker genes Contacting a candidate compound with a cell into which a vector containing the protein has been introduced;
b) measuring the activity of the reporter gene; and
c) selecting a compound that reduces the expression level of the reporter gene relative to a control.

適したレポーター遺伝子および宿主細胞は当技術分野で周知である。スクリーニングのために必要なレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写調節領域を用いることによって作製しうる。マーカー遺伝子の転写調節領域が当業者に既知である場合には、これまでの配列情報を用いることによってレポーター構築物を作製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域がまだ同定されていない場合には、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントを、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリーから単離することができる。   Suitable reporter genes and host cells are well known in the art. The reporter construct required for screening can be prepared by using the transcriptional regulatory region of the marker gene. If the transcriptional regulatory region of the marker gene is known to those skilled in the art, a reporter construct can be prepared by using the sequence information so far. If the transcriptional regulatory region of the marker gene has not yet been identified, the nucleotide segment containing the transcriptional regulatory region can be isolated from the genomic library based on the nucleotide sequence information of the marker gene.

さらに、本発明の細胞増殖性疾患を治療するための化合物をスクリーニングするための方法のもう1つの態様において、本方法はAPCDD1のプロモーター領域を用いる。本発明によれば、βカテニン/Tcf4複合体は、APCDD1遺伝子の転写調節領域内にある2つのTcf/LEF結合モチーフと結合し、かつAPCDD1の転写活性化にかかわっていることが見いだされた。したがって、APCDD1の転写活性化を阻害する化合物は、本発明のAPCDD1ポリペプチドの活性を阻害する薬剤の候補としての役を果たし、このポリペプチドと関連のある疾患、例えば、癌などの細胞増殖性疾患、特に結腸直腸癌の治療に応用することができる。   Furthermore, in another embodiment of the method for screening a compound for treating a cell proliferative disease of the present invention, the method uses the promoter region of APCDD1. According to the present invention, it was found that the β-catenin / Tcf4 complex binds to two Tcf / LEF binding motifs in the transcriptional regulatory region of the APCDD1 gene and is involved in the transcriptional activation of APCDD1. Therefore, a compound that inhibits the transcriptional activation of APCDD1 serves as a candidate for an agent that inhibits the activity of the APCDD1 polypeptide of the present invention, and cell proliferative properties such as diseases associated with this polypeptide, such as cancer. It can be applied to the treatment of diseases, especially colorectal cancer.

このスクリーニング方法は、（a）APCDD1の2つのTcf/LEF結合モチーフをレポーター遺伝子の上流に含むベクターを構築する段階；（b）段階（a）のベクターによって細胞の形質転換を行う段階；（c）βカテニン/Tcf 4複合体の存在下、被験化合物を段階（b）の細胞と接触させる段階；（d）レポーター遺伝子の発現を検出する段階；および（e）レポーター遺伝子の発現を被験化合物の非存在下と比較して抑制する被験化合物を選択する段階を含む。   This screening method comprises the steps of (a) constructing a vector containing two Tcf / LEF binding motifs of APCDD1 upstream of a reporter gene; (b) transforming a cell with the vector of step (a); (c Contacting the test compound with the cells of step (b) in the presence of β-catenin / Tcf 4 complex; (d) detecting the expression of the reporter gene; and (e) expressing the reporter gene expression of the test compound. Selecting a test compound that inhibits compared to absence.

任意の被験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵性微生物の産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物（synthetic micromolecular compound）、天然化合物を用いることができる。   Any test compound such as cell extract, cell culture supernatant, fermentable microorganism product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein, peptide, non-peptide compound, synthetic micromolecular compound (synthetic micromolecular compounds), natural compounds can be used.

このスクリーニングは、例えば、実施例28に記載された方法に従って実施しうる。例えば、レポーター遺伝子の上流にAPCDD1の2つのTcf/LEF結合モチーフを含むベクターは、レポーター遺伝子を含む発現ベクターに、APCDD1のプロモーター領域を挿入することによって構築することができる。APCDD1のプロモーター領域は、ヒトAPCDD1遺伝子（配列番号：7）の5'領域をプローブとして用いて、ゲノムライブラリーから入手できる。βカテニンおよびTcf-4は実施例28のようにして調製することができる。   This screening may be performed, for example, according to the method described in Example 28. For example, a vector containing two Tcf / LEF binding motifs of APCDD1 upstream of a reporter gene can be constructed by inserting the promoter region of APCDD1 into an expression vector containing a reporter gene. The promoter region of APCDD1 can be obtained from a genomic library using the 5 ′ region of the human APCDD1 gene (SEQ ID NO: 7) as a probe. β-catenin and Tcf-4 can be prepared as in Example 28.

発現が検出可能である限り、任意のレポーター遺伝子をスクリーニングに用いることができる。レポーター遺伝子の例には、β-gal遺伝子、CAT遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子の発現の検出は、レポーター遺伝子の種類に応じて行うことができる。ベクターを導入する細胞としては特に制限はないが、好ましい例としてはHeLa細胞が挙げられる。   Any reporter gene can be used for screening as long as expression is detectable. Examples of reporter genes include β-gal gene, CAT gene and luciferase gene. Detection of reporter gene expression can be performed according to the type of reporter gene. Although there is no restriction | limiting in particular as a cell which introduce | transduces a vector, A HeLa cell is mentioned as a preferable example.

スクリーニングによって単離された化合物は、本発明のAPCDD1タンパク質の発現を阻害する薬剤の候補であり、APCDD1タンパク質と関連のある疾患、例えば、癌などの細胞増殖性疾患、より具体的には結腸直腸癌の治療に応用することができる。さらに、APCDD1タンパク質の転写活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物も、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。   The compound isolated by the screening is a candidate for a drug that inhibits the expression of the APCDD1 protein of the present invention, and a disease associated with the APCDD1 protein, for example, a cell proliferative disease such as cancer, more specifically, colorectal It can be applied to the treatment of cancer. Furthermore, compounds obtained by the screening method of the present invention include compounds in which a part of the structure of the compound that inhibits the transcriptional activity of the APCDD1 protein is converted by addition, deletion, and / or substitution.

本発明の細胞増殖性疾患を治療するための化合物をスクリーニングするための方法のさらにもう1つの態様において、本方法はPPIL1のSNW1（SKI相互作用タンパク質）またはスタスミンとの結合能力を利用する。本発明のPPIL1タンパク質は、ビタミンD受容体の転写活性に関与するタンパク質、SNW1、および細胞周期の進行に関与するサイトゾル性リンタンパク質、スタスミンと会合することが判明している。これらの所見は、本発明のPPIL1タンパク質が、SNW1およびスタスミンなどの分子との結合によって細胞増殖の機能を発揮することを示唆する。このため、PPIL1タンパク質とSNW1またはスタスミンとの結合を阻害して細胞増殖を抑制することが考えられ、この結合を阻害する化合物は癌などの細胞増殖性疾患を治療するための医薬品として役立つと考えられる。本方法を用いてスクリーニングされた化合物により治療される細胞増殖性疾患は、好ましくは結腸直腸癌である。   In yet another embodiment of the method for screening compounds for treating cell proliferative disorders of the present invention, the method utilizes the ability of PPIL1 to bind to SNW1 (SKI interacting protein) or stathmin. The PPIL1 protein of the present invention has been found to associate with a protein involved in the transcriptional activity of vitamin D receptor, SNW1, and a cytosolic phosphoprotein, stathmin, involved in cell cycle progression. These findings suggest that the PPIL1 protein of the present invention exerts a function of cell proliferation by binding to molecules such as SNW1 and stathmin. For this reason, it is conceivable to inhibit cell growth by inhibiting the binding of PPIL1 protein to SNW1 or stathmin, and compounds that inhibit this binding are considered to be useful as pharmaceuticals for treating cell proliferative diseases such as cancer. It is done. The cell proliferative disorder to be treated with a compound screened using this method is preferably colorectal cancer.

このスクリーニング方法は、（a）被験化合物の存在下で本発明のポリペプチドをスタスミンまたはSNW1と接触させる段階；（b）ポリペプチドとスタスミンまたはSNW1との結合を検出する段階；および（c）ポリペプチドとスタスミンまたはSNW1との結合を阻害する化合物を選択する段階を含む。   This screening method comprises (a) contacting the polypeptide of the present invention with stathmin or SNW1 in the presence of a test compound; (b) detecting binding between the polypeptide and stathmin or SNW1; and (c) poly Selecting a compound that inhibits the binding of the peptide to stathmin or SNW1.

このスクリーニングに用いられる本発明のPPIL1ポリペプチド、およびSNW1またはスタスミンは、組換えポリペプチドでも天然のタンパク質でもよく、または、相互の結合能を保っている限り、それらの部分ペプチドでもよい。スクリーニングに用いられるPPIL1ポリペプチド、SNW1またはスタスミンは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質でありうる。   The PPIL1 polypeptide of the present invention, SNW1 or stathmin used for this screening may be a recombinant polypeptide or a natural protein, or may be a partial peptide thereof as long as it retains the binding ability to each other. The PPIL1 polypeptide, SNW1 or stathmin used in the screening can be, for example, a purified polypeptide, a soluble protein, a form bound to a carrier, or a fusion protein fused to another polypeptide.

任意の被験化合物、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵性微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成ミクロ分子化合物および天然化合物を用いることができる。     Any test compound such as cell extract, cell culture supernatant, fermentable microbial product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein, peptide, non-peptide compound, synthetic micromolecular compound and Natural compounds can be used.

PPIL1タンパク質とSNW1またはスタスミンとの結合を阻害する化合物に関するスクリーニングの方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。このようなスクリーニングは、インビトロアッセイ系、例えば細胞系において行うことができる。より具体的には、まず、PPIL1ポリペプチドまたはSNW1もしくはスタスミンのいずれかを支持体に対して結合させ、それに対してもう一方のタンパク質を被験試料とともに添加する。次に、混合物をインキュベートし、洗浄した上で、支持体と結合したもう一方のタンパク質を検出および/または測定する。   As a screening method for a compound that inhibits the binding between PPIL1 protein and SNW1 or stathmin, many methods well known to those skilled in the art can be used. Such screening can be performed in an in vitro assay system, such as a cell system. More specifically, first, either PPIL1 polypeptide or SNW1 or stathmin is bound to a support, and the other protein is added thereto together with a test sample. The mixture is then incubated and washed, and the other protein bound to the support is detected and / or measured.

タンパク質を結合させるために用いうる支持体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖類、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれる；以上の材料から作製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）を用いることが好ましい。ビーズを用いる場合には、それらをカラムに充填してもよい。   Examples of supports that can be used to bind proteins include insoluble polysaccharides such as agarose, cellulose, and dextran, and synthetic resins such as polyacrylamide, polystyrene, and silicone; made from the above materials It is preferable to use commercially available beads and plates (for example, multiwell plates, biosensor chips, etc.). If beads are used, they may be packed into a column.

タンパク質は、化学的結合および物理的吸着などの慣行の方法に従って支持体に結合させることができる。または、タンパク質は、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合させてもよい。さらに、アビジンとビオチンの結合を利用して、タンパク質を支持体に結合させることもできる。   The protein can be bound to the support according to conventional methods such as chemical binding and physical adsorption. Alternatively, the protein may be bound to the support via an antibody that specifically recognizes the protein. Furthermore, the protein can be bound to the support using the bond between avidin and biotin.

タンパク質同士の結合は、緩衝液がタンパク質同士の結合を阻害しない限りは、例えばこれらに限定されないがリン酸緩衝液およびTris緩衝液の緩衝液中で行われる。   As long as the buffer does not inhibit the binding between proteins, for example, but not limited to, the binding between proteins is performed in a buffer solution of a phosphate buffer and a Tris buffer.

本発明において、表面プラスモン共鳴現象を利用するバイオセンサーを、結合したタンパク質の検出または定量のための手段として用いることもできる。このようなバイオセンサーを用いると、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、標識を行わずに、タンパク質同士の相互作用を表面プラスモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる（例えば、BIAcore、ファルマシア）。このため、BIAcoreなどのバイオセンサーを用いて、PPIL1ポリペプチドとSNW1またはスタスミンとの結合を評価することが可能である。   In the present invention, a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can also be used as a means for detecting or quantifying the bound protein. When such a biosensor is used, the interaction between proteins can be observed in real time as a surface plasmon resonance signal using only a very small amount of polypeptide and without labeling (for example, BIAcore, Pharmacia). ). For this reason, it is possible to evaluate the binding between PPIL1 polypeptide and SNW1 or stathmin using a biosensor such as BIAcore.

または、PPIL1ポリペプチドまたはSNW1もしくはスタスミンのいずれかを標識し、結合したタンパク質の標識を、結合したタンパク質の検出または測定に用いることもできる。具体的には、タンパク質の一方をあらかじめ標識した後に、標識したタンパク質を被験化合物の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、洗浄後、結合したタンパク質を標識によって検出または測定する。   Alternatively, PPIL1 polypeptide or either SNW1 or stathmin can be labeled and the bound protein label can be used for detection or measurement of bound protein. Specifically, after labeling one of the proteins in advance, the labeled protein is brought into contact with the other protein in the presence of the test compound, and after washing, the bound protein is detected or measured with the label.

本方法におけるタンパク質の標識のためには、放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン）およびビオチン/アビジンなどの標識物質を用いることができる。タンパク質を放射性同位体で標識する場合には、検出または測定を液体シンチレーションによって行うことができる。または、酵素で標識したタンパク質は、呈色などの基質の酵素的変化を検出するために、酵素基質を添加して吸光光度計で検出または測定することもできる。さらに、蛍光物質を標識として用いる場合には、結合したタンパク質を蛍光光度計を用いて検出または測定することができる。 For protein labeling in this method, radioactive isotopes (eg 3 H, 14 C, 32 P, 33 P, 35 S, 125 I, 131 I), enzymes (eg alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, Labeling substances such as β-galactosidase, β-glucosidase), fluorescent substances (eg fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine) and biotin / avidin can be used. If the protein is labeled with a radioisotope, detection or measurement can be performed by liquid scintillation. Alternatively, a protein labeled with an enzyme can be detected or measured with an absorptiometer by adding an enzyme substrate in order to detect an enzymatic change of the substrate such as coloration. Furthermore, when a fluorescent substance is used as a label, the bound protein can be detected or measured using a fluorometer.

さらに、PPIL1ポリペプチドとSNW1またはスタスミンとの結合を、PPIL1ポリペプチドおよびSNW1またはスタスミンに対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体上に固定させたPPIL1ポリペプチドを被験化合物およびSNW1またはスタスミンと接触させた後に、混合物をインキュベートし、洗浄した上で、SNW1またはスタスミンに対する抗体を用いて検出または測定を行うことができる。または、SNW1またはスタスミンを支持体上に固定化し、PPIL1に対する抗体を抗体として用いてもよい。   Furthermore, the binding of PPIL1 polypeptide to SNW1 or stathmin can be detected or measured using PPIL1 polypeptide and an antibody against SNW1 or stathmin. For example, after contacting PPIL1 polypeptide immobilized on a support with a test compound and SNW1 or stathmin, the mixture is incubated, washed, and then detected or measured using an antibody against SNW1 or stathmin. it can. Alternatively, SNW1 or stathmin may be immobilized on a support, and an antibody against PPIL1 may be used as the antibody.

抗体を本スクリーニングに用いる場合には、抗体を上記の標識物質のいずれかで標識し、標識物質に基づいて検出または測定を行うことが好ましい。または、標識物質で標識した二次抗体によって検出されるように、PPIL1ポリペプチド、SNW1またはスタスミンに対する抗体を一次抗体として用いてもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質と結合した抗体は、プロテインGまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定することもできる。   When an antibody is used for this screening, it is preferable to label the antibody with any of the labeling substances described above and perform detection or measurement based on the labeling substance. Alternatively, an antibody against PPIL1 polypeptide, SNW1 or stathmin may be used as the primary antibody as detected by a secondary antibody labeled with a labeling substance. Furthermore, the antibody bound to the protein in the screening of the present invention can also be detected or measured using a protein G or protein A column.

または、本発明のスクリーニング方法のもう1つの態様において、細胞を利用する2-ハイブリッド系を用いることもできる（「MATCHMAKER 2-ハイブリッド系」「哺乳動物MATCHMAKER 2-ハイブリッドアッセイキット」「MATCHMAKER 1-ハイブリッド系」（クロンテック）；「HybriZAP 2-ハイブリッドベクター系」（ストラタジーン）；参考文献「DaltonおよびTreisman、Cell 68: 597-612 (1992)」「FieldsおよびSternglanz、Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）。   Alternatively, in another embodiment of the screening method of the present invention, a two-hybrid system using cells can be used (“MATCHMAKER 2-hybrid system”, “Mammal MATCHMAKER 2-hybrid assay kit”, “MATCHMAKER 1-hybrid”). "HybriZAP 2-hybrid vector system" (Stratagene); References "Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)" "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994) ) ").

2-ハイブリッド系では、本発明のPPIL1ポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて、酵母細胞において発現させる。本発明のPPIL1ポリペプチドと結合するSNW1またはスタスミンをVP16またはGAL4転写活性化領域と融合させ、被験化合物の存在下で酵母細胞において同様に発現させる。被験化合物がPPIL1ポリペプチドとSNW1またはスタスミンとの結合を阻害しなければ、この2つの結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出されるようになる。   In the two-hybrid system, the PPIL1 polypeptide of the invention is fused to the SRF-binding region or GAL4-binding region and expressed in yeast cells. SNW1 or stathmin that binds to the PPIL1 polypeptide of the present invention is fused to the VP16 or GAL4 transcriptional activation region and similarly expressed in yeast cells in the presence of the test compound. If the test compound does not inhibit the binding between the PPIL1 polypeptide and SNW1 or stathmin, the two bindings activate the reporter gene and detect positive clones.

レポーター遺伝子としては、HIS3遺伝子のほかに、例えば、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを用いることができる。   As the reporter gene, for example, Ade2 gene, lacZ gene, CAT gene, luciferase gene and the like can be used in addition to the HIS3 gene.

本スクリーニングによって単離される化合物は、本発明のPPIL1タンパク質の活性を阻害する薬剤の候補であり、PPIL1タンパク質と関連のある疾患、例えば、癌などの細胞増殖性疾患、より具体的には結腸直腸癌の治療に応用することができる。さらに、PPIL1タンパク質とSNW1またはスタスミンとの結合を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物も、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。   The compound isolated by this screening is a candidate for a drug that inhibits the activity of the PPIL1 protein of the present invention, and is associated with PPIL1 protein, for example, cell proliferative diseases such as cancer, more specifically colorectal It can be applied to the treatment of cancer. Furthermore, compounds obtained by the screening method of the present invention include compounds in which a part of the structure of a compound that inhibits the binding of PPIL1 protein to SNW1 or stathmin is converted by addition, deletion, and / or substitution. .

本発明の方法によって単離された化合物を、細胞増殖性疾患（例えば、癌）を治療するために、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、チンパンジーに対して調合薬として投与する場合には、単離された化合物を直接投与してもよく、または既知の薬剤調製法を用いて剤形に製剤化してもよい。例えば、必要に応じて、薬剤を糖衣錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、およびマイクロカプセルとして経口投与することもでき、または水もしくは他の任意の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液である注射剤の形態として非経口的に投与することもできる。例えば、化合物を、一般に認められる薬剤の実現のために必要な単位用量の形で、薬理学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、媒質、保存料、結合剤などと混合することができる。これらの製剤における有効成分の量により、指定された範囲内にある適した投与量が得られる。   The compounds isolated by the methods of the present invention can be used to treat cell proliferative diseases (eg, cancer) and humans and other mammals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs. When administered as a pharmaceutical to cattle, monkeys, baboons, chimpanzees, the isolated compound may be administered directly or may be formulated into dosage forms using known pharmaceutical preparation methods . For example, if desired, the drug can be administered orally as sugar-coated tablets, capsules, elixirs, and microcapsules, or a sterile solution or suspension in water or any other pharmaceutically acceptable liquid It can also be administered parenterally as a liquid injection form. For example, the compound may be in a pharmaceutically acceptable carrier or vehicle, specifically sterile water, saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, in the form of a unit dose necessary for the realization of a generally accepted drug. Can be mixed with agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, media, preservatives, binders and the like. The amount of active ingredient in these formulations will give a suitable dosage within the specified range.

錠剤およびカプセル剤に混合しうる添加剤の例には、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴムおよびアラビアゴムなどの結合剤；結晶セルロースなどの媒質；コーンスターチ、ゼラチンおよびアルギン酸などの膨潤剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味料；ペパーミント、冬緑油およびチェリーなどの香味剤がある。単位投与剤形がカプセル剤である場合には、油などの液体担体も上記の成分にさらに含めることができる。注射用の滅菌混合物は、通常の薬剤の実現に倣って、注射用の蒸留水などの媒体を用いて製剤化することができる。   Examples of additives that can be mixed into tablets and capsules include binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic; media such as crystalline cellulose; swelling agents such as corn starch, gelatin and alginic acid; lubricants such as magnesium stearate Agents; sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin; flavoring agents such as peppermint, winter green oil and cherry. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oil can further be included in the above ingredients. Sterile mixtures for injection can be formulated using a medium such as distilled water for injection following the realization of normal drugs.

生理食塩水、グルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトールおよび塩化ナトリウムなどの佐剤を含むその他の等張液を、注射用の水溶液として用いることができる。これらは適した可溶化剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどの多価アルコール、Polysorbate 80(商標)およびHCO-50などの非イオン性界面活性剤などと組み合わせて用いることができる。   Other isotonic solutions containing saline, glucose, and adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride can be used as an aqueous solution for injection. These are used in combination with suitable solubilizers such as alcohols, specifically polyhydric alcohols such as ethanol, propylene glycol and polyethylene glycol, nonionic surfactants such as Polysorbate 80 ™ and HCO-50, etc. be able to.

ゴマ油またはダイズ油は油脂性液体として用いることができ、これらを可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて用いることもでき、さらにこれらをリン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液；塩酸プロカインなどの鎮痛薬；ベンジルアルコール、フェノールなどの安定剤；および抗酸化剤とともに製剤化することもできる。調製された注射剤は適したアンプルに充填することができる。   Sesame oil or soybean oil can be used as an oleaginous liquid, which can also be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent, and these can be used in buffers such as phosphate buffer and sodium acetate Liquids; analgesics such as procaine hydrochloride; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; and antioxidants can also be formulated. The prepared injection can be filled into a suitable ampoule.

本発明の医薬化合物を、例えば動脈内注射、静脈内注射、皮下注射として、および同じく鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与または経口投与として患者に対して投与するためには、当業者によく知られた方法を用いることができる。投与量および投与方法は患者の体重および年齢ならびに投与方法に応じて異なる；しかし、当業者は慣行的にそれらを選択しうる。前記化合物がDNAによってコードされうる場合には、DNAを遺伝子治療用のベクターに挿入し、治療を行うためにそのベクターを投与することができる。投与量および投与方法は患者の体重、年齢および症状に応じて異なるが、当業者はそれらを適切に選択しうる。   To administer a pharmaceutical compound of the invention to a patient, for example, as an intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, and also as intranasal, transbronchial, intramuscular or oral administration, to a person skilled in the art Well known methods can be used. The dosage and method of administration vary depending on the patient's weight and age and the method of administration; however, one skilled in the art can routinely select them. If the compound can be encoded by DNA, the DNA can be inserted into a gene therapy vector and the vector administered for treatment. The dose and method of administration vary depending on the patient's weight, age and symptoms, but those skilled in the art can appropriately select them.

例えば、症状によって若干の違いはあるものの、本発明のポリペプチドと結合してその活性を調節する化合物の投与量は、標準的な成人（体重60kg）に対して経口投与する場合、約0.1mg〜約100mg/日、好ましくは約1.0mg〜約50mg/日、より好ましくは約1.0mg〜約20mg/日である。   For example, although there are slight differences depending on the symptoms, the dose of the compound that binds to the polypeptide of the present invention and modulates its activity is about 0.1 mg when administered orally to a standard adult (body weight 60 kg). To about 100 mg / day, preferably about 1.0 mg to about 50 mg / day, more preferably about 1.0 mg to about 20 mg / day.

標準的な成人（体重60kg）に対して注射剤の形態として非経口的に投与する場合には、患者、標的臓器、症状および投与方法に応じて若干の違いはあるものの、約0.01mg〜約30mg/日、好ましくは約0.1〜約20mg/日、より好ましくは約0.1〜約10mg/日の用量を静脈注射することが好都合である。同じく、他の動物の場合にも、体重60kgに換算した量を投与することが可能である。   When administered parenterally as a form of injection to a standard adult (body weight 60 kg), there are slight differences depending on the patient, target organ, symptoms and administration method, but about 0.01 mg to about It is convenient to inject a dose of 30 mg / day, preferably about 0.1 to about 20 mg / day, more preferably about 0.1 to about 10 mg / day. Similarly, in the case of other animals, it is possible to administer an amount converted to a body weight of 60 kg.

さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる、癌などの細胞増殖性疾患の治療または予防のための方法を提供する。本方法によれば、本発明のポリペプチドに対する抗体の薬学的有効量を投与する。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、およびAPCDD1タンパク質の発現は癌細胞で上方制御されている上に、これらのタンパク質の発現の抑制は細胞増殖活性の低下をもたらすため、抗体とこれらのタンパク質との結合により、細胞増殖性疾患の治療または予防が可能であると考えられる。このため、本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のタンパク質の活性を低下させるのに十分な投与量（これは0.1〜約250mg/kg/日の範囲にある）で投与される。成人に対する用量の範囲は一般に約5mg〜約17.5g/日であり、好ましくは約5mg〜約10g/日、最も好ましくは約100mg〜約3g/日である。または、腫瘍細胞に特異的な細胞表面マーカーと結合する抗体を薬物送達のためのツールとして用いることもできる。例えば、細胞障害物質を有した抗体を、腫瘍細胞を損傷させるのに十分な用量として投与する。   Furthermore, the present invention provides a method for treating or preventing a cell proliferative disease such as cancer using an antibody against the polypeptide of the present invention. According to this method, a pharmaceutically effective amount of an antibody against the polypeptide of the present invention is administered. Since the expression of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, and APCDD1 proteins is up-regulated in cancer cells, and suppression of the expression of these proteins results in decreased cell proliferative activity, binding of antibodies to these proteins It is considered possible to treat or prevent cell proliferative diseases. Thus, the antibody against the polypeptide of the present invention is administered at a dosage sufficient to reduce the activity of the protein of the present invention (which ranges from 0.1 to about 250 mg / kg / day). The dose range for adults is generally about 5 mg to about 17.5 g / day, preferably about 5 mg to about 10 g / day, and most preferably about 100 mg to about 3 g / day. Alternatively, antibodies that bind to cell surface markers specific for tumor cells can be used as a tool for drug delivery. For example, an antibody with a cytotoxic agent is administered as a dose sufficient to damage tumor cells.

本発明はまた、抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、もしくはAPCDD1タンパク質もしくはその免疫活性断片、またはタンパク質のいずれか1つをコードする核酸およびその断片を投与する段階を含む方法にも関する。WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質またはその免疫活性断片は、細胞増殖性疾患に対するワクチンとして有用である。本発明において、細胞増殖性疾患に対するワクチンとは、動物に接種した時に抗腫瘍免疫を誘導する作用を有する物質のことを指す。一般に、抗腫瘍免疫には以下のような免疫応答が含まれる：
‐腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
‐腫瘍を認識する抗体の誘導、および
‐抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。 The present invention also provides a method for inducing anti-tumor immunity comprising administering a nucleic acid encoding any one of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein or an immunoactive fragment thereof, or a protein thereof, and fragments thereof It also relates to the method of inclusion. WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein or immunologically active fragments thereof are useful as vaccines against cell proliferative diseases. In the present invention, a vaccine against a cell proliferative disease refers to a substance having an action of inducing antitumor immunity when inoculated into an animal. In general, anti-tumor immunity includes immune responses such as:
-Induction of cytotoxic lymphocytes against the tumor,
-Induction of antibodies recognizing tumors, and-induction of anti-tumor cytokine production.

したがって、ある特定のタンパク質が、動物に接種された時にこれらの免疫応答を誘導する場合には、そのタンパク質は抗腫瘍免疫誘導作用を有すると判定される。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、宿主におけるタンパク質に対する免疫系の応答をインビボまたはインビトロで観察することによって検出しうる。   Therefore, if a specific protein induces these immune responses when inoculated into an animal, it is determined that the protein has an antitumor immunity inducing action. Induction of anti-tumor immunity by a protein can be detected by observing the immune system's response to the protein in the host in vivo or in vitro.

例えば、細胞障害性Tリンパ球の誘導を検出するための方法はよく知られている。生体の内部に進入する外来物質は、抗原提示細胞（APC）の作用によってT細胞およびB細胞に対して提示される。APCにより提示された抗原に対して抗原特異的な様式で応答したT細胞は、抗原による刺激のために細胞障害性T細胞（または細胞障害性Tリンパ球；CTL）に分化した後に増殖する（これはT細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、特定のペプチドによるCTL誘導は、そのペプチドをAPCによりT細胞に対して提示させ、CTLの誘導を検出することによって評価することができる。さらに、APCにはCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、マクロファージ、好酸球およびNK細胞を活性化する作用もある。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞も抗腫瘍免疫において重要であるため、これらの細胞の活性化作用を指標として用いてペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用を評価することができる。   For example, methods for detecting the induction of cytotoxic T lymphocytes are well known. A foreign substance that enters the inside of the living body is presented to T cells and B cells by the action of antigen-presenting cells (APC). T cells that have responded in an antigen-specific manner to the antigen presented by APC proliferate after differentiation into cytotoxic T cells (or cytotoxic T lymphocytes; CTLs) for stimulation by the antigen ( This is called T cell activation). Therefore, CTL induction by a specific peptide can be evaluated by presenting the peptide to T cells by APC and detecting the induction of CTL. APC also has the effect of activating CD4 + T cells, CD8 + T cells, macrophages, eosinophils and NK cells. Since CD4 + T cells and CD8 + T cells are also important in anti-tumor immunity, the anti-tumor immunity inducing action of the peptide can be evaluated using the activation effect of these cells as an index.

例えば、樹状細胞（DC）をAPCとして用いてCTLの誘導作用を評価するための方法は周知である。DCは最も強いCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法では、まず被験ポリペプチドをDCと接触させ、続いてこのDCをT細胞と接触させる。DCとの接触後に目的の細胞に対する細胞障害作用を有するT細胞が検出されれば、被験ポリペプチドが細胞障害性T細胞を誘導する活性を持つことが示される。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば、51Cr標識した腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。または、3H-チミジン取り込み活性またはLDH（ラクトースデヒドロゲナーゼ）放出を指標として用いて腫瘍細胞の損傷の程度を評価する方法もよく知られている。 For example, a method for evaluating the inducing action of CTL using dendritic cells (DC) as APC is well known. DC is a representative APC having the strongest CTL inducing action. In this method, the test polypeptide is first contacted with DC, and then this DC is contacted with T cells. If a T cell having a cytotoxic effect on a target cell is detected after contact with DC, it indicates that the test polypeptide has an activity of inducing a cytotoxic T cell. The activity of CTL against tumor can be detected using, for example, lysis of 51 Cr-labeled tumor cells as an indicator. Alternatively, a method of evaluating the degree of tumor cell damage using 3 H-thymidine uptake activity or LDH (lactose dehydrogenase) release as an index is also well known.

APCとしては、DCに限らず、末梢血単核細胞（PBMC）を用いてもよい。この場合、CTLの誘導は、PBMCをGM-CSFおよびIL-4の存在下で培養することによって増強されうることが報告されている。同様に、CTLは、PBMCをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびIL-7の存在下で培養することによっても誘導されることが示されている。   The APC is not limited to DC, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) may be used. In this case, it has been reported that the induction of CTL can be enhanced by culturing PBMC in the presence of GM-CSF and IL-4. Similarly, CTL has been shown to be induced by culturing PBMC in the presence of keyhole limpet hemocyanin (KLH) and IL-7.

これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された被験ポリペプチドは、DC活性化作用とそれに続くCTL誘導活性とを有するポリペプチドである。このため、腫瘍細胞に対するCTLを誘導するポリペプチドは腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、ポリペプチドとの接触によって腫瘍に対するCTLを誘導する能力を獲得したAPCも腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチド抗原の提示によって細胞障害性を獲得したCTLを腫瘍に対するワクチンとして用いることもできる。APCおよびCTLに起因する抗腫瘍免疫を用いた、腫瘍に対するこのような治療方法は、細胞免疫療法と呼ばれる。   The test polypeptide confirmed to have CTL-inducing activity by these methods is a polypeptide having a DC activation action and a subsequent CTL-inducing activity. Therefore, polypeptides that induce CTL against tumor cells are useful as vaccines against tumors. Furthermore, APCs that have acquired the ability to induce CTLs against tumors by contact with polypeptides are also useful as vaccines against tumors. Furthermore, CTLs that have acquired cytotoxicity due to presentation of polypeptide antigens by APC can also be used as vaccines against tumors. Such a treatment for tumors using anti-tumor immunity resulting from APC and CTL is called cellular immunotherapy.

一般に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合には、構造の異なる複数のポリペプチドを併用し、それらをDCと接触させることによってCTL誘導の効率が高まることが知られている。このため、DCをタンパク質断片で刺激する場合には、多くの種類の断片の混合物を用いることが有利である。   In general, when using a polypeptide for cellular immunotherapy, it is known that a plurality of polypeptides having different structures are used in combination, and contacting them with DC increases the efficiency of CTL induction. For this reason, when stimulating DC with protein fragments, it is advantageous to use a mixture of many types of fragments.

または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導を、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって確認することもできる。例えば、ポリペプチドに対する抗体が、ポリペプチドで免疫した実験動物において誘導された場合、および腫瘍細胞の増殖がこのような抗体によって抑制された場合に、そのポリペプチドは抗腫瘍免疫を誘導する能力がある。   Alternatively, the induction of anti-tumor immunity by the polypeptide can be confirmed by observing the induction of antibody production against the tumor. For example, when an antibody to a polypeptide is induced in a laboratory animal immunized with the polypeptide, and the growth of tumor cells is suppressed by such an antibody, the polypeptide is capable of inducing anti-tumor immunity. is there.

抗腫瘍免疫は本発明のワクチンを投与することによって誘導され、これにより、HCCまたは結腸直腸癌の治療および予防が可能になる。癌に対する治療または癌の発症の予防効果には、癌細胞の増殖の阻害活性、癌の退縮、および癌の発症の抑制といった段階のいずれか一つが含まれうる。そのほかに、癌を有する個体の死亡率が低下し、血液中の腫瘍マーカーが減少し、癌に付随する検出可能な症状なども緩和されうる。このような効果は統計学的に有意である、例えば、癌の発症に対する治療効果または予防効果をワクチンを投与しない対照と比較して、5％またはそれ未満の有意水準での観測結果等が好ましい。統計分析には、例えば、スチューデントのt検定、マン-ホイットニーのU検定またはANOVAを用いうる。   Anti-tumor immunity is induced by administering the vaccine of the present invention, which allows the treatment and prevention of HCC or colorectal cancer. The effect of treating cancer or preventing the onset of cancer can include any one of the following stages: inhibitory activity of cancer cell proliferation, regression of cancer, and suppression of onset of cancer. In addition, mortality of individuals with cancer can be reduced, tumor markers in the blood can be reduced, and detectable symptoms associated with cancer can be alleviated. Such an effect is statistically significant, for example, an observation result at a significance level of 5% or less is preferable in comparison with a control in which a vaccine is not administered for a therapeutic or preventive effect on the onset of cancer. . For statistical analysis, for example, Student's t test, Mann-Whitney U test or ANOVA may be used.

免疫学的活性を有する上記のタンパク質、またはタンパク質をコードするベクターを、アジュバントと併用してもよい。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と同時に（または連続して）投与した場合に、そのタンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバンなどが含まれるが、これらには限定されない。さらに、本発明のワクチンを薬学的に許容される担体と適宜配合してもよい。このような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれる。さらに、必要に応じて、安定剤、懸濁剤、保存料、界面活性剤などを含んでもよい。ワクチンは全身的または局所的に投与される。ワクチン投与は単回投与でもよく、または複数回投与により追加刺激されてもよい。   The above-mentioned protein having immunological activity or a vector encoding the protein may be used in combination with an adjuvant. An adjuvant refers to a compound that enhances the immune response to a protein when administered concurrently (or sequentially) with the protein having immunological activity. Examples of adjuvants include, but are not limited to, cholera toxin, salmonella toxin, alum and the like. Furthermore, the vaccine of the present invention may be appropriately blended with a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of such carriers include sterilized water, physiological saline, phosphate buffer, culture solution, and the like. Furthermore, you may contain a stabilizer, a suspension agent, a preservative, surfactant, etc. as needed. The vaccine is administered systemically or locally. Vaccine administration may be a single dose or boosted by multiple doses.

APCまたはCTLを本発明のワクチンとして用いる場合に、腫瘍を、例えばエクスビボの方法によって治療または予防することができる。より具体的に述べると、治療または予防を受ける対象のPBMCを採取し、細胞をエクスビボでポリペプチドと接触させ、APCまたはCTLの誘導後に、細胞を対象に対して投与することができる。ポリペプチドをコードするベクターをPBMC中にエクスビボで導入することによってAPCを誘導することもできる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは投与前にクローニングすることができる。標的細胞を損傷させる活性の高い細胞のクローニングおよび増殖を行うことにより、細胞免疫療法をさらに効率的に行うことができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLは、細胞が由来する個体における細胞免疫療法のみならず、他の個体の同様の種類の腫瘍にも用いうる。   When APC or CTL is used as the vaccine of the present invention, the tumor can be treated or prevented, for example, by the ex vivo method. More specifically, PBMCs of a subject to be treated or prevented can be collected, the cells are contacted with the polypeptide ex vivo, and the cells can be administered to the subject after induction of APC or CTL. APC can also be induced by ex vivo introduction of a vector encoding a polypeptide into PBMC. In vitro derived APCs or CTLs can be cloned prior to administration. Cell immunotherapy can be performed more efficiently by cloning and growing highly active cells that damage target cells. Furthermore, APCs and CTLs isolated in this way can be used not only for cellular immunotherapy in the individual from which the cells are derived, but also for similar types of tumors in other individuals.

さらに、本発明のポリペプチドの薬学的有効量を含む、癌などの細胞増殖性疾患の治療または予防のための薬学的組成物も提供する。この薬学的組成物は抗腫瘍免疫を生じさせるために用いることができる。WDRPUHおよびKRZFPUHの通常の発現はそれぞれ精巣、ならびに胎盤および精巣に限局しており、このため、これらの遺伝子の抑制は他の臓器には有害な影響を及ぼさないと考えられる。したがって、WDRPUHおよびKRZFPUHポリペプチドは細胞増殖性疾患、特にHCCを治療するのに好ましい。   Furthermore, a pharmaceutical composition for treating or preventing a cell proliferative disease such as cancer, comprising a pharmaceutically effective amount of the polypeptide of the present invention is also provided. This pharmaceutical composition can be used to generate anti-tumor immunity. Normal expression of WDRPUH and KRZFPUH is confined to the testis, and placenta and testis, respectively, and therefore suppression of these genes may not have a detrimental effect on other organs. Thus, WDRPUH and KRZFPUH polypeptides are preferred for treating cell proliferative diseases, particularly HCC.

以下の実施例は、本発明を例示するとともに、当業者によるその作成および使用を補助する目的で提示される。実施例はいかなる形でも本発明の範囲を限定することは意図していない。   The following examples are presented to illustrate the present invention and to assist one of ordinary skill in making and using the same. The examples are not intended to limit the scope of the invention in any way.

別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。本発明の実施または検討においては本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に説明するものである。本明細書中に引用するいかなる特許、特許出願および刊行物も参照として本明細書に組み入れられる。   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are described below. Any patents, patent applications, and publications cited herein are hereby incorporated by reference.

発明を実施するための最良の態様
本発明は以下の実施例によって詳細に例示されるが、これらの実施例には限定されない。 Best Mode for Carrying Out the Invention The present invention is illustrated in detail by the following examples, but is not limited to these examples.

実施例1：HCCにおいて高頻度に上方制御される2つの新規遺伝子WDRPUHおよびKRZFDUHの同定
23040種の遺伝子を含む、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイ（施設内で作製した）を用いて、20例のHCCの発現プロファイルを、対応する非癌肝組織のプロファイルと比較した。より具体的には、HCC組織および対応する非癌組織は、外科手術を受けた患者の外科手術標本からインフォームドコンセントを得た上で入手した。キアゲンRNeasyキット（キアゲン）またはTrizol試薬（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを顕微解剖組織から抽出した。抽出した全RNAをDNアーゼIで消化し、Ampliscribe T7転写キット（エピセンターテクノロジーズ（Epicentre Technologies））を用いて増幅し、逆転写時にCy色素（アマシャム（Amersham））を用いて標識した。非癌組織および腫瘍由来のRNAを標識するためにそれぞれCy5およびCy3を用いた。続いて、ハイブリダイゼーション、洗浄、および検出をOnoらの方法（Cancer Res 60：5007-11（2000)）に従って行った。各標的スポットでのCy5およびCy3の蛍光強度をArray Visionソフトウエア（アマシャムファルマシア（Amersham Pharmacia））を用いて測定した。測定は2回ずつ行い、各標的スポットで検出された蛍光強度からバックグラウンドシグナルを差し引いた後に、平均値を算出した。続いて、各スライドについて、52種のハウスキーピング遺伝子の平均Cy5強度および平均Cy3強度が合致するように、スライド上で検出されたすべての蛍光強度を標準化した。Cy3およびCy5の両方に関して蛍光強度が25,000単位未満であった遺伝子は以降の検討から除外し、Cy3/Cy5シグナル比が＞2.0であったものを以降の評価のために選択した。 Example 1: Identification of two novel genes WDRPUH and KRZFDUH that are frequently upregulated in HCC
Using a genome-wide cDNA microarray (made in-house) containing 23040 genes, the expression profiles of 20 HCCs were compared with the corresponding non-cancerous liver tissue profiles. More specifically, HCC tissues and corresponding non-cancerous tissues were obtained after obtaining informed consent from surgical specimens of patients undergoing surgery. Total RNA was extracted from microdissected tissues using Qiagen RNeasy kit (Qiagen) or Trizol reagent (Life Technologies) according to the manufacturer's protocol. The extracted total RNA was digested with DNase I, amplified using Ampliscribe T7 transcription kit (Epicentre Technologies) and labeled with Cy dye (Amersham) during reverse transcription. Cy5 and Cy3 were used to label RNA from non-cancerous tissue and tumor, respectively. Subsequently, hybridization, washing, and detection were performed according to the method of Ono et al. (Cancer Res 60: 5007-11 (2000)). The fluorescence intensity of Cy5 and Cy3 at each target spot was measured using Array Vision software (Amersham Pharmacia). The measurement was performed twice, and the average value was calculated after subtracting the background signal from the fluorescence intensity detected at each target spot. Subsequently, for each slide, all fluorescence intensities detected on the slide were normalized so that the average Cy5 intensity and the average Cy3 intensity of 52 housekeeping genes matched. Genes with fluorescence intensity less than 25,000 units for both Cy3 and Cy5 were excluded from further studies and those with a Cy3 / Cy5 signal ratio> 2.0 were selected for further evaluation.

HCCで高頻度に上方制御される遺伝子のうち、UniGeneクラスター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）のEST（Hs.122614）に対応する施設内アクセッション番号D3197の遺伝子が、12例のHCCのうち11例で、対応する非癌肝組織に比べ過剰発現していた（図1a）。この遺伝子はWD40反復を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでおり、このためWDRPUH（WD40 repeat protein up-regulated in HCCs）と命名された。WDRPUHはまた、2例の胃癌のうち1例でも上方制御されていた。さらに、14例のHCCのうち11例で、対応する非癌肝組織に比べ有意に上方制御される遺伝子として施設内アクセッション番号C6242（EST Hs.58461）の遺伝子が検出され（図1b）、この遺伝子は、それがコードするタンパク質がジンクフィンガーモチーフを含むことに基づいて、KRZFPUH（Kruppel-type zinc finger protein up-regulated in HCC）と命名された。KRZFPUHはまた、2例の被験胃癌症例の全例および36例の肺癌症例中2例でも上方制御されていた。   Among the genes that are frequently upregulated by HCC, the institutional accession number D3197 corresponding to the EST (Hs.122614) of the UniGene cluster (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) The gene was overexpressed in 11 of 12 HCCs compared to the corresponding non-cancerous liver tissue (Figure 1a). This gene contains an open reading frame encoding a protein containing the WD40 repeat and was therefore named WDRPUH (WD40 repeat protein up-regulated in HCCs). WDRPUH was also up-regulated in 1 of 2 gastric cancers. Furthermore, in 11 of 14 HCCs, the gene of institutional accession number C6242 (EST Hs.58461) was detected as a gene that was significantly up-regulated compared to the corresponding non-cancerous liver tissue (FIG. 1b), This gene was named KRZFPUH (Kruppel-type zinc finger protein up-regulated in HCC) based on the fact that the protein it encodes contains a zinc finger motif. KRZFPUH was also up-regulated in all 2 gastric cancer cases and 2 of 36 lung cancer cases.

引き続いて、WDRPUHおよびKRZFPUHの発現上昇を別の10例のHCC症例で確認するために半定量的RT-PCRを用いた（図1cおよびd）。具体的には、キアゲンRNeasyキット（キアゲン）またはTrizol試薬（ライフテクノロジーズ）を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを抽出した。ポリdT12-18プライマー（アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））をSuperscript II逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）とともに用いて、全RNAの10μgアリコートを逆転写し、一本鎖cDNAとした。得られた一本鎖cDNA調製物を、容積20μlのPCR緩衝液（タカラ（TaKaRa））中に希釈した。続いて、以下のプライマーを用い、標準的なRT-PCR法によるPCR増幅を行った：
WDRPUHフォワードプライマー：5'-CAGGTGGAAATGACCATCTGGTCAAAG-3'（配列番号：9）およびリバースプライマー：5'-CATCAGCTTCAGGAGGTATATGGTAC-3'（配列番号：10）；ならびに
KRZFPUHフォワードプライマー：5'-GTGGCACTGTGGTGTTACCTTAT-3'（配列番号：11）およびリバースプライマー：5'-CCTCTAAACCTTTGCCTACGACT-3'（配列番号：12）。 Subsequently, semi-quantitative RT-PCR was used to confirm elevated expression of WDRPUH and KRZFPUH in another 10 HCC cases (FIGS. 1c and d). Specifically, total RNA was extracted using Qiagen RNeasy kit (Qiagen) or Trizol reagent (Life Technologies) according to the manufacturer's protocol. Using a poly dT 12-18 primer (Amersham Pharmacia Biotech) with Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies), a 10 μg aliquot of total RNA was reverse transcribed into single stranded cDNA. The resulting single-stranded cDNA preparation was diluted in a 20 μl volume of PCR buffer (TaKaRa). Subsequently, PCR amplification by standard RT-PCR was performed using the following primers:
WDRPUH forward primer: 5'-CAGGTGGAAATGACCATCTGGTCAAAG-3 '(SEQ ID NO: 9) and reverse primer: 5'-CATCAGCTTCAGGAGGTATATGGTAC-3' (SEQ ID NO: 10); and
KRZFPUH forward primer: 5′-GTGGCACTGTGGTGTTACCTTAT-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and reverse primer: 5′-CCTCTAAACCTTTGCCTACGACT-3 ′ (SEQ ID NO: 12).

増幅はGeneAmp PCRシステム9700（パーキンエルマー（Perkin-Elmer））を以下の条件で用いて行った：94℃ 4分間の変性の後に、94℃ 30秒間、56℃ 30秒間、72℃ 45秒間を35サイクル。   Amplification was performed using a GeneAmp PCR system 9700 (Perkin-Elmer) under the following conditions: 94 ° C. for 4 minutes after denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 45 seconds. cycle.

実施例2：新規ヒト遺伝子WDRPUHの発現、単離、および特徴分析
次に、WDRPUHのPCR産物をプローブとして用いる多組織ノーザンブロット分析を行った。より具体的には、ヒト多組織ブロット（クロンテック）をWDRPUHの32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンにより-80℃で24〜72時間行った。その結果、2kb転写物が精巣で大量に発現することが見いだされた（図2a）。D3197はノーザンブロット上で検出されたWDRPUH cDNAよりもサイズが小さかったため、本発明者らは次にWDRPUH cDNAの5'配列を調べた。まず、BLASTプログラムを用いてゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中のD3197に対応するゲノム配列を検索し、染色体バンド17p13に位置づけられているコスミド配列（GenBankアクセッション番号AC026855）を見いだした。このゲノム配列のエクソン配列候補をGENSCAN、Gene RecognitionおよびAssembly Internet Linkプログラムを用いて予想し、予想されたエクソン配列を連結した。続いて、cDNA末端の5'迅速増幅（5'RACE）を以下の通りに行った。Marathon cDNA増幅キット（クロンテック）を用い、製造者の指示に従って5'RACEを行った。WDRPUHの5'部分を、遺伝子特異的リバースプライマー5'-TTACCGTCGTTCCATGCTGAAATGATGC-3'（配列番号：13）およびキットに付属のAP-1プライマーを用いて調製した。cDNA鋳型はヒト精巣mRNA（クロンテック）から合成し、増幅産物をTAクローニングキット（インビトロジェン）を用いてクローニングし、その配列をABI PRISM 3700DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems））で決定した。決定されたアセンブルされた配列は、620個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードする1860ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2152ヌクレオチド（GenBankアクセッション番号AB065281）からなっていた。Simple Modular Architecture Research Tool（SMART、http://smart.embl-heidelberg.de）を用いたタンパク質モチーフに関する検索により、予想されるタンパク質に11個のWD40反復ドメインがあることが判明した（図2b）。決定したWDRPUHのヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：1および2に示す。 Example 2: Expression, isolation and characterization of the novel human gene WDRPUH Next, a multi-tissue northern blot analysis was performed using the WDRPUH PCR product as a probe. More specifically, human multi-tissue blot (Clontech) was hybridized with WDRPUH 32 P-labeled PCR product. Prehybridization, hybridization, and washing were performed according to the supplier's recommendations. Blot autoradiography was performed at −80 ° C. for 24-72 hours with an intensifying screen. As a result, it was found that a 2 kb transcript was expressed in a large amount in the testis (FIG. 2a). Since D3197 was smaller in size than the WDRPUH cDNA detected on the Northern blot, we next examined the 5 ′ sequence of the WDRPUH cDNA. First, the BLAST program is used to search the genome sequence corresponding to D3197 in the genome database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), and the cosmid sequence located in chromosome band 17p13 ( GenBank accession number AC026855). Candidate exon sequences of this genomic sequence were predicted using the GENSCAN, Gene Recognition, and Assembly Internet Link programs, and the predicted exon sequences were linked. Subsequently, 5 ′ rapid amplification of cDNA ends (5′RACE) was performed as follows. 5'RACE was performed using a Marathon cDNA amplification kit (Clontech) according to the manufacturer's instructions. The 5 ′ portion of WDRPUH was prepared using the gene-specific reverse primer 5′-TTACCGTCGTTCCATGCTGAAATGATGC-3 ′ (SEQ ID NO: 13) and the AP-1 primer attached to the kit. The cDNA template was synthesized from human testis mRNA (Clontech), the amplified product was cloned using a TA cloning kit (Invitrogen), and the sequence was determined with an ABI PRISM 3700 DNA sequencer (Applied Biosystems). The determined assembled sequence consisted of 2152 nucleotides (GenBank accession number AB065281) containing an open reading frame of 1860 nucleotides encoding a protein with 620 amino acid residues. A search for protein motifs using the Simple Modular Architecture Research Tool (SMART, http://smart.embl-heidelberg.de) revealed that the predicted protein has 11 WD40 repeat domains (Figure 2b). . The determined nucleotide sequence of WDRPUH and its predicted amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.

実施例3：WDRPUHの細胞内局在
WDRPUHに対応する全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット：5'-GGGGTACCACCATGGATAACAAAATTTCGCCGGAG-3'（配列番号：14）および5'-CGGAATTCTCAGGAGGTATATGGGTACTTCCATGC-3'（配列番号：15）を用いて増幅し、pcDNA3.1myc/Hisベクター（インビトロジェン）中にクローニングした。続いて、構築されたベクターpcDNA3.1myc/His-WDRPUHをSNU475細胞（韓国細胞株バンク（Korea cell-line bank））に一過的にトランスフェクトし、この細胞をRPMI1640中で増殖させた。4％パラホルムアルデヒドを含むPBS中で細胞を15分間かけて固定し、続いて0.1％Triton X-100を含むPBSにより室温（RT）で2.5分間の透過化処理を行った。その後に、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするために細胞を2％BSA（PBS中）で覆い、4℃で24時間おいた。1：1000に希釈したマウス抗mycモノクローナル抗体（シグマ（Sigma））を免疫細胞化学染色のための一次抗体として用い、ローダミン結合抗マウス二次抗体（LeincoおよびICN）とのインキュベーションにより反応物を可視化した。核は4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸（DAPI）で対比染色した。蛍光画像はECLIPSE E800顕微鏡によって得た。その結果、タグ標識WDRPUHタンパク質が細胞の細胞質中に存在することが判明した（図3）。 Example 3: Subcellular localization of WDRPUH
The entire coding region corresponding to WDRPUH is amplified using a set of gene-specific primers: 5'-GGGGTACCACCATGGATAACAAAATTTCGCCGGAG-3 '(SEQ ID NO: 14) and 5'-CGGAATTCTCAGGAGGTATATGGGTACTTCCATGC-3' (SEQ ID NO: 15), and pcDNA3 Cloned into .1 myc / His vector (Invitrogen). Subsequently, the constructed vector pcDNA3.1myc / His-WDRPUH was transiently transfected into SNU475 cells (Korea cell-line bank) and the cells were grown in RPMI1640. Cells were fixed for 15 minutes in PBS containing 4% paraformaldehyde, followed by permeabilization with PBS containing 0.1% Triton X-100 for 2.5 minutes at room temperature (RT). Thereafter, the cells were covered with 2% BSA (in PBS) to block non-specific hybridization and left at 4 ° C. for 24 hours. Mouse anti-myc monoclonal antibody (Sigma) diluted 1: 1000 is used as the primary antibody for immunocytochemical staining, and the reaction is visualized by incubation with rhodamine-conjugated anti-mouse secondary antibodies (Leinco and ICN) did. The nuclei were counterstained with 4 ′, 6′-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Fluorescence images were obtained with an ECLIPSE E800 microscope. As a result, it was found that the tag-labeled WDRPUH protein is present in the cytoplasm of the cell (FIG. 3).

実施例4：細胞増殖に対するWDRPUHの作用
細胞増殖に対するWDRPUHの作用を分析するために、WDRPUHを発現するプラスミド（pcDNA-WDRPUH）をNIH3T3細胞（ATCC、Rockville、MD）にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。具体的には、WDRPUHに対応する全コード領域を実施例3の通りに増幅し、pcDNA3.1（インビトロジェン）中にクローニングした。この細胞に対してpcDNA-WDRPUHプラスミド、対照プラスミド（擬似）およびWDRPUHの相補鎖を発現するプラスミド（pcDNA-アンチセンス）のそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネティシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で10〜21日インキュベートした。続いて細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。実験はすべて3回ずつ行った。 Example 4: Effect of WDRPUH on cell growth To analyze the effect of WDRPUH on cell proliferation, plasmids (pcDNA-WDRPUH) expressing WDRPUH were transfected into NIH3T3 cells (ATCC, Rockville, MD) to form colonies. The assay was performed. Specifically, the entire coding region corresponding to WDRPUH was amplified as in Example 3 and cloned into pcDNA3.1 (Invitrogen). The cells were transfected with each of a pcDNA-WDRPUH plasmid, a control plasmid (pseudo) and a plasmid expressing the complementary strand of WDRPUH (pcDNA-antisense). Transfected cells were incubated for 10-21 days in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing the appropriate concentration of geneticin. Subsequently, the cells were fixed with 100% methanol and stained with Giemsa solution. All experiments were performed in triplicate.

その結果、pcDNA-WDRPUHをトランスフェクトした細胞には、対照プラスミド（擬似）またはpcDNA-アンチセンスをトランスフェクトした細胞よりも著しく多数のコロニーが形成された（図4aおよびb）。有意差を判定するためにスチューデントのt検定による統計分析を行った。   As a result, cells transfected with pcDNA-WDRPUH formed significantly more colonies than cells transfected with control plasmid (mock) or pcDNA-antisense (FIGS. 4a and b). Statistical analysis by Student's t-test was performed to determine significant differences.

実施例5：WDRPUHの発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによる肝臓癌細胞の増殖抑制
WDRPUHの抑制により、HCC細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、WDRPUHの発現を抑制するよう設計された種々のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した。SNU475細胞（韓国細胞株バンク）を10cm培養皿にプレーティングし（2×10５個/培養皿）、これに対してWDRPUHの第1エクソン-イントロン境界を含むアンチセンスS-オリゴヌクレオチド(WDRPUH-AS4；5'-GGCCTCACCATTGAAG-3'（配列番号：16））または対照S-オリゴヌクレオチド (WDRPUH-S4；5'-CTTCAATGGTGAGGCC-3'（配列番号：17））をLIPOFECTIN試薬（GIBCO BRL）を用いてトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたRPMI1640中で6〜12日にわたって培養した。この細胞を、RT-PCRおよびウエスタンブロットによってWDRPUHおよびGAPDHの発現に関して分析した。 Example 5: Inhibition of growth of liver cancer cells by antisense S-oligonucleotides designed to reduce WDRPUH expression
In order to verify whether inhibition of WDRPUH results in growth delay and / or cell death of HCC cells, various antisense S-oligonucleotides designed to suppress expression of WDRPUH were synthesized. SNU475 cells (Korean cell line bank) were plated on a 10cm culture dish (2 x 10 5 cells / culture dish), whereas an antisense S-oligonucleotide containing the first exon-intron boundary of WDRPUH (WDRPUH- AS4; 5'-GGCCTCACCATTGAAG-3 '(SEQ ID NO: 16)) or control S-oligonucleotide (WDRPUH-S4; 5'-CTTCAATGGTGAGGCC-3' (SEQ ID NO: 17)) using LIPOFECTIN reagent (GIBCO BRL) And cultured in RPMI 1640 supplemented with the appropriate concentration of geneticin for 6-12 days. The cells were analyzed for expression of WDRPUH and GAPDH by RT-PCR and Western blot.

SNU475細胞におけるWDRPUHの内因性発現は、WDRPUH-AS4のトランスフェクションにより、対照（WDRPUH-S4）よりも有意に低下した（図5a）。   Endogenous expression of WDRPUH in SNU475 cells was significantly reduced by transfection with WDRPUH-AS4 over control (WDRPUH-S4) (FIG. 5a).

次に、SNU475細胞を5×10５個/100mm培養皿の密度でプレーティングして、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）アッセイを行った。細胞に対して、WDRPUHの発現を抑制するように設計されたセンスS-オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを3連ずつトランスフェクトした。トランスフェクションから72時間後に、培地を500μg/mlのMTT（シグマ）を含む新たな培地と交換し、プレートを37℃で4時間インキュベートした。その後、1mlの0.01N HCl/10％SDSを添加して細胞を可溶化し、ELISAプレートリーダーを検査波長570nm（基準630nm）で用いて可溶化物の吸光度を測定した。細胞生存度は吸光度を対照細胞の吸光度と比較して表した。 Next, SNU475 cells were plated at a density of 5 × 10 5 cells / 100 mm culture dish and 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Went. The cells were transfected in triplicate with sense S-oligonucleotides or antisense S-oligonucleotides designed to suppress WDRPUH expression. 72 hours after transfection, the medium was replaced with fresh medium containing 500 μg / ml MTT (Sigma) and the plates were incubated at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, 1 ml of 0.01N HCl / 10% SDS was added to solubilize the cells, and the absorbance of the lysate was measured using an ELISA plate reader at a test wavelength of 570 nm (reference 630 nm). Cell viability was expressed by comparing absorbance to that of control cells.

RT-PCRおよびウエスタンブロットによる上記の分析と同様に、WDRPUH-AS4のトランスフェクションにより、生存細胞の数はWDRPUH-S4に比べ有意に減少し（図5b）、このことからWDRPUHが肝細胞癌細胞の細胞増殖および/または生存に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。この結果は3回の独立した実験によって確認された。   Similar to the above analysis by RT-PCR and Western blot, transfection with WDRPUH-AS4 significantly reduced the number of viable cells compared to WDRPUH-S4 (Figure 5b), which indicates that WDRPUH is a hepatocellular carcinoma cell. These results suggest that it may play an important role in cell proliferation and / or survival. This result was confirmed by three independent experiments.

実施例6：WDRPUH siRNAを発現するプラスミドの構築、およびHCC細胞の増殖に対するその効果
哺乳動物細胞において、相補的ヌクレオチド19個および3'末端にチミジンまたはウリジンの相補的二量体を有する20〜21塩基長の二本鎖RNA（dsRNA）から構成される低分子干渉RNA（siRNA）は、遺伝子発現の全体的な変化を伴わずに、遺伝子特異的な遺伝子サイレンシング作用を有することが最近示されている。このため、WDRPUHの発現に対する効果について検討するために、本発明者らはさまざまなWDRPUH-siRNAを発現するプラスミドを構築した。 Example 6: Construction of a plasmid expressing WDRPUH siRNA and its effect on proliferation of HCC cells 20-21 having 19 complementary nucleotides and a thymidine or uridine complementary dimer at the 3 ′ end in mammalian cells Recently, small interfering RNA (siRNA) composed of double-stranded RNA (dsRNA) of base length has been shown to have gene-specific gene silencing action without overall changes in gene expression. ing. For this reason, in order to examine the effect on the expression of WDRPUH, the present inventors constructed plasmids expressing various WDRPUH-siRNAs.

まず、psiH1BX3.0ベクターを以下のようにして構築した。H1RNA遺伝子はRNAポリメラーゼIIIで転写すると、ウリジンが3'末端に存在する短い転写物を生じることが報告されているため、プロモーター領域を含むH1RNA遺伝子のゲノム断片を、プライマーのセット：5'-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3'（配列番号：18）および5'-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3'（配列番号：19）；ならびに鋳型としてヒト胎盤DNAを用いてPCRを行い増幅した。その産物を精製し、TAクローニングキット（インビトロジェン）を用い、供給元のプロトコールに従ってpCR2.0プラスミドベクター中にクローニングした。H1RNA遺伝子を含む断片を、プライマーのセット：5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3'（配列番号：20）および5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3'（配列番号：21）を用いてPCRを行い増幅し、BamHIおよびXhoIで消化して精製した。続いて、H1RNA遺伝子を含む精製BamHI-XhoI断片を、pcDNA3.1(+)（インビトロジェン）のヌクレオチド1257〜56断片中にクローニングした。連結したDNAを鋳型に、プライマー：5'-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3'（配列番号：22）および5'-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3'（配列番号：23）を用いてPCRを行った。この産物をHindIIIで消化し、その後、自己連結させてpsiH1BX3.0ベクタープラスミドを作製した。   First, the psiH1BX3.0 vector was constructed as follows. Since transcription of H1RNA gene with RNA polymerase III has been reported to produce a short transcript in which uridine is present at the 3 'end, the genomic fragment of the H1RNA gene including the promoter region was used as a primer set: 5'-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA -3 ′ (SEQ ID NO: 18) and 5′-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 19); and human placental DNA as a template were amplified by PCR. The product was purified and cloned into a pCR2.0 plasmid vector using a TA cloning kit (Invitrogen) according to the supplier's protocol. A fragment containing the H1 RNA gene was amplified by PCR using a set of primers: 5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3 '(SEQ ID NO: 20) and 5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3' (SEQ ID NO: 21), and BamHI and XhoI Digested with and purified. Subsequently, the purified BamHI-XhoI fragment containing the H1 RNA gene was cloned into the nucleotide 1257-56 fragment of pcDNA3.1 (+) (Invitrogen). Using the ligated DNA as a template, PCR was performed using primers: 5′-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 22) and 5′-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 23). This product was digested with HindIII and then self-ligated to produce the psiH1BX3.0 vector plasmid.

対照プラスミドおよびWDRPUH-siRNAを発現するプラスミドは、二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiH1BX3.0ベクターのBbsI部位にクローニングすることによって調製した。ベクター中にクローニングしたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：
psiH1BX-WDRPUH01、5'-CACCAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTTCAAGAGAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3'（配列番号：24）および5'-AAAAAATGTGATCTTCTCCAGGTGCTCTCTTGAAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3'（配列番号：25）；
psiH1BX-WDRPUH02、5'-CACCAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTTCAAGAGACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3'（配列番号：26）および5'-AAAAAAGGACACCAGTTTCTCGTAGTCTCTTGAACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3'（配列番号：27）；
psiH1BX-WDRPUH03、5'-CACCAAAGAGACGCTCATAGCGACTTTCAAGAGAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3'（配列番号：28）および5'-AAAAAAAGAGACGCTCATAGCGACTTCTCTTGAAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3'（配列番号：29）；
psiH1BX-WDRPUH05、5'-CACCAACGACGGTAAAATCCGAGCCTTCAAGAGAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3'（配列番号：30）および5'-AAAAAACGACGGTAAAATCCGAGCCTCTCTTGAAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3'（配列番号：31）；ならびに
対照psiH1BX-EGFP (擬似)、5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'（配列番号：32）および5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'（配列番号：33）。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。 Control plasmids and plasmids expressing WDRPUH-siRNA were prepared by cloning a double stranded oligonucleotide into the BbsI site of the psiH1BX3.0 vector. The oligonucleotides cloned into the vector were as follows:
psiH1BX-WDRPUH01, 5'-CACC AATGTGATCTTCTCCAGGTGC TTCAAGAGAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3 '(SEQ ID NO: 24) and 5'-AAAA AATGTGATCTTCTCCAGGTGC TCTCTTGAAGCACCTGGAGAAGATCACATT-3' (SEQ ID NO: 25);
psiH1BX-WDRPUH02, 5'-CACC AAGGACACCAGTTTCTCGTAG TTCAAGAGACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3 '(SEQ ID NO: 26) and 5'-AAAA AAGGACACCAGTTTCTCGTAG TCTCTTGAACTACGAGAAACTGGTGTCCTT-3' (SEQ ID NO: 27);
psiH1BX-WDRPUH03, 5'-CACC AAAGAGACGCTCATAGCGACT TTCAAGAGAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3 '(SEQ ID NO: 28) and 5'-AAAA AAAGAGACGCTCATAGCGACT TCTCTTGAAAGTCGCTATGAGCGTCTCTTT-3' (SEQ ID NO: 29);
psiH1BX-WDRPUH05, 5'-CACC AACGACGGTAAAATCCGAGCC TTCAAGAGAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3 '(SEQ ID NO: 30) and 5'-AAAA AACGACGGTAAAATCCGAGCT TCTCTTGAAGGCTCGGATTTTACCGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 31); and psiCTC 3 ′ (SEQ ID NO: 32) and 5′-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 33).
The target sequence of siRNA in each sequence is underlined.

FuGENE6試薬（ロシュ（Roche））を用い、供給元の推奨に従ってこれらのプラスミドをHepG2細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に全RNAを細胞から抽出した。   These plasmids were transfected into HepG2 cells using FuGENE6 reagent (Roche) according to the supplier's recommendations. Total RNA was extracted from the cells 48 hours after transfection.

その結果、これらのうちpsiH1BX-WDRPUH01は、psiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03、またはpsiH1BX-WDRPUH05とは異なり、細胞におけるWDRPUHの発現を有意に抑制した（図6A）。WDRPUHの抑制が肝臓癌細胞の増殖抑制をもたらすか否かを検証するために、HepG2細胞に対してpsiH1BX-WDRPUH01、psiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03、またはpsiH1BX-WDRPUH05、psiH1BX-EGFP、または擬似ベクターをトランスフェクトした。psiH1BX-WDRPUH01をトランスフェクトした細胞の生細胞数はpsiH1BX-WDRPUH02、psiH1BX-WDRPUH03、またはpsiH1BX-WDRPUH05、psiH1BX-EGFP、または対照をトランスフェクトした細胞よりも著しく少なく、このことからWDRPUHの発現低下によって肝臓癌細胞の増殖が抑制されることが示唆された（図6B）。   As a result, among these, psiH1BX-WDRPUH01 significantly suppressed the expression of WDRPUH in cells, unlike psiH1BX-WDRPUH02, psiH1BX-WDRPUH03, or psiH1BX-WDRPUH05 (FIG. 6A). To verify whether suppression of WDRPUH results in suppression of liver cancer cell growth, psiH1BX-WDRPUH01, psiH1BX-WDRPUH02, psiH1BX-WDRPUH03, or psiH1BX-WDRPUH05, psiH1BX-EGFP, or a pseudo-vector on HepG2 cells Was transfected. The number of viable cells transfected with psiH1BX-WDRPUH01 is significantly less than that of psiH1BX-WDRPUH02, psiH1BX-WDRPUH03, or psiH1BX-WDRPUH05, psiH1BX-EGFP, or the control-transfected cells. It was suggested that the proliferation of liver cancer cells was suppressed (FIG. 6B).

実施例7：抗WDRPUH抗体の調製
WDRPUHの発現について検討し、その機能を解明するために、WDRPUHに対するポリクローナル抗体を以下の通りに調製した。まず、His標識した組換えWDRPUHを大腸菌で産生させ、Pro Bond（商標）ヒスチジンレジン（インビトロジェン）を用い、製造者の推奨に従って細胞から精製した。この組換えタンパク質をウサギの免疫処置に用い、WDRPUHに対するポリクローナル抗体を血清から精製した。 Example 7: Preparation of anti-WDRPUH antibody
In order to investigate the expression of WDRPUH and elucidate its function, a polyclonal antibody against WDRPUH was prepared as follows. First, His-tagged recombinant WDRPUH was produced in E. coli and purified from cells using Pro Bond ™ histidine resin (Invitrogen) according to the manufacturer's recommendations. This recombinant protein was used for rabbit immunization and a polyclonal antibody against WDRPUH was purified from serum.

免疫前血清とは異なり、抗WDRPUH血清を用いたイムノブロットではFLAG標識WDRPUHの70kDバンドが検出され、これは抗FLAG抗体を用いて検出されたものとサイズが同じであった（図7）。   Unlike pre-immune serum, immunoblotting with anti-WDRPUH serum detected a 70 kD band of FLAG-labeled WDRPUH, which was the same size as that detected with anti-FLAG antibody (FIG. 7).

実施例8：新規ヒト遺伝子KRZFPUHの発現、単離、および特徴分析
C6242 cDNAをプローブとして用いて、実施例2の通りに多組織ノーザンブロット分析を行った。その結果、2.8kb転写物が胎盤および精巣で大量に発現されることが示された（図8a）。C6242はノーザンブロット上で検出されたものよりもサイズが小さかったため、KRZFPUH cDNAの5'部分の配列を調べた。まず、BLASTプログラムを用いてゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中のC6242に対応するゲノム配列を検索し、染色体バンド16p11に位置づけられているワーキングドラフト（working draft）配列（GenBankアクセッション番号：NT-024802）を見いだした。このゲノム配列とGENSCAN、Gene RecognitionおよびAssembly Internet Linkプログラムを用いてエクソン配列候補を予想し、予想されたエクソン配列を連結した。続いて、プライマーとして5'-TAGATTCTGGGCGCACTTGTGGCTCTCC-3'（配列番号：34）を用いた以外は実施例2の通りに5'RACEを行い、その結果、500アミノ酸のタンパク質をコードする1500ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2744ヌクレオチドのアセンブルされた配列（GenBankアクセッション番号AB065282）を得た。Simple Modular Architecture Research Tool（SMART、http://smart.embl-heidelberg.de）を用いたタンパク質モチーフに関する検索により、予想されるタンパク質がKruppel型ジンクフィンガードメインを含むことが判明した（図8b）。決定されたKRZFPUHのヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：3および4に示されている。 Example 8: Expression, isolation and characterization of a novel human gene KRZFPUH
Multitissue Northern blot analysis was performed as in Example 2 using C6242 cDNA as a probe. As a result, it was shown that the 2.8 kb transcript was expressed in a large amount in the placenta and testis (FIG. 8a). Since C6242 was smaller in size than that detected on the Northern blot, the sequence of the 5 ′ portion of the KRZFPUH cDNA was examined. First, using the BLAST program, a genome sequence corresponding to C6242 in the genome database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) is searched, and a working draft positioned at chromosome band 16p11 ( working draft) sequence (GenBank accession number: NT-024802). Using this genome sequence and the GENSCAN, Gene Recognition, and Assembly Internet Link programs, exon sequence candidates were predicted and the predicted exon sequences were linked. Subsequently, 5′-RACE was performed as in Example 2 except that 5′-TAGATTCTGGGCGCACTTGTGGCTCTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 34) was used as a primer. As a result, a 1500 nucleotide open reading encoding a 500 amino acid protein was performed. An assembled sequence of 2744 nucleotides containing the frame (GenBank accession number AB065282) was obtained. A search for protein motifs using the Simple Modular Architecture Research Tool (SMART, http://smart.embl-heidelberg.de) revealed that the predicted protein contained a Kruppel-type zinc finger domain (FIG. 8b). The determined nucleotide sequence of KRZFPUH and its predicted amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.

実施例9：KRZFPUHの細胞内局在
KRZFPUHに対応する全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット：5'-GGGGTACCACCATGGCGCCACCTTCG-3'（配列番号：35）および5'-CGGAATTCATGGGCGTTGCCCCTCTGACTGG-3'（配列番号：36）を用いて増幅し、pcDNA3.1myc/Hisベクター（インビトロジェン）中にクローニングした。続いて、この構築物をSNU475細胞（韓国細胞株バンク）に一過的にトランスフェクトし、KRZFPUHの細胞内局在を実施例3の通りに調べた。細胞の免疫細胞化学染色により、タグ標識KRZFPUHタンパク質が核内に存在することが判明した（図9）。 Example 9: Subcellular localization of KRZFPUH
The entire coding region corresponding to KRZFPUH is amplified using a set of gene-specific primers: 5'-GGGGTACCACCATGGCGCCACCTTCG-3 '(SEQ ID NO: 35) and 5'-CGGAATTCATGGGCGTTGCCCCTCTGACTGG-3' (SEQ ID NO: 36), and pcDNA3 Cloned into .1 myc / His vector (Invitrogen). Subsequently, this construct was transiently transfected into SNU475 cells (Korean cell line bank), and the intracellular localization of KRZFPUH was examined as in Example 3. Immunohistochemical staining of the cells revealed that the tag-labeled KRZFPUH protein was present in the nucleus (Figure 9).

実施例10：細胞増殖に対するKRZFPUHの作用
細胞増殖に対するKRZFPUHの作用を分析するために、KRZFPUHを発現するプラスミド（pcDNA-KRZFPUH）をCOS7細胞（ATCC、Rockville、MD）にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。具体的には、KRZFPUHに対応する全コード領域を実施例9の通りに増幅し、pcDNA3.1（インビトロジェン）中にクローニングした。この細胞に対してpcDNA-KRZFPUHプラスミド、対照プラスミド（擬似）およびKRZFPUHの相補鎖を発現するプラスミド（pcDNA-アンチセンス）のそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネティシンを含むDMEM中で10〜21日インキュベートした。その後に、細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。実験はすべて3回ずつ行った。図10aおよびbに示したように、KRZFPUHの相補鎖を発現する対照プラスミド（pcDNA-アンチセンス）に比べ、pcDNA-KRZFPUHはCOS7細胞で著しく多くのコロニーを形成した。この結果は3回の独立した実験によって確認された。有意差を判定するためにスチューデントtのt検定による統計分析を行った。 Example 10: Effect of KRZFPUH on cell proliferation To analyze the effect of KRZFPUH on cell proliferation, a plasmid expressing KRZFPUH (pcDNA-KRZFPUH) was transfected into COS7 cells (ATCC, Rockville, MD) to form colonies. The assay was performed. Specifically, the entire coding region corresponding to KRZFPUH was amplified as in Example 9 and cloned into pcDNA3.1 (Invitrogen). The cells were transfected with each of pcDNA-KRZFPUH plasmid, control plasmid (pseudo) and plasmid expressing the complementary strand of KRZFPUH (pcDNA-antisense). Transfected cells were incubated for 10-21 days in DMEM containing the appropriate concentration of geneticin. Thereafter, the cells were fixed with 100% methanol and stained with Giemsa solution. All experiments were performed in triplicate. As shown in FIGS. 10a and b, pcDNA-KRZFPUH formed significantly more colonies in COS7 cells than the control plasmid (pcDNA-antisense) expressing the complementary strand of KRZFPUH. This result was confirmed by three independent experiments. Statistical analysis by Student's t test was performed to determine the significant difference.

実施例11：KRZFPUHの発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによる肝臓癌細胞の増殖抑制
KRZFPUH発現の抑制により、HCC細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、KRZFPUHの発現を抑制するために設計された種々のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した。Alexander細胞（ATCC、Rockville、MD）を10cm培養皿にプレーティングし（2×10５個/培養皿）、これに対してKRZFPUHの第1エクソン-イントロン境界を含むアンチセンスS-オリゴヌクレオチド(KRZFPUH-AS4；5'-GGCCTCACCGAGCGCG-3'（配列番号：37））または対照S-オリゴヌクレオチドKRZFPUH-S4；5'-CGCGCTCGGTGAGGCC-3'（配列番号：38））をLIPOFECTIN試薬（GIBCO BRL）を用いてトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたRPMI1640中で6〜12日間培養した。続いて細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。大量のKRZFPUHを構成性に発現するAlexander細胞において、KRZFPUHの内因性発現および生存細胞の数は、アンチセンスS-オリゴヌクレオチド（KRZFPUH-AS4）のトランスフェクションにより、対照センスS-オリゴヌクレオチド（KRZFPUH-S4）よりも有意に低下し（図11aおよびb）、このことからKRZFPUHがHCC細胞の細胞増殖および/または生存に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。この結果は3回の独立した実験によって確認された。有意差を判定するためにスチューデントのt検定による統計分析を行った。 Example 11: Inhibition of growth of liver cancer cells by antisense S-oligonucleotide designed to reduce KRZFPUH expression
In order to verify whether suppression of KRZFPUH expression resulted in HCC cell growth delay and / or cell death, we synthesized various antisense S-oligonucleotides designed to suppress KRZFPUH expression. . Alexander cells (ATCC, Rockville, MD) were plated into 10cm culture dishes (2 × 10 5 cells / dish), the first exon of KRZFPUH contrast - antisense S- oligonucleotides containing intron boundaries (KRZFPUH -AS4; 5'-GGCCTCACCGAGCGCG-3 '(SEQ ID NO: 37)) or control S-oligonucleotide KRZFPUH-S4; 5'-CGCGCTCGGTGAGGCC-3' (SEQ ID NO: 38)) using LIPOFECTIN reagent (GIBCO BRL) And cultured in RPMI 1640 supplemented with the appropriate concentration of geneticin for 6-12 days. Subsequently, the cells were fixed with 100% methanol and stained with Giemsa solution. In Alexander cells that constitutively express large amounts of KRZFPUH, endogenous expression of KRZFPUH and the number of surviving cells were determined by transfection with an antisense S-oligonucleotide (KRZFPUH-AS4) and a control sense S-oligonucleotide (KRZFPUH- This was significantly lower than that of S4) (FIGS. 11a and b), suggesting that KRZFPUH may play an important role in cell proliferation and / or survival of HCC cells. This result was confirmed by three independent experiments. Statistical analysis by Student's t-test was performed to determine significant differences.

実施例12：KRZFPUH siRNAを発現するプラスミドの構築、およびHCC細胞の増殖に対するその効果
二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiU6BX3.0ベクター中にクローニングすることにより、KRZFPUH-siRNAを発現するプラスミドを調製した。KRZFPUH-siRNA用に用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：
psiU6BX-KRZFPUH1に対しては、5'-CACCAACGAAACACCGATGACTGGGTTCAAGAGACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3'(SEQ ID NO：104) および5'-AAAAAACGAAACACCGATGACTGGGTCTCTTGAACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3' (SEQ ID NO：105) ；
psiU6BX-KRZFPUH2に対しては、5'-CACCAATCACCGGACCACACACACATTCAAGAGATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3' (SEQ ID NO：106) および5'-AAAAAATCACCGGACCACACACACATCTCTTGAATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3' (SEQ ID NO：107)；
psiU6BX-KRZFPUH3に対しては、5'-CACCAAACCTTGCCTACGACATGTTTTCAAGAGAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3' (SEQ ID NO：108) および5'-AAAAAAACCTTGCCTACGACATGTTTCTCTTGAAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3' (SEQ ID NO：109) ；ならびに
psiU6BX-KRZFPUH4に対しては、5'-CACCAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTTCAAGAGACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3' (SEQ ID NO：110) および5'-AAAAAAAAGGTTTCCGTTAGCCCCGTCTCTTGAACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3' (SEQ ID NO：111) 。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。 Example 12: Construction of a plasmid expressing KRZFPUH siRNA and its effect on proliferation of HCC cells A plasmid expressing KRZFPUH-siRNA was prepared by cloning a double-stranded oligonucleotide into the psiU6BX3.0 vector. The oligonucleotides used for KRZFPUH-siRNA were as follows:
For psiU6BX-KRZFPUH1, 5'-CACC AACGAAACACCGATGACTGGG TTCAAGAGACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3 '(SEQ ID NO: 104) and 5'-AAAA AACGAAACACCGATGACTGGG TCTCTTGAACCCAGTCATCGGTGTTTCGTT-3' (SEQ ID NO: 105)
For psiU6BX-KRZFPUH2, 5'-CACC AATCACCGGACCACACACACA TTCAAGAGATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3 '(SEQ ID NO: 106) and 5'-AAAA AATCACCGGACCACACACACA TCTCTTGAATGTGTGTGTGGTCCGGTGATT-3' (SEQ ID NO: 107);
For psiU6BX-KRZFPUH3, 5'-CACC AAACCTTGCCTACGACATGTT TTCAAGAGAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3 '(SEQ ID NO: 108) and 5'-AAAA AAACCTTGCCTACGACATGTT TCTCTTGAAAACATGTCGTAGGCAAGGTTT-3' (SEQ ID NO: 109);
For psiU6BX-KRZFPUH4, 5'-CACC AAAAGGTTTCCGTTAGCCCCG TTCAAGAGACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3 '(SEQ ID NO: 110) and 5'-AAAA AAAAGGTTTCCGTTAGCCCCG TCTCTTGAACGGGGCTAACGGAAACCTTTT-3' (SEQ ID NO: 111).
The target sequence of siRNA in each sequence is underlined.

FuGENE6試薬（ロシュ）を用い、供給元の推奨に従って、psiU6BX-KRZFPUH、psiU6BX-EGFPまたはpsiU6BX-擬似プラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に全RNAを細胞から抽出した。   Cells were transfected with psiU6BX-KRZFPUH, psiU6BX-EGFP or psiU6BX-pseudoplasmid using FuGENE6 reagent (Roche) according to the supplier's recommendations. Total RNA was extracted from the cells 48 hours after transfection.

哺乳動物細胞において、相補的ヌクレオチド19個および3'末端にチミジンまたはウリジンの相補的二量体を有する20または21塩基長の二本鎖RNA（dsRNA）から構成される低分子干渉RNA（siRNA）は、遺伝子発現の全体的な変化を伴わずに、遺伝子特異的な遺伝子サイレンシング作用を有することが最近示されている。このため、KRZFPUHの発現に対する効果について検討するために、本発明者らはさまざまなKRZFPUH-siRNAを発現するプラスミドを構築した。これらのsiRNAのうちpsiU6BX-KRZFPUH2は、psiU6BX-KRZFPUH1、psiU6BX-KRZFPUH3、およびpsiU6BX-KRZFPUH4とは異なり、Huh7細胞、Alexander細胞、HepG2細胞およびSNU449細胞におけるKRZFPUHの発現を有意に抑制した（図12および13、データ非提示）。KRZFPUHの抑制により、肝臓癌細胞の増殖抑制がもたらされるか否かを検証するために、Huh7細胞、Alexander細胞に対してpsiU6BX-KRZFPUH2、psiU6BX-KRZFPUH1、psiU6BX-KRZFPUH3、psiU6BX-KRZFPUH4、psiU6BX-EGFPまたは擬似ベクターをトランスフェクトした。psiU6BX-KRZFPUH2をトランスフェクトした細胞の生細胞数はpsiU6BX-KRZFPUH1、psiU6BX-KRZFPUH3、psiU6BX-KRZFPUH4、psiU6BX-EGFP、または対照をトランスフェクトした細胞よりも著しく少なく、このことからKRZPUHの発現低下によって肝臓癌細胞の増殖が抑制されることが示唆された（図12および13）。   In mammalian cells, small interfering RNA (siRNA) composed of double-stranded RNA (dsRNA) 20 or 21 bases long with 19 complementary nucleotides and a thymidine or uridine complementary dimer at the 3 'end Has recently been shown to have a gene-specific gene silencing effect without an overall change in gene expression. For this reason, in order to examine the effect on the expression of KRZFPUH, the present inventors constructed plasmids expressing various KRZFPUH-siRNAs. Of these siRNAs, psiU6BX-KRZFPUH2, unlike psiU6BX-KRZFPUH1, psiU6BX-KRZFPUH3, and psiU6BX-KRZFPUH4, significantly suppressed KRZFPUH expression in Huh7, Alexander, HepG2 and SNU449 cells (Figure 12 and 13, data not shown). To examine whether suppression of KRZFPUH results in suppression of liver cancer cell growth, psiU6BX-KRZFPUH2, psiU6BX-KRZFPUH1, psiU6BX-KRZFPUH3, psiU6BX-KRZFPUH4, psiU6BX-EGFP against Huh7 cells and Alexander cells Alternatively, a mock vector was transfected. The number of viable cells in psiU6BX-KRZFPUH2 transfected cells is significantly less than in psiU6BX-KRZFPUH1, psiU6BX-KRZFPUH3, psiU6BX-KRZFPUH4, psiU6BX-EGFP, or control-transfected cells, which means that decreased expression of KRZPUH It was suggested that the proliferation of cancer cells was suppressed (FIGS. 12 and 13).

実施例13：ヒト結腸癌において高頻度に上方制御される新規遺伝子PPIL1の同定
23040種の遺伝子を含む、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイ（施設内で作製した）を用いて、実施例1のように、11例の結腸癌組織の発現プロファイルを対応する非癌結腸粘膜組織のものと比較した。この分析により、対応する非癌組織に比べ癌組織で発現レベルが高頻度に上昇している遺伝子が数多く同定された。それらのうち、CGI-124/PPIL1遺伝子（GenBankアクセッション番号：AF151882）に対応する施設内アクセッション番号B9486の遺伝子は、選択基準を満たした6例中全例において、対応する非癌粘膜に比べ癌組織で発現レベルが高く、倍率2.36〜4.68倍の範囲であることが判明した（図14a）。マイクロアレイの結果を明確にするために、別の結腸癌試料におけるこれらの転写物の転写の発現を、プライマー：5'-GGACAGGTCGAGGTGGTGC-3'（フォワード）（配列番号：39）および5'-CTCGACGAGTTCTCCCATCG-3'（リバース）（配列番号：40）を用い、実施例1の通りに半定量的RT-PCRを行って検討した。この半定量的RT-PCRによれば、PPIL1の発現は20例中17例で上昇していることが確認された（図14b）。 Example 13: Identification of a novel gene PPIL1 that is frequently upregulated in human colon cancer
Using a genome-wide cDNA microarray (made in-house) containing 23040 genes, as in Example 1, the expression profile of 11 colon cancer tissues was compared with that of the corresponding non-cancer colon mucosal tissues. Compared. This analysis identified a number of genes whose expression levels increased more frequently in cancer tissues than in corresponding non-cancerous tissues. Among them, the gene of institutional accession number B9486 corresponding to the CGI-124 / PPIL1 gene (GenBank accession number: AF151882) was compared with the corresponding non-cancerous mucosa in all 6 cases that met the selection criteria. It was found that the expression level was high in cancer tissues, and the magnification range was 2.36 to 4.68 times (FIG. 14a). To clarify the microarray results, the expression of the transcripts of these transcripts in different colon cancer samples was analyzed using primers: 5'-GGACAGGTCGAGGTGGTGC-3 '(forward) (SEQ ID NO: 39) and 5'-CTCGACGAGTTCTCCCATCG- Using 3 ′ (reverse) (SEQ ID NO: 40), semi-quantitative RT-PCR was performed as in Example 1 for examination. This semi-quantitative RT-PCR confirmed that PPIL1 expression was increased in 17 of 20 cases (FIG. 14b).

実施例14：PPIL1の構造
PPIL1に対応するAF151882の配列に関する相同性検索を、米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のBLASTプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて公開データベースを対象にさらに行ったところ、PPIL1の5'部分または3'部分をそれぞれ含むBE908798、AK026636を含むESTが同定され、染色体バンド6p21.1に位置づけられているゲノム配列（GenBankアクセッション番号NT_007592）が同定された。アセンブルされたPPIL1のcDNA配列は、498ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む1734ヌクレオチドを有していた。cDNA配列とゲノム配列との比較により、この遺伝子が4つのエクソンからなることが示された。この遺伝子の予想されるアミノ酸配列はマウスのものと98％の同一性を有していた（図15）。決定されたPPIL1のヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：5および6に示す。 Example 14: Structure of PPIL1
Using the BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) of the National Center for Biotechnology Information, a homology search for AF151882 sequences corresponding to PPIL1 When further performed on a public database, ESTs containing BE908798 and AK026636 containing 5 ′ part or 3 ′ part of PPIL1, respectively, were identified, and the genome sequence (GenBank accession number NT_007592) located in chromosome band 6p21.1 was identified. ) Was identified. The assembled PPIL1 cDNA sequence had 1734 nucleotides including an open reading frame of 498 nucleotides. Comparison of the cDNA and genomic sequences showed that this gene consists of four exons. The predicted amino acid sequence of this gene was 98% identical to that of the mouse (FIG. 15). The determined nucleotide sequence of PPIL1 and its predicted amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.

実施例15：細胞増殖に対するPPIL1の作用
細胞増殖に対するPPIL1の作用を分析するために、myc標識PPIL1を発現するプラスミド（pcDNA3.1myc/His-PPIL1）をNIH3T3細胞（ATCC、Rockville、MD）にトランスフェクトして、コロニー形成アッセイを行った。プラスミドは以下の通りに構築した。まず、キアゲンRNeasyキット（キアゲン）またはTrizol試薬（ライフテクノロジーズ）を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを抽出した。ポリdT12-18プライマー（アマシャムファルマシアバイオテク）をSuperscript II逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）とともに用いて、全RNAの10μgアリコートを逆転写し、一本鎖cDNAとした。得られた一本鎖cDNA調製物を、容積20μlのPCR緩衝液（タカラ）中に希釈した。続いて、PPIL1に対応する全コード領域を増幅するために、標準的なRT-PCR実験によるPCR増幅を以下のプライマーを用いて行った：5'-AGACAAGCTTTCCGCCGCCGGC-3'（フォワード）（配列番号：41）および5'-GTCTCTCGAGAAGGGTATGCCTTAATGATCTTC-3'（リバース）（配列番号：42）。 Example 15: Effect of PPIL1 on cell proliferation To analyze the effect of PPIL1 on cell proliferation, a plasmid expressing myc-labeled PPIL1 (pcDNA3.1myc / His-PPIL1) was transferred into NIH3T3 cells (ATCC, Rockville, MD). A colony formation assay was performed. The plasmid was constructed as follows. First, total RNA was extracted using Qiagen RNeasy kit (Qiagen) or Trizol reagent (Life Technologies) according to the manufacturer's protocol. Using a poly dT 12-18 primer (Amersham Pharmacia Biotech) with Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies), a 10 μg aliquot of total RNA was reverse transcribed into single-stranded cDNA. The resulting single-stranded cDNA preparation was diluted in a 20 μl volume of PCR buffer (Takara). Subsequently, in order to amplify the entire coding region corresponding to PPIL1, PCR amplification by a standard RT-PCR experiment was performed using the following primers: 5'-AGACAAGCTTTCCGCCGCCGGC-3 '(forward) (SEQ ID NO: 41) and 5'-GTCTCTCGAGAAGGGTATGCCTTAATGATCTTC-3 '(reverse) (SEQ ID NO: 42).

RT-PCRはGeneAmp PCRシステム9700（パーキンエルマー、Foster City、CA）を以下の条件で用いて行った：94℃ 4分間の変性の後に、94℃ 30秒間、56℃ 30秒間、72℃ 45秒間を28サイクル。増幅断片をpcDNA3.1myc/His（インビトロジェン）ベクター中に挿入した。続いて、構築したpcDNA3.1myc/His-PPIL1をNIH3T3細胞にトランスフェクトした。   RT-PCR was performed using GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) Under the following conditions: 94 ° C. for 4 minutes, followed by 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 45 seconds. The 28 cycles. The amplified fragment was inserted into a pcDNA3.1myc / His (Invitrogen) vector. Subsequently, the constructed pcDNA3.1myc / His-PPIL1 was transfected into NIH3T3 cells.

NIH3T3細胞において、pcDNA3.1myc/His-PPIL1は、対照プラスミドpcDNA3.1myc/His-LacZ、またはPPIL1の相補鎖を発現するpcDNA3.1myc/His-asPPIL1に比べ著しく多くのコロニーを誘導した（図16a）。   In NIH3T3 cells, pcDNA3.1myc / His-PPIL1 induced significantly more colonies than control plasmid pcDNA3.1myc / His-LacZ or pcDNA3.1myc / His-asPPIL1 expressing the complementary strand of PPIL1 (FIG. 16a). ).

さらに、内因性PPIL1の発現量が少ないHCT116ヒト結腸癌細胞（ATCC、Rockville、MD）をpcDNA3.1myc/His-PPIL1のトランスフェクションに用いた以外は、上記と同様の実験を行った。その結果、トランスフェクトしたHCT116ヒト結腸癌細胞ではコロニー形成活性の上昇が認められた（図16b）。   Furthermore, an experiment similar to the above was performed except that HCT116 human colon cancer cells (ATCC, Rockville, MD) with low expression level of endogenous PPIL1 were used for transfection of pcDNA3.1myc / His-PPIL1. As a result, increased colony-forming activity was observed in the transfected HCT116 human colon cancer cells (FIG. 16b).

実施例16：PPIL1の発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドによる結腸癌細胞の増殖抑制
PPIL1の抑制により、結腸癌細胞の増殖遅延および/または細胞死がもたらされるか否かを検証するために、PPIL1に対応する4組の対照S-オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成した：対照センスオリゴヌクレオチドPPIL1-S2、5'-CTTCGCTATGGCGGCA-3'（配列番号：43）；アンチセンスS-オリゴヌクレオチドPPIL1-AS2、5'-TGCCGCCATAGCGAAG-3'（配列番号：44）；およびスクランブル（scramble）S-オリゴヌクレオチドPPIL1-SCR2、5'-GTTGCACAGCGACGCA-3'（配列番号：92）。合成したオリゴヌクレオチドのそれぞれを、検討した11種の結腸癌細胞株の中でPPIL1発現レベルが高いことが示されたヒト結腸癌細胞SW480（ATCC、Rockville、MD）、SNU-C4およびSNU-C5（いずれも韓国細胞株バンク）に対して、LIPOFECTIN試薬（GIBCO BRL）を用いてトランスフェクトした。どの培地にも適切な濃度のジェネティシンを加えた上で、SW480はライボビッツL-15培地中、SNU-C4およびSNU-C5はRPMI1640中で6〜12日間培養した。続いて細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。 Example 16: Inhibition of growth of colon cancer cells by antisense S-oligonucleotides designed to reduce PPIL1 expression
To examine whether inhibition of PPIL1 leads to growth delay and / or cell death of colon cancer cells, four sets of control S-oligonucleotides and antisense S-oligonucleotides corresponding to PPIL1 were synthesized. : Control sense oligonucleotide PPIL1-S2, 5'-CTTCGCTATGGCGGCA-3 '(SEQ ID NO: 43); antisense S-oligonucleotide PPIL1-AS2, 5'-TGCCGCCATAGCGAAG-3' (SEQ ID NO: 44); and scramble ( scramble) S-oligonucleotide PPIL1-SCR2, 5′-GTTGCACAGCGACGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 92). Each of the synthesized oligonucleotides, human colon cancer cells SW480 (ATCC, Rockville, MD), SNU-C4 and SNU-C5, which were shown to have high levels of PPIL1 expression among the 11 colon cancer cell lines studied (Both Korean cell line banks) were transfected using LIPOFECTIN reagent (GIBCO BRL). SW480 was cultured in Leibovitz L-15 medium, and SNU-C4 and SNU-C5 were cultured in RPMI1640 for 6-12 days with the appropriate concentration of geneticin added to each medium. Subsequently, the cells were fixed with 100% methanol and stained with Giemsa solution.

アンチセンスS-オリゴヌクレオチドのうち、PPIL1-AS2はSNU-C5細胞におけるPPIL1の発現を対照センス（PPIL1-S2）に比べ有意に低下させた（図17a）。トランスフェクションから6日後の時点で、PPIL1-AS2をトランスフェクトした細胞の生存細胞数は、対照、PPIL1-S2、またはスクランブルS-オリゴヌクレオチド（PPIL1-SCR2）をトランスフェクトした細胞よりも有意に少なく、このことからPPIL1の抑制により、トランスフェクト細胞の増殖および/または生存度が低下することが示唆された（図17b）。3回の独立した実験で一致する結果が得られた。   Among the antisense S-oligonucleotides, PPIL1-AS2 significantly reduced the expression of PPIL1 in SNU-C5 cells compared to the control sense (PPIL1-S2) (FIG. 17a). Six days after transfection, PPIL1-AS2 transfected cells have significantly fewer viable cells than control, PPIL1-S2, or scrambled S-oligonucleotide (PPIL1-SCR2) transfected cells. This suggests that suppression of PPIL1 decreases the proliferation and / or viability of the transfected cells (FIG. 17b). Consistent results were obtained in three independent experiments.

SW480細胞、SNU-C4細胞およびSNU-C5細胞におけるPPIL1-AS2の増殖阻害作用を測定するために、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）アッセイをさらに行った。具体的には、細胞を5×10５個/100mm培養皿の密度でプレーティングし、それに対して、PPIL1の発現を抑制するように設計されたセンスS-オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを3連ずつトランスフェクトした。トランスフェクションから72時間後に、培地を500μg/mlのMTT（シグマ）を含む新たな培地と交換し、プレートを37℃で4時間インキュベートした。その後に、1mlの0.01N HCl/10％SDSを添加して細胞を可溶化し、ELISAプレートリーダーを検査波長570nm（基準630nm）で用いて可溶化物の吸光度を測定した。細胞生存度は吸光度を対照細胞の吸光度と比較して表した。その結果、これらの3種類の細胞株において、PPIL1-AS2をトランスフェクトした細胞の生細胞数はPPIL1-S2をトランスフェクトした細胞よりも有意に少なかった（図17c）。 In order to measure the growth inhibitory effect of PPIL1-AS2 in SW480 cells, SNU-C4 cells and SNU-C5 cells, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide ( MTT) assay was further performed. Specifically, cells are plated at a density of 5 × 10 5 cells / 100 mm culture dish, whereas sense S-oligonucleotide or antisense S-oligonucleotide designed to suppress PPIL1 expression. Were transfected in triplicate. 72 hours after transfection, the medium was replaced with fresh medium containing 500 μg / ml MTT (Sigma) and the plates were incubated at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, 1 ml of 0.01N HCl / 10% SDS was added to solubilize the cells, and the absorbance of the lysate was measured using an ELISA plate reader at a test wavelength of 570 nm (reference 630 nm). Cell viability was expressed by comparing absorbance to that of control cells. As a result, in these three cell lines, the number of viable cells transfected with PPIL1-AS2 was significantly less than that of cells transfected with PPIL1-S2 (FIG. 17c).

実施例17：PPIL1タンパク質とSNW1との相互作用
PPIL1との相同性が高い2種類の原核生物タンパク質、Cyp2（***酵母（Schizosaccharomyces pombe））およびCypE（細胞性粘菌（Dictiostelium discoideum））は、それぞれSnw1およびSnwAと相互作用することが報告されている。このため、PPIL1タンパク質はSnw1およびSnwAのヒトホモログであるSNW1/SKIPと会合するとの仮説を立てた。この仮説を検討するために、Flag標識PPIL1タンパク質を発現するpFLAG-PPIL1を構築した。まず、PPIL1の全コード領域を実施例15の通りに増幅し、その産物をpFLAG-CMV-5c（シグマ）のクローニング部位にクローニングしてpFLAG-PPIL1を調製した。同様に、SNW1の全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット：5'-TGGGAAQTTCCGGAAGAAGATGGCGCTCACCAGC-3'（フォワード）（配列番号：45）および5'-GTGCCTCGAGCTTCCTCCTCTTCTTGCCTTCATGC-3'（リバース）（配列番号：46）を用いてRT-PCRにより増幅し、pcDNA3.1myc/His（インビトロジェン）のクローニング部位にクローニングして、myc標識SNW1を発現するpcDNA3.1myc-SNW1を構築した。次に、pFLAG-PPIL1を単独で、またはpcDNA3.1myc-SNW1とともにCOS7細胞（ATCC、Rockville、MD）にトランスフェクトした。 Example 17: Interaction between PPIL1 protein and SNW1
Two prokaryotic proteins with high homology to PPIL1, Cyp2 (Schizosaccharomyces pombe) and CypE (Dictiostelium discoideum) have been reported to interact with Snw1 and SnwA, respectively. Yes. For this reason, it was hypothesized that PPIL1 protein associates with SNW1 / SKIP, a human homologue of Snw1 and SnwA. To examine this hypothesis, pFLAG-PPIL1 expressing a Flag-tagged PPIL1 protein was constructed. First, the entire coding region of PPIL1 was amplified as in Example 15, and the product was cloned into the cloning site of pFLAG-CMV-5c (Sigma) to prepare pFLAG-PPIL1. Similarly, the entire coding region of SNW1 is a gene-specific primer set: 5'-TGGGAAQTTCCGGAAGAAGATGGCGCTCACCAGC-3 '(forward) (SEQ ID NO: 45) and 5'-GTGCCTCGAGCTTCCTCCTCTTCTTGCCTTCATGC-3' (reverse) (SEQ ID NO: 46) Was amplified by RT-PCR and cloned into the cloning site of pcDNA3.1myc / His (Invitrogen) to construct pcDNA3.1myc-SNW1 expressing myc-tagged SNW1. PFLAG-PPIL1 was then transfected into COS7 cells (ATCC, Rockville, MD) alone or with pcDNA3.1myc-SNW1.

続いて、抗FLAG抗体による細胞可溶化物の免疫沈降を以下の通りに行った：pFLAG-PPIL1およびpcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトしたCOS7細胞をトランスフェクション48時間後に回収し、20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1％NP-40、および1X完全プロテアーゼ阻害剤カクテルEDTA(-)（ベーリンガー（Boehringer））を含む可溶化緩衝液に溶解した。この細胞可溶化物を抗FLAG M2抗体（シグマ）によって免疫沈降させた。沈降したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、抗FLAG M2抗体を用いてイムノブロット分析を行った。   Subsequently, immunoprecipitation of cell lysates with anti-FLAG antibody was performed as follows: COS7 cells transfected with pFLAG-PPIL1 and pcDNA3.1myc / His-SNW1 were collected 48 hours after transfection and 20 mM Tris. Dissolved in solubilization buffer containing -HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, and 1X complete protease inhibitor cocktail EDTA (-) (Boehringer). The cell lysate was immunoprecipitated with anti-FLAG M2 antibody (Sigma). Precipitated proteins were separated by SDS-PAGE and immunoblot analysis was performed using anti-FLAG M2 antibody.

免疫沈降の後に、抗c-Myc抗体を用いてイムノブロット分析を行った。具体的には、pFLAG-PPIL1および/またはpcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトした細胞をPBSで2回洗い、可溶化緩衝液（150mM NaCl、1％Triton X-100、50mM Tris-HCl pH 7.4、1mM DTT、および1X完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ベーリンガー））中に回収した。細胞のホモジナイズ処理および10,000×g、30分間の遠心処理の後に、Bradfordアッセイ（Bio-Rad）によって上清をタンパク質濃度に関して標準化した。タンパク質を10％SDS-PAGEにより分離し、マウス抗myc抗体（サンタクルズ（SANTA CRUZ））を用いてイムノブロットを行った。HRP結合ヤギ抗マウスIgG（アマシャム）を、ECL検出システム（アマシャム）用の二次抗体として用いた。   Immunoprecipitation was followed by immunoblot analysis using anti-c-Myc antibody. Specifically, cells transfected with pFLAG-PPIL1 and / or pcDNA3.1myc / His-SNW1 were washed twice with PBS and solubilized buffer (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM DTT, and 1X complete protease inhibitor cocktail (Boehringer)). After cell homogenization and centrifugation at 10,000 × g for 30 minutes, supernatants were normalized for protein concentration by Bradford assay (Bio-Rad). Proteins were separated by 10% SDS-PAGE and immunoblotted using a mouse anti-myc antibody (SANTA CRUZ). HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Amersham) was used as a secondary antibody for the ECL detection system (Amersham).

その結果、細胞に対して両方のプラスミドを同時にトランスフェクトした場合には、myc標識SNW1タンパク質に対応するバンドが観察された（図18）。さらに、抗cMyc抗体を用いて可溶化物の免疫沈降を行うと、Flag標識PPIL1タンパク質が沈降した。これらの結果から、PPIL1がインビボで直接的または間接的にSNW1と会合しうることが裏づけられた。   As a result, when cells were transfected with both plasmids simultaneously, a band corresponding to myc-labeled SNW1 protein was observed (FIG. 18). Furthermore, when the lysate was immunoprecipitated using an anti-cMyc antibody, Flag-labeled PPIL1 protein was precipitated. These results confirmed that PPIL1 can associate with SNW1 directly or indirectly in vivo.

実施例18：PPIL1とSNW1の共存
PPIL1とSNW1の会合をさらに確かめるために、COS7細胞におけるFLAG標識PPIL1タンパク質およびmyc標識SNW1タンパク質の細胞内局在を、pFLAG-PPIL1およびpcDNA3.1myc-SNW1を同時トランスフェクトした細胞に対し抗FLAG抗体を用いて免疫組織化学染色することで検討した。具体的には、pFLAG-PPIL1およびpcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトした細胞を、4％パラホルムアルデヒドを含むPBS中に15分間おいて固定した後に、0.1％Triton X-100を含むPBS中に室温で2.5分間おいて透過化処理を行った。その後、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするために細胞を2％BSA（PBS中）で覆い、4℃で24時間おいた。1：1000に希釈したマウス抗mycモノクローナル抗体（シグマ）または1：2000に希釈したマウス抗FLAG抗体（シグマ）を免疫細胞化学染色のための一次抗体として用い、ローダミン結合抗マウス二次抗体（LeincoおよびICN）とのインキュベーションにより反応物を可視化した。核はDAPIで対比染色した。蛍光画像はECLIPSE E800顕微鏡によって得た。 Example 18: Coexistence of PPIL1 and SNW1
To further confirm the association of PPIL1 and SNW1, the intracellular localization of FLAG-tagged PPIL1 protein and myc-tagged SNW1 protein in COS7 cells and anti-FLAG antibody against cells co-transfected with pFLAG-PPIL1 and pcDNA3.1myc-SNW1 Were examined by immunohistochemical staining. Specifically, cells transfected with pFLAG-PPIL1 and pcDNA3.1myc / His-SNW1 were fixed in PBS containing 4% paraformaldehyde for 15 minutes and then in PBS containing 0.1% Triton X-100. The permeabilization treatment was performed at room temperature for 2.5 minutes. The cells were then covered with 2% BSA (in PBS) and blocked at 4 ° C. for 24 hours to block nonspecific hybridization. Mouse anti-myc monoclonal antibody (Sigma) diluted 1: 1000 or mouse anti-FLAG antibody (Sigma) diluted 1: 2000 was used as the primary antibody for immunocytochemical staining, and rhodamine-conjugated anti-mouse secondary antibody (Leinco And the reaction was visualized by incubation with ICN). Nuclei were counterstained with DAPI. Fluorescence images were obtained with an ECLIPSE E800 microscope.

抗FLAG抗体を用いた細胞の免疫組織化学染色によって核内のシグナルが示され、抗myc抗体を用いた場合にも核および細胞質に同様の陽性染色が示された。マージ画像（図19aおよびb）およびDAPIの対比染色（図19c）により、FLAG標識PPIL1タンパク質およびmyc標識SNW1タンパク質が核内に共存することが示され（図19d）、これはPPIL1とSNW1が相互作用するという見解と一致した。   Signals in the nucleus were shown by immunohistochemical staining of cells with anti-FLAG antibody, and similar positive staining was shown in the nucleus and cytoplasm when anti-myc antibody was used. Merged images (Figures 19a and b) and DAPI counterstaining (Figure 19c) show that FLAG-labeled PPIL1 protein and myc-labeled SNW1 protein coexist in the nucleus (Figure 19d), indicating that PPIL1 and SNW1 interact Consistent with the view that it works.

実施例19：ヒト多組織におけるPPIL1の発現
PPIL1 cDNAをプローブとして用いて多組織ノーザンブロット分析を行った。具体的には、ヒト多組織ブロット（クロンテック、Palo Alto、CA）をPPIL1の32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンを-80℃で24〜72時間用いて行った。 Example 19: PPIL1 expression in human multiple tissues
Multi-tissue Northern blot analysis was performed using PPIL1 cDNA as a probe. Specifically, a human multi-tissue blot (Clontech, Palo Alto, Calif.) Was hybridized with a 32 P-labeled PCR product of PPIL1. Prehybridization, hybridization, and washing were performed according to the supplier's recommendations. Blot autoradiography was performed using an intensifying screen at -80 ° C for 24-72 hours.

その結果、発現した1.7kb転写物の遍在性発現が示された。検討した組織のうち、心臓、骨格筋、精巣、甲状腺および副腎で大量の発現が観察された（図20）。   The results showed ubiquitous expression of the expressed 1.7 kb transcript. Among the examined tissues, a large amount of expression was observed in the heart, skeletal muscle, testis, thyroid gland and adrenal gland (FIG. 20).

実施例20：PPIL1 siRNAを発現するプラスミドの構築、および結腸癌細胞の増殖に対するその効果
PPIL1発現の影響を検討するために、さまざまなPPIL1-siRNAを発現するプラスミドを構築した。まず、psiH1BX3.0ベクターを実施例6と同じように構築した。さらに、対照ベクターpsiH1BX-EGFPも実施例6のように調製した。続いて、PPIL1-siRNAを発現するプラスミドを、二本鎖オリゴヌクレオチドをpsiH1BX3.0ベクターのBbsI部位にクローニングすることによって調製した。ベクター中にクローニングしたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：
psiH1BX-PPIL-A、5'-TCCCGCATGCTCCAAAGACCTGTTTCAAGAGAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3'（配列番号：47）および5'-AAAAGCATGCTCCAAAGACCTGTTCTCTTGAAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3' （配列番号：48）；
psiH1BX-PPIL-B、5'-TCCCAGACTTCATGATCCAAGGATTCAAGAGATCCTTGGATCATGAAGTCT-3'（配列番号：49）および5'-AAAAAGACTTCATGATCCAAGGATCTCTTGAATCCTTGGATCATGAAGTCT 3'（配列番号：50）；ならびに
psiH1BX-PPIL-C、5'-TCCCTGGCAGCCAGTTCTTTGTGTTCAAGAGACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'（配列番号：51）および5'-AAAATGGCAGCCAGTTCTTTGTGTCTCTTGAACACAAAGAACTGGCTGCCA-3'（配列番号：52）。
それぞれの配列中のsiRNAの標的配列には下線を施してある。 Example 20: Construction of a plasmid expressing PPIL1 siRNA and its effect on proliferation of colon cancer cells
In order to examine the effect of PPIL1 expression, plasmids expressing various PPIL1-siRNAs were constructed. First, the psiH1BX3.0 vector was constructed in the same manner as in Example 6. In addition, a control vector psiH1BX-EGFP was also prepared as in Example 6. Subsequently, a plasmid expressing PPIL1-siRNA was prepared by cloning a double stranded oligonucleotide into the BbsI site of the psiH1BX3.0 vector. The oligonucleotides cloned into the vector were as follows:
psiH1BX-PPIL-A, 5'-TCCC GCATGCTCCAAAGACCTGTT TCAAGAGAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3 '(SEQ ID NO: 47) and 5'-AAAA GCATGCTCCAAAGACCTGTT CTCTTGAAACAGGTCTTTGGAGCATGC-3' (SEQ ID NO: 48);
psiH1BX-PPIL-B, 5'-TCCC AGACTTCATGATCCAAGGAT TCAAGAGATCCTTGGATCATGAAGTCT-3 '(SEQ ID NO: 49) and 5'-AAAA AGACTTCATGATCCAAGGAT CTCTTGAATCCTTGGATCATGAAGTCT 3' (SEQ ID NO: 50);
psiH1BX-PPIL-C, 5'-TCCC TGGCAGCCAGTTCTTTGTGT TCAAGAGACACAAAGAACTGGCTGCCA-3 '(SEQ ID NO: 51) and 5'-AAAA TGGCAGCCAGTTCTTTGTGT CTCTTGAACACAAAGAACTGGCTGCCA-3' (SEQ ID NO: 52).
The target sequence of siRNA in each sequence is underlined.

FuGENE6試薬（ロシュ）を用い、供給元の推奨に従ってこれらのプラスミドを結腸癌細胞SNUC4またはSNUC5にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に全RNAを細胞から抽出した。   These plasmids were transfected into colon cancer cells SNUC4 or SNUC5 using FuGENE6 reagent (Roche) according to the supplier's recommendations. Total RNA was extracted from the cells 48 hours after transfection.

これらのうちpsiH1BX-PPIL-Aは、psiH1BX-PPIL-BおよびpsiH1BX-PPIL-Cとは異なり、SNUC4細胞およびSNUC5細胞におけるPPIL1の発現を有意に抑制した（図21A）。PPIL1の抑制により、結腸癌細胞SNUC4およびSNUC5の増殖抑制がもたらされるか否かを検証するために、psiH1BX-PPIL-A、psiH1BX-PPIL-B、psiH1BX-PPIL-C、または対照psiH1BX-EGFPを細胞にトランスフェクトした。psiH1BX-PPIL-Aをトランスフェクトした細胞の生細胞数は、psiH1BX-PPIL-B、psiH1BX-PPIL-C、またはpsiH1BX-EGFPをトランスフェクトした細胞よりも著しく少なく、このことからPPIL1の発現低下によって結腸癌細胞の増殖が抑制されることが示された（図21B）。   Of these, psiH1BX-PPIL-A, unlike psiH1BX-PPIL-B and psiH1BX-PPIL-C, significantly suppressed the expression of PPIL1 in SNUC4 and SNUC5 cells (FIG. 21A). To examine whether inhibition of PPIL1 results in growth inhibition of colon cancer cells SNUC4 and SNUC5, psiH1BX-PPIL-A, psiH1BX-PPIL-B, psiH1BX-PPIL-C, or control psiH1BX-EGFP Cells were transfected. The number of viable cells transfected with psiH1BX-PPIL-A is significantly less than cells transfected with psiH1BX-PPIL-B, psiH1BX-PPIL-C, or psiH1BX-EGFP. It was shown that the growth of colon cancer cells was suppressed (FIG. 21B).

実施例21：組換えPPIL1タンパク質の調製
PPIL1に対する特異的抗体を作製するために、PPILの組換えタンパク質を調製した。PPIL1の全コード領域は、プライマーのセット：5'-CGCCGGATCCGCTATGGCGGCAATTCCCCCAG-3'（配列番号：53）および5'-AGCACTCGAGCCCAGAAGGGTATGCCTTAATGATC-3'（配列番号：54）を用いてRT-PCRにより増幅した。その産物を精製し、BamHlおよびXholで消化し、pGEX-6P-1ベクター（pGEX-PPIL1）またはpET21aベクター（pET-PPIL1）の適切なクローニング部位にクローニングした。pGEX-PPIL1またはpET-PPIL1を大腸菌DH10B細胞またはBL21コドンプラス細胞に形質転換した。組換えタンパク質をIPTGの添加によって誘導し、製造者のプロトコールに従って抽出物から精製した。プラスミドを大腸菌細胞に形質転換したところ、SDS-PAGE上に予想されたサイズで組換えタンパク質の産生が観察された（図22AおよびB）。 Example 21: Preparation of recombinant PPIL1 protein
To produce a specific antibody against PPIL1, a recombinant protein of PPIL was prepared. The entire coding region of PPIL1 was amplified by RT-PCR using a set of primers: 5′-CGCCGGATCCGCTATGGCGGCAATTCCCCCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 53) and 5′-AGCACTCGAGCCCAGAAGGGTATGCCTTAATGATC-3 ′ (SEQ ID NO: 54). The product was purified, digested with BamHl and Xhol and cloned into the appropriate cloning site of the pGEX-6P-1 vector (pGEX-PPIL1) or pET21a vector (pET-PPIL1). pGEX-PPIL1 or pET-PPIL1 was transformed into E. coli DH10B cells or BL21 codon plus cells. The recombinant protein was induced by the addition of IPTG and purified from the extract according to the manufacturer's protocol. When the plasmid was transformed into E. coli cells, recombinant protein production was observed at the expected size on SDS-PAGE (FIGS. 22A and B).

実施例22：細菌2-ハイブリッドスクリーニング系による、スタスミンがPPIL1相互作用性タンパク質であることの同定
PPIL1の機能を分析するために、細菌2-ハイブリッドスクリーニング系を用いてPPIL1相互作用性タンパク質を検索した。BacterioMatch 2-ハイブリッド系（ストラタジーン）を用い、製造者のプロトコールに従って細菌2-ハイブリッドアッセイを行った。実施例21の通りに入手したPPIL1の全コード配列をpBTベクターのBamHl-Xhol部位にベイト（bait）としてクローニングし、ヒト胎児脳cDNAライブラリー（ストラタジーン）をスクリーニングした。同定された陽性クローンのうち、スタスミンは細菌でのpBT-PPIL1およびpTRG-STMNによる同時形質転換により、PPIL1との相互作用を示した（図23A）。 Example 22: Identification of stathmin as a PPIL1-interacting protein by a bacterial two-hybrid screening system
To analyze the function of PPIL1, PPIL1-interacting proteins were searched using a bacterial two-hybrid screening system. BacterioMatch 2-hybrid system (Stratagene) was used to perform a bacterial 2-hybrid assay according to the manufacturer's protocol. The entire coding sequence of PPIL1 obtained as in Example 21 was cloned as a bait into the BamHl-Xhol site of the pBT vector, and a human fetal brain cDNA library (Stratagene) was screened. Of the positive clones identified, stathmin showed interaction with PPIL1 by cotransformation with pBT-PPIL1 and pTRG-STMN in bacteria (FIG. 23A).

さらに、免疫沈降アッセイを行った。具体的には、COS7細胞に対して、実施例17の通りに調製したFLAG標識PPIL1を発現するpFLAG-PPIL1、およびHA標識スタスミンタンパク質を発現するpCMV-HA-STMN、またはそれらの組み合わせをトランスフェクトし、PBSで洗浄し、150mM NaCl、1％NP-40、10mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、および1X完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ）を含むNET-N緩衝液中に溶解した。代表的な免疫沈降反応では、300μgの全細胞抽出物を、1μgのマウス抗FLAG抗体（シグマ）または3μgのラット抗HA抗体および20μlのプロテインGセファロースビーズ（ザイメッド（Zymed））とともに4℃で1〜2時間インキュベートした。ビーズを1mlのNET-N緩衝液で5回洗い、ビーズに結合したタンパク質を、SDS試料緩衝液中で煮沸することによって溶出させた。沈降したタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、抗HA抗体または抗FLAG M2抗体を用いてイムノブロット分析を行った。   In addition, an immunoprecipitation assay was performed. Specifically, COS7 cells were transfected with pFLAG-PPIL1 expressing FLAG-labeled PPIL1 and pCMV-HA-STMN expressing HA-labeled stathmin protein, or a combination thereof, prepared as described in Example 17. The solution was washed with PBS and dissolved in NET-N buffer containing 150 mM NaCl, 1% NP-40, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, and 1X complete protease inhibitor cocktail (Roche). In a typical immunoprecipitation reaction, 300 μg whole cell extract was mixed with 1 μg mouse anti-FLAG antibody (Sigma) or 3 μg rat anti-HA antibody and 20 μl protein G sepharose beads (Zymed) at 1 ° C. Incubated for ~ 2 hours. The beads were washed 5 times with 1 ml NET-N buffer and the protein bound to the beads was eluted by boiling in SDS sample buffer. Precipitated proteins were separated by SDS-PAGE and immunoblot analysis was performed using anti-HA antibody or anti-FLAG M2 antibody.

上記の通り、インビボでのFLAG標識PPIL1タンパク質とHA標識スタスミンタンパク質との会合が、COS7細胞における免疫沈降アッセイによって証明された（図23B）。興味深いことに、抗スタスミン抗体を用いたウエスタンブロット分析によって18kDaタンパク質および20kDaタンパク質に対応する2つのバンドが示され、このことから修飾型のスタスミンの存在が示唆された。スタスミンはセリン/トレオニンリン酸化部位と推定される部位（Ser16、Ser25、Ser38、およびSer63）を有することが示されているため、大きい方のバンドはリン酸化型のスタスミンに対応すると思われる。さらに、抗Flag抗体を用いた免疫沈降で20kDaタンパク質に対応する単一バンドが示されたことからみて、PPIL1はこの修飾型と会合するか、スタスミンとの結合によってその修飾を増加させる可能性がある。   As described above, in vivo association of FLAG-labeled PPIL1 protein with HA-labeled stathmin protein was demonstrated by immunoprecipitation assay in COS7 cells (FIG. 23B). Interestingly, Western blot analysis with an anti-stasmin antibody showed two bands corresponding to the 18 kDa protein and the 20 kDa protein, suggesting the presence of a modified form of stathmin. Since stathmin has been shown to have a putative serine / threonine phosphorylation site (Ser16, Ser25, Ser38, and Ser63), the larger band appears to correspond to the phosphorylated form of stathmin. In addition, immunoprecipitation with anti-Flag antibody showed a single band corresponding to the 20 kDa protein, indicating that PPIL1 may associate with this modified form or increase its modification by binding to stathmin. is there.

実施例23：細胞内におけるFlag標識PPIL1とHA標識スタスミンの共存
PPIL1およびスタスミンが細胞内で共存するか否かを検証するために、実施例22のように、COS7細胞に対してpFLAG-PPIL1およびpCMV-HA-STMNを同時にトランスフェクトし、免疫組織化学染色によって細胞内局在を検討した（図24）。抗FLAG抗体を用いた染色ではFlag標識PPIL1は核および細胞質の両方に局在することが示されたが、抗HA抗体による染色ではHA標識スタスミンが細胞質中にPPIL1と共存することが示された。このデータは、PPIL1およびスタスミンが細胞質中で相互作用するという見解を支持するものである。 Example 23: Coexistence of Flag-labeled PPIL1 and HA-labeled stathmin in cells
In order to verify whether PPIL1 and stathmin coexist in cells, as in Example 22, COS7 cells were simultaneously transfected with pFLAG-PPIL1 and pCMV-HA-STMN, and immunohistochemical staining was performed. Intracellular localization was examined (FIG. 24). Staining with anti-FLAG antibody showed that Flag-labeled PPIL1 was localized in both the nucleus and cytoplasm, but staining with anti-HA antibody showed that HA-labeled stathmin coexists with PPIL1 in the cytoplasm . This data supports the view that PPIL1 and stathmin interact in the cytoplasm.

実施例24：PPIL1との相互作用に関するスタスミンの責任領域（responsible region）
さらに、この相互作用の責任領域を明らかにするために、pCMV-HA-STMNの種々の欠失変異体および野生型pFLAG-PPIL1を用いて、実施例22と同じように免疫沈降アッセイを行った。STMNの欠失変異体は、以下のプライマーのセット：
欠失変異体1に対しては、5'-ATTGGTACCATGGAGCTGATTCTCAGCCCTCGGTC-3'（配列番号：55）および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'（配列番号：56）；
欠失変異体2に対しては、5'-ATTGGTACCATGGTTCCAGAATTCCCCCTTTCCCCT-3'（配列番号：57）および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'（配列番号：58）；
欠失変異体3に対しては、5'-ATTGGTACCATGGATCTTTCCCTGGAGGAAATTCAG-3'（配列番号：59）および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'（配列番号：60）；
欠失変異体4に対しては、5'-ATTGGTACCATGGCTGAGGTCTTGAAGCAGCTGGC-3'（配列番号：61）および5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3'（配列番号：62）；ならびに
欠失変異体5に対しては、5'-ATTGGTACCTTCACCATGGCTTCTTCTGATATCC-3'（配列番号：63）および5'-AATCTCGAGGCGTCTTTCTTCTGCAGCTTC-3'（配列番号：64）を用い、完全長クローン（pFLAG-PPIL1）を鋳型に増幅した。PCR産物はpcDNA3.1myc/HisのKpnlおよびXhol部位にクローニングした。 Example 24: Stasmin's responsible region for interaction with PPIL1
Furthermore, in order to clarify the responsible region of this interaction, immunoprecipitation assay was performed in the same manner as in Example 22 using various deletion mutants of pCMV-HA-STMN and wild type pFLAG-PPIL1. . STMN deletion mutants have the following primer sets:
For deletion mutant 1, 5′-ATTGGTACCATGGAGCTGATTCTCAGCCCTCGGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 55) and 5′-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 56);
For deletion mutant 2, 5'-ATTGGTACCATGGTTCCAGAATTCCCCCTTTCCCCT-3 '(SEQ ID NO: 57) and 5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 58);
For deletion mutant 3, 5'-ATTGGTACCATGGATCTTTCCCTGGAGGAAATTCAG-3 '(SEQ ID NO: 59) and 5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 60);
For deletion mutant 4, 5'-ATTGGTACCATGGCTGAGGTCTTGAAGCAGCTGGC-3 '(SEQ ID NO: 61) and 5'-AATCTCGAGGTCAGCTTCAGTCTCGTCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 62); and for deletion mutant 5, 5 ' A full-length clone (pFLAG-PPIL1) was amplified using '-ATTGGTACCTTCACCATGGCTTCTTCTGATATCC-3' (SEQ ID NO: 63) and 5'-AATCTCGAGGCGTCTTTCTTCTGCAGCTTC-3 '(SEQ ID NO: 64) as a template. The PCR product was cloned into the Kpnl and Xhol sites of pcDNA3.1myc / His.

スタスミンのアミノ酸1〜43を欠失した欠失変異体（欠失変異体3）はPPIL1と会合可能であったが、1〜65を欠失した変異体（欠失変異体4）は会合不能であった。一方、アミノ酸1〜61を含む別の変異体は結合が可能であり（図25AおよびB）、このことから、コドン44〜61を含む領域が結合に非常に重要であることが示された。   A deletion mutant lacking amino acids 1 to 43 of stathmin (deletion mutant 3) was able to associate with PPIL1, but a mutant lacking 1 to 65 (deletion mutant 4) was unable to associate Met. On the other hand, another variant containing amino acids 1-61 is capable of binding (FIGS. 25A and B), indicating that the region containing codons 44-61 is very important for binding.

実施例25：スタスミンのリン酸化およびPPIL1との相互作用
抗Flag抗体を用いた免疫沈降によって修飾型のスタスミンに対応する単一のバンドが示されたため、セリンリン酸化部位と推定される部位でのその変異型を発現するプラスミドを調製し、それとPPIL1との結合を検討した（図26A）。具体的には、変異体（SerがAlaに置換）は、QuikChange部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン）およびプライマーのセット：
S16Aに対しては、5'-CTGGAGAAGCGTGCCGCAGGCCAGGCTTTTG-3'（配列番号：65）および5'-CAAAAGCCTGGCCTGCGGCACGCTTCTCCAG-3'（配列番号：66）；
S25Aに対しては、5'-GCTTTTGAGCTGATTCTCGCCCCTCGGTCAAAAGAATCTG-3'（配列番号：67）および5'-CAGATTCTTTTGACCGAGGGGCGAGAATCAGCTCAAAAGC-3'（配列番号：68）；
S38Aに対しては、5'-CCAGAATTCCCCCTTGCCCCTCCAAAGAAGAAG-3'（配列番号：69）および5'-CTTCTTCTTTGGAGGGGCAAGGGGGAATTCTGG-3'（配列番号：70）；
S63Aに対しては、5'-CAGAAGAAAGACGCAAGGCCCATGAAGCTGAGG-3'（配列番号：71）および5'-CCTCAGCTTCATGGGCCTTGCGTCTTTCTTCTG-3'（配列番号：72）を用い、供給元の推奨に従って調製した。 Example 25: Phosphorylation of stathmin and interaction with PPIL1 Immunoprecipitation with anti-Flag antibody showed a single band corresponding to modified stathmin, so that at the presumed serine phosphorylation site A plasmid expressing the mutant was prepared, and its binding to PPIL1 was examined (FIG. 26A). Specifically, mutants (Ser replaced by Ala), QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene) and primer set:
For S16A, 5′-CTGGAGAAGCGTGCCGCAGGCCAGGCTTTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 65) and 5′-CAAAAGCCTGGCCTGCGGCACGCTTCTCCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 66);
For S25A, 5'-GCTTTTGAGCTGATTCTCGCCCCTCGGTCAAAAGAATCTG-3 '(SEQ ID NO: 67) and 5'-CAGATTCTTTTGACCGAGGGGCGAGAATCAGCTCAAAAGC-3' (SEQ ID NO: 68);
For S38A, 5′-CCAGAATTCCCCCTTGCCCCTCCAAAGAAGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 69) and 5′-CTTCTTCTTTGGAGGGGCAAGGGGGAATTCTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 70);
For S63A, 5′-CAGAAGAAAGACGCAAGGCCCATGAAGCTGAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 71) and 5′-CCTCAGCTTCATGGGCCTTGCGTCTTTCTTCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 72) were used and prepared according to the supplier's recommendations.

S16AまたはS63A変異体をトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット分析からは非リン酸化型およびリン酸化型が検出されたが、S38Aを用いた場合には非リン酸化型に対応する単一のバンドが示された。このため、スタスミンのセリン38は細胞内でリン酸化されると考えられる。驚くことには、スタスミン-S38A変異体はPP1L1と会合可能であった（図26B）。したがって、PPIL1とスタスミンの相互作用は、スタスミンのコドン44〜61にあるPPIL1結合部位に隣接したセリン38のリン酸化を増強するものと思われる。   Western blot analysis of cells transfected with S16A or S63A mutants detected unphosphorylated and phosphorylated forms, but S38A shows a single band corresponding to the unphosphorylated forms. It was done. For this reason, it is thought that serine 38 of stathmin is phosphorylated intracellularly. Surprisingly, the stathmin-S38A mutant was able to associate with PP1L1 (FIG. 26B). Thus, the interaction between PPIL1 and stathmin appears to enhance the phosphorylation of serine 38 adjacent to the PPIL1 binding site at stathmin codons 44-61.

実施例26：APCによって調節される遺伝子としてのAPCDD1の単離
結腸直腸癌の発生には、βカテニン/Tcf経路の調節障害が初期段階としてかかわる。このため、次の手順として、この経路の下流遺伝子を検索した。結腸癌細胞へのAPCの形質導入は核内のβカテニンレベルを低下させ、引き続いてβカテニン/Tcf複合体の転写促進活性を抑制する（van der Heydenら、J Cell Sci 111：1741-9（1998)）。このため、大量のβカテニンが核および細胞質に蓄積するSW480細胞の発現プロファイルを、実施例1と同様のマイクロアレイ手法を用いて比較した。 Example 26: Isolation of APCDD1 as a gene regulated by APC Development of colorectal cancer involves impaired regulation of the β-catenin / Tcf pathway as an early stage. Therefore, the downstream gene of this pathway was searched as the next procedure. Transduction of APC into colon cancer cells reduces the level of β-catenin in the nucleus and subsequently suppresses the transcription-promoting activity of the β-catenin / Tcf complex (van der Heyden et al., J Cell Sci 111: 1741-9 ( 1998)). Therefore, the expression profiles of SW480 cells in which a large amount of β-catenin accumulates in the nucleus and cytoplasm were compared using the same microarray technique as in Example 1.

βカテニン/Tcf複合体によって調節される遺伝子を同定するために、SW480細胞（ATCC、Rockville、MD）に対して、野生型APC（Ad-APC）またはLacZ（Ad-LacZ；対照遺伝子）を発現するアデノウイルス構築物をMOI＝100で感染させ、ライボビッツL-15培地中で培養した。感染から72時間後に、全RNAを細胞から抽出し、Satohら（Nat Genet 24：245-50（2000)）の通りにポリA RNAを抽出物から精製し、T7ベースのRNA増幅を行った。Ad-APCおよびAd-LacZを感染させたSW480細胞から増幅されたRNA（aRNA）をそれぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTPで標識し、その同量をマイクロアレイスライド上での同時ハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いた。   Express wild-type APC (Ad-APC) or LacZ (Ad-LacZ; control gene) against SW480 cells (ATCC, Rockville, MD) to identify genes regulated by β-catenin / Tcf complex Adenovirus constructs infected with MOI = 100 and cultured in Leibovitz L-15 medium. At 72 hours post infection, total RNA was extracted from the cells and poly A RNA was purified from the extract as described by Satoh et al. (Nat Genet 24: 245-50 (2000)) and T7 based RNA amplification was performed. RNA (aRNA) amplified from SW480 cells infected with Ad-APC and Ad-LacZ are labeled with Cy5-dCTP and Cy3-dCTP, respectively, and the same amount is probe for simultaneous hybridization on microarray slides Used as.

APCのトランスフェクションによって発現レベルが下方制御された遺伝子の数を特定するために、Ad-APCを感染させたSW480細胞における23040種の遺伝子の発現プロファイルをAd-LacZのものと比較した。遺伝子のうち、NCBI（米国国立バイオテクノロジー情報センター）のUniGeneクラスターのEST、Hs.20665に対応する施設内アクセッション番号B7323Nの遺伝子を、発現レベルがAd-APCに反応してAd-LacZに比べ約4分の1に低下する遺伝子として同定した。   To identify the number of genes whose expression levels were down-regulated by APC transfection, the expression profiles of 23040 genes in SW480 cells infected with Ad-APC were compared with those of Ad-LacZ. Among genes, NCBI (National Center for Biotechnology Information) UniGene cluster EST, in-facility accession number B7323N corresponding to Hs.20665, compared to Ad-LacZ in the expression level in response to Ad-APC It was identified as a gene that declined by about a quarter.

その後に、APCの発現低下を確かめるための半定量的RT-PCR実験を行った（図27a）。具体的には、キアゲンRNeasyキット（キアゲン）またはTrizol試薬（ライフテクノロジーズ）を用い、製造者のプロトコールに従って全RNAを抽出した。ポリdT12-18プライマー（アマシャムファルマシアバイオテク）をSuperscript II逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）とともに用いて、全RNAの10μgアリコートを逆転写し、一本鎖cDNAとした。得られた一本鎖cDNA調製物を、容積20μlのPCR緩衝液（タカラ）中に希釈した。続いて、以下のプライマーを用い、標準的なRT-PCR実験によるPCR増幅を行った：フォワード、5'-GGATCATCTATCGGTCAGACG-3'（配列番号：73）；およびリバース、5'-TGGGTCACATCCTGCTGGATG-3'（配列番号：74）。増幅はGeneAmp PCRシステム9700（パーキンエルマー、Foster City、CA）を以下の条件で用いて行った：94℃ 4分間の変性の後に、94℃ 30秒間、56℃ 30秒間、72℃ 45秒間を30サイクル。 After that, a semi-quantitative RT-PCR experiment was conducted to confirm the decrease in APC expression (FIG. 27a). Specifically, total RNA was extracted using Qiagen RNeasy kit (Qiagen) or Trizol reagent (Life Technologies) according to the manufacturer's protocol. Using a poly dT 12-18 primer (Amersham Pharmacia Biotech) with Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies), a 10 μg aliquot of total RNA was reverse transcribed into single-stranded cDNA. The resulting single-stranded cDNA preparation was diluted in a 20 μl volume of PCR buffer (Takara). Subsequently, PCR amplification by standard RT-PCR experiments was performed using the following primers: forward, 5′-GGATCATCTATCGGTCAGACG-3 ′ (SEQ ID NO: 73); and reverse, 5′-TGGGTCACATCCTGCTGGATG-3 ′ ( SEQ ID NO: 74). Amplification was performed using a GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) Under the following conditions: 94 ° C. for 4 minutes, followed by 94 ° C. for 30 seconds, 56 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 45 seconds. cycle.

さらに、βカテニン/Tcf-4複合体の活性を同じく下方制御する野生型AXIN1を発現するアデノウイルスAd-Axinを用いて細胞を処理し、B7323Nの発現に関して検討した。その結果、AXIN1の形質導入によるB7323Nの発現低下が同様に観察された（図27a）。   Furthermore, the cells were treated with adenovirus Ad-Axin expressing wild-type AXIN1, which also down-regulates the activity of β-catenin / Tcf-4 complex, and the expression of B7323N was examined. As a result, a decrease in the expression of B7323N due to AXIN1 transduction was also observed (FIG. 27a).

B7323NのcDNA配列を用いて公開データベースの相同性検索を行ったところ、100種を上回るEST、および、染色体バンド18p11.2に位置づけられている1つのヒトゲノム配列（GenBankアクセッション番号NT_019631）が同定された。B7323Nの完全長cDNA配列を決定するために、B7323Nに対する遺伝子特異的プライマー（5'-GCTCGTCTGACCGATAGATGATCC-3'（配列番号：75））を用いた点以外は実施例2の通りに5'RACEを行い、cDNA配列を入手した。その結果、その完全長cDNA配列が決定された。このcDNAは、予想分子量が58.8kDである推定514アミノ酸のタンパク質をコードする1542ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む2607ヌクレオチドから構成されていた（GenBankアクセッション番号AB104887）。予想されるAPCDD1タンパク質は、サーモバシラス・キシラニリチカス（Thermobacillus xylanilyticus）のエンド-1,4-βキシラナーゼと31％の同一性があった。コンピュータプログラムSMART（http://smart/embl-heidelberg/de/）およびPSORT II Prediction（http://psort.nibb.ac.jp/form2.html）を用いたモチーフ検索ではデータベース中に既知のドメインは同定されなかった。このため、この遺伝子はAPCDD1（down-regulated by APC1）と命名された。cDNA配列とゲノム配列とを比較してAPCDD1のゲノム構造を決定することが可能であり、これは5つのエクソンからなっており、約40kbのゲノム領域をカバーしていた（データ非提示）。決定されたAPCDD1のヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：7および8に示す。   A public database homology search using the B7323N cDNA sequence identified more than 100 ESTs and one human genome sequence (GenBank accession number NT_019631) located in chromosome band 18p11.2. It was. To determine the full-length cDNA sequence of B7323N, 5'RACE was performed as in Example 2 except that the gene-specific primer for B7323N (5'-GCTCGTCTGACCGATAGATGATCC-3 '(SEQ ID NO: 75)) was used. The cDNA sequence was obtained. As a result, the full-length cDNA sequence was determined. This cDNA was composed of 2607 nucleotides containing an open reading frame of 1542 nucleotides encoding a putative 514 amino acid protein with a predicted molecular weight of 58.8 kD (GenBank Accession No. AB104887). The predicted APCDD1 protein had 31% identity with the Thermobacillus xylanilyticus endo-1,4-β xylanase. Known domains in the database for motif search using the computer program SMART (http: // smart / embl-heidelberg / de /) and PSORT II Prediction (http://psort.nibb.ac.jp/form2.html) Was not identified. For this reason, this gene was named APCDD1 (down-regulated by APC1). It was possible to determine the genomic structure of APCDD1 by comparing the cDNA sequence with the genomic sequence, which consisted of 5 exons and covered a genomic region of about 40 kb (data not shown). The determined nucleotide sequence of APCDD1 and its predicted amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.

さらに、APCDD1に対して実施例2の通りにノーザンブロット分析を行った。このノーザンブロット分析により、APCDD1の2.6kb転写物は心臓、膵臓、前立腺、および卵巣で大量に発現するが、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、および末梢白血球における発現は乏しいことが示された（図27b）。   Further, Northern blot analysis was performed on APCDD1 as in Example 2. This Northern blot analysis shows that the 2.6kb transcript of APCDD1 is highly expressed in heart, pancreas, prostate, and ovary, but poorly expressed in lung, liver, kidney, spleen, thymus, colon, and peripheral leukocytes (Figure 27b).

実施例27：結腸癌組織におけるAPCDD1の発現
βカテニンの蓄積は結腸直腸腫瘍に高頻度にみられる特徴であるため、結腸癌組織および対応する非癌組織におけるAPCDD1の発現を実施例26の通りに半定量的RT-PCRによって検討したところ、検討した30例の腫瘍のうち20例（67％）で発現上昇が検出された（図27c）。この結果は、APCDD1がβカテニン/Tcf転写複合体の活性化に応答して上方制御されるという事実と一致した。 Example 27: Expression of APCDD1 in colon cancer tissue Since accumulation of β-catenin is a frequent feature in colorectal tumors, expression of APCDD1 in colon cancer tissue and corresponding non-cancerous tissue is as in Example 26. When examined by semi-quantitative RT-PCR, increased expression was detected in 20 (67%) of the 30 tumors examined (FIG. 27c). This result was consistent with the fact that APCDD1 is upregulated in response to activation of the β-catenin / Tcf transcription complex.

実施例28：APCDD1のプロモーター活性はβカテニンおよび野生型Tcf4複合体によって上方制御される
APCDD1のプロモーター活性がβカテニン/Tcf4複合体によって制御されるか否かを検証するために、Tcf/LEF結合モチーフと推定される2つのモチーフ（TBM1および2）を含むレポータープラスミドP1を、活性化型である変異型βカテニンと野生型Tcf4の存在下または非存在下でHeLa細胞にトランスフェクトした（図28a）。より具体的には、APCDD1の転写開始部位（TIS）と推定される部位を、ヒトゲノム配列（GenBankアクセッション番号NT_019631.4）とAPCDD1 cDNAの配列とを比較して決定した。APCDD1の5'隣接領域の3つの断片をPCRによって増幅し（P1、P2、およびP3）、pGL3-Basicベクター（プロメガ（Promega））の適切な酵素部位にクローニングした。Tcf/LEF結合モチーフと推定されるモチーフを1つまたは2つ含むP1およびP2に対してQuickChange（商標）部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン）を用いることによって部位特異的変異誘発法を実施した。活性化型である変異型βカテニンは、プライマーのセット：5'-AAGGATCCGCGTGGACAATGGCTACTCAAG-3'（配列番号：76）および5'-GGACTCGAGACAGGTCAGTATCAAACCAGGCCAG-3'（配列番号：77）を用い、HCT116結腸癌細胞から抽出したRNAを鋳型にRT-PCRによって調製し、その後にpcDNA3.1プラスミドベクター（インビトロジェン）の適切なクローニング部位にクローニングした。Tcf-4の全コード領域のヒトcDNA断片およびその5'欠失領域（wtTcf4、dnTcf4）は、プライマーのセット：TcfF1：5'-AAGAATTCTGCTGGTGGGTGAAAAAAAAATGC-3'（配列番号：78）およびTcfR1：5'-CTACTCGAGTTCTAAAGACTTGGTGACGAGCGAC-3'（配列番号：79）、ならびにTcfF3：5'-AGGAATTCGTGCATCATGGTCCCACCACATCATAC-3'（配列番号：80）およびTcfR1をそれぞれ用い、RT-PCRによって増幅した。その産物もpcDNA3.1プラスミドベクター中にクローニングした。2μgの各レポータープラスミドおよび1.5μgの各発現構築物を、0.5μgのpRL-TKプラスミド（プロメガ）とともに、トランスフェクションの効率を標準化するためのFuGENE6（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim））を用いて、HeLa細胞に同時トランスフェクトした。レポーターアッセイはDual-Luciferaseレポーターアッセイ系を用い、供給元の推奨（プロメガ）に従って行った。 Example 28: APCDD1 promoter activity is upregulated by β-catenin and wild-type Tcf4 complex
To verify whether the promoter activity of APCDD1 is regulated by β-catenin / Tcf4 complex, we activated reporter plasmid P1, which contains two motifs (TBM1 and 2) presumed to be Tcf / LEF binding motifs HeLa cells were transfected in the presence or absence of the mutant β-catenin and wild type Tcf4 (FIG. 28a). More specifically, a site presumed to be the transcription start site (TIS) of APCDD1 was determined by comparing the human genome sequence (GenBank accession number NT_019631.4) with the sequence of APCDD1 cDNA. Three fragments of the 5 ′ flanking region of APCDD1 were amplified by PCR (P1, P2, and P3) and cloned into the appropriate enzyme sites of the pGL3-Basic vector (Promega). Site-directed mutagenesis was performed by using the QuickChange ™ site-directed mutagenesis kit (Stratagene) for P1 and P2 containing one or two putative Tcf / LEF binding motifs . Mutant β-catenin, which is an activated form, is obtained from HCT116 colon cancer cells using a set of primers: 5'-AAGGATCCGCGTGGACAATGGCTACTCAAG-3 '(SEQ ID NO: 76) and 5'-GGACTCGAGACAGGTCAGTATCAAACCAGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 77). The extracted RNA was prepared by RT-PCR using the template and then cloned into the appropriate cloning site of pcDNA3.1 plasmid vector (Invitrogen). The human cDNA fragment of the entire coding region of Tcf-4 and its 5 ′ deletion region (wtTcf4, dnTcf4) are a set of primers: TcfF1: 5′-AAGAATTCTGCTGGTGGGTGAAAAAAAAATGC-3 ′ (SEQ ID NO: 78) and TcfR1: 5′- CTACTCGAGTTCTAAAGACTTGGTGACGAGCGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 79) and TcfF3: 5′-AGGAATTCGTGCATCATGGTCCCACCACATCATAC-3 ′ (SEQ ID NO: 80) and TcfR1 were used and amplified by RT-PCR. The product was also cloned into pcDNA3.1 plasmid vector. 2 μg of each reporter plasmid and 1.5 μg of each expression construct, along with 0.5 μg of pRL-TK plasmid (Promega), using FuGENE6 (Boehringer Mannheim) to normalize transfection efficiency, Co-transfected with The reporter assay was performed using a Dual-Luciferase reporter assay system according to the supplier's recommendations (Promega).

プラスミドP1のレポーター活性は、活性化型のβカテニンおよび野生型Tcf4の導入によって有意に上昇した（図28b）。興味深いことに、この活性上昇は、P1をドミナントネガティブ型のTcf4とともに同時トランスフェクトした場合には抑制され、このことからTcf4がAPCDD1のプロモーター活性に影響を及ぼすことが示唆された。   The reporter activity of plasmid P1 was significantly increased by the introduction of activated β-catenin and wild-type Tcf4 (FIG. 28b). Interestingly, this increase in activity was suppressed when P1 was co-transfected with a dominant negative form of Tcf4, suggesting that Tcf4 affects the promoter activity of APCDD1.

そのプロモーター活性の原因となる因子を明らかにするために、P1の種々の欠失変異体のそれぞれについてプロモーター活性をさらに比較した。P1の活性はP2およびP3のそれぞれの活性よりも有意に高く、TBM2のみを含むP2の活性はP3のものよりも有意に高かった（図28b）。これらのデータは、-971および-151を含む領域がβカテニン/Tcf4複合体と会合すること、およびそれがAPCDD1プロモーター活性に関与することを示唆する。この領域はTcf/LEF結合モチーフと考えられる2つのモチーフを含むため、これらのモチーフは転写活性化の原因になるとの仮説を立てた。   In order to clarify the factor responsible for the promoter activity, the promoter activity was further compared for each of the various deletion mutants of P1. The activity of P1 was significantly higher than that of each of P2 and P3, and the activity of P2 containing only TBM2 was significantly higher than that of P3 (FIG. 28b). These data suggest that the region containing -971 and -151 associates with the β-catenin / Tcf4 complex and that it is involved in APCDD1 promoter activity. Since this region contains two motifs that are thought to be Tcf / LEF binding motifs, it was hypothesized that these motifs would cause transcriptional activation.

この仮説を検討するために、Tcf/LEF結合モチーフの候補が、βカテニン/Tcf4複合体を結合できないCTTTGGC（配列番号：81）へと改変されたレポータープラスミドP1MおよびP2Mを構築した。これらの5種類のプラスミドを用いてレポーターアッセイを行い、変異したモチーフを含むP1M断片およびP2M断片はAPCDD1の転写を活性化する能力が低下していること；ならびにそのルシフェラーゼ活性がP2断片またはP3断片と同等であることを明らかにした（図28b）。これらの結果は、Tcf/LEF結合モチーフと推定されるモチーフが両方ともAPCDD1の転写活性化に関与することを意味する。 To test this hypothesis, reporter plasmids P1M and P2M were constructed in which the candidate Tcf / LEF binding motif was modified to CTTTG GC (SEQ ID NO: 81) that cannot bind the β-catenin / Tcf4 complex. Reporter assay using these 5 types of plasmids, P1M and P2M fragments containing mutated motifs have reduced ability to activate APCDD1 transcription; and their luciferase activity is P2 or P3 fragments (Fig. 28b). These results imply that both putative Tcf / LEF binding motifs are involved in the transcriptional activation of APCDD1.

実施例29：電気泳動移動度シフトアッセイ
βカテニン/Tcf4複合体がTBM1およびTBM2と直接会合するか否かを検討するために、TBM1配列（APCDD1-TBM1）およびTBM2配列（APCDD1-TBM2）を含むように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を行った。具体的には、EMSAは以前の記載（van der Heydenら、J Cell Sci 111：1741-9（1998)）の通りに、SW480細胞の無傷核から得た抽出物を用いて行った。2つの二本鎖16ヌクレオチドDNAプローブを、APCDD1-TBM1に関してはFF（5'-GCTTTGATTGTGGTGA-3'（配列番号：82））およびRR（5'-TCACCACAATCAAAGC-3'（配列番号：83））を、APCDD1-TBM2に関してはFF2（5'-CCCCTTTGAACACCTT-3'（配列番号：84））およびRR2（5'-AAGGTGTTCAAAGGGG-3'（配列番号：85））をアニーリングさせることによって調製した。 Example 29: Electrophoretic Mobility Shift Assay In order to investigate whether β-catenin / Tcf4 complex is directly associated with TBM1 and TBM2, including TBM1 sequence (APCDD1-TBM1) and TBM2 sequence (APCDD1-TBM2) Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was performed using the designed oligonucleotides. Specifically, EMSA was performed using extracts obtained from intact nuclei of SW480 cells as previously described (van der Heyden et al., J Cell Sci 111: 1741-9 (1998)). Two double-stranded 16 nucleotide DNA probes, FF (5'-GCTTTGATTGTGGTGA-3 '(SEQ ID NO: 82)) and RR (5'-TCACCACAATCAAAGC-3' (SEQ ID NO: 83)) for APCDD1-TBM1 APCDD1-TBM2 was prepared by annealing FF2 (5′-CCCCTTTGAACACCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 84)) and RR2 (5′-AAGGTGTTCAAAGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 85)).

βカテニン/Tcf4とAPCDD1-TBM1およびAPCDD1-TBM2の双方との結合に対応するバンドのシフトが、抗βカテニン抗体の添加によって観察されたが、P53抗体（対照）の添加によっては観察されなかった（図29）。予想された通り、この結合は野生型非標識オリゴヌクレオチドの添加によって阻害されたが、変異型非標識オリゴヌクレオチドによっては阻害されなかった。   A band shift corresponding to binding of β-catenin / Tcf4 to both APCDD1-TBM1 and APCDD1-TBM2 was observed with the addition of anti-β-catenin antibody but not with the addition of P53 antibody (control). (Figure 29). As expected, this binding was inhibited by the addition of wild type unlabeled oligonucleotide, but not by the mutant unlabeled oligonucleotide.

実施例30：インビトロでのLoVo細胞における細胞増殖に対するAPCDD1の作用
結腸直腸腫瘍発生におけるAPCDD1の役割を明らかにするために、少量のAPCDD1を発現するLoVo細胞（ATCC、Rockville、MD）においてコロニー形成アッセイを行う目的で、APCDD1（pcDNA-APCDD1）およびAPCDD1の相補鎖（pcDNA-アンチセンス）を発現するプラスミドを調製した。より具体的には、APCDD1の全コード領域を、遺伝子特異的プライマーのセット：5'-GCGGAATTCAGGGCCCAGAGCAGGACTG-3'（配列番号：86）および5'-TAGCTCGAGCTAAAACTTCTATCTGCGGATGT-3'（配列番号：87）を用い、RT-PCRによって増幅した。このPCR産物をpcDNA3.1（インビトロジェン）の適切なクローニング部位にクローニングした。続いて、LoVo細胞に対して構築したpcDNA-APCDD1またはpcDNA-アンチセンスをトランスフェクトし、適切な濃度のジェネティシンを加えたハムF-12培地中で細胞を10〜21日間インキュベートした。細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液によって染色した。 Example 30: Effect of APCDD1 on cell proliferation in LoVo cells in vitro To determine the role of APCDD1 in colorectal tumor development, colony formation assay in LoVo cells (ATCC, Rockville, MD) expressing low amounts of APCDD1 For the purpose of the above, plasmids expressing APCDD1 (pcDNA-APCDD1) and the complementary strand of APCDD1 (pcDNA-antisense) were prepared. More specifically, the entire coding region of APCDD1 is used using a set of gene-specific primers: 5′-GCGGAATTCAGGGCCCAGAGCAGGACTG-3 ′ (SEQ ID NO: 86) and 5′-TAGCTCGAGCTAAAACTTCTATCTGCGGATGT-3 ′ (SEQ ID NO: 87), Amplified by RT-PCR. This PCR product was cloned into the appropriate cloning site of pcDNA3.1 (Invitrogen). Subsequently, pcDNA-APCDD1 or pcDNA-antisense constructed against LoVo cells were transfected, and the cells were incubated for 10-21 days in Ham's F-12 medium supplemented with the appropriate concentration of geneticin. Cells were fixed with 100% methanol and stained with Giemsa solution.

その結果、対照プラスミドpcDNA-アンチセンスまたはpcDNAと比較して、pcDNA-APCDD1は著しく多くのコロニーを生じた（図30a）。この結果は3回の独立した実験によって確認された。細胞増殖に対するその効果をインビトロで裏づけるために、外因性APCDD1を発現するLoVo細胞（LoVo-APCDD1細胞）を樹立し、その増殖を、擬似ベクターをトランスフェクトした対照細胞と比較した（図30b）。LoVo-APCDD1細胞は対照LoVo-擬似細胞に比べ著しく高い速度で増殖した（図30c）。   As a result, pcDNA-APCDD1 produced significantly more colonies compared to the control plasmid pcDNA-antisense or pcDNA (FIG. 30a). This result was confirmed by three independent experiments. To support its effect on cell proliferation in vitro, LoVo cells expressing exogenous APCDD1 (LoVo-APCDD1 cells) were established and their proliferation compared to control cells transfected with a mock vector (FIG. 30b). LoVo-APCDD1 cells proliferated at a significantly higher rate than control LoVo-mock cells (FIG. 30c).

実施例31：ヌードマウスにおける腫瘍増殖に対するAPCDD1の効果
インビボでのAPCDD1の役割を調べるために、ヌードマウスでのLoVo-APCDD1細胞の2種類のクローンまたはLoVo-擬似細胞の2種類のクローンのいずれかを、12匹のBALBcAnN Crj-nu/nuマウスに同時に移植した。具体的には、腫瘍細胞、LoVo-APCDD1、またはLoVo-ベクターを最終濃度が5×10７個/mlになるように調整し、その100μlをBALB/cAnN Crj-nu/nuマウスの中背部後方にそれぞれ皮下注射した。腫瘍の計測は7日毎に8週間にわたって行い、体積を式V＝π/6×a２×bによって概算したが、ここで「a」は短軸であり、「b」は長軸である。 Example 31: Effect of APCDD1 on tumor growth in nude mice To investigate the role of APCDD1 in vivo, either two clones of LoVo-APCDD1 cells or two clones of LoVo-mock cells in nude mice Were simultaneously transplanted into 12 BALBcAnN Crj-nu / nu mice. Specifically, tumor cells, LoVo-APCDD1, or LoVo-vectors were adjusted to a final concentration of 5 × 10 7 cells / ml, and 100 μl of the cells were placed behind the middle back of BALB / cAnN Crj-nu / nu mice. Each was injected subcutaneously. Tumor measurements were taken every 7 days for 8 weeks and the volume was estimated by the formula V = π / 6 × a 2 × b, where “a” is the short axis and “b” is the long axis.

その結果、LoVo-APCDD1クローンの腫瘍の平均サイズは移植8週後に約482mm３および653mm３に達したが、LoVo-擬似では65mm３および277mm３であった；このことはAPCDD1の導入がインビボの細胞に対して増殖促進効果をもたらすことを示している（図30d）。 As a result, the average tumor size of LoVo-APCDD1 clones reached about 482mm 3 and 653mm 3 after transplantation 8 weeks, the LoVo- pseudo was 65 mm 3 and 277 mm 3; this is the introduction of APCDD1 is vivo It shows that it has a growth promoting effect on cells (FIG. 30d).

実施例32：APCDD1の発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖阻害作用
APCDD1の増殖促進的な役割を評価するために、APCDD1に対応する、さまざまな対の対照S-オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成し、それらを、検討した11種の結腸癌細胞株のなかでAPCDD1を大量に発現するSW480細胞にトランスフェクトした。この方法は、SNU475細胞の代わりにSW480細胞を用い、以下のS-オリゴヌクレオチドを用いた点以外は、実施例5に記載した手順に従って行った：対照センスS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-S2、5'-ATGTCCTGGCCGCGCC-3'（配列番号：88）；アンチセンスS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-AS2、5'-GGCGCGGCCAGGACAT-3'（配列番号：89）；リバースS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-R2、5'-TACAGGACCGGCGCGG-3'（配列番号：90）；およびスクランブルS-オリゴヌクレオチドAPCDD1-Sc2、5'-ATCTGGTCCGGCGCGG-3'（配列番号：91）。 Example 32: Growth inhibitory effect of antisense S-oligonucleotide designed to reduce the expression of APCDD1
To assess the pro-proliferative role of APCDD1, various pairs of control and antisense S-oligonucleotides corresponding to APCDD1 were synthesized and tested in 11 colon cancer cell lines Among them, SW480 cells expressing a large amount of APCDD1 were transfected. This method was performed according to the procedure described in Example 5 except that SW480 cells were used instead of SNU475 cells and the following S-oligonucleotides were used: control sense S-oligonucleotides APCDD1-S2, 5 ′ -ATGTCCTGGCCGCGCC-3 '(SEQ ID NO: 88); antisense S-oligonucleotide APCDD1-AS2, 5'-GGCGCGGCCAGGACAT-3' (SEQ ID NO: 89); reverse S-oligonucleotide APCDD1-R2, 5'-TACAGGACCGGCGCGG- 3 '(SEQ ID NO: 90); and scrambled S-oligonucleotide APCDD1-Sc2, 5'-ATCTGGTCCGGCGCGG-3' (SEQ ID NO: 91).

これらのオリゴヌクレオチドのうち、APCDD1-AS2は、細胞におけるAPCDD1の発現を対照APCDD1-S2に比べ有意に抑制した（図31a）。興味深いことに、トランスフェクションから6日後の時点でのAPCDD1-AS2の導入は細胞の増殖巣形成をAPCDD1-S2に比べ明らかに抑制し、このことからAPCDD1の抑制によってトランスフェクト細胞の増殖および/または生存度が低下することが示唆された（図31b）。MTTアッセイにより、APCDD1-R2、APCDD1-Sc2および非処理細胞と比較して、APCDD1-AS2に応答して細胞生存度が低下することが裏づけられた（図31c）。   Of these oligonucleotides, APCDD1-AS2 significantly suppressed the expression of APCDD1 in cells compared to control APCDD1-S2 (FIG. 31a). Interestingly, the introduction of APCDD1-AS2 at 6 days after transfection clearly suppressed cell foci formation compared to APCDD1-S2, indicating that inhibition of APCDD1 led to growth and / or growth of transfected cells. It was suggested that the viability decreased (FIG. 31b). The MTT assay confirmed that cell viability decreased in response to APCDD1-AS2 compared to APCDD1-R2, APCDD1-Sc2 and untreated cells (FIG. 31c).

実施例33：結腸癌細胞株におけるAPCDD1の発現
APCDD1の発現および機能について検討するために、APCDD1に対するポリクローナル抗体を以下の通りに調製した。まず、組換えHis標識したAPCDD1タンパク質を大腸菌で産生させ、Pro Bond（商標）ヒスチジンレジン（インビトロジェン）を用い、製造者の推奨に従って細胞から精製した。この組換えタンパク質をウサギの免疫処置に用い、APCDD1に対するポリクローナル抗体を血清から精製した。ウエスタンブロット分析に関しては、タンパク質を10％SDS-PAGEによって分離し、抗APCDD1抗体を用いてイムノブロットを行った。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG（サンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology））をECL検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク）用の二次抗体として用いた。 Example 33: Expression of APCDD1 in colon cancer cell lines
To examine the expression and function of APCDD1, a polyclonal antibody against APCDD1 was prepared as follows. First, recombinant His-labeled APCDD1 protein was produced in E. coli and purified from cells using Pro Bond ™ histidine resin (Invitrogen) according to manufacturer's recommendations. This recombinant protein was used for immunization of rabbits, and a polyclonal antibody against APCDD1 was purified from serum. For Western blot analysis, proteins were separated by 10% SDS-PAGE and immunoblotted with anti-APCDD1 antibody. HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology) was used as a secondary antibody for the ECL detection system (Amersham Pharmacia Biotech).

抗APCDD1抗体を用いたSW480細胞および凍結組織の免疫組織化学染色も実施例18に記載の通りに行った。パラフィン包埋した組織切片を、製造者の推奨する方法に従ってSAB-POペルオキシダーゼ免疫染色システム（ニチレイ、東京、日本）に供した。抗原は、脱パラフィン処理および再水和を行った組織から、スライドをクエン酸緩衝液（pH6）中に入れて電子オーブンにより700Wで10分間前処理することにより回収した。HCT116、SNUC4およびSW480を含む結腸癌細胞の抽出物を用いた、抗APCDD1抗体によるウエスタンブロット分析により、APCDD1に対応する58kDaバンドが示された（図32）。内因性APCDD1タンパク質のサイズは、抗FLAG抗体によって検出された外因性Flag標識APCDD1タンパク質と非常に類似していた。APCDD1の発現は3種類の結腸癌細胞株の中でSW480細胞が最も高かった。   Immunohistochemical staining of SW480 cells and frozen tissue using anti-APCDD1 antibody was also performed as described in Example 18. Paraffin-embedded tissue sections were subjected to SAB-PO peroxidase immunostaining system (Nichirei, Tokyo, Japan) according to the method recommended by the manufacturer. The antigen was recovered from the deparaffinized and rehydrated tissue by placing the slides in citrate buffer (pH 6) and pretreating at 700 W for 10 minutes in an electronic oven. Western blot analysis with anti-APCDD1 antibody using an extract of colon cancer cells containing HCT116, SNUC4 and SW480 showed a 58 kDa band corresponding to APCDD1 (FIG. 32). The size of the endogenous APCDD1 protein was very similar to the exogenous Flag-tagged APCDD1 protein detected by the anti-FLAG antibody. The expression of APCDD1 was highest in SW480 cells among the three types of colon cancer cell lines.

実施例34：結腸癌細胞および組織におけるAPCDD1の細胞内局在
その細胞内局在を調べるために、SW480細胞を用いてAPCDD1の蛍光免疫組織化学染色を行った。細胞を固定し、抗APCDD1で染色し、フルオレセインを結合させた二次抗体によって可視化した。シグナルは細胞間境界および細胞質で観察された（図33）。 Example 34: Intracellular localization of APCDD1 in colon cancer cells and tissues To examine its subcellular localization, fluorescent immunohistochemical staining of APCDD1 was performed using SW480 cells. Cells were fixed, stained with anti-APCDD1, and visualized with a secondary antibody conjugated with fluorescein. Signals were observed at the cell-cell boundary and cytoplasm (Figure 33).

非癌結腸粘膜組織および癌組織におけるAPCDD1発現も調べたが、これは染色により、非癌細胞および癌細胞の細胞質中に認められた（図34）。注目されることとして、上皮細胞の頂部境界域に強いシグナルが観察された。   APCDD1 expression in non-cancerous colonic mucosal and cancerous tissues was also examined, which was found in the cytoplasm of non-cancerous and cancerous cells by staining (FIG. 34). Of note, a strong signal was observed in the apical border of epithelial cells.

実施例35：結腸の正常上皮、腺癌、および腺腫におけるAPCDD1の発現
APCDD1タンパク質の発現レベルを非癌上皮細胞と腫瘍細胞との間で比較するために、パラフィン包埋した組織を免疫組織化学染色に供した。癌細胞の方が非癌上皮細胞よりも抗APCDD1抗体によって強く染色された（図35）。また、腺腫細胞でも弱いシグナルが観察された（図36）。 Example 35: Expression of APCDD1 in normal epithelium, adenocarcinoma, and adenoma of the colon
To compare the expression level of APCDD1 protein between non-cancer epithelial cells and tumor cells, paraffin-embedded tissues were subjected to immunohistochemical staining. Cancer cells were stained more strongly with anti-APCDD1 antibody than non-cancer epithelial cells (FIG. 35). A weak signal was also observed in adenoma cells (FIG. 36).

産業上の利用可能性
新規ヒト遺伝子WDRPUHおよびKRZFPUHの発現は非癌肝組織に比べ肝細胞癌で顕著に上昇している。一方、新規ヒト遺伝子PPIL1およびAPCDD1の発現は非癌組織に比べ結腸癌細胞で顕著に上昇している。したがって、これらの遺伝子は癌の診断マーカーとして役立つと思われ、それらによってコードされるタンパク質は診断アッセイに用いることができると考えられる。 Industrial Applicability The expression of novel human genes WDRPUH and KRZFPUH is significantly increased in hepatocellular carcinoma compared to non-cancerous liver tissue. On the other hand, the expression of novel human genes PPIL1 and APCDD1 is markedly elevated in colon cancer cells compared to non-cancerous tissues. Thus, these genes would be useful as cancer diagnostic markers and the proteins encoded by them could be used in diagnostic assays.

本発明者らは、新規タンパク質WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現が細胞増殖を促し、一方、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAによって細胞増殖が抑制されることも示した。これらの所見は、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1タンパク質が発癌活性を誘発することを示唆する。このため、この新規癌タンパク質は癌に対する医薬品の開発のための有用な標的となる。例えば、WDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1の発現を阻止する薬剤、またはその活性を妨げる薬剤は、抗癌剤、特にHCCおよび結腸癌の治療用の抗癌剤として治療上有用な可能性がある。このような薬剤の例には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、およびWDRPUH、KRZFPUH、PPIL1、またはAPCDD1を認識する抗体が含まれる。   The inventors have shown that the expression of the novel proteins WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 promotes cell proliferation, while cell proliferation is suppressed by antisense oligonucleotides or siRNAs corresponding to WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 genes. I also showed that. These findings suggest that WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 protein induces oncogenic activity. Thus, this novel oncoprotein is a useful target for the development of pharmaceuticals against cancer. For example, an agent that blocks the expression of WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1 or an agent that interferes with its activity may be therapeutically useful as an anticancer agent, particularly an anticancer agent for the treatment of HCC and colon cancer. Examples of such agents include antisense oligonucleotides, siRNA, and antibodies that recognize WDRPUH, KRZFPUH, PPIL1, or APCDD1.

さらに、本発明者らは、PPIL1がスタスミンと直接会合することも示しており、この結果は、PPIL1にインビボでスタスミンのリン酸化を増強させる能力があることを示唆する。スタスミンは細胞周期の進行に関与するとともにさまざまな種類の癌と関係していることが報告されているため、この複合体の活性を阻害する薬剤も結腸直腸癌の治療および予防に有用な可能性がある。   In addition, we have also shown that PPIL1 associates directly with stathmin, and this result suggests that PPIL1 has the ability to enhance phosphorylation of stathmin in vivo. Because stathmin has been reported to be involved in cell cycle progression and associated with various types of cancer, drugs that inhibit the activity of this complex may also be useful in the treatment and prevention of colorectal cancer There is.

さらに、本発明により、βカテニン/Tcf-4複合体とAPCDD1の2つのTcf/LEF結合モチーフとの結合がAPCDD1の転写活性化に関与することが示された。したがって、この複合体と結合モチーフとの結合を阻害する薬剤も結腸直腸癌の治療および予防に有用な可能性がある。   Furthermore, according to the present invention, it was shown that the binding between β-catenin / Tcf-4 complex and two Tcf / LEF binding motifs of APCDD1 is involved in the transcriptional activation of APCDD1. Therefore, agents that inhibit the binding of this complex to the binding motif may also be useful for the treatment and prevention of colorectal cancer.

本発明を詳細に特定の態様を参照しながら説明してきたが、発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、さまざまな変更および改変を行いうることは当業者には明らかであると考えられる。   Although the present invention has been described in detail with reference to specific embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention.

HCCにおけるWDRPUHおよびKRZFPUHの発現を示す。図1aは、cDNAマイクロアレイで調べた20例のHCCにおけるWDRPUHの相対的な発現比（癌/非癌）を示す。その発現は、選択基準（Cy3シグナルおよびCy5シグナルの両方が25,000を上回る）を満たした12例のHCCのうち11例で上方制御されていた（Cy3：Cy5強度比が＞2.0）。図1bは、20例のHCCにおけるKRZFPUHの相対的な発現比（癌/非癌）を示す。その発現は、選択基準を満たした14例のHCCのうち11例で上方制御されていた（Cy3：Cy5強度比が＞2.0）。図1cおよび1dは、別の10例のHCC症例を用いて半定量的RT-PCRにより分析したWDRPUH（c）およびKRZFPUH（d）の発現を示した写真を提示している（T、腫瘍組織；N、正常組織）。GAPDHの発現を内部対照として用いた。The expression of WDRPUH and KRZFPUH in HCC is shown. FIG. 1a shows the relative expression ratio (cancer / non-cancer) of WDRPUH in 20 HCCs examined by cDNA microarray. Its expression was up-regulated in 11 of 12 HCCs that met the selection criteria (both Cy3 and Cy5 signals exceeded 25,000) (Cy3: Cy5 intensity ratio> 2.0). FIG. 1b shows the relative expression ratio (cancer / non-cancer) of KRZFPUH in 20 HCCs. Its expression was up-regulated in 11 of 14 HCCs that met the selection criteria (Cy3: Cy5 intensity ratio> 2.0). Figures 1c and 1d present photographs showing the expression of WDRPUH (c) and KRZFPUH (d) analyzed by semi-quantitative RT-PCR using another 10 HCC cases (T, tumor tissue) ; N, normal tissue). GAPDH expression was used as an internal control. 種々のヒト組織におけるWDRPUHの発現、ならびにWDRPUHの予想されるタンパク質構造およびタンパク質モチーフを示す。図2aは、多組織ノーザンブロット分析によって分析した、種々のヒト組織におけるWDRPUHの発現を示した写真である。図2bはWDRPUHの予想されるタンパク質構造を示す。2 shows the expression of WDRPUH in various human tissues and the predicted protein structure and protein motif of WDRPUH. FIG. 2a is a photograph showing the expression of WDRPUH in various human tissues analyzed by multi-tissue northern blot analysis. FIG. 2b shows the predicted protein structure of WDRPUH. pcDNA3.1myc/His-WDRPUHをトランスフェクトしたSNU475細胞に対する免疫細胞化学により、具体的には抗mycモノクローナル抗体および可視化のためのFITC結合二次抗マウスIgG抗体を用いて観察したWDRPUHの細胞内局在を示した写真である。核はDAPIにより対比染色した。Intracellular localization of WDRPUH observed by immunocytochemistry on SNU475 cells transfected with pcDNA3.1myc / His-WDRPUH, specifically using anti-myc monoclonal antibody and FITC-conjugated secondary anti-mouse IgG antibody for visualization It is a photograph showing the presence. Nuclei were counterstained with DAPI. NIH3T3細胞の細胞増殖に対するWDRPUHの作用を示す。図4aは、WDRPUH、WDRPUHに対するアンチセンス、およびベクター単独をトランスフェクトしたNIH3T3細胞に対するコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。図4bは電気的密度測定（electric densitometry）によって算定したコロニー数を示す。（*）は、スチューデントのt検定による評価での対照細胞との有意差（p＜0.05）を示す。The effect | action of WDRPUH with respect to the cell growth of NIH3T3 cell is shown. FIG. 4a is a photograph showing the results of a colony formation assay for NIH3T3 cells transfected with WDRPUH, antisense to WDRPUH, and vector alone. FIG. 4b shows the number of colonies calculated by electric densitometry. (*) Indicates a significant difference (p <0.05) from the control cells as assessed by Student's t-test. WDRPUHを抑制するように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖抑制作用を示す。図5aは、センス（WDRPUH-S4）またはアンチセンス（WDRPUH-AS4）オリゴヌクレオチドにより12時間処理したSNU475細胞におけるWDRPUHおよびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図5bは、MTTアッセイによって測定した、オリゴヌクレオチド処理から72時間後のSNU475細胞の細胞生存度を示す。Fig. 4 shows the growth inhibitory action of an antisense S-oligonucleotide designed to inhibit WDRPUH. FIG. 5a shows a photograph showing the expression of WDRPUH and GAPDH (control) in SNU475 cells treated with sense (WDRPUH-S4) or antisense (WDRPUH-AS4) oligonucleotides for 12 hours. FIG. 5b shows cell viability of SNU475 cells 72 hours after oligonucleotide treatment as measured by MTT assay. WDRPUH-siRNAの増殖抑制作用を示す。図6Aは、WDRPUH-siRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞におけるWDRPUHおよびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図6Bは、対照-siRNAまたはWDRPUH-siRNAで処置した生細胞のギムザ染色の結果を示した写真を示す。It shows the growth inhibitory action of WDRPUH-siRNA. FIG. 6A shows a photograph showing the expression of WDRPUH and GAPDH (control) in HepG2 cells transfected with WDRPUH-siRNA. FIG. 6B shows photographs showing the results of Giemsa staining of live cells treated with control-siRNA or WDRPUH-siRNA. 抗WDRPUH抗血清（#1、#2および#3）、免疫前血清、および抗FLAG抗体を用いた、FLAG標識WDRPUHタンパク質のスロットブロット分析の結果を示した写真である。It is the photograph which showed the result of the slot blot analysis of the FLAG labeled WDRPUH protein using the anti-WDRPUH antiserum (# 1, # 2 and # 3), the preimmune serum, and the anti-FLAG antibody. 種々のヒト組織におけるKRZFPUHの発現、ならびにKRZFPUHの予想されるタンパク質構造およびタンパク質モチーフを示す。図8aは、多組織ノーザンブロット分析によって分析した、種々のヒト組織におけるKRZFPUHの発現を示した写真である。図8bはKRZFPUHの予想されるタンパク質構造を示す。Figure 3 shows the expression of KRZFPUH in various human tissues and the predicted protein structure and protein motif of KRZFPUH. FIG. 8a is a photograph showing the expression of KRZFPUH in various human tissues analyzed by multi-tissue northern blot analysis. FIG. 8b shows the predicted protein structure of KRZFPUH. pcDNA3.1myc/His-KRZFPUHをトランスフェクトしたSNU475細胞に対する免疫細胞化学により、具体的には抗Hisモノクローナル抗体および可視化のためのローダミン結合二次抗マウスIgG抗体を用いて観察したKRZFPUHの細胞内局在を示した写真である。核はDAPIにより対比染色した。Intracellular localization of KRZFPUH observed by immunocytochemistry on SNU475 cells transfected with pcDNA3.1myc / His-KRZFPUH, specifically using anti-His monoclonal antibody and rhodamine-conjugated secondary anti-mouse IgG antibody for visualization It is a photograph showing the presence. Nuclei were counterstained with DAPI. COS7細胞の細胞増殖に対するKRZFPUHの作用を示す。図10aは、KRZFPUH、およびKRZFPUHに対するアンチセンスをトランスフェクトしたCOS7細胞のコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。図10bは、電気的密度測定によって算定したコロニー数を示す。（*）は、スチューデントのt検定による評価での対照細胞との有意差（p＜0.05）を示す。The effect | action of KRZFPUH with respect to the cell proliferation of COS7 cell is shown. FIG. 10a is a photograph showing the results of a colony formation assay of COS7 cells transfected with KRZFPUH and antisense to KRZFPUH. FIG. 10b shows the number of colonies calculated by electrical density measurement. (*) Indicates a significant difference (p <0.05) from the control cells as assessed by Student's t-test. KRZFPUHを抑制するように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖抑制作用を示す。図11aは、センス（KRZFPUH-S4）またはアンチセンス（KRZFPUH-AS4）オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたAlexander細胞におけるWDRPUHおよびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図11bは、KRZFPUH-S4またはKRZFPUH-AS4のいずれかで12時間処理したSNU475細胞におけるKRZFPUHの発現を示す。（*）は、スチューデントのt検定による評価での対照細胞との有意差（p＜0.05）を示す。Fig. 5 shows the growth inhibitory action of antisense S-oligonucleotides designed to inhibit KRZFPUH. FIG. 11a shows a photograph showing the expression of WDRPUH and GAPDH (control) in Alexander cells transfected with sense (KRZFPUH-S4) or antisense (KRZFPUH-AS4) oligonucleotides. FIG. 11b shows KRZFPUH expression in SNU475 cells treated with either KRZFPUH-S4 or KRZFPUH-AS4 for 12 hours. (*) Indicates a significant difference (p <0.05) from the control cells as assessed by Student's t-test. Huh7細胞におけるKRZFPUHの発現に対するKRZFPUH-siRNAの増殖抑制作用を示す。図12Aは、psiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）、psiU6BX-EGFP（EGFP）、または擬似ベクター（擬似）をトランスフェクトしたHuh7細胞から抽出したRNAを用いて行った半定量的RT-PCRの結果を示す。GAPDHを内部対照として用いた。図12Bは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）、またはKRZFPUH-siRNAを発現するプラスミドをトランスフェクトした生細胞に対してトランスフェクション5日目に行ったMTTアッセイの結果を示す。（*）はFisherの制約付き最小有意差検定による評価での有意差（p＜0.01）を示す。図12Cは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）またはpsiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）をトランスフェクトした生細胞に対してトランスフェクション10日目に行ったMTTアッセイの結果を示す。（*）はFisherの制約付き最小有意差検定による評価での有意差（p＜0.01）を示す。図12Dは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）またはpsiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）をトランスフェクトした生細胞のギムザ染色の結果（トランスフェクション10日目）を示した写真を示す。The growth inhibitory effect of KRZFPUH-siRNA with respect to the expression of KRZFPUH in Huh7 cells is shown. Figure 12A shows semi-quantitative RT-PCR results using RNA extracted from Huh7 cells transfected with psiU6BX-KRZFPUH2 (Si-02), psiU6BX-EGFP (EGFP), or pseudovector (pseudo). Show. GAPDH was used as an internal control. FIG. 12B shows the results of MTT assays performed on day 5 of transfection on control plasmids (mock and EGFP) or live cells transfected with plasmids expressing KRZFPUH-siRNA. (*) Indicates significant difference (p <0.01) as evaluated by Fisher's constrained least significant difference test. FIG. 12C shows the results of MTT assays performed on day 10 of transfection on live cells transfected with control plasmids (mock and EGFP) or psiU6BX-KRZFPUH2 (Si-02). (*) Indicates significant difference (p <0.01) as evaluated by Fisher's constrained least significant difference test. FIG. 12D shows photographs showing the results of Giemsa staining (transfection day 10) of live cells transfected with control plasmids (mock and EGFP) or psiU6BX-KRZFPUH2 (Si-02). 種々の細胞の生存度に対するKRZFPUH-siRNAの作用を示す。図13Aは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）またはpsiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）をトランスフェクトしたAlexander細胞を用いてトランスフェクション10日目に行ったMTTアッセイの結果を示す。図13Bは、対照プラスミド（擬似およびEGFP）またはpsiU6BX-KRZFPUH2（Si-02）をトランスフェクトしたSNU449細胞を用いてトランスフェクション10日目に行ったMTTアッセイの結果を示す。図13Cは、MTTアッセイによって測定した、HepG2細胞の生存度に対するKRZFPUH-siRNAの作用を示す。（*）は、Fisherの制約付き最小有意差検定による評価での有意差（p＜0.01）を示す。The effect of KRZFPUH-siRNA on the viability of various cells is shown. FIG. 13A shows the results of an MTT assay performed on day 10 of transfection using Alexander cells transfected with control plasmids (mock and EGFP) or psiU6BX-KRZFPUH2 (Si-02). FIG. 13B shows the results of an MTT assay performed on day 10 of transfection using SNU449 cells transfected with control plasmids (mock and EGFP) or psiU6BX-KRZFPUH2 (Si-02). FIG. 13C shows the effect of KRZFPUH-siRNA on HepG2 cell viability as measured by MTT assay. (*) Indicates a significant difference (p <0.01) as evaluated by Fisher's constrained least significant difference test. 結腸癌におけるPPIL1の発現を示す。図14aは、cDNAマイクロアレイで調べた11例の結腸癌症例におけるPPIL1の相対的な発現比（癌/非癌）を示す。その発現は、選択基準を満たした6例中6例で上方制御されていた（Cy3：Cy5強度比が＞2.0）。図14bは、別の20例の結腸癌症例を用いて半定量的RT-PCRによって分析したPPIL1の発現を示した写真を示している（T、腫瘍組織；N、正常組織）。GAPDHの発現を内部対照として用いた。1 shows PPIL1 expression in colon cancer. FIG. 14a shows the relative expression ratio of PPIL1 (cancer / non-cancer) in 11 colon cancer cases examined by cDNA microarray. Its expression was up-regulated in 6 of 6 cases that met the selection criteria (Cy3: Cy5 intensity ratio> 2.0). FIG. 14b shows a photograph showing the expression of PPIL1 analyzed by semi-quantitative RT-PCR using another 20 colon cancer cases (T, tumor tissue; N, normal tissue). GAPDH expression was used as an internal control. PPIL1（ヒト）、Ppil1（マウス）、Cyp2（***酵母）およびCypE（細胞性粘菌）の間における類似性を示す。The similarity between PPIL1 (human), Ppil1 (mouse), Cyp2 (fission yeast) and CypE (cellular slime mold) is shown. NIH3T3細胞およびHCT116細胞の細胞増殖に対するPPIL1の作用を示す。図16aは、PPIL1をトランスフェクトしたNIH3T3細胞のコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。図16bは、PPIL1をトランスフェクトしたHCT116細胞のコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。いずれの実験においても、pcDNA-LacZ、およびPPIL1のコード領域の相補鎖を発現するpcDNA3.1-アンチセンスを陰性対照として用いた。The effect of PPIL1 on the cell proliferation of NIH3T3 cells and HCT116 cells is shown. FIG. 16a is a photograph showing the results of a colony formation assay of NIH3T3 cells transfected with PPIL1. FIG. 16b is a photograph showing the results of a colony formation assay of HCT116 cells transfected with PPIL1. In both experiments, pcDNA3.1-antisense expressing pcDNA-LacZ and the complementary strand of the coding region of PPIL1 was used as a negative control. ヒト結腸癌細胞株SW480におけるPPIL1のアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖抑制作用を示す。図17aは、センスS-オリゴヌクレオチド（PPIL1-S2）、アンチセンスS-オリゴヌクレオチド（PPIL1-AS2）またはスクランブルS-オリゴヌクレオチド（PPIL1-SCR2）で処理したSW480細胞におけるPPIL1およびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図17bは、PPIL1-AS2の増殖抑制作用を示した写真である。図17cは、MTTアッセイによって測定した、オリゴヌクレオチド処理から72時間後のSW480細胞、SNUC4細胞、およびSNUC5細胞の細胞生存度を示す。Fig. 5 shows the growth inhibitory effect of PPIL1 antisense S-oligonucleotide in human colon cancer cell line SW480. FIG. 17a shows PPIL1 and GAPDH (control) in SW480 cells treated with sense S-oligonucleotide (PPIL1-S2), antisense S-oligonucleotide (PPIL1-AS2) or scrambled S-oligonucleotide (PPIL1-SCR2). The photograph which showed expression is shown. FIG. 17b is a photograph showing the growth inhibitory action of PPIL1-AS2. FIG. 17c shows the cell viability of SW480, SNUC4, and SNUC5 cells 72 hours after oligonucleotide treatment, as measured by MTT assay. インビトロでPPIL1がSNW1と会合することを示した写真を示す。COS7細胞に、pFLAG CMV-PPIL1およびpcDNA3.1myc/His-SNW1を同時トランスフェクトした。この細胞から得た可溶化物を抗c-Mycポリクローナル抗体または抗FLAGモノクローナル抗体によって免疫沈降させるとともに、抗FLAGモノクローナル抗体または抗c-Mycポリクローナル抗体をそれぞれ用いてイムノブロットを行った。2 shows photographs showing that PPIL1 associates with SNW1 in vitro. COS7 cells were co-transfected with pFLAG CMV-PPIL1 and pcDNA3.1myc / His-SNW1. The lysate obtained from the cells was immunoprecipitated with an anti-c-Myc polyclonal antibody or an anti-FLAG monoclonal antibody, and immunoblotted with an anti-FLAG monoclonal antibody or an anti-c-Myc polyclonal antibody, respectively. FLAG標識PPIL1およびmyc標識SNW1タンパク質の細胞内局在を示した写真を示す。図19aは、pFLAG CMV-PPIL1をトランスフェクトし、抗FLAG M2モノクローナル抗体で染色したCOS7細胞の写真である。標識タンパク質は、ローダミンで標識した抗マウスIgG抗体を用いて可視化した。図19bは、pcDNA3.1myc/His-SNW1をトランスフェクトし、抗c-Myc抗体で染色したCOS7細胞の写真である。標識タンパク質は、FITCで標識した抗ウサギIgG抗体を用いて可視化した。図19cは、核をDAPIで対比染色した細胞の写真である。図19dは（a）（b）および（c）のマージ画像である。PPIL1およびSNW1は核内に共存していた。The photograph which showed the intracellular localization of FLAG label | marker PPIL1 and myc label | marker SNW1 protein is shown. FIG. 19a is a photograph of COS7 cells transfected with pFLAG CMV-PPIL1 and stained with anti-FLAG M2 monoclonal antibody. The labeled protein was visualized using an anti-mouse IgG antibody labeled with rhodamine. FIG. 19b is a photograph of COS7 cells transfected with pcDNA3.1myc / His-SNW1 and stained with anti-c-Myc antibody. The labeled protein was visualized using an anti-rabbit IgG antibody labeled with FITC. FIG. 19c is a photograph of cells in which nuclei were counterstained with DAPI. FIG. 19d is a merged image of (a), (b), and (c). PPIL1 and SNW1 coexisted in the nucleus. 多組織ノーザンブロット分析によって分析した、種々のヒト組織におけるPPIL1の発現を示した写真である。FIG. 2 is a photograph showing the expression of PPIL1 in various human tissues analyzed by multi-tissue northern blot analysis. SNUC4細胞およびSNUC5細胞におけるPPIL1-siRNAの増殖抑制作用を示す。図21Aは、PPIL1-siRNAをトランスフェクトしたSNUC4細胞およびSNUC5細胞におけるPPIL1およびGAPDH（対照）の発現を示した写真を示す。図21Bは、対照-siRNAまたはPPIL1-siRNAで処理した生細胞のギムザ染色の結果を示した写真を示す。The growth inhibitory effect of PPIL1-siRNA in SNUC4 cell and SNUC5 cell is shown. FIG. 21A shows photographs showing the expression of PPIL1 and GAPDH (control) in SNUC4 and SNUC5 cells transfected with PPIL1-siRNA. FIG. 21B shows a photograph showing the results of Giemsa staining of live cells treated with control-siRNA or PPIL1-siRNA. 大腸菌におけるPPIL1組換えタンパク質の発現を示す。図22Aは、GSTと融合させたPPIL1タンパク質の発現を示した写真である。図22Bは、His標識PPIL1タンパク質の発現を示した写真である。1 shows expression of PPIL1 recombinant protein in E. coli. FIG. 22A is a photograph showing the expression of PPIL1 protein fused with GST. FIG. 22B is a photograph showing the expression of His-tagged PPIL1 protein. 細菌2-ハイブリッド系におけるPPIL1とスタスミンの相互作用を示す。図23Aは、2-ハイブリッド系におけるPPIL1とスタスミンの相互作用を示した写真である。図23Bは、インビボでのPPIL1とスタスミンの相互作用を示した写真である。The interaction of PPIL1 and stathmin in a bacterial 2-hybrid system is shown. FIG. 23A is a photograph showing the interaction between PPIL1 and stathmin in a 2-hybrid system. FIG. 23B is a photograph showing the interaction between PPIL1 and stathmin in vivo. pFLAG-PPIL1およびpCMV-HA-STMNを同時トランスフェクトしたCOS7細胞の細胞質におけるPPIL1およびスタスミンの共存を示す。図24は、COS7細胞の細胞質におけるPPIL1およびスタスミンの蛍光免疫組織化学染色の結果を示した写真を示す。Figure 3 shows the coexistence of PPIL1 and stathmin in the cytoplasm of COS7 cells co-transfected with pFLAG-PPIL1 and pCMV-HA-STMN. FIG. 24 shows photographs showing the results of fluorescent immunohistochemical staining of PPIL1 and stathmin in the cytoplasm of COS7 cells. インビボにおけるスタスミンの種々の欠失変異体とPPIL1の相互作用を示す。図25Aは、スタスミンの種々の欠失変異体の構造の概略図を示す。図25Bは、インビボにおけるスタスミンの発現およびPPIL1と欠失変異体の共沈を示した写真を示す。Figure 5 shows PPIL1 interaction with various deletion mutants of stathmin in vivo. FIG. 25A shows a schematic diagram of the structure of various deletion mutants of stathmin. FIG. 25B shows photographs showing stathmin expression in vivo and coprecipitation of PPIL1 and deletion mutants. インビボにおけるスタスミン変異体の発現およびPPIL1との相互作用を示す。図26Aは、SerをAlaで置換したスタスミン変異体の概略図を示す。図26Bは、インビボにおけるスタスミンの発現およびPPIL1と変異体の共沈を示した写真を示す。Figure 5 shows the expression of stathmin mutant in vivo and its interaction with PPIL1. FIG. 26A shows a schematic diagram of a stathmin mutant in which Ser is replaced with Ala. FIG. 26B shows photographs showing in vivo expression of stathmin and coprecipitation of PPIL1 and mutants. APCDD1の発現を示した写真を示す。図27aは、Ad-APCまたはAd-AxinをトランスフェクトしたSW480細胞におけるAPCDD1の発現低下を示した写真を示す。RNAおよびタンパク質抽出物は、指定のアデノウイルスをMOI 100で感染させ、72時間インキュベートしたSW480細胞から単離した。図27bは、ノーザンブロットによって分析した、成人組織におけるAPCDD1の発現を示す写真である。APCDD1は主として心臓、膵臓、前立腺、および卵巣で発現したが、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、および末梢血細胞でもわずかに発現した。図27cは、半定量的RT-PCRによって測定した、結腸癌組織（T）および対応する非癌粘膜（N）におけるAPCDD1の発現を示した写真を示す。検討した30例のうち20例（67％）で発現上昇が観察された。GAPDHの発現を内部対照として用いた。The photograph which showed the expression of APCDD1 is shown. FIG. 27a shows a photograph showing reduced expression of APCDD1 in SW480 cells transfected with Ad-APC or Ad-Axin. RNA and protein extracts were isolated from SW480 cells infected with the indicated adenovirus at MOI 100 and incubated for 72 hours. FIG. 27b is a photograph showing the expression of APCDD1 in adult tissues analyzed by Northern blot. APCDD1 was expressed primarily in the heart, pancreas, prostate, and ovary, but was also weakly expressed in lung, liver, kidney, spleen, thymus, colon, and peripheral blood cells. FIG. 27c shows a photograph showing the expression of APCDD1 in colon cancer tissue (T) and the corresponding non-cancerous mucosa (N) as measured by semi-quantitative RT-PCR. Increased expression was observed in 20 (67%) of the 30 cases studied. GAPDH expression was used as an internal control. APCDD1の種々のプラスミドを用いて行ったレポーターアッセイの結果を示す。図28aは、APCDD1の5'隣接領域に存在する推定上のTcf4結合因子、およびAPCDD1の種々のレポータープラスミドを示した概略図である。転写開始部位と推定される部位からのヌクレオチド位置をプラスまたはマイナスを付けた数字で示す。図28bは、レポータープラスミドと発現プラスミド（pcDNA-擬似、pcDNA-mutβカテニン、pcDNA-wtTcf-4またはpcDNA-dnTcf4）とを種々組み合わせて同時トランスフェクトしたHeLa細胞のルシフェラーゼ活性を示す。レポーターアッセイはトランスフェクションから48時間後に3回ずつ行った。バーは標準偏差を示す。（*）はシェフェ（Scheffe）のF検定による評価での有意差（P＜0.01）を表す。The result of the reporter assay performed using various plasmids of APCDD1 is shown. FIG. 28a is a schematic showing the putative Tcf4 binding factor present in the 5 ′ flanking region of APCDD1 and various reporter plasmids of APCDD1. Nucleotide positions from the site that is presumed to be the transcription start site are indicated by numbers with plus or minus. FIG. 28b shows the luciferase activity of HeLa cells co-transfected with various combinations of reporter plasmids and expression plasmids (pcDNA-pseudo, pcDNA-mutβcatenin, pcDNA-wtTcf-4 or pcDNA-dnTcf4). Reporter assays were performed 3 times 48 hours after transfection. Bars indicate standard deviation. (*) Represents a significant difference (P <0.01) in the Scheffe F-test evaluation. TBM1またはTBM2を含む因子とβカテニン/Tcf4複合体との相互作用を示したEMSAの結果を示す写真である。複合体を表すバンドのスーパーシフトは、抗βカテニン抗体（レーン2）の添加後には観察されたが、抗P53抗体（レーン3）の添加後には観察されなかった。Tcf4プローブおよびβカテニン/Tcf4プローブに対応するバンドは、標識していない野生型プローブ（レーン5）の添加によって特異的にブロックされた。It is a photograph showing the results of EMSA showing the interaction between a factor containing TBM1 or TBM2 and a β-catenin / Tcf4 complex. A supershift of the band representing the complex was observed after the addition of anti-β-catenin antibody (lane 2) but not after the addition of anti-P53 antibody (lane 3). Bands corresponding to Tcf4 and β-catenin / Tcf4 probes were specifically blocked by the addition of unlabeled wild type probe (lane 5). インビトロでのLoVo細胞における細胞増殖に対するAPCDD1の作用を示す。図30aは、LoVo細胞におけるコロニー形成アッセイの結果を示した写真である。細胞にはpcDNA3.1-APCDD1、pcDNA、またはpcDNA-アンチセンスをトランスフェクトした。図30bは、外因性APCDD1を発現するLoVo細胞（LoVo-APCDD1）および対照細胞（LoVo-ベクター）におけるAPCDD1の発現を示した写真である。図30cは、LoVo-APCDD1細胞およびLoVo-ベクター細胞の増殖を示す。図30dは、LoVo-APCDD1細胞の2種類のクローンおよびLoVo-ベクター細胞の2種類のクローンによる、ヌードマウスでの腫瘍の増殖を示す。Figure 2 shows the effect of APCDD1 on cell proliferation in LoVo cells in vitro. FIG. 30a is a photograph showing the results of a colony formation assay in LoVo cells. Cells were transfected with pcDNA3.1-APCDD1, pcDNA, or pcDNA-antisense. FIG. 30b is a photograph showing the expression of APCDD1 in LoVo cells expressing exogenous APCDD1 (LoVo-APCDD1) and control cells (LoVo-vector). FIG. 30c shows the growth of LoVo-APCDD1 cells and LoVo-vector cells. FIG. 30d shows tumor growth in nude mice with two clones of LoVo-APCDD1 cells and two clones of LoVo-vector cells. APCDD1の発現を低下させるように設計されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖阻害作用を示す。図31Aは、センスS-オリゴヌクレオチド（APCDD-S2）またはアンチセンスS-オリゴヌクレオチド（APCDD-AS2）で24時間処理したSW480細胞におけるAPCDD1の発現を示した写真を示す。GAPDHの発現を内部対照として用いた。図31Bは、APCDD-AS2の増殖抑制作用を示した写真である。図31Cは、MTTアッセイにより測定した、オリゴヌクレオチド処理後のSW480細胞の細胞生存度を示す。バーは標準偏差を示す。（*）は、シェフェ（Scheffe）のF検定による評価での有意差（P＜0.01）を表す。FIG. 6 shows the growth inhibitory action of antisense S-oligonucleotides designed to reduce the expression of APCDD1. FIG. 31A shows a photograph showing the expression of APCDD1 in SW480 cells treated with sense S-oligonucleotide (APCDD-S2) or antisense S-oligonucleotide (APCDD-AS2) for 24 hours. GAPDH expression was used as an internal control. FIG. 31B is a photograph showing the growth inhibitory action of APCDD-AS2. FIG. 31C shows the cell viability of SW480 cells after oligonucleotide treatment as measured by MTT assay. Bars indicate standard deviation. (*) Represents a significant difference (P <0.01) in the Scheffe F-test evaluation. APCDD1を単独で、またはpFLAG-APCDD1とともにトランスフェクトしたCOS7細胞、および結腸癌細胞株のウエスタンブロット分析を示した写真である。FIG. 6 is a photograph showing Western blot analysis of COS7 cells transfected with APCDD1 alone or with pFLAG-APCDD1, and colon cancer cell lines. SW480細胞におけるAPCDD1タンパク質の細胞内局在を示した写真を示す。The photograph which showed the intracellular localization of APCDD1 protein in SW480 cell is shown. 結腸の非癌粘膜（A）および腺癌（B）におけるAPCDD1の蛍光免疫組織化学染色の結果を示した写真を示す。The photograph which showed the result of the fluorescence immunohistochemical staining of APCDD1 in the non-cancerous mucosa (A) and adenocarcinoma (B) of the colon is shown. 結腸癌組織におけるAPCDD1の免疫組織化学染色の結果を示した写真を示す。The photograph which showed the result of the immunohistochemical staining of APCDD1 in a colon cancer tissue is shown. 結腸腺腫におけるAPCDD1の免疫組織化学染色の結果を示した写真を示す。The photograph which showed the result of the immunohistochemical staining of APCDD1 in a colon adenoma is shown.

Claims (20)

以下からなる群より選択される、ポリペプチド：
（a）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（c）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、配列番号：1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。 A polypeptide selected from the group consisting of:
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 having one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions having cell growth activity equivalent to that of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. And (c) hybridizing under high stringency conditions with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 having a cell growth activity equivalent to that of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polypeptide encoded by a polynucleotide. 請求項1記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。   2. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. 請求項2記載のポリヌクレオチドを含むベクター。   A vector comprising the polynucleotide according to claim 2. 請求項2記載のポリヌクレオチドまたは請求項3記載のベクターを保有する宿主細胞。   A host cell carrying the polynucleotide of claim 2 or the vector of claim 3. 以下の段階を含む、請求項1記載のポリペプチドを生産するための方法：
（a）請求項4記載の宿主細胞を培養する段階；
（b）宿主細胞にポリペプチドを発現させる段階；および
（c）発現されたポリペプチドを収集する段階。
を含む方法。 A method for producing a polypeptide according to claim 1 comprising the following steps:
(A) culturing the host cell of claim 4;
(B) allowing the host cell to express the polypeptide; and (c) collecting the expressed polypeptide.
Including methods. 請求項1記載のポリペプチドと結合する抗体。   An antibody that binds to the polypeptide of claim 1. 配列番号：1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に対して相補的であって、前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を定量するための、少なくとも15ヌクレオチドを含むプローブまたはプライマー。 A probe or primer which is complementary to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary strand thereof and which comprises at least 15 nucleotides for quantifying the polynucleotide or the complementary strand thereof . 配列番号：1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み配列番号：２のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチド、またはセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の組み合わせを含み、前記センス鎖配列が配列番号：1のヌクレオチド配列中の１９−２５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を標的配列として含み配列番号：２のポリペプチドの産生を減少させる低分子干渉RNA。   An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and inhibiting the expression of the polypeptide of SEQ ID NO: 2, or a combination of a sense strand sequence and an antisense strand sequence, wherein the sense strand sequence A small interfering RNA comprising a nucleotide sequence 19-25 nucleotides long in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a target sequence and reducing the production of the polypeptide of SEQ ID NO: 2. 配列番号：16のヌクレオチド配列を含む請求項8記載のアンチセンスポリヌクレオチド。   The antisense polynucleotide of claim 8 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16. その標的配列が、配列番号：93、94、95、および96のヌクレオチド配列を標的配列として含むヌクレオチドからなる群より選択される、請求項8記載の低分子干渉RNA。   9. The small interfering RNA according to claim 8, wherein the target sequence is selected from the group consisting of nucleotides comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 93, 94, 95, and 96 as target sequences. 対象から採取された標本の生物試料における、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むWDRPUH遺伝子の発現レベルを細胞増殖性疾患のマーカーとして検出する段階を含む細胞増殖性疾患のマーカーを検出するための方法。   A method for detecting a marker for cell proliferative disease, comprising detecting the expression level of a WDRPUH gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a marker for cell proliferative disease in a biological sample of a specimen collected from a subject . 以下からなる群より選択される方法のいずれか1つによって発現レベルが検出される、請求項11記載の方法：
（a）配列番号：1のヌクレオチド配列を含むWDRPUH遺伝子のmRNAを検出する段階；
（b）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する段階；および
（c）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドの細胞増殖活性を検出する段階。 12. The method of claim 11, wherein the expression level is detected by any one of the methods selected from the group consisting of:
(A) detecting WDRPUH gene mRNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) detecting a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and (c) detecting a cell proliferation activity of the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 細胞増殖性疾患が癌である、請求項11〜12のいずれか一項記載の方法。   The method according to any one of claims 11 to 12, wherein the cell proliferative disease is cancer. 次の要素(a)または(b)を含む細胞増殖性疾患の診断薬；
（a）配列番号：1のヌクレオチド配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド；または
（b）配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体。 A diagnostic agent for cell proliferative disease comprising the following element (a) or (b):
(A) SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence or oligonucleotide comprising a complementarity of at least 15 nucleotides in a complementary sequence; or (b) SEQ ID NO: antibodies that bind to a polypeptide consisting of the amino acid sequence. 以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための候補化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）被験化合物を、
（1）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（2）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（3）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な細胞増殖活性を有する、配列番号：1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階；
（b）ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；ならびに
（c）ポリペプチドと結合する化合物を選択する段階。 A method of screening for candidate compounds for treating a cell proliferative disorder comprising the following steps:
(A) a test compound,
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(2) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 having one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions having cell growth activity equivalent to that of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. And (3) hybridizing under high stringency conditions with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 having a cell proliferation activity equivalent to that of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polypeptide encoded by a polynucleotide,
Contacting with a polypeptide selected from the group consisting of:
(B) detecting the binding activity between the polypeptide and the test compound; and (c) selecting a compound that binds to the polypeptide. 以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）被験化合物を、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現する細胞と接触させる段階；および
（b）配列番号：1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階。 A method of screening for compounds for treating cell proliferative disorders, comprising the following steps:
(A) contacting the test compound with a cell that expresses a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and (b) the expression level of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1: Selecting a compound that decreases compared to the level of expression detected in the absence. 以下の段階を含む、細胞増殖性疾患を治療するための化合物に関するスクリーニングの方法：
（a）被験化合物を、
（1）配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（2）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物学的活性を有する、1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（3）配列番号：2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物学的活性を有する、配列番号：1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階；
（b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；ならびに
（c）被験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較してポリペプチドの生物学的活性を抑制する化合物を選択する段階
であって、前記生物学的活性が細胞増殖活性である方法。 A method of screening for compounds for treating cell proliferative disorders, comprising the following steps:
(A) a test compound,
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
(2) Amino acid of SEQ ID NO: 2 having one or more amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions having a biological activity equivalent to that of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polypeptide comprising the sequence, and (3) under highly stringent conditions with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 having a biological activity equivalent to that of the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A polypeptide encoded by a hybridizing polynucleotide;
Contacting with a polypeptide selected from the group consisting of:
(B) detecting the biological activity of the polypeptide of step (a); and (c) comparing the biological activity of the polypeptide compared to the biological activity detected in the absence of the test compound. A method of selecting a compound to inhibit, wherein the biological activity is cell proliferation activity. 細胞増殖性疾患が癌である、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。   The method according to any one of claims 15 to 17, wherein the cell proliferative disease is cancer. 配列番号：1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み配列番号：２のポリペプチドの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドまたはセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の組み合わせを含み、前記センス鎖配列が配列番号：1のヌクレオチド配列中の１９−２５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を標的配列として含み配列番号：２のポリペプチドの産生を減少させる低分子干渉RNAの薬学的有効量を含む、細胞増殖性疾患を治療するための組成物。   An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and inhibiting the expression of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or a combination of a sense strand sequence and an antisense strand sequence, wherein the sense strand sequence comprises A cell proliferative disease comprising a nucleotide sequence 19-25 nucleotides long in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a target sequence and comprising a pharmaceutically effective amount of a small interfering RNA that reduces the production of the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Composition for the treatment of. 細胞増殖性疾患が癌である、請求項19記載の組成物。 20. The composition according to claim 19 , wherein the cell proliferative disorder is cancer.
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