JP6017448B2 - 血液疾患の診断方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、患者の血液疾患の診断方法に関する。

大量の造血細胞および細胞が通過する分化の多くの工程は、この種の細胞から生じる新生物の分類をさらに複雑にしている。「リアルな」実体に基づく分類を確立するための努力にもかかわらず、カテゴリの一部は不明瞭であり、多くの場合、臨床経過の治療に対する応答に関して非常に不均一な群を含む。この不均一性が、一方では、ある挙動を他の挙動から区別することができるマーカーの絶え間ない探索、そして他方では、議論の的であるこの種の新生物の分類が絶えず修正を受けていることの原因である。

理想的な分類システムは、正確で、再現可能であり、使いやすくなければならず、特に生物学的および臨床的有意性を有するべきである（Ｃｈａｎ ＷＣ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏａｔ Ｍｅｄ Ｊ．２００５；４６：３４９−５９）。血液新生物の現在の診断システムおよび分類は、組織学的および形態学的な、免疫表現型的および細胞遺伝学的特徴の認識ならびに予後的価値を有する分子マーカーの研究に基づく。しかし、このようにして定義される診断カテゴリの一部では、以下のことが認められる：

・著しく不均一な治療応答：同じ疾患内で、患者は完全な寛解もしくは部分的な寛解に至るか、または特定の治療に応答しないもしくは治療後に再発する。幹細胞の移植は、有効であるが毒性を伴う選択的応答であるので、この種の新生物では応答を予測できることが特に重要である。従来の治療を行う前に、いずれの患者がこの治療に対して応答するかを判定できることは、各々の患者に最も有効な治療を適用できるために有益であり得る。

・変動のある臨床挙動：このカテゴリ内で、一部の患者については、疾患は長期間安定なままであり、治療を必要としないが、また別の患者では、疾患は急速に進行し、積極的な治療を必要とする。

これらの変動は、診断カテゴリの中での分子的な不均一性の存在、従来の診断方法では判定することができない相違、およびしたがって、この種の新生物の特徴づけにおいてより大きな識別能を提供する新しい形態の分析の探究を指摘する。

これに関して、発現アレイの使用は、多くの腫瘍で認められる生物学的および臨床的多様性を解釈することにおいてのみならず、多くの症状に、特に血液系に影響を及ぼす生物学的および病理学的過程を理解するうえでも有効であることが明らかにされている。発現アレイは、固体支持体に結合した、ｍＲＮＡまたはその対応するｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡに相補的な配列の順序づけられたアレイであり、数百または数千の遺伝子の区別的発現を同時に分析することを可能にする。これらがしばしば結合される支持体の１つは、しばしばマイクロアレイ、バイオチップまたは単にチップという用語で示される体裁である、スライドガラスに類似した長方形のガラスの断片である。これらの使用は、様々な疾患の診断のためまたは疾患に罹患する感受性の評価を進化させるためにますます頻繁になりつつある。

１９９９年に、Ｇｏｌｕｂのグループは、血液新生物の分類におけるアレイの役割に言及した最初の論文の１つを発表した（Ｇｏｌｕｂ ＴＲ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８６：５３１−７）。６８１７の遺伝子が提示されたアレイが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）における発現プロフィールの研究のために使用された。５０の遺伝子の群が白血病の種類を予測する能力によって選択され（クラス予測因子）、これらは未知の試料の群を正しいカテゴリに分類するために使用された。これら５０の遺伝子の発現の検討は、ＡＭＬまたはＡＬＬの試料の分類のために十分である。ＡＭＬとＡＬＬとの区別は現在の診断方法で広く確立されているという事実にもかかわらず、研究は各々の種類の急性白血病に関連する特定の発現パターンの存在を明らかにし、その使用を証明した。

欧州特許出願第１９４７１９４号は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を診断するための特定のオリゴヌクレオチドの使用を提案した。

ＷＯ２００５／０８０６０１は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の分類、診断および予後についての遺伝学的分析の方法を開示する。この特許出願は、ＡＭＬサブタイプを区別する方法を提供しているが、前白血病状態と白血病状態の識別のための方法は提供していない。

ＷＯ２００６／１２５１９５は、その発現が試料を骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）もしくはＡＭＬとして分類するかまたは罹患していないと分類することを可能にする、２４遺伝子の群を開示する。しかし、この文献は、異なる悪性度のＭＤＳを分類するための方法を提供していない。

そのため、癌の悪性状態と前悪性状態を診断し、分類するための新しい方法を提供する必要がある。

酸化ストレスは、一般に反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成と抗酸化防御系障害との間の不均衡状態と定義される。酸化ストレスが癌の病態生理学に関与することは長年知られている。

内因性または外因性に産生される高レベルのＲＯＳは、生体細胞中の脂質、タンパク質および核酸を攻撃することができる。これは、ＲＯＳの過剰生成を防止するおよびそれらの有害な作用を制限するための様々な抗酸化防御機構を発現する細胞をもたらした。適切な酸化還元の均衡は抗酸化酵素の複合作用によって維持されている。

骨髄異形成症候群および急性白血病は病的造血を特徴とする。ＲＯＳは、確実にヒトの造血において重要な役割を果たす。例えば、ＲＯＳが誘導するｐ３８ ＭＡＰＫ活性化は造血において極めて重要であり、造血幹細胞（ＨＳＣ）が休止状態から脱する引き金を引くためおよび成熟と分化を駆動するためにはＲＯＳレベルの上昇が必要であることはマウスモデルにおいて十分に確立されている。さらに、高いＲＯＳレベルはＨＳＣの自己更新活性の乱れを誘導する。正常細胞の腫瘍形質転換への進行が、細胞の増殖、生存および分化を制御する遺伝子の突然変異の蓄積から生じることは現在では広く確立されている。おおよそ、骨髄異形成症候群の症例の３０％が急性白血病に進行する。間接的な証拠は、骨髄異形成症候群の病因における酸化的ＤＮＡ損傷の役割を示唆する。さらに、骨髄異形成症候群および白血病患者からの骨髄細胞でのＲＯＳのフローサイトメトリ定量化は、すべての症例においてＲＯＳレベルの上昇を明らかにする。

そのため、前悪性状態と悪性状態における抗酸化応答を検討することは、新しい有用な方法を提供するための良好な出発点であると思われる。

癌幹細胞（ＣＳＣ）仮説は、腫瘍内の細胞のサブセットが、持続的に成長する腫瘍の生成を繰り返す能力を有することを示唆する（Ｃｌａｒｋｅ ＭＦ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００６；６６：９３３９−４４）。ＣＳＣはヒトにおいて最もよく記述されており、ヒトでは、稀ないわゆる白血病幹細胞（Ｌ−ＨＳＣ）を前向きに単離することができ、免疫無防備状態のマウスに導入した場合、疾患を伝播することを示すことができる（Ｌａｐｉｄｏｔ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９４；６４５−８）。この表現型を共有しない細胞がしばしば白血病クローンの大部分を占めるが、移植後に疾患を伝播することはできない。Ｌ−ＨＳＣに関する初期の研究は、現在、急速に増えつつある腫瘍のリストに拡大されている（Ｂｏｍｋｅｎ Ｓ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１０３：４３９−４５）。これらはヒトにおいて白血病を治療するのに一般的に使用される薬剤に耐性であると思われるので、一部の患者ではＬ−ＨＳＣが再発の原因であると考えられる（Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｆ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５：１３１５−２１）。Ｌ−ＨＳＣ発現のために機能的に重要な遺伝子は、それゆえ、最終的な治療標的であり得る。これは、他のＲＯＳ消去系が他の癌幹細胞における調節に重要である可能性を増大させる。実際に、乳癌のＣＳＣにおける低いＲＯＳレベルが最近報告されており、これはグルタチオン生合成遺伝子の発現上昇に結びつけられた（Ｄｉｅｈｎ Ｍ，Ｎａｔｕｒｅ．２００９；４５８：７８０−３）。

したがって、本発明の１つの目的は、癌を診断するための新しい方法を提供することである。

本発明の別の目的は、他の方法では分類することができない、病理学的試料を分類するための迅速で効率的な方法を提供することである。

本発明の別の目的は、上記方法の実施のためのキットを提供することである。

本発明の別の目的は、上記方法の実施を可能にする組成物を提供することである。

本発明は、血液疾患、特に骨髄性および／またはリンパ性血液疾患、好ましくは骨髄性血液疾患の、好ましくはインビトロでの、診断および／または分類のための方法に関する。

前記方法は以下の工程を含む：
ａ）被験者の血液試料に含まれる細胞から、好ましくは血液細胞または骨髄細胞を含有する試料から、少なくとも、２４遺伝子の群の中から選択される遺伝子のセットに属する６遺伝子のサブグループの遺伝子の発現レベルを測定する工程、ここで、前記２４遺伝子の群は配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成され、
前記被験者は、血液疾患、特に骨髄性および／またはリンパ性血液疾患、好ましくは骨髄性血液疾患に罹患していることが疑われ、
前記６遺伝子は、配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成される前記サブグループに属する、
ｂ）工程ａ）で測定された各遺伝子の発現レベルを、対照試料に含まれる細胞から、好ましくは血液細胞または骨髄細胞を含有する試料からの同じそれぞれの遺伝子の発現レベルと比較して、前記サブグループの各遺伝子ついての遺伝子発現レベル比を確立する工程、ここで、前記対照試料は前記生物学的試料と同じ性質である、
ｃ）前記生物学的試料の状態を、前記サブグループからの少なくとも３個の遺伝子の任意の組合せの各遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合、前記生物学的試料は血液疾患細胞を示すと判定する工程。

言い換えると、本発明による工程ｂ）は、以下のことから成る。

工程ａ）で測定された各遺伝子の発現レベルを、対照試料に含まれる細胞から、好ましくは血液細胞または骨髄細胞を含有する対照試料からの同じそれぞれの遺伝子の発現レベルと比較して、前記サブグループの各遺伝子について、工程ａ）で測定された各遺伝子の発現レベルｉと対照試料に含まれる細胞からの同じそれぞれの遺伝子の発現レベルｉとの間の遺伝子発現レベル比Ｒ_ｉを確立すること、ここで、前記対照試料は前記生物学的試料と同じ性質である。

本発明による工程ｃ）は、前記生物学的試料の状態を、前記サブグループからの３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率Ｒ_ｉが、
・≧２、
・または≦０．５
のいずれかである場合、前記生物学的試料は血液疾患細胞を示すと判定することから成る。

本発明は、少なくとも６の特定の遺伝子、すなわち配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成される２４の特定の遺伝子の群に属する、配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成される遺伝子が、血液疾患の状態を判定するのに十分であるという予想外の所見に基づく。

本発明は、好ましくはこれまでに血液疾患のために治療を受けたことがない患者からの試料に関して実施される。

これらの遺伝子は、具体的には、ＲＯＳが蓄積する細胞の解毒に関与する酵素をコードする遺伝子である。

ＲＯＳの除去に関与する自然過程を図１に示す。

本発明によれば、２４遺伝子の群（Ｃ）は、遺伝子のセット（Ｂ）を含み、前記セットは、上記で定義された６個の特定の遺伝子のサブグループ（Ａ）を含む。本発明による群／セット／サブグループの重なりを図２に示す。

本発明による方法は、したがって次のように実施される：
・患者の試料から、前記試料中に含まれる核酸分子、好ましくはＲＮＡ分子を当分野で公知の抽出方法に従って抽出する、
・少なくとも配列番号：１〜６を含むかまたはこれらによって構成される核酸分子に対応する特定の核酸分子の量を、以下で例示する周知の技術によって定量化する、
・上記工程で定量化した量を対照試料中に含まれる同じ核酸分子の量と比較して、比率を確立する。

したがって、参照として使用される対照試料は健常個体の試料であり、前記健常試料は患者の試料と同じ性質である。好都合には、対照試料は様々な健常個体の多数の試料のプールに対応し、すなわち対照試料は多数の健常個体の平均である。

上述したように、患者の試料と対照試料は同じ起源である。これは、患者の試料が患者の血液に由来する場合、対照試料は１名または多数の健常個体の血液に由来することを意味する。血液は、本発明では、全血、血漿、血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）等を意味する。

同様に、患者の試料が骨髄に由来する場合、対照試料は１名または多数の健常個体の骨髄に由来する。

本発明では、生物学的試料が使用される患者の生物学的試料は、血液疾患、特に骨髄性および／またはリンパ性血液疾患、好ましくは骨髄性血液疾患に罹患していることが疑われる。

これは、患者の病理学的状態が、
・不確定である（病理学者は、前記患者が血液疾患に罹患しているかどうかわからない）、
・または決定される（病理学者は、患者が血液疾患に罹患していることがわかる）
のいずれかであることを意味する。

これはまた、患者の病理学的状態が、
・最初に決定され（病理学者は、患者が血液疾患に罹患しているか否かを同定する）、
・および、患者が血液疾患に罹患している場合は、前記血液疾患を分類する
であることを意味する。

病理学的状態が不確定である場合、病理学者は、前記患者からの生物学的試料中の配列番号：１〜６から成る遺伝子の発現レベルを測定し、比率Ｒｉを確立して、患者が血液疾患に罹患しているか否かを判定するために、前記発現レベルを、上記で定義したように、同じ性質の対照試料（例えば対照試料または参照として使用される健常ドナーからの細胞のプール）中の同じ遺伝子（すなわち配列番号：１〜６の遺伝子）の発現レベルと比較する。

病理学的状態が決定された場合（例えば細胞学的試験によって）、病理学者は、前記患者からの生物学的試料中の配列番号：１〜６から成る遺伝子の発現レベルを測定し、比率Ｒｉを確立するために、前記発現レベルを、上記で定義したように、同じ性質の対照試料（例えば対照試料または参照として使用される健常ドナーからの細胞のプール）中の同じ遺伝子（すなわち配列番号：１〜６の遺伝子）の発現レベルと比較して、本発明の方法に従って血液疾患を分類することができる。

本発明による方法は、血液疾患、特に骨髄性疾患に相当する試料と同定されたまたはその疑いがある試料の状態を評価するための、使いやすく、迅速で効率的な方法を提供する。

患者試料の、上記で定義されたサブグループに属する上記６遺伝子のうち少なくとも３遺伝子の発現レベルと、対照試料の同じ少なくとも３遺伝子の発現レベルとの比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合、患者の試料は、血液疾患に相当する試料の特徴を示すとみなされる。

上記および以下では、比率は次のように定義される：
Ｒｉ＝［患者試料中の配列番号：ｉの遺伝子ｉの量（発現レベル）］／［対照試料中の配列番号：ｉの遺伝子ｉの量（発現レベル）］。

ｉは１から２４までにわたる。

それゆえ、Ｒ_３は、配列番号：３の遺伝子に関する上記で定義された比率であり、したがってＲ_ｉは、配列番号：ｉに関する上記で定義された比率であって、ｉは１から２４までにわたる。

本発明では、「前記サブグループの６遺伝子のうち少なくとも３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２または≦０．５である」とは、３または４または５または６個の遺伝子の任意の組合せの各遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２または≦０．５であることを意味する。

６遺伝子の中から選択される３遺伝子の２０の組合せすべてを以下に列挙する：
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：４、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：５、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：３＋配列番号：４、
配列番号：１＋配列番号：３＋配列番号：５、
配列番号：１＋配列番号：３＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：４＋配列番号：５、
配列番号：１＋配列番号：４＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：５＋配列番号：６、
配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４、
配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：５、
配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：６、
配列番号：２＋配列番号：４＋配列番号：５、
配列番号：２＋配列番号：４＋配列番号：５、
配列番号：２＋配列番号：５＋配列番号：６、
配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：５、
配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：６、
配列番号：３＋配列番号：５＋配列番号：６および
配列番号：４＋配列番号：５＋配列番号：６。

６遺伝子の中の４遺伝子の１５の組合せすべては次のものである：
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：５、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：５、
配列番号：１＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：４＋配列番号：５、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：４＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：５＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：５、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：６、
配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：５、
配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：６、
配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：５＋配列番号：６、
配列番号：２＋配列番号：４＋配列番号：５＋配列番号：６および
配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：５＋配列番号：６。

６遺伝子の中の５遺伝子の６の組合せすべては次のものである：配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：５、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：５＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：４＋配列番号：５＋配列番号：６、
配列番号：１＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：５＋配列番号：６および
配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：５＋配列番号：６。

最後に、６個の遺伝子の組合せは、配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４＋配列番号：５＋配列番号：６である。

本発明によれば、６遺伝子のサブグループの少なくとも３遺伝子の任意の組合せに属する各遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２または≦０．５である患者の試料は、血液疾患に相当する試料とみなされる。

例えば、配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３の組合せを試験する場合、上記で述べたそれぞれの比率Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が次のとおり：
Ｒ１≧２およびＲ２≧２およびＲ３≧２、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≧２およびＲ３≧２、または
Ｒ１≧２およびＲ２≦０．５およびＲ３≧２、または
Ｒ１≧２およびＲ２≧２およびＲ３≦０．５、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≦０．５およびＲ３≧２、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≧２およびＲ３≦０．５、または
Ｒ１≧２およびＲ２≦０．５およびＲ３≦０．５、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≦０．５およびＲ３≦０．５
であれば、比率が計算された患者の試料は、血液疾患に相当する試料とみなされる。

上記の例は、変更すべきところは変更して、上記の少なくとも３個の遺伝子の組合せに適用される。

その結果として、配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４の組合せを検討する場合、３個の遺伝子の４つの組合せが存在する：
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：３、
配列番号：１＋配列番号：２＋配列番号：４、
配列番号：１＋配列番号：３＋配列番号：４、および
配列番号：２＋配列番号：３＋配列番号：４。

それゆえ、それぞれの比率Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４が次のとおりであれば、比率が計算された患者の試料は、血液疾患に相当する試料とみなされる：
・組合せ１に関して：
Ｒ１≧２およびＲ２≧２およびＲ３≧２、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≧２およびＲ３≧２、または
Ｒ１≧２およびＲ２≦０．５およびＲ３≧２、または
Ｒ１≧２およびＲ２≧２およびＲ３≦０．５、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≦０．５およびＲ３≧２、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≧２およびＲ３≦０．５、または
Ｒ１≧２およびＲ２≦０．５およびＲ３≦０．５、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≦０．５およびＲ３≦０．５、
・組合せ２に関して：
Ｒ１≧２およびＲ３≧２およびＲ４≧２、または
Ｒ１≦０．５およびＲ３≧２およびＲ４≧２、または
Ｒ１≧２およびＲ３≦０．５およびＲ４≧２、または
Ｒ１≧２およびＲ３≧２およびＲ４≦０．５、または
Ｒ１≦０．５およびＲ３≦０．５およびＲ４≧２、または
Ｒ１≦０．５およびＲ３≧２およびＲ４≦０．５、または
Ｒ１≧２およびＲ３≦０．５およびＲ４≦０．５、または
Ｒ１≦０．５およびＲ３≦０．５およびＲ４≦０．５、
・組合せ３に関して：
Ｒ１≧２およびＲ２≧２およびＲ４≧２、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≧２およびＲ４≧２、または
Ｒ１≧２およびＲ２≦０．５およびＲ４≧２、または
Ｒ１≧２およびＲ２≧２およびＲ４≦０．５、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≦０．５およびＲ４≧２、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≧２およびＲ４≦０．５、または
Ｒ１≧２およびＲ２≦０．５およびＲ４≦０．５、または
Ｒ１≦０．５およびＲ２≦０．５およびＲ４≦０．５、
・組合せ４に関して：
Ｒ２≧２およびＲ３≧２およびＲ４≧２、または
Ｒ２≦０．５およびＲ３≧２およびＲ４≧２、または
Ｒ２≧２およびＲ３≦０．５およびＲ４≧２、または
Ｒ２≧２およびＲ３≧２およびＲ４≦０．５、または
Ｒ２≦０．５およびＲ３≦０．５およびＲ４≧２、または
Ｒ２≦０．５およびＲ３≧２およびＲ４≦０．５、または
Ｒ２≧２およびＲ３≦０．５およびＲ４≦０．５、または
Ｒ２≦０．５およびＲ３≦０．５およびＲ４≦０．５。

本発明では、発現レベルが測定される遺伝子は、前記遺伝子の転写によって得られるＲＮＡ分子によって示される。転写の過程は当分野で周知である。

それゆえ、本発明は、上記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子の転写の産物である、すなわち前記遺伝子の発現の産物であるＲＮＡ分子の量を決定することによって測定される、上記で定義された方法に関する。

本発明における一部の遺伝子は、多くの変異体、すなわち配列が異なる多くのＲＮＡ分子を発現することができる。これらの変異体は、一般に選択的スプライシング後に配列が異なり、前記選択的スプライシングは、結果として、生じるＲＮＡ分子において遺伝子に含まれる核酸配列の１またはそれ以上の部分を付加、欠失および／または修飾していなければならない。当業者は選択的スプライシングの機構を理解している。

それゆえ、本発明による一部の遺伝子は、２以上のＲＮＡ分子を発現し、変異体を提供することができる。

ＰＲＤＸ遺伝子は、３つの異なる変異体：配列番号：５の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第一変異体、配列番号：７３の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第二変異体および配列番号：７４の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第三変異体を発現することができる。

ＳＯＤ２遺伝子は、３つの異なる変異体：配列番号：７の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第一変異体、配列番号：７５の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第二変異体および配列番号：７６の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第三変異体を発現することができる。

ＧＳＲ遺伝子は、４つの異なる変異体：配列番号：８の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第一変異体、配列番号：７７の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第二変異体、配列番号：７８の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第三変異体および配列番号：７９の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第四変異体を発現することができる。

ＧＬＲＸ遺伝子は、２つの異なる変異体：配列番号：９の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第一変異体および配列番号：８０の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第二変異体を発現することができる。

ＰＤＲＸ５遺伝子は、３つの異なる変異体：配列番号：１１の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第一変異体、配列番号：８１の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第二変異体および配列番号：８２の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第三変異体を発現することができる。

ＧＰＸ４遺伝子は、２つの異なる変異体：配列番号：１４の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第一変異体および配列番号：８３の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第二変異体を発現することができる。

ＰＤＲＸ５遺伝子は、３つの異なる変異体：配列番号：１６の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第一変異体、配列番号：８４の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第二変異体および配列番号：８５の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列から成る第三変異体を発現することができる。

したがって、本発明によれば、配列番号：５を含むかまたは配列番号：５によって構成される遺伝子の発現レベルの測定は、配列番号：７３もしくは配列番号：７４を含むかまたは配列番号：７３もしくは配列番号：７４によって構成される遺伝子の発現レベルの測定によって評価することができる。

同様に、配列番号：７を含むかまたは配列番号：７によって構成される遺伝子の発現レベルの測定は、配列番号：７５もしくは配列番号：７６を含むかまたは配列番号：７５もしくは配列番号：７６によって構成される遺伝子の発現レベルの測定によって評価することができる。

さらに、配列番号：８を含むかまたは配列番号：８によって構成される遺伝子の発現レベルの測定は、配列番号：７７、配列番号：７８もしくは配列番号：７９を含むかまたは前記配列番号によって構成される遺伝子の発現レベルの測定によって評価することができる。

さらに、配列番号：９を含むかまたは配列番号：９によって構成される遺伝子の発現レベルの測定は、配列番号：８０を含むかまたは配列番号：８０によって構成される遺伝子の発現レベルの測定によって評価することができる。

さらに、配列番号：１１を含むかまたは配列番号：１１によって構成される遺伝子の発現レベルの測定は、配列番号：８１もしくは配列番号：８２を含むかまたは配列番号：８１もしくは配列番号：８２によって構成される遺伝子の発現レベルの測定によって評価することができる。

さらに、配列番号：１４を含むかまたは配列番号：１４によって構成される遺伝子の発現レベルの測定は、配列番号：８３を含むかまたは配列番号：８３によって構成される遺伝子の発現レベルの測定によって評価することができる。

さらに、配列番号：１６を含むかまたは配列番号：１６によって構成される遺伝子の発現レベルの測定は、配列番号：８４もしくは配列番号：８５を含むかまたは配列番号：８４もしくは配列番号：８５によって構成される遺伝子の発現レベルの測定によって評価することができる。

それゆえ、本発明において上記および下記で開示されるように、以下の配列：配列番号：５、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１４および配列番号：１６を含むかまたはこれらによって構成される遺伝子は、上記で定義されたように、それらのそれぞれの変異体によって置き換えることができる。

本発明に従って使用される遺伝子を以下の表１に示す：

表１は、本発明において使用される遺伝子および、変異体が存在する場合は、変異体の配列番号を示す。

本発明によれば、血液疾患は、主として血液を侵す疾患に相当する。特に、本発明による血液疾患は、異常ヘモグロビン症および骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患（慢性骨髄性白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板減少症、突発性骨髄線維症を含む、骨髄性細胞数の増加または骨髄線維症）、リンパ球増殖性疾患（慢性リンパ性白血病、リンパ腫、骨髄腫、形質細胞腫を含む、リンパ系細胞数の増加）、急性白血病ならびに凝固障害（出血および凝固の障害）などの機構にかかわりなくすべての血球減少症（貧血：赤血球数またはヘモグロビンの減少、血小板減少症：血小板数の減少、および白血球減少症：白血球数の減少）を包含する。

１つの好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、工程ｂ）で確立された比率が、
・配列番号：１の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列によって構成される遺伝子について、≦０．３、ならびに
・配列番号：２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子について、≧３．０である場合、前記生物学的試料は急性骨髄性白血病を示す。

言い換えると、本発明の１つの実施形態は上記で定義された方法に関し、ここで、
・配列番号：１の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率Ｒ_１が≦０．３であり、ならびに
・配列番号：２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率Ｒ_２およびＲ_３が≧３．０である、
場合、前記生物学的試料は急性骨髄性白血病を示す。

本発明の１つの実施形態では、比率Ｒ_１が≦０．３であり、ならびに比率Ｒ_２およびＲ_３がどちらも≧３である場合、患者に由来する試料は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を示す。前記３つの基準は累積的である。

ＡＭＬは、骨髄起源の未熟細胞のクローン性増殖である。それらは、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する患者において新たにまたは二次的に出現し得る。フランス・アメリカ・イギリスの研究者から成るグループ（ＦＡＢ）によって作成された分類は、腫瘍細胞の形態学的基準および免疫表現型に基づき８つの型（Ｍ０〜Ｍ７）を考慮している（Ｂｅｎｎｅｔｔ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．，１９７６）。

世界保健機構（ＷＨＯ）は、生物学的に均質な実体を臨床的な適切さで定義することができるように形態学的、免疫表現型的、遺伝学的および臨床データを組み込むことによってＡＭＬを分類している。したがって、ＡＭＬは４つの大きなカテゴリに分類される：
１．再発性遺伝子異常を伴うＡＭＬ、
２．多血球系異形成を伴うＡＭＬ、
３．治療に関連するＡＭＬおよび
４．分類できないＡＭＬ。

本発明以前は、細胞遺伝学的分析が最も強力な予後予測因子であった。この分析は、異なる予後を有するＡＭＬのサブグループを同定するために使用される：治療に対して良好な応答を有する低危険度（ｔ（８；２１）、ｔ（１５；１７）またはｉｎｖ（１６））、中間危険度（正常核型またはｔ（９；１１））または高危険度（ｉｎｖ（３）、ｄｅｌ（５ｑ）もしくはｄｅｌ（７ｑ）、または４以上の変化）。危険性のある群の中で分子的な不均一性が存在する。正常核型を有する患者の一部の症例において、一部の遺伝子に突然変異の存在が認められている。

好都合には、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、工程ｂ）で確立された比率が、
・配列番号：１の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列によって構成される遺伝子について、≦０．３、ならびに
・配列番号：２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子について、≧３．０、
さらに前記試料と前記対照試料で測定された配列番号：１０から成る遺伝子の発現レベル間の比率Ｒ１０が０．５以下（Ｒ１０≦０．５）、好ましくは０．３以下（Ｒ１０≦０．３）である、
場合、前記生物学的試料は急性骨髄性白血病を示す。

別の実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、工程ｃ）は次のとおりである：
前記サブグループからの少なくとも３個の遺伝子の任意の組合せの各遺伝子について、工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかであり、
ただし、
・前記生物学的試料で測定されたおよび前記対照試料で測定された配列番号：１の核酸配列を含むかもしくはこの核酸配列によって構成される遺伝子の発現レベル間の比率が≦０．３ではないか、または
・前記生物学的試料で測定されたおよび前記対照試料で測定された配列番号：２もしくは３の核酸配列を含むかもしくは前記核酸配列によって構成される遺伝子の各々の発現レベル間の比率が≧３ではない
場合、前記生物学的試料は、骨髄異形成疾患、特に不応性貧血（ＲＡ）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、５ｑ−症候群および分類できない骨髄異形成の中から選択される骨髄異形成を示す。

言い換えると、別の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、
前記サブグループからの少なくとも３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合、
ただし、少なくとも３個の遺伝子の組合せが配列番号：１、２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子に相当し、ここで、
・配列番号：１の核酸配列を含むかもしくはこの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率ＲＩが≦０．３であり、ならびに
・配列番号：２および３の核酸配列を含むかもしくはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率ＲＩが≧３である場合は、この組合せは除外され、
前記生物学的試料は、骨髄異形成疾患、特に環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）または５ｑ−症候群および分類できない骨髄異形成の中から選択される骨髄異形成を示す。

本発明によれば、配列番号：１〜６の核酸を含むかまたはこれによって構成される遺伝子によって構成されるサブグループに属する少なくとも３個の遺伝子の比率が、配列番号：１の比率が≦０．３であり、ならびに配列番号：２および３の比率が≧３である配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３の特定の組合せを除き、≧２または≦０．５のいずれかである場合、生物学的試料は、骨髄異形成疾患、特に環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）または５ｑ−症候群および分類できない骨髄異形成の中から選択される骨髄異形成を示す。

本発明によれば、骨髄異形成疾患は前白血病と定義され、骨髄性血液細胞の無効な産生（または形成異常）と急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）への形質転換の危険性によって結びついた血液学的状態の多様な集まりに相当する。

フランス・アメリカ・イギリスの研究者から成るグループ（ＦＡＢ）の分類は、骨髄異形成疾患を次のように細分した：
骨髄中の５％未満の初期血液細胞（骨髄芽球）および主として赤血球前駆体で見られる病理学的異常を特徴とする、不応性貧血（ＲＡ）、
同じく骨髄中の５％未満の骨髄芽球を特徴とするが、「環状鉄芽球」と呼ばれる異常な鉄の詰まった細胞である、骨髄中の１５％またはそれ以上の赤血球前駆体の存在によって区別される、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、
骨髄中の５〜２０％の骨髄芽球を特徴とする、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、
骨髄中の２１〜３０％の骨髄芽球を特徴とする（＞３０％の芽球は急性骨髄性白血病と定義される）、移行期の芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ−Ｔ）、ならびに
骨髄中の２０％未満の骨髄芽球および末梢血中を循環する１０００×１０^９／μＬを超える単球（白血球の一種）を特徴とする、慢性骨髄性白血病またはＣＭＬと混同してはならない、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）。

最近、世界保健機構（ＷＨＯ）は異形成症候群を次のように分類した：

染色体５ｑ欠失症候群（染色体５ｑのモノソミー、５ｑ−症候群）は、ヒト５番染色体の長腕（ｑ腕）の一部の喪失によって引き起こされる稀な疾患である。

５ｑ−症候群は、大球性貧血ならびにしばしば血小板増加症、赤芽球減少症、核低分葉を伴う巨核球過形成および５番染色体の孤立した中間部欠失を特徴とする。５ｑ−症候群は主に高齢の女性において認められる。

さらに別の実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、
前記セットは１０遺伝子を含み、前記１０遺伝子は、配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、および工程ｃ）は次のとおりである：
・前記サブグループからの３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合、
ただし、
前記生物学的試料で測定されたおよび前記対照試料で測定された配列番号：１の核酸配列を含むかもしくはこの核酸配列によって構成される遺伝子の発現レベル間の比率が≦０．３ではないか、または
・前記生物学的試料で測定されたおよび前記対照試料で測定された配列番号：２もしくは３の核酸配列を含むかもしくは前記核酸配列によって構成される遺伝子の各々の発現レベル間の比率が≧３ではなく、
さらに
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２であり、および前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の他の遺伝子の工程ｂ）で確立された比率が≦０．５であれば、
前記生物学的試料は、芽球増加を伴う不応性貧血または５ｑ−症候群を示す。

言い換えると、さらに別の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、
前記セットは１０遺伝子を含み、前記１０遺伝子は、配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、および工程ｃ）は次のとおりである：
・前記サブグループからの３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合、
ただし、少なくとも３個の遺伝子の組合せが配列番号：１、２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子に相当する場合、ここで、
・配列番号：１の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率ＲＩが≦０．３であり、ならびに
・配列番号：２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率ＲＩが≧３．０であれば、
この組合せは除外され、
さらに、
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２であり、および前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の他の遺伝子の工程ｂ）で確立された比率が≦０．５であれば、
前記生物学的試料は、芽球増加を伴う不応性貧血または５ｑ−症候群を示す。

本発明のこの好都合な実施形態では、セットに属する遺伝子（すなわち配列番号：１〜１０を含むかまたはこれらによって構成される遺伝子）は、骨髄異形成疾患を識別するために有用である。

より正確には、セットに属するがサブグループには属さない遺伝子（すなわち配列番号：７〜１０を含むかまたはこれらによって構成される遺伝子、図２におけるＤ）は、骨髄異形成疾患を識別するために有用である。

次に、配列番号：１〜６の遺伝子の発現レベルを測定することにより、生物学的試料が骨髄異形成疾患を示すとみなされる場合、本発明によれば、配列番号：７〜１０から成る群の少なくとも１個の遺伝子の発現の比率が≧２であり、および配列番号：７〜１０から成る群の少なくとも１個の遺伝子の発現の比率が≦０．５であるとき、芽球増加を伴う不応性貧血および５ｑ−症候群をその他の病変から区別することが可能である。

本発明の別の好都合な実施形態は、先に定義された方法に関し、ここで、
前記セットは１０遺伝子を含み、前記１０遺伝子は、配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、および工程ｃ）は次のとおりである：
・前記サブグループからの３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合、
ただし、
前記生物学的試料で測定されたおよび前記対照試料で測定された配列番号：１の核酸配列を含むかもしくはこの核酸配列によって構成される遺伝子の発現レベル間の比率が≦０．３ではないか、または
・前記生物学的試料で測定されたおよび前記対照試料で測定された配列番号：２もしくは３の核酸配列を含むかもしくは前記核酸配列によって構成される遺伝子の各々の発現レベル間の比率が≧３ではなく、
ならびに
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２であり、および前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の他の遺伝子の工程ｂ）で確立された比率が≦０．５であり、
さらに
前記セットに属さない２４遺伝子の群の少なくとも４遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧３であれば、
前記生物学的試料は、芽球増加を伴う不応性貧血を示す。

言い換えると、本発明の別の好都合な実施形態は、先に定義された方法に関し、ここで、
前記セットは１０遺伝子を含み、前記１０遺伝子は、配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、および工程ｃ）は次のとおりである：
・前記サブグループからの３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合、
ただし、少なくとも３個の遺伝子の組合せが配列番号：１、２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子に相当する場合、ここで、
・配列番号：１の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率ＲＩが≦０．３であり、ならびに
・配列番号：２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率ＲＩが≧３．０であれば、
この組合せは除外され、
ならびに
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２であり、および前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の他の遺伝子の工程ｂ）で確立された比率が≦０．５であり、
さらに
・前記セットに属さない２４遺伝子の群の少なくとも４遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧３であれば、
前記生物学的試料は、芽球増加を伴う不応性貧血を示す。

本発明のこの好都合な実施形態では、群に属する遺伝子（すなわち配列番号：１〜２４を含むかまたはこれらによって構成される遺伝子）は、芽球増加を伴う不応性貧血と５ｑ−症候群とを識別するために有用である。

より正確には、群に属するがセットには属さない遺伝子（すなわち配列番号：１１〜２４を含むかまたはこれらによって構成される遺伝子、図２におけるＥ）は、芽球増加を伴う不応性貧血と５ｑ−症候群との識別のために有用である。

本発明はまた、血液疾患、特に骨髄性および／またはリンパ性血液疾患、好ましくは骨髄性血液疾患の、好ましくはインビトロでの、診断および／または分類のための方法に関し、
前記方法は以下の工程を含む：
ａ）被験者の血液試料に含まれる細胞から、好ましくは血液細胞または骨髄細胞を含有する試料から、少なくとも、２４遺伝子の群の中から選択される遺伝子のセットに属する６遺伝子のサブグループの遺伝子の発現レベルを測定する工程、ここで、前記２４遺伝子の群は配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成され、
前記６遺伝子は、配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成される前記サブグループに属する、
ｂ）工程ａ）で測定された各遺伝子の発現レベルを、対照試料に含まれる細胞から、好ましくは血液細胞または骨髄細胞を含有する対照試料からの同じそれぞれの遺伝子の発現レベルと比較して、前記サブグループの各遺伝子について、工程ａ）で測定された各遺伝子の発現レベルと対照試料に含まれる細胞からの同じそれぞれの遺伝子の発現レベルとの間の遺伝子発現レベル比Ｒｉを確立する工程、ここで、前記対照試料は前記生物学的試料と同じ性質である、
ｃ）前記生物学的試料の状態を、前記サブグループからの３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率Ｒｉが、
・≧２
・または≦０．５のいずれかである場合、前記生物学的試料は血液疾患細胞を示すと判定する工程。

本発明の１つの好都合な実施形態は上記で定義された方法に関し、ここで、
・配列番号：１の核酸配列を含むかまたはこの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率Ｒ_ｉが≦０．３であり、ならびに
・配列番号：２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率Ｒ_ｉが≧３．０である、
場合、前記生物学的試料は急性骨髄性白血病を示す。

本発明による方法のこの好都合な実施形態では、工程ｃ）において、遺伝子ＧＰＸ３（配列番号：１）の発現レベルの比率Ｒｉが≦０．３であり、遺伝子ＧＰＸ１（１）（配列番号：２）の発現レベルの比率が≧３.０であり、および遺伝子ＧＬＲＸ２（２）（配列番号：３）の発現レベルの比率が≧３.０である場合、生物学的試料は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を示す。

別の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、工程ｃ）は次のとおりである：
前記サブグループからの少なくとも３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子について工程ｂ）で確立された比率Ｒ_ｉが≧２または≦０．５のいずれかである場合、
ただし、３個の遺伝子の組合せが配列番号：１、２および３の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子に相当し、ここで、
・配列番号：１の核酸配列を含むかもしくはこの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率Ｒ_ｉが≦０．３であり、ならびに
・配列番号：２および３の核酸配列を含むかもしくはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子について、比率Ｒ_ｉが≧３．０である場合は、前記組合せは除外され、
前記生物学的試料は、骨髄異形成疾患、特に、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）または５ｑ−症候群および分類できない骨髄異形成の中から選択される骨髄異形成を示す。

言い換えると、配列番号：１〜６を含むかまたはこれらによって構成される遺伝子の中から選択される少なくとも３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子の発現レベルの、工程ｃ）で確立された比率Ｒｉが≧２または≦０．５のいずれかであり、および前記組合せが、生物学的試料を、ＡＭＬを示すと定義する組合せに相当しない場合、前記試料は骨髄異形成疾患または症候群を示す。

本発明の別の好都合な実施形態は、先に定義された方法に関し、ここで、
前記セットは１０遺伝子を含み、前記１０遺伝子は、配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、およびさらに、工程ｃ）において、
・前記サブグループに属さない前記セットのすべての遺伝子の比率Ｒｉが０．３から２の間に含まれ、この区間の末端値は除外される場合、
前記生物学的試料は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

本発明において「前記サブグループに属さない前記セットの遺伝子」は、図２で定義される群Ｄに属する遺伝子に相当する。

サブグループは配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子から成り、およびセットは配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子から成るので、その結果として、前記サブグループに属さない前記セットの遺伝子は、配列番号：７〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子に相当する。

上記実施形態では、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０の核酸配列によって示される各遺伝子についての比率Ｒ_ｉ、すなわち前記遺伝子の比率すべてが０．３から２の間に含まれ、０．３および２はこの区間から除外される場合、前記生物学的試料は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

配列番号：１〜６の遺伝子の比率の評価に加えて、０．３＜Ｒ７＜２および０．３＜Ｒ８＜２および０．３＜Ｒ９＜２および０．３＜Ｒ１０＜２であり、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０が配列番号：７、８、９および１０によって示される遺伝子についてのそれぞれの比率を表す場合、前記生物学的試料は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す、と記述することが可能である。

「０．３から２の間に含まれ、この区間の末端値は除外される」という用語は、数学記号：］０．３；２．０［によって表される区間を指す。この区間は、０．３から２の間に含まれるすべての値を包含するが、０．３および２の特定の値を除外する。

Ｒｉ＝０．３またはＲｉ＝２．０である場合、Ｒｉは区間］０．３；２．０［に属さない。

特定の区間内の、配列番号：７〜１０によって示される遺伝子の発現レベルの比率の評価は、一部の骨髄異形成症候群を識別することを可能にする。

要約すると、白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示される各遺伝子の比率が区間］０．３；２．０［に含まれる場合、生物学的試料は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

１つの別の好都合な実施形態では、本発明は上述した定義による方法に関し、ここでさらに、工程ｃ）において、
・前記セットに属さない遺伝子の前記群に属する少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒｉが≦０．３である場合、前記生物学的試料は環状鉄芽球を伴う不応性貧血を示し、および
・前記セットに属さない遺伝子の前記群に属する少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒｉが≧３.０である場合、前記生物学的試料は多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

本発明において「前記セットに属さない遺伝子の前記群に属する遺伝子」は、図２で定義される群Ｅに属する遺伝子に相当する。

サブグループは配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子から成り、セットは配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子から成り、および群は配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子から成るので、その結果として、前記セットに属さない前記群の遺伝子は、配列番号：１１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される遺伝子に相当する。

上記実施形態では、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４によって示される遺伝子は、試験される生物学的試料の性質についての補足情報を提供する。

要約すると、
１）ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される各遺伝子の比率が区間］０．３；２．０［に含まれ、ならびに
ｃ）配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４によって示される、少なくとも１個の遺伝子、すなわち１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０または１１または１２または１３または１４個の遺伝子の比率が≧３．０である場合、前記生物学的試料は多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示し、ならびに
２）ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される各遺伝子の比率が区間］０．３；２．０［に含まれ、ならびに
ｃ）配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４によって示される、少なくとも１個の遺伝子、すなわち１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０または１１または１２または１３または１４個の遺伝子の比率が≦０．３である場合、前記生物学的試料は環状鉄芽球を伴う不応性貧血を示す。

１つの他の実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、
前記セットは１０遺伝子を含み、前記１０遺伝子は、配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、およびさらに、
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２．０であるか、または
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．３であるか、または前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２．０であり、および前記サブグループに属さない別の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．３である場合、
前記生物学的試料は、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、芽球増加を伴う不応性貧血、５ｑ−症候群および分類できない骨髄異形成の中から選択されるものを示す。

この好都合な実施形態では、配列番号：７、８、９または１０によって示される少なくとも１個の遺伝子が上記で定義された区間］０．３；２．０［に属さない場合を考慮している。

１番目の場合、少なくとも１個の遺伝子は、その他の遺伝子の比率にかかわりなく、≧２．０の比率を有する。２番目の場合、少なくとも１個の遺伝子は、その他の遺伝子の比率にかかわりなく、≦０．３の比率を有する。３番目の場合、その他の遺伝子の比率にかかわりなく、少なくとも１個の遺伝子は≧２．０の比率を有し、および別の遺伝子は≦０．３の比率を有する。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は先に定義された方法に関し、ここで、
前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２．０であり、および前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の別の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．５である場合、前記生物学的試料は、典型的な芽球増加を伴う不応性貧血または５ｑ−症候群である。

この実施形態は、その他の遺伝子の比率にかかわりなく、少なくとも１個の遺伝子が≧２．０の比率を有する場合、特に少なくとも１個の遺伝子が≧２．０の比率を有し、および別の遺伝子が≦０．５の比率を有する、それゆえおそらく≦０．３の比率を有する場合に関する。

この特定の状況は、典型な芽球増加を伴う不応性貧血または５ｑ−症候群である骨髄異形成症候群を検出するまたは同定することを可能にする。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は先に定義された方法に関し、ここで、
前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２．０であり、および前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の別の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．５である場合、
前記生物学的試料は、典型的な芽球増加を伴う不応性貧血または５ｑ−症候群であり、
さらに、
・前記セットに属さない遺伝子の前記群に属する少なくとも４個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧３．０である場合、前記生物学的試料は芽球増加を伴う不応性貧血を示し、および
・前記セットに属さない遺伝子の前記群に属する最大でも３個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧３．０である場合、前記生物学的試料は５ｑ−症候群を示す。

要約すると、
１）ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≧２．０であり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の他の遺伝子の比率が≦０．５であり、ならびに
ｃ）配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４によって示される、少なくとも４個の遺伝子、すなわち４または５または６または７または８または９または１０または１１または１２または１３または１４個の遺伝子の比率が≧３．０である場合、前記生物学的試料は芽球増加を伴う不応性貧血を示し、ならびに
２）ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≧２．０であり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の他の遺伝子の比率が≦０．５であり、ならびに
ｃ）配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４によって示される、最大でも３個の遺伝子、すなわち０または１または２または３個の遺伝子の比率が≧３．０である場合、前記生物学的試料は５ｑ−症候群を示す。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は上記の定義による方法に関し、ここで、
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２．０であり、および
・前記サブグループに属さない前記セットのいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≦０．５ではない場合、
前記生物学的試料は多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

この特定の実施形態では、配列番号：７、８、９または１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≧２．０であり、およびその他の遺伝子の比率が区画［０．５；＋∞［に含まれる場合、前記生物学的試料は多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

要約すると、
ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≧２．０であり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示されるいずれの遺伝子の比率も≦０．５ではない場合、前記生物学的試料は多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は上記の定義による方法に関し、ここでさらに、
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．５であり、および
・前記サブグループに属さない前記セットのいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≧２．０ではない場合、
前記生物学的試料は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、芽球増加を伴う不応性貧血、５ｑ−症候群または分類できない骨髄異形成を示す。

この特定の実施形態では、配列番号：７、８、９または１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≦０．５であり、およびその他の遺伝子の比率が区画］−∞；２．０］に含まれる場合、前記生物学的試料は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、芽球増加を伴う不応性貧血、５ｑ−症候群または分類できない骨髄異形成を示す。

要約すると、
ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≦０．５であり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示されるいずれの遺伝子の比率も≧２．０ではない場合、前記生物学的試料は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、芽球増加を伴う不応性貧血、５ｑ−症候群または分類できない骨髄異形成を示す。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、工程ｃ）において、
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．５であり、および
・前記サブグループに属さない前記セットのいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≧２．０ではない場合、
ならびにさらに、
・前記セットに属さない遺伝子の前記群に属するすべての遺伝子の比率Ｒ_ｉが０．５から２の間に含まれ、この区間の末端値は除外される場合、
前記生物学的試料は分類できない骨髄異形成を示す。

この好都合な実施形態では、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４によって示される遺伝子は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症および５ｑ−症候群から分類できない骨髄異形成を識別するために有用である。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここで、工程ｃ）において、
・前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．３であり、および
・前記サブグループに属さない前記セットのいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≧２．０ではない場合、
ならびにさらに、
・前記セットに属さない遺伝子の前記群に属する少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２．０である場合、前記生物学的試料は、５ｑ−症候群または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

要約すると、
ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≦０．３であり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示されるいずれの遺伝子の比率も≧２．０ではなく、ならびに
ｃ）配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２．０である場合、前記生物学的試料は、５ｑ−症候群または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

本発明の別の好都合な実施形態は上記で定義された方法に関し、ここで、
前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．３であり、および前記サブグループに属さないいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≧２．０ではない場合、
前記生物学的試料は、分類できない骨髄異形成、５ｑ−症候群または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

要約すると、
ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≦０．３であり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示されるいずれの遺伝子の比率も≧２．０ではない場合、前記生物学的試料は、分類できない骨髄異形成、５ｑ−症候群または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

本発明の別の好都合な実施形態は上記で定義された方法に関し、ここで、
前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．３であり、および前記サブグループに属さないいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≧２．０ではない場合、
ならびにさらに、
前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも２個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．３であり、および前記サブグループに属さない前記セットのいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≧２．０ではない場合、
前記生物学的試料は、５ｑ−症候群または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

要約すると、
ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≦０．３であり、配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の他の遺伝子の比率が≦０．３であり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示されるいずれの遺伝子の比率も≧２．０ではない場合、前記生物学的試料は、５ｑ−症候群または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示す。

本発明の別の好都合な実施形態は上記で定義された方法に関し、ここで、
前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも１個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．３であり、および前記サブグループに属さないいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≧２．０ではない場合、
ならびに、
前記サブグループに属さない前記セットの少なくとも２個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≦０．３であり、および前記サブグループに属さない前記セットのいずれの遺伝子の比率Ｒ_ｉも≧２．０ではない場合、
前記生物学的試料は、５ｑ−症候群または多血球系異形成を伴う不応性血球減少症を示し、
ならびに、
さらに前記セットに属さない遺伝子の前記群に属する少なくとも２個の遺伝子の比率Ｒ_ｉが≧２．０である場合、前記生物学的試料は５ｑ−症候群を示す。

要約すると、
ａ）白血病を定義する組合せを除き、配列番号：１、２、３、４、５および６によって示される６遺伝子の中から選択される３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子についての比率が≧２．０または≦０．５のいずれかであり、ならびに
ｂ）配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の遺伝子の比率が≦０．３であり、配列番号：７、８、９および１０によって示される少なくとも１個の他の遺伝子の比率が≦０．３であり、ならびに配列番号：７、８、９および１０によって示されるいずれの遺伝子の比率も≧２．０ではなく、ならびに、
ｃ）配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４によって示される少なくとも２個の遺伝子の比率が≧２．０である場合、前記生物学的試料は５ｑ−症候群を示す。

本発明はまた、血液疾患、特に骨髄性および／またはリンパ性血液疾患、好ましくは骨髄性血液疾患の、好ましくはインビトロでの、診断および／または分類のための方法に関する。
前記方法は以下の工程を含む：
ａ）被験者の血液試料に含まれる細胞から、好ましくは血液細胞または骨髄細胞を含有する試料から、２４遺伝子の発現レベルを測定する工程、ここで、前記２４遺伝子は配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成され、
ｂ）工程ａ）で測定された各遺伝子の発現レベルを、対照試料に含まれる細胞から、好ましくは血液細胞または骨髄細胞を含有する試料からの同じそれぞれの遺伝子の発現レベルと比較して、前記サブグループの各遺伝子についての遺伝子発現レベル比を確立する工程、ここで、前記対照試料は前記生物学的試料と同じ性質であり、ならびに、
ｃ）前記生物学的試料の状態を、工程ｂ）で確立された比率のとおりであると判定する工程。

より好都合には、本発明は先に定義された方法に関し、ここで、遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量の測定を可能にする方法によって測定される。好ましくは、前記方法は定量的方法である。

ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ分子についての大きさおよび配列情報を与えるノーザンブロット法によって定量的に測定することができる。ＲＮＡの試料をアガロースゲル上で分離し、標的配列に相補的な放射性標識ＲＮＡプローブにハイブリダイズさせる。次に放射性標識ＲＮＡをオートラジオグラフによって検出する。付加的なｍＲＮＡサイズ情報は選択的にスプライシングされた転写産物の識別を可能にするので、ノーザンブロット法は広く使用されている。

ｍＲＮＡの存在率を測定するための別のアプローチは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲと併用したＲＴ−ＰＣＲ）である。ＲＴ−ＰＣＲは、最初に逆転写によってｍＲＮＡからＤＮＡ鋳型を作製し、この鋳型はｃＤＮＡと呼ばれる。次のこのｃＤＮＡ鋳型をｑＰＣＲのために使用し、ｑＰＣＲでは、ＤＮＡ増幅過程が進行するとともにプローブの蛍光が変化する。慎重に構築された標準曲線を用いて、ｑＰＣＲは、ｍＲＮＡのコピー数などの絶対的な測定を、典型的にはホモジナイズされた組織のナノリットル当たりのコピー単位または細胞当たりのコピー単位で、生じさせることができる。ｑＰＣＲは非常に高感度である（単一ｍＲＮＡ分子の検出が可能である）が、蛍光プローブが必要とされるため高価であり得る。

ノーザンブロットおよびＲＴ−ｑＰＣＲは、単一遺伝子または少数の遺伝子が発現されるかどうかを検出するために有用である。

当業者に公知の他の方法には、ＤＮＡマイクロアレイまたは遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）のような技術が含まれる。

ＳＡＧＥは、種々のメッセンジャーＲＮＡの細胞濃度の相対的測定を提供することができる。標識に基づく方法の大きな利点は、細胞内に存在する任意の転写産物の正確な測定を可能にする、「オープン構造」であり、前記転写産物の配列は公知または未知であり得る。

本発明に従って使用される好ましい方法はＲＴ−ｑＰＣＲである。

さらに別の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された方法に関し、ここでは、遺伝子の発現レベルの測定を、配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成される２４対のオリゴヌクレオチドの群に属する少なくとも６対のオリゴヌクレオチドを使用することによって実施し、前記少なくとも６対のオリゴヌクレオチドは、配列番号：２５〜３６の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成される。

本発明では、
・配列番号：２５および配列番号：２６の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：２７および配列番号：２８の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：２の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：２９および配列番号：３０の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：３の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：３１および配列番号：３２の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：４の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：３３および配列番号：３４の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：５の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：３５および配列番号：３６の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：６の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用する。

１つの好都合な実施形態では、本発明は、

配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成される２４対のオリゴヌクレオチドの群に属する少なくとも１０対のオリゴヌクレオチドを使用する、前記で定義された方法に関し、前記少なくとも１０対のオリゴヌクレオチドは、配列番号：２５〜４４の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成される。

本発明では、
・配列番号：３６および配列番号：３７の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：７の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：３８および配列番号：３９の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：８の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：４１および配列番号：４２の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：９の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：４３および配列番号：４４の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１０の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用する。

１つの好都合な実施形態では、本発明は、
配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成される２４対のオリゴヌクレオチドを使用する、上記で定義された方法に関する。

本発明では、
・配列番号：４５および配列番号：４６の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１１の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：４７および配列番号：４８の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１２の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：４９および配列番号：５０の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１３の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：５１および配列番号：５２の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１４の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：５３および配列番号：５４の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１５の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：５５および配列番号：５６の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１６の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：５７および配列番号：５８の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１７の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：５９および配列番号：６０の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１８の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：６１および配列番号：６２の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：１９の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：６３および配列番号：６４の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：２０の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：６５および配列番号：６６の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：２１の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：６７および配列番号：６８の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：２２の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：６９および配列番号：７０の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：２３の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用し、
・配列番号：７１および配列番号：７２の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成されるオリゴヌクレオチドの対を、配列番号：２４の核酸配列を含むかまたはこれによって構成される遺伝子の発現レベルを測定するために使用する。

以下の表３は、本発明に従って使用される遺伝子／変異体／オリゴヌクレオチドを示す。

表３

上記で定義されたオリゴヌクレオチドは、好ましくはｑＰＣＲ反応を実施するために使用される。

ｑＰＣＲは当分野で周知であり、染料またはレポータープローブのいずれかと共に、標的遺伝子の特異的増幅を可能にするオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することによって実施できる。

両方の技術を以下で簡単に要約する。

・二本鎖ＤＮＡ結合染料をレポーターとして用いるリアルタイムＰＣＲ：

ＤＮＡ結合染料は、ＰＣＲにおいてすべての二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合し、染料の蛍光を生じさせる。ＰＣＲの間のＤＮＡ産物の増加は、それゆえ、蛍光強度の増大をもたらし、この増加は各サイクルで測定され、したがってＤＮＡ濃度を定量化することを可能にする。

しかし、ＳＹＢＲグリーンなどのｄｓＤＮＡ染料は、非特異的ＰＣＲ産物（プライマー二量体など）を含む、すべてのｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産物に結合する。これは、意図される標的配列の正確な定量化に潜在的に干渉し得るまたは正確な定量化を妨げ得る。

反応は、蛍光ｄｓＤＮＡ染料を添加して、通常どおりに調製する。

反応はリアルタイムＰＣＲ装置で実施され、各サイクル後に、蛍光のレベルを検出器で測定する；染料はｄｓＤＮＡ（すなわちＰＣＲ産物）に結合した場合にのみ蛍光を発する。標準希釈物を基準にして、ＰＣＲにおけるｄｓＤＮＡ濃度を決定することができる。

他のリアルタイムＰＣＲ法と同様に、得られた数値はそれらに関連する絶対単位（すなわちｍＲＮＡコピー／細胞）を有さない。上述したように、測定されたＤＮＡ／ＲＮＡ試料の標準希釈物との比較は標準に対する試料の割合または比率を与えるだけであり、異なる組織間または実験条件間での相対的な比較だけが可能になる。定量化の精度を保証するため、通常、標的遺伝子の発現を安定に発現される遺伝子に対して基準化する必要がある（下記参照）。これは、実験試料全体にわたるＲＮＡの量または質の起こり得る相違を補正することができる。

・蛍光レポータープローブ法

蛍光レポータープローブは、プローブ配列を含むＤＮＡだけを検出する；それゆえ、レポータープローブの使用は特異性を有意に上昇させ、非特異的ＤＮＡ増幅の存在下であっても定量化を可能にする。蛍光プローブは、すべての標的遺伝子が同様の効率で増幅されるならば、異なる色の標識を有する特異的なプローブに基づく（同じ反応中でいくつかの遺伝子を検出するための）マルチプレックスアッセイにおいて使用することができる。蛍光レポータープローブの特異性はまた、ＰＣＲにおける望ましくない潜在的副産物である、プライマー二量体によって引き起こされる測定の干渉も防ぐ。しかし、蛍光レポータープローブはプライマー二量体の阻害作用は妨げず、これは反応における望ましくない産物の蓄積を低下させ得る。

この方法は、プローブの一端に蛍光レポーターおよび反対側の端に蛍光のクエンチャーを有するＤＮＡベースのプローブを利用する。レポーターがクエンチャーにごく近接すると、その蛍光の検出が妨げられる；Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解はレポーター−クエンチャーの近接性を破壊し、したがって消光されない蛍光の放出を可能にし、これを励起後のレーザーで検出することができる。各々のＰＣＲサイクルでレポータープローブによって標的化される産物の増加は、それゆえ、プローブの分解とレポーターの放出による蛍光の比例的な増大を生じさせる。

ＰＣＲを通常どおりに調製し、レポータープローブを添加する。

ＰＣＲのアニーリング工程の間に、プローブとプライマーの両方がＤＮＡ標的にアニーリングする。

新たなＤＮＡ鎖の重合がプライマーから開始され、ポリメラーゼがプローブに達すると、その５’−３’エキソヌクレアーゼがプローブを分解して、蛍光レポーターをクエンチャーから物理的に分離し、蛍光の増大を生じさせる。

蛍光は、リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー内で検出および測定され、産物の指数関数的増加に対応するその幾何学的増大を使用して、各反応における閾値サイクル（ＣＴ）を決定する。

１つの特定の実施形態では、上記で定義された遺伝子の発現レベルの測定は、上記で定義された特定のオリゴヌクレオチドに加えて、市販のプローブを使用することによって達成される。発現レベルを予想する各々の遺伝子は特定のプローブに関連し、１つの遺伝子を認識するプローブは別の遺伝子を認識することができない。さらに、１つの遺伝子に特異的なプローブはまた、前記遺伝子の変異体が存在する場合は、変異体も検出することができる。

本発明で使用される好都合なプローブを表Ａに列挙する。

遺伝子／変異体／オリゴヌクレオチドとプローブとの関連性を以下の表４に示す。

表４

表４は以下のように読み取ることができる：ＧＰＸ３（配列番号：１）の発現レベルは、配列番号：２４および２５のオリゴヌクレオチドを用いて、以下の配列ＣＣＡＧＣＣＧＣを有する、蛍光染料およびクエンチャーと結合した、プローブを使用することによって定量的に測定することができる。

また、別の例として：ＰＤＲＸ（配列番号：５）またはその変異体の１つ（配列番号：７３もしくは７４）の発現レベルは、配列番号：３３および３４のオリゴヌクレオチドを用いて、以下の配列ＣＴＧＧＣＴＧＧを有する、蛍光染料およびクエンチャーと結合した、プローブを使用することによって定量的に測定することができる。

上記の定義は、変更すべきところは変更して、その他の遺伝子にも適用される。

上記のクエンチャーおよび染料は、アッセイに依存して、当業者によって選択され得る。

別の好都合な実施形態では、本発明は、配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成される少なくとも６遺伝子の各々の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを使用する、好ましくは配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成される少なくとも１０遺伝子の各々の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを使用する、特に配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらによって構成される２４遺伝子の各々の発現レベルの測定を可能にするオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを使用する、上記で定義された方法に関する。

この実施形態では、上記方法をノーザンブロットアッセイに適合させる。

本発明はまた、少なくとも、２４遺伝子の群の中から選択される遺伝子のセットに属する６遺伝子のサブグループの遺伝子の発現の測定を可能にするオリゴヌクレオチドを含む組成物に関し、前記２４遺伝子の群は、配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、
前記サブグループに属する前記６遺伝子は、配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される。

１つの好都合な実施形態では、本発明は、少なくとも、２４遺伝子の群の中から選択される１０遺伝子のセットの遺伝子の発現の測定を可能にするオリゴヌクレオチドを含む、前記で定義された組成物に関し、前記２４遺伝子の群は、配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、

前記セットに属する前記１０遺伝子は、配列番号：１〜１０の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は、前記２４遺伝子の群の２４遺伝子の発現の測定を可能にするオリゴヌクレオチドを含む、上記で定義された組成物に関する。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された組成物に関し、前記組成物は、少なくとも、配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される２４遺伝子の群の中から選択される遺伝子のセットに属する６遺伝子のサブグループの遺伝子の発現の測定を可能にする、配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る４８オリゴヌクレオチドのライブラリの中から選択される少なくとも１２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記少なくとも１２のオリゴヌクレオチドは、配列番号：２５〜３６の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された組成物に関し、前記組成物は、少なくとも、配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される２４遺伝子の群の中から選択される１０遺伝子のセットの遺伝子の発現の測定を可能にする、配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る４８オリゴヌクレオチドのライブラリの中から選択される少なくとも２０のオリゴヌクレオチドを含み、
前記少なくとも２０のオリゴヌクレオチドは、配列番号：２５〜４４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る。

１つの他の好都合な実施形態では、本発明は上記で定義された組成物に関し、前記組成物は、配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成される２４遺伝子の群の発現の測定を可能にする、配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る４８オリゴヌクレオチドを含む。

上記組成物は、上記表４で定義されるプローブをさらに含み得る。

別の態様では、本発明は、血液疾患、特に骨髄性および／またはリンパ性血液疾患、好ましくは骨髄性血液疾患の、好ましくはインビトロでの、診断および／または分類に使用するための、上記の組成物に関する。

それゆえ、本発明は上記組成物自体に関し、および上記のようなその使用のための前記組成物に関する。

本発明は、配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る４８オリゴヌクレオチドの群の中から選択される少なくとも１２のオリゴヌクレオチドを含むキットに関し、前記少なくとも１２のオリゴヌクレオチドは、配列番号：２５〜３６の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る。

１つの好都合な実施形態では、本発明は、少なくとも２０のオリゴヌクレオチドを含む、上記で定義されたキットに関し、前記少なくとも２０のオリゴヌクレオチドは、配列番号：２５〜４４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る。

１つの好都合な実施形態では、本発明は、配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列から成る４８オリゴヌクレオチドを含む、上記で定義されたキットに関する。

本発明はまた、１つの好都合な実施形態では、配列番号：１〜６を含むかまたはこれらから成る核酸分子とそれぞれ相互作用する少なくとも６の特定のプローブをさらに含む、好ましくは配列番号：１〜１０を含むかまたはこれらから成る核酸分子とそれぞれ相互作用する少なくとも１０の特定のプローブをさらに含む、特に、配列番号：１〜２４を含むかまたはこれらから成る核酸分子とそれぞれ相互作用する少なくとも２４の特定のプローブをさらに含む、上記で定義されたキットに関する。

１つの別の好都合な実施形態では、本発明は、配列番号：１〜２４の遺伝子に対応する核酸分子を、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、環状赤芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）または５ｑ−症候群および分類できない骨髄異形成の中から選択される少なくとも１つの病変を示す量でさらに含む、上記で定義されたキットに関する。

別の好都合な実施形態では、本発明はまた、上記で定義された対照試料の核酸分子をさらに含む、上記で定義されたキットに関する。

本発明はまた、配列番号：１〜２４によって示される２４遺伝子の群の中から選択される、配列番号：１〜６によって示される遺伝子に対応する核酸分子を少なくとも含むかまたは少なくとも前記核酸分子によって構成される陽性対照試料に関し、前記核酸分子は、それぞれの核酸分子の各々が１の量で存在する健常試料と比較して、表５または表６の最初の６行に提示される量で前記試料中に存在する。

表５は、配列番号：１〜２４の各遺伝子について、上記病変に相当する特定の区間を示す。

表６は、配列番号：１〜２４の各遺伝子について、上記病変に相当する平均±標準偏差を示す。

本発明はまた、血液疾患の治療の効果を判定するための方法に関し、前記治療は患者に投与される傾向があり、
前記方法は、
ａ）血液疾患、好ましくは骨髄性および／またはリンパ性血液疾患、より好ましくは骨髄性血液疾患に罹患した被験者の生物学的試料を、好ましくはインビトロで、前記血液疾患を治療するために使用される傾向があるまたは前記疾患を治療する傾向がある薬剤と接触させる工程、
ｂ）工程ａ）で薬剤と接触させた生物学的試料において、少なくとも、２４遺伝子の群の中から選択される遺伝子のセットに属する６遺伝子のサブグループの遺伝子の発現レベルを測定する工程、ここで、前記２４遺伝子の群は配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、
前記サブグループに属する前記６遺伝子は配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列によって構成され、
ならびに
ｃ）少なくとも、前記の、工程ｂ）で得られた２４遺伝子の群の中から選択される遺伝子のセットに属する６遺伝子のサブグループの遺伝子の発現レベルを、前記血液疾患を治療するために使用される傾向があるまたは前記疾患を治療する傾向がある前記薬剤と接触させていない前記生物学的試料での測定で得られた、少なくとも、前記の、２４遺伝子の群の中から選択される遺伝子のセットに属する６遺伝子のサブグループの遺伝子の発現レベルと比較する工程、
を含む。

上記方法は実施が容易であり、薬剤に対するＡＭＬ試料の感受性を評価することを可能にする。これは、腫瘍が薬剤に対して耐性であるため、患者において無効であり得る治療のコストを低減するために非常に重要である。

上記方法は、ＡＭＬの進行に対して効果を有する、および患者の治療のためにインビボで使用することができる薬剤を、インビトロでスクリーニングするために好都合に使用される。

これは、後成的修飾を調節することができる薬剤または化合物、特にアザシチジン（５−アザシチジン）またはデシタビン（５−アザデオキシシチジン）などの脱メチル化剤をスクリーニングするためにより好都合に重要である。

アザシチジンおよびデシタビンは、ＡＭＬおよび高悪性度のＭＤＳを治療するために使用される強力な化学療法剤であるが、ＡＭＬおよび高悪性度ＭＤＳの約３０％だけがこれらの作用に対して感受性である。したがって、コストおよび無効な治療の副作用を低減するために、治療されねばならないＡＭＬおよび高悪性度ＭＤＳがこれらの化合物に応答性であるかどうかをインビトロで確認することは好都合である。

実施例９は、アザシチジンでのＡＭＬ試料の治療が配列番号：１〜２４の遺伝子（およびその結果として配列番号：１〜６の遺伝子）の発現比率を調節できることを示し、アザシチジンが、ＡＭＬ試料が由来するこの特定の患者において、インビボで使用された場合有効であることを明らかにする。

好都合には、本発明は、前記セットが配列番号：１〜１０の核酸配列から成る１０遺伝子から成る、上記で定義された方法に関する。

好都合には、本発明は、配列番号：１〜２４から成る２４遺伝子の発現レベルを測定する、上記で定義された方法に関する。

図１は、反応性酸素種（ＲＯＳ、Ｏ_２ ^・−）を除去するために細胞において使用される天然の機構を示す。Ｏ_２ ^・−はＨ_２Ｏ_２分子に変換され、前記Ｈ_２Ｏ_２は、解毒過程としてＨ_２ＯとＯ_２分子に変換されるか、または細胞内で生物学的作用を及ぼす^・ＯＨおよびＯＨ⁻に変換される。

図２は、本発明による遺伝子のサブグループ（Ａ）、セット（Ｂ）および群（Ｃ）の間の重なりを示す。Ｄは、セットに属するがサブグループには属さない遺伝子に対応する全体を示す。Ｅは、群に属するがセットには属さない遺伝子に対応する全体を示す。

図３Ａ〜図３Ｅは、ＲＡＲＳ、ＲＣＭＤ、ＲＡＥＢおよびＡＭＬの各病変について、配列番号：１〜２４によって示される各遺伝子の発現レベルの図式的表示である。

図３Ａは、５つの健常骨髄試料（対照試料）を使用することにより、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較した、ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた指示されている遺伝子の発現レベルをｘ軸に示すヒストグラムである。

ｙ軸は、比率ΔＣＴ_遺伝子（ΔＣＴ_遺伝子＝ＣＴ_遺伝子−ＣＴ_{ＧＡＰＤＨ}）を示す。

図３Ｂは、対照試料（健常骨髄試料）と比較したＲＡＲＳ試料中の各指示遺伝子（ｘ軸）の発現の変動の平均（黒色の線）および平均の標準誤差（灰色の領域）のグラフ表示である。ｙ軸は、ｌｏｇ_１０で表した、対照試料と比較した量の変動を示す。

図３Ｃは、対照試料（健常骨髄試料）と比較したＲＣＭＤ試料中の各指示遺伝子（ｘ軸）の発現の変動の平均（黒色の線）および平均の標準誤差（灰色の領域）のグラフ表示である。ｙ軸は、ｌｏｇ_１０で表した、対照試料と比較した量の変動を示す。

図３Ｄは、対照試料（健常骨髄試料）と比較したＲＡＥＢ試料中の各指示遺伝子（ｘ軸）の発現の変動の平均（黒色の線）および平均の標準誤差（灰色の領域）のグラフ表示である。ｙ軸は、ｌｏｇ_１０で表した、対照試料と比較した量の変動を示す。

図３Ｅは、対照試料（健常骨髄試料）と比較したＡＭＬ試料中の各指示遺伝子（ｘ軸）の発現の変動の平均（黒色の線）および平均の標準誤差（灰色の領域）のグラフ表示である。ｙ軸は、ｌｏｇ_１０で表した、対照試料と比較した量の変動を示す。

図４Ａ〜図４Ｄは、ＲＡＲＳ（図４Ａ）、ＲＣＭＤ（図４Ｂ）、ＲＡＥＢ（図４Ｃ）およびＡＭＬ（図４Ｄ）の各病変についての、配列番号：１〜２４によって示される遺伝子の各々の発現レベルの図式的表示である。分類できない骨髄異形成症候群試料の配列番号：１〜２４によって示される各遺伝子の発現レベルの表示を、４Ａ〜Ｄの各図において破線で示す。

図５ＡおよびＢは、２つの独立した分類できない骨髄異形成症候群試料の配列番号：１〜２４によって示される遺伝子の各々の発現レベル（図５Ｂ）の図式的表示であり、前記発現はＲＣＭＤ試料で認められる発現レベル（図５Ａ）に類似する。

図６は、２つの独立した慢性骨髄単球性白血病試料の配列番号：１〜２４によって示される遺伝子の各々の発現レベル（図６Ｂ）の図式的表示であり、前記発現はＲＡＥＢ試料で認められる発現レベル（図６Ａ）とは異なる。

図７は、ＲＣＭＤの診断時（パネルＢ）および１２か月後（パネルＢ、破線）の患者の配列番号：１〜２４によって示される遺伝子の各々の発現レベルの図式的表示である。診断時の試料はＲＣＭＤ試料に類似し（パネルＡ）、１２か月後の試料はＲＡＥＢの獲得形質を有する（パネルＢおよびパネルＣにおけるＰＤＲＸ２（１）およびＧＬＲＸ５参照）。

図８は、アザシチジンでの治療後の同じＡＭＬ（破線）と比較した、ＡＭＬの配列番号：１〜２４によって示される遺伝子の各々の発現レベルの図式的表示である。

≪実施例≫

予備注釈

以下の実施例で使用したすべての試料は、盲検において、最初に本発明に従って試験し、対照試料と比較した。

すべてのＳＭＤおよび白血病試料は本発明による方法の条件を満たす、すなわち試料の各々において配列番号：１〜６の遺伝子の少なくとも３遺伝子が、対照試料中の同じ対応する遺伝子の発現と比較したそれらの比率が０．５未満または２超のいずれかであるように発現される。

実施例１：

以下の実施例では、患者の試料および解析遺伝子発現を以下のように分析する。

試験材料および方法

試料の採取

正常骨髄（ＢＭ）試料（標準として使用した）を、整形外科手術を受けた患者から得た。ＭＤＳおよびＡＭＬ患者からの骨髄試料は、診断の時点およびフォローアップの間に得た。ＡＭＬおよびＭＤＳ細胞を形態学的、細胞化学的および細胞遺伝学的所見に従って分類した。倫理委員会によって承認された手順に従って患者に通知し、同意を得た。ＢＭ試料をヘパリン加シリンジに吸引し、ＥＤＴＡチューブに移した。

赤血球溶解

ＢＭ ３ｍＬについて、ＥＤＴＡ（０．１２ｍＭ）、重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ_３）（１０ｍＭ）および塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）（１５０ｍＭ）を含む溶解緩衝液４７ｍＬ中で溶解を実施した。室温で１５分間のインキュベーション後、細胞を７００ｇで１０分間遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２０ｍＬ中で２回洗浄した。ペレットをＴｒｉｚｏｌ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１ｍＬ／８×１０^６細胞）に再懸濁し、１５分間激しく混合した。溶解物をＲＮＡ抽出工程まで−８０℃で保存した。

ＲＮＡ抽出

全ＲＮＡ抽出をクロロホルム／イソプロパノール／エタノール法に従って実施した。相の分離は、クロロホルム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したＴｒｉｚｏｌ（商標）１ｍＬにつき０．２ｍＬ）を溶解物に添加することによって得た。５０秒間混合した後、溶液を４℃で１５分間、１２，０００ｇで遠心分離することによって３つの相に分けた。イソプロパノール（Ｔｒｉｚｏｌ（商標）１ｍＬにつき０．５ｍＬ）を添加することによってＲＮＡを水相から沈殿させた。室温で１０分間のインキュベーションおよび４℃で１０分間の１２，０００ｇでの遠心分離後、ＲＮＡを７５％エタノール（Ｔｒｉｚｏｌ（商標）１ｍＬにつき１ｍＬ）で洗浄し、４℃で５分間、７５００ｇで遠心分離した。この工程を２回実施した。エタノール上清を除去した後、ＲＮＡペレットを２０分間空気乾燥した。次に、ＲＮＡをＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商品名）ＤＥＰＣ処理水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬに溶解し、−８０℃で保存した。

ＲＮＡの定量化および定性化

全細胞ＲＮＡを、Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ １０００分光光度計（Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量化し、ＲＮＡ純度を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。

逆転写および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析

各試料からの全ＲＮＡ３μｇを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＶＩＬＯ（商品名）ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、供給者のプロトコールに従って逆転写した。遺伝子発現の相対的定量化を、ＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｗｗｗ．ｒｏｃｈｅ−ａｐｐｌｉｅｄ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｓｉｓ／ｒｔｐｃｒ／ｕｐｌ／ｅｚｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）で設計されたＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙアッセイを用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０マイクロウェルプレートに基づくサイクラープラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）でのリアルタイムＰＣＲによって実施した。プライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙプローブはＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。各標的のプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列を表Ａに示す。すべての標的を同時に分析した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてｃＤＮＡ ２０ｎｇに関して１０μＬの総容量で実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０を、初期変性（９５℃、１０分）、次いで９５℃、１０秒、６０℃、３０秒、７２℃、１秒および４０℃、１０秒の最終冷却工程の４５サイクルにプログラムした。すべての反応を三重に実施し、平均値を定量化のために使用した。結果を、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｃｉｅｎｃｅからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０ソフトウェア（バージョン１．５．０）で決定したサイクル閾値（ＣＴ）を使用して相対定量法（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ_患者−ΔＣＴ_標準）によって解析した。ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰＤＨ）を、標的の発現を基準化するための内在性コントロールとして使用した（ΔＣＴ＝ＣＴ_標的−ＣＴ_{内在性コントロール}）。患者と標準との間の相対的ｍＲＮＡ発現の変化を、２ｅｘｐ（−ΔΔＣＴ）法（Ｌｉｖａｋ ＫＪ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２ｅｘｐ（−ΔΔＣＴ）ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１；２５：４０２−４０８）を用いて各標的について決定した。

実施例２：骨髄異形成および白血病を診断するための６遺伝子の使用

方法の有効性を調べるため、白血病試料であると同定された患者試料を使用し、配列番号：１〜配列番号：６によって示される遺伝子の各々の発現レベルを、表４のオリゴヌクレオチドおよびプローブを使用することにより、実施例１で開示したようにＲＴ−ｑＰＣＲによって評価した。

結果を以下の表７に示す：

表７は、各ＡＭＬ試料Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５についての各々の指示されている遺伝子（配列番号：１〜６）の発現レベルの比率を示す。

以下の場合、本発明で定義される基準を満たす：
配列番号：１〜６によって示される遺伝子の中の３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子の発現レベルの比率が≧２．０または≦０．５のいずれかである場合、試料は血液疾患を示すとみなされる。

考慮される３遺伝子の組合せにかかわらず、上記基準が満たされる。

その他の基準は、配列番号：１の比率が≦０．３であり、ならびに配列番号：２および３の両方の比率が≧３．０である場合、試料はＡＭＬを示す。

やはり、試験された上記５つのＡＭＬ試料（表７）すべてについて、基準が満たされる。

試験した試料すべてがＡＭＬに関する基準を満たす。それゆえ、本発明による方法はＡＭＬと骨髄異形成疾患との識別を可能にする。

実施例３：白血病細胞株に関する本発明の方法の有効性確認

本発明の方法の有効性を確認するため、配列番号：１〜６によって示される遺伝子の発現レベルを、ＦＡＢ分類に従って定義されるほとんどすべてのＡＭＬサブタイプに対応する１１の細胞株において評価した。

以下の細胞株を試験した：
ＫＧ１ａおよびＫＧ１（ＦＡＢ Ｍ０／Ｍ１）、ＨＬ６０（ＦＡＢ Ｍ２）、ＫＡＳＵＭＩ−１（ＦＡＢ Ｍ２）、ＭＬ−２（ＦＡＢ Ｍ４）、ＭＶ４−１１（ＦＡＢ Ｍ５）、ＴＨＰ−１（ＦＡＢ Ｍ５）、Ｕ９３７（ＦＡＢ Ｍ５）、Ｋ５６２（ＦＡＢ Ｍ６）、ＴＦ−１（ＦＡＢ Ｍ６）およびＵＴ７（ＦＡＢ Ｍ７）。

発現レベルを以下の表８に示す。

表８は、対照試料（健常骨髄試料）中の対応する遺伝子の発現レベルと比較した、対応する細胞株における指示遺伝子の発現レベルの比率Ｒ_ｉを示す。

以下の場合、本発明で定義される基準を満たす：
配列番号：１〜６によって示される遺伝子の中の３遺伝子の任意の組合せの各遺伝子の発現レベルの比率が≧２．０または≦０．５のいずれかである場合、試料は血液疾患を示すとみなされる。

考慮される３遺伝子の組合せにかかわらず、上記基準が満たされる。

その他の基準は、配列番号：１の比率が≦０．３であり、ならびに配列番号：２および３の両方の比率が≧３．０である場合、試料はＡＭＬを示す。

やはり、試験した１１の上記細胞株すべてについて（表３）、基準が満たされ、本発明の方法は、この細胞株に関して得られたこれらの結果が一次白血病細胞で得られる結果に対応することを確認する。

実施例４：骨髄異形成試料の分類

上記で定義されたように、配列番号：１〜２４によって示される遺伝子の発現レベルの測定は骨髄異形成症候群のサブタイプを同定することを可能にする。

本発明による方法の有効性を確認するために、他の手法によって分類された患者試料のパネルを試験した。

３つのＲＡＲＳ、６つのＲＣＭＤおよび３つのＲＡＥＢを使用して、配列番号：１〜２４によって示される遺伝子の発現レベルを評価した。

結果を以下に提示する：

表９：ＲＡＲＳ試料

表１０：ＲＣＭＤ試料

表１１：ＲＡＥＢ試料

試験した試料すべてが、本発明による方法において定義される基準を満たす。

実施例５：ＲＡＲＳ、ＲＣＭＤ、ＲＡＥＢおよびＡＭＬの特異的プロフィールの図式的表示

上記分類に対応する結果を、決定された試料を示す領域に対応する、「アンチオキシドグラム」によって図示することができる。

配列番号：１〜２４の各遺伝子の発現を上記で定義したようにｑＲＴ−ＰＣＲによって測定し、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現レベルと比較する。

図３Ａは、発現レベルに従って分類した、ＧＡＰＤＨと比較した配列番号：１〜２４の各遺伝子の発現の変動を示す。遺伝子番号は上記表１を使用することによって容易に見出される。

ＲＡＲＳ試料（図３Ｂ）、ＲＣＭＤ試料（図３Ｃ）、ＲＡＥＢ試料（図３Ｄ）およびＡＭＬ試料（図３Ｅ）についてのアンチオキシドグラムを使用して新たな試料を分類することができる。

実際に、配列番号：１〜２４によって示される各遺伝子についての比率を測定することにより、曲線を描くことができる。この曲線を、次に、アンチオキシドグラムと比較することができ、したがって、試験した試料がどのような種類の病変に属するかが容易に決定される。

実施例６：分類できない骨髄異形成症候群の分類

上記アンチオキシドグラムは、他の分類手法ではうまくいかない骨髄異形成症候群を分類するために用いることができる。

配列番号：１〜２４の遺伝子の各々の発現レベルを本発明に従って測定し、曲線を作製した。

この曲線（破線）を、次に、ＲＡＲＳ、ＲＣＭＤ、ＲＡＥＢおよびＡＭＬの「特異的」アンチオキシドグラムと比較した。

図４は、発現の比率Ｒ_ｉの大部分がＲＣＤＭ試料の特徴である比率に近いことを示す。

図５は、分類できない骨髄異形成症候群の２つの独立した試料が配列番号：１〜２４の遺伝子の類似した発現レベルを示し、したがってＲＣＤＭ試料の特徴であるものに近いことを示す。

実施例７：オキシドグラムを使用することによるＭＤＳの区別

慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）は、単球増加を特徴とする白血病の形態である。この疾患の類別は論議の的となってきた。

ＣＭＭＬを有する患者は、患者の特定の症状に依存して骨髄異形成症候群または骨髄増殖性腫瘍のいずれかを模倣する、様々な臨床特徴を呈し得る。

この論議のために、ＣＭＭＬは２０００年代初期に世界保健機構によって「骨髄異形成／骨髄増殖性」カテゴリの内科疾患に分類された。

本発明によるオキシドグラムは、組織学的分析によるとＲＡＥＢに近い、ＣＭＭＬ試料の状態を判定するのに役立ち得る。

図６に示すように、ＣＭＭＬを有する２名の患者の試料の配列番号：１〜２４の遺伝子の発現レベルは、ＲＡＥＢの配列番号：１〜２４の遺伝子の発現レベルとは異なる。

これらのデータは、ＣＭＭＬがＭＤＳとは異なることを明らかにする。

実施例８：進行性ＭＤＳのフォローアップのためのオキシドグラムの使用

先に述べたように、ＭＤＳは徐々にＡＭＬへと進行する。したがって、この進行が緩やかであるか急速であるかを知ることは重要である。

オキシドグラムを使用して、配列番号：１〜２４の遺伝子の分子発現が診断の時点から所定の日までに進行したかどうかを判定することができる。

一例を図７に示す。患者はｔ＝０の時点でＲＣＭＤを有すると診断された。

診断から１２か月後にも、配列番号：１〜２４の遺伝子の発現レベルを測定した。

図７は、診断時と１２か月後の発現の間の相違を示す。１２か月後に、オキシドグラムは患者がＲＣＭＤからＲＡＥＢへと進行しつつあることを示すが、組織学的分析はいかなる相違も示さない。

実施例９：脱メチル化剤の抗腫瘍作用のインビトロでの測定

ＡＭＬを治療するために新しい治療薬が積極的に探索されている。これらの化合物は、広範な探索のために、費用がかかり、また残念ながらすべてのＡＭＬ試料において普遍的に有効というわけではない。

ＡＭＬサブタイプの平均３０％が新規治療薬に応答性であり、白血病の進行を遅らせるために患者において有効に使用することができる。

しかし、薬剤に対する正または負のインビボ応答は、治療の開始から６〜９か月後まで得ることができない。

本発明によるオキシドグラムを使用して、配列番号：１〜２４の遺伝子の発現レベルの変化を調べることにより、薬剤が白血病試料に有効であるかどうかをインビトロで評価することができる。

図８は、脱メチル化剤アザシチジンで治療したＡＭＬ試料の例を示す。この図は、この特定の試料において、治療が遺伝子の発現レベルを変化させ、患者のためにインビボで有効であり得ることを明らかにする。

Claims (8)

1. 急性骨髄性白血病又は骨髄異形成疾患の、インビトロでの、診断の補助のための方法であって、
   ａ）被験者の生物学的試料に含まれる骨髄細胞から、少なくとも、２４遺伝子の群の中から選択される遺伝子のセットに属する６遺伝子の発現レベルを測定する工程、ここで、前記２４遺伝子の群は配列番号：１〜２４の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成され、
   前記６遺伝子は、配列番号：１〜６の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成されるものとし、
   ｂ）工程ａ）で測定された各遺伝子の発現レベルを、対照試料に含まれる細胞からの同じそれぞれの遺伝子の発現レベルと比較して、前記６遺伝子の各遺伝子についての遺伝子発現レベル比を確立する工程、ここで、前記対照試料は健常個体の試料であるものとし、および
   ｃ）前記生物学的試料の状態を、前記６遺伝子からの少なくとも３個の遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合に、前記生物学的試料は急性骨髄性白血病又は骨髄異形成疾患を示していると判定する工程、
   を含む前記方法。
2. 工程ｂ）で確立された比率が、
   ・配列番号：１の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成される遺伝子について、≦０．３、ならびに
   ・配列番号：２および３の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列によって構成される遺伝子について、≧３．０である場合に、
   前記生物学的試料は急性骨髄性白血病を示す、請求項１に記載の方法。
3. 工程ｃ）が次のとおりである：
   ・前記６遺伝子からの３遺伝子について工程ｂ）で確立された比率が≧２または≦０．５のいずれかである場合、
   ただし、
   ・前記生物学的試料で測定されたおよび前記対照試料で測定された配列番号：１の核酸配列を含むかもしくは前記核酸配列によって構成される遺伝子の発現レベル間の比率が≦０．３ではないか、または
   ・前記生物学的試料で測定されたおよび前記対照試料で測定された配列番号：２もしくは３の核酸配列を含むかもしくは前記核酸配列によって構成される遺伝子の各々の発現レベル間の比率が≧３ではない場合、
   前記生物学的試料は、骨髄異形成疾患を示す、請求項１に記載の方法。
4. 遺伝子の発現レベルを定量的方法、特にＲＴ−ｑＰＣＲによって測定する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 少なくとも工程ａ）における前記６遺伝子の発現レベルの測定を、少なくとも配列番号：２５〜３６のヌクレオチド分子を使用することによって実施する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列から成る４８オリゴヌクレオチドのライブラリの中から選択される少なくとも１２のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、前記少なくとも１２のオリゴヌクレオチドが配列番号：２５〜３６の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列から成る、組成物。
7. 急性骨髄性白血病又は骨髄異形成疾患の、インビトロでの、診断に使用するための、請求項６に記載の組成物。
8. 配列番号：２５〜７２の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列から成る４８オリゴヌクレオチドの群の中から選択される少なくとも１２のオリゴヌクレオチドを含むキットであって、前記少なくとも１２のオリゴヌクレオチドが配列番号：２５〜３６の核酸配列を含むかまたは前記核酸配列から成る、キット。

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