JP6010019B2 - がん、自己免疫および感染症の免疫療法開発用自然処理hla制限ペプチドの特異的定量方法 - Google Patents
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Description
がん精巣抗原:これまでに同定された T 細胞が認識できる最初の TAA(腫瘍関連抗原の略、疾病関連抗原は DAA と略される)はこのクラスに属し、このクラスは、メンバーが、組織学的に異なるヒト腫瘍および正常組織では、精巣の***細胞/精原細胞および時折胎盤でのみ発現していることから、初めはがん精巣(CT)抗原と呼ばれていた。精巣の細胞はクラス I 及びクラス II の HLA 分子を発現しないため、これらの抗原は通常 細胞によって認識されず、よって免疫学的には腫瘍特異的であると考えられる。CT 抗原として良く知られている例は、MAGE ファミリーのメンバーまたは NY−ESO-1 である。
分化抗原:これらの TAA は腫瘍及び腫瘍の発生源となった正常組織間で共有され、多くがメラノーマまたは正常のメラニン細胞内で見出されている。これらのメラニン細胞系列関連のタンパク質の多くはメラニンの生合成に関与しており、それゆえに腫瘍特異的でないにもかかわらずがんの免疫療法に広く使用されている。例として、チロシナーゼや Melan-A/MART-1 がメラノーマに、PSA が前立腺癌に使用されているが、これだけに限定されない。
過剰発現 TAA:広く発現している TAA をコード化している遺伝子は組織学的に異なる型の腫瘍で検出され、また正常組織でも低い発現レベルで検出される。正常組織により処理され潜在的に提示されるエピトープの多くが T 細胞に認識される閾値を下回っているが、一方、これらの腫瘍細胞の過剰発現が以前に獲得された耐性を破って抗がん作用を始動させる可能性はありうる。このクラスの TAA の代表例は、Her-2/neu、サービビン、テロメラーゼ及び WT1 である。
腫瘍特異的抗原:これらの特有の TAA は正常の遺伝子(例えば β カテニン、CDK4 など)の突然変異により生じる。これらの分子変化の一部は腫瘍性形質転換と進行の両方又は一方に関与している。腫瘍特異的抗原は正常組織に対する自己免疫反応のリスクを持たずに、通常強い免疫応答を始動させることができる。一方、これらの TAA は多くの場合、これらが同定されたまさにその腫瘍のみに関連しており、通常、個々の多数の腫瘍間では共有されない。
異常な翻訳後修飾により生ずる TAA:このような TAA は、腫瘍内で特異的でもなく過剰発現もされないタンパク質から生ずるにもかかわらず、腫瘍内で主に活性な翻訳後工程に関連する腫瘍となる。このクラスの例として、MUC1 に関しては腫瘍細胞で新規エピトープに導く、変化したグリコシル化パターンや、腫瘍細胞に特異的または非特異的な、分解過程中のタンパク質スプライシングが挙げられる 。
がんウイルスタンパク質:これらの TAA はがん形成プロセスで非常に重要な役割を果たす可能性のあるウイルスタンパク質であり、異種(ヒト由来ではない)であるので、T 細胞応答を喚起できる。このようなタンパク質の例として、子宮頸癌で発現されるヒトのパピローマタイプ 16 ウイルスタンパク質、E6 と E7 がある。
- 異なる量および MHC 発現レベルの組織サンプルの取り扱いを可能にする、すなわち一次組織サンプルに容易に適用できる。
- 例えば beta2m ノックアウトサンプルを作成する必要がある細胞には限定されない、すなわち一次(ヒト)組織サンプルにも適用可能である。
- 「ハイスループット」レベルで実施できる。
- 漸増的に実施できる、すなわち数年にわたり既存の定量データベースを新しいサンプルデータで拡大する。
「提示プロフィール」または「提示プロット」という用語は、本明細書では、棒グラフで表された異なるサンプルのペプチドに関する、平均的提示を示す。この提示は最大領域に比べた量をパーセントで表している。バラツキは測定反復数に基づき 95% 信頼区間として表示される。ペプチドはサンプル中で同定されたが、定量は不可能だった場合、NA(該当なし/領域なし)と表示される。
「提示スコア」とは 1 群の組織中のペプチド過剰発現の指標を他群と比較した結果で、0〜1 の間の値で表す。提示スコアが小さければ小さいほど、過剰発現の可能性が高くなる。ペプチドがいずれの正常または非疾病サンプルで見出されなかった場合、スコアは計算されず、そのためゼロに設定される。
有意に過剰提示された TUMAP(腫瘍関連ペプチド)セットを測定するには、有意な閾値(例、0.05)を選択し、この閾値よりも小さい提示スコアを持つすべての TUMAP を含める/取得する必要がある。そのため、提示スコアは偶然に過剰提示されたTUMAP 出現の確率を反映している。
統計学的に、提示スコアは線形混合モデルの p 値であると考えられる。この場合、スコアは、変量効果としてサンプル間とサンプル内のバラツキ、および固定効果として例えば腫瘍の実体と正常組織の差を組み入れた提示データ(TUMAP 特徴領域)のモデルとなる。より簡単なアプローチでは、提示スコアは t 検定の p 値であると考えられる。
提示スコアは、FDR(偽発見率)による多変量検定に対して補正される。
「品質管理」という用語は、本明細書では、データを本発明方法で使用可能にするために、本発明方法で使用される前記データが、十分な基準に適合しているかを検証することに関連する。1 例は、同定した配列の総数および解析したサンプルすべてのペプチドの量的再現性に基づく、面積分散の小さい配列数である。すなわち、いくつのペプチド配列がサンプル中で同定できるか(好ましくは信頼性をもって同定される)、またそれらの同定ペプチドの何パーセントが(例、25%、30%、50% または 75%)少ないバラツキの信頼区間(例、CV が20% 以下)に割り当てられるかである。これは、異なるサンプル間で信頼性のある正規化を得るのに必要な条件である。通常、信頼性をもって同定できるペプチド配列数が多いほど、データの質は「より高く」なる。別の例は、同定と区間推定値の質をコントロールすることであり、例えば、ペプチド同定結果と区間再現性の「古典的な」視覚調査によるか、または統計的解析によって行う。
a)1 つ以上の疾病一次組織サンプルおよび 1 つ以上の健常一次組織サンプル、好ましくは疾病組織に相当するものを提供する。
b)前記サンプルから MHCリガンドペプチドを単離する。
c)前記 MHCリガンドペプチドの HPLC-MS 分析を実施する。
d)ステップ c)から派生し、各シグナルの前駆体イオンシグナル強度(面積)を抽出する。
e)異なる測定操作とサンプルの間の面積をグループ化するために、フラグメントスペクトルのクラスタリングおよびデータベース検索により前記 MHCリガンドペプチドの配列を同定し、さらに反復測定内の面積を正規化し、反復測定間の技術的性能/感度の差を補正し、誤差推定値を含む 1 サンプル当たりの各ペプチドの平均量を得る。
f)異なるサンプル間の比較で対立遺伝子特異的配列サブグループを生成するために前記配列を MHC 対立遺伝子に割り当て、さらに該対立遺伝子特異的サブグループを使って異なるサンプル間を正規化し、異なるサンプルサイズまたは MHC 発現レベルを説明する。その結果がサンプル間で比較可能な相対量となる。
g)サンプルすべてのペプチド再現性に基づきデータの品質管理を実施し、同定した配列総数および面積分散の小さい配列数ができるだけ高いことを検証する。
h)MHC リガンドペプチドの過剰発現の可能性を測定するために、提示プロフィールと提示スコアを計算する。
i)同定と区間推定値の質をコントロールするが、例えば、ペプチド同定結果と区間再現性の外観検査によるか、または統計的解析によって行う。
j)前記の 1 つ以上の疾病一次組織サンプルで検出された値を、前記の 1 つ以上の一次健常組織から得た値と比較する。
k)前記 MHC リガンドペプチドを定量する。
a)1つ以上の疾病一次組織サンプルおよび1つ以上の健常一次組織好ましくは 1 種以上の哺乳動物の疾病組織に相当するものを提供する。
b)前記サンプルから MHC リガンドペプチドを単離する。
c)前記 MHC リガンドペプチドの HPLC-MS 分析を実施する。
d)ステップ c)から派生し、各シグナルの前駆体イオンシグナル強度(面積)を抽出する。
e)異なる測定操作とサンプルの間の面積をグループ化するために、フラグメントスペクトルのクラスタリングおよびデータベース検索により前記 MHC リガンドペプチドの配列を同定し、さらに反復測定内の面積を正規化し、反復測定間の技術的性能/感度の差を補正し、誤差推定値を含む 1 サンプル当たりの各ペプチドの平均量を得る。
f)異なるサンプル間の比較で対立遺伝子特異的配列サブグループを生成するために前記配列を MHC 対立遺伝子に割り当て、さらに該対立遺伝子特異的サブグループを使って異なるサンプル間を正規化し、異なるサンプルサイズまたは MHC 発現レベルを説明する。その結果がサンプル間で比較可能な相対量となる。
g)ペプチド再現性に基づきデータの品質管理を実施し、同定した配列総数および面積分散の小さい配列数が25 以上、好ましくは50 以上さらに好ましくは100以上であるかを検証する。
h)MHC リガンドペプチドの過剰発現の可能性を測定するために、提示プロフィールと提示スコアを計算する。
i)統計的解析によって同定と区間推定値の質をコントロールする。
j)前記の 1 つ以上の疾病一次組織サンプルで検出された値を、前記の 1 つ以上の健常組織から得た値と比較する。
k)前記 MHC リガンドペプチドを定量する。
ペプチドは、免疫刺激物質、例えばサイトカインなどと共に投与することもできる。
HLA-A*01、HLA-A*02 および HLA-A*024 は、これらの遺伝子座から発現されうる、異なる MHC クラス I 対立遺伝子の例である。
組織サンプル
患者の腫瘍組織および正常組織は、分析された腫瘍実体によって異なる数箇所の病院から提供された。手術前にすべての患者から書面でインフォームドコンセントを得た。組織は、術後直ちに液体窒素で衝撃冷凍し、TUMAP を単離するまで −80℃で保存した。
衝撃冷凍した組織サンプルの HLA ペプチドプールは、わずかに修飾したプロトコールに従い、HLA−A、−B、−C 特異的抗体 W6/32、HLA-A*02 特異的抗体 BB7.2、CNBr−活性化セファロース、酸処理、および限外ろ過により、固体組織から免疫沈降によって得た。異なる HLA 対立遺伝子に対し、当分野で既知の他の特異的抗体が使用でき、例として A*03 用の GAP-A3、B 対立遺伝子用のB1.23.2 がある。
得られた HLA ペプチドプールをその疎水性に従い逆相クロマトグラフィー(nanoAcquity UPLC system、Waters)により分離し、溶出したペプチドは、ESI 源付き LTQ オービトラップ型ハイブリッド質量分析計(ThermoElectron)で分析した。ペプチドプールを 1.7μm C18 逆相充填剤(Waters)が詰まった分析用溶融シリカミクロキャピラリーカラム(75μm 内径 x 250 mm)に、流速 400 nL/min で直接装填した。その後ペプチドを,流速 300iL/分で 10%から 33%まで,2 段階の 180 分バイナリ勾配をかけて分離した。勾配は、溶媒 A(0.1% 蟻酸水溶液)と溶媒B(0.1% 蟻酸アセトニトリル溶液)から成る。金被覆ガラスキャピラリー(PicoTip, New Objective)を nanoESI 源の導入に使った。LTQ オービトラップ型質量分析計は TOP5 法と TOP3 法を使ってデータ依存モードで操作した。手短に言えば、オービトラップで(TOP3 では R=30,000、TOP5 では R=60000)、高い質量確度の全スキャンからスキャンサイクルを開始し、続いて、以前に選択したイオン(TOP5)を動的排除した 5 つの最も多量に存在する前駆イオンについてはオービトラップで(R=7500)、または以前に選択したイオン(TOP3)を動的排除した 3 つの最も多量に存在する前駆イオンについては LTQ で、MS/MS スキャンを実施した。
各サンプルについて、TOP5 モードで 2 回、TOP3 モードで 3 回の 5 回の無標識 LCMS 反復測定を得た。LCMS データは、LCMS 調査とタンデム MS(MS/MS)データを分析する自家パイプラインにより処理された。我々の漸増する反復取得の設定、および標準的プロテミクスソフトウェアによって満足に取り扱われないペプチドミクスデータについては、専用のデータ解析で最適化され、採用されている。新しい各データセットは、Immatics Discovery データベース(MySQL)に統合される。全データは、入手可能なプロテオームデータ、ゲノムデータ、および文献データと相互参照される。
タンデム MS スペクトルは msn_extract(ThermoScientific)を使って抽出し、IPI データベースに対して Sequest で検索した。タンパク質データベースのヒットはその後、HLA ペプチドミクスデータ用に最適化した閾値を使い、自動品質フィルタリングにより検証される。増大するペプチドワクチン候補はさらに手動点検によって確認される。
LCMS 調査データは、高質量確度を使用するタンデム MS とは独立して解析された。LCMS シグナルとそのシグナル領域(イオン計数)を抽出するために、プログラム SuperHirn(ETH Zurich)が使用された。そのため、各同定ペプチドは定量的データと関連づけることができ、サンプルと組織間の相対的定量を可能にする。
β-2m-ミクログロプリン(b2m)は、基準タンパク質として β アクチンを使用してウェスタンブロッティングによって定量し、ゲル上に負荷したタンパク質量に対して正規化した。
細胞株による TUMAP 定量法の開発
定量パイプラインを確立するために、異なる方法が適用された。第 1 にサンプルのバラツキをシミュレーションするために、2% と 20% に希釈したJY 細胞株を使って希釈実験を実施した各希釈サンプルについて、反復測定を3回行った。測定間およびサンプル間のバラツキを正規化後、2 つのサンプル間の正規化係数は 9.95 であった。
さらに、異なる取得方法を比較し、ペプチド同定数と確度、さらに本実験の設定における定量精度を最大にした。この目的に対し、異なる MS/MS モードにおいて、JY サンプルを約 50 回反復測定した。
相対的に定量された TUMAP の例を以下に示す。
神経膠芽細胞腫ワクチンカクテルの一部である、PTPRZ1(チロシンホスファターセ、受容体タイプ、Z ポリペプチド 1)HLA クラス I ペプチドの提示プロフィール。赤は、異なる臓器の正常組織サンプルと比較した腫瘍サンプルを示している。各バーは、前記ペプチドに対し正規化したサンプル領域の中央値を表し、一方、エラーバーは、測定のバラツキのインジケータとして最小と最大の反復測定領域を示す。
CDK1 でコード化された胃癌関連 TUMAP の提示プロフィールについては、図 5 を参照。
ASPM でコード化された胃癌関連 TUMAP の提示プロフィールについては、図 6 を参照。
異なる組織実体中のMHC タンパク質の発現
本発明者らは、3 重 MHC α鎖/β-2-ミクログロブリン/ペプチド複合体(図 7 参照)の代表的化合物として、β-2-ミクログロブリンを使って MHC 発現レベルの範囲を知るために、異なる組織実体中の MHC 分子発現を解析した。
ウェスタンブロッティング(WB)に比較した質量分析に基づく MHC 量の正規化
表 2:MHC の WB に基づく正規化と MS に基づく正規化の比較
MS 正規化係数は、計算においてより多くの同定数を使用すれば、正確度が向上する。そのため、MS に基づく正規化は、一次組織免疫沈降から得た MHC 分子量の変動を補正する信頼性のある方法である。
定量的性能を継続的にチェックするために、我々は保持時間とシグナル領域の精度管理用に 7 つの非ヒト由来合成ペプチドを確立し導入した。
MHC 分子による腫瘍細胞表面に提示されることが同定されたペプチドすべてが、免疫療法に適しているとはいえないが、その理由は、これらの多くのペプチドが多数の細胞タイプにより発現された正常の細胞タンパク質に由来しているからである。これらのペプチドのほんの僅かだけが、腫瘍に関連しており、由来する腫瘍を認識するのに高い特異性を有する T 細胞を誘発できる傾向を有している。このようなペプチドを同定し、ワクチン接種により誘発される自己免疫のリスクを最小限にするため、本発明者は多数の正常組織と比較して、腫瘍細胞で過剰発現されるタンパク質に由来するこれらのペプチドに焦点を当てた。
書面によるインフォームドコンセントを各患者から得たのちに、外科的に切除した組織標本が異なる 2 ヶ所の臨床施設(例 1 を参照)から提供された。腫瘍組織標本は、術後直ちに液体窒素でスナップ凍結し、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を使い均質化した。総 RNAを TRI 試薬(Ambion、ドイツ、ダルムシュタット)、続いて RNeasy(QIAGEN、ドイツ、ヒルデン)によるクリーンアップによりこれらのサンプルから調製し、両方法とも製造者のプロトコールに従って実施した。
すべての腫瘍と正常組織の RNA サンプルの遺伝子発現解析は、Affymetrix Human Genome(HG)U133A または HG-U133 Plus 2.0 オリゴヌクレオチドマイクロアレイ(Affymetrix、米国カリフォルニア州サンタクララ)を使って実施した。すべてのステップは Affymetrix マニュアルに従って実施された。簡単にいうと、二本鎖 cDNA を総 RNA 5〜8μg から SuperScript RTII(Invitrogen)とオリゴ-dT-T7 プライマー(MWG Biotech、ドイツ、エーバースベルク)を使って取扱説明書の説明通りに合成した。In vitro 転写は、U133A アレイには BioArray 高収率 RNA 転写ラベルキット(ENZO Diagnostics, Inc.、米国ニューヨーク州ファーミンデール)で、U133 Plus 2.0 アレイには GeneChip IVT ラベルキット(Affymetrix)で実施した後、cRNA フラグメンテーション、ハイブリダイゼーション、およびストレプトアビジン−フィコエリトリンとビオチン化抗ストレプトアビジン抗体(Molecular Probes、オランダ、ライデン)による染色を行った。画像は Agilent 2500A 遺伝子アレイスキャナー(U133A)または Affymetrix 遺伝子チップスキャナー 3000(U133 Plus 2.0)でスキャンし、データは全パラメータの初期設定値を用いて GCOS ソフトウェア(Affymetrix)で解析した。正規化は、Affymetrix により提供された 100 個のハウスキーピング遺伝子を使った。相対的発現値は、ソフトウェアで得たシングルログ比から計算し、正常腎サンプルは適宜 1.0 に設定した。
IMA941 MHC クラス I 提示ペプチドの in vitro 免疫原性
本発明の TUMAP の免疫原性について情報を得るため、すでに(Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J.Immunol., 171, 4974-4978)により報告され、十分確立された in vitro 刺激プラットフォームを用いて検討を行った。我々が 32 HLA-A*2402 の免疫原性を示すことができた前記方法は、本発明の TUMAP を限定し、これらのペプチドが T 細胞エピトープであり、このエピトープに対して CD8+ 前駆体 T 細胞がヒトに存在することを立証した(表 3)。
ペプチド-MHC 複合体(pMHC)および抗 CD28 抗体を載せた人工抗原提示細胞(aAPC)による in vitro 刺激を実行するために、発明者はまず、血液バンク Tuebingen から得た健常ドナーの新鮮 HLA-A*24 白血球分離生成物から CD8 T 細胞を単離した。
検討した HLA クラス I ペプチド 25 個について、in vitro 免疫原性をペプチド特異的 T 細胞株を生成させることにより証明できた。本発明の 2 つのペプチドに対する、TUMAP 特異的多量体染色後の典型的なフローサイトメトリーの結果を、対応する負のコントロールと共に図 3 に示す。本発明 25 個のペプチドの結果を表 3 に要約する。
本発明者により実施された in vitro 免疫原性の結果が、評価可能な陽性試験ドナーとウェルのパーセンテージを示している。少なくとも 2 つのドナーと 24 個のウェルが各ペプチドについて評価可能であった。
Claims (12)
- a)被験者から得られた1つ以上の疾病一次組織サンプルおよび健常組織から得られた1つ以上の健常一次組織サンプルを準備する工程、
b)前記疾病一次組織サンプルおよび健常一次組織サンプルから MHC リガンドペプチドを単離する工程、
c)HPLC-MS分析においてペプチドシグナルを生成する前記単離されたMHCリガンドペプチドの HPLC-MS 分析を実施する工程、
d)フラグメントスペクトルを生成するそれぞれの前記MHC リガンドペプチドシグナルの前駆体イオンシグナル面積を測定する工程、
e)工程d)により得られるフラグメントスペクトルのクラスタリングおよびデータベース検索により前記MHC リガンドペプチドの配列を同定する工程、並びに、
異なる疾病一次組織サンプルの間の前駆体イオンシグナル面積のグループ化を行うことにより、かつ、工程c)および工程d)の反復測定を行い、該反復測定間の技術的性能/感度の差を補正するために反復測定内の前駆体イオンシグナル面積の正規化を行うことにより、誤差推定値を含む1サンプル当たりの各ペプチドの平均量を決定する工程、
f)異なる疾病一次組織サンプル間のペプチドの比較が可能な相対量を決定する工程であって、前記相対量を決定するために、サンプル毎のサイズまたは MHC発現レベルを考慮したMHC対立遺伝子特異的配列サブグループを使った前記異なるサンプル間のペプチドの正規化を行うことを含み、前記MHC対立遺伝子特異的配列サブグループは、異なるサンプル間のペプチドの比較により、工程e)で同定したMHCリガンドペプチド配列を個別のMHC 対立遺伝子に割り当てて生成したものである、工程、
g)MHCリガンドペプチドの工程e)に記載の平均量および工程f)に記載の相対量に基づいて、前記疾病一次組織サンプルおよび前記健常一次組織サンプルのMHCリガンドペプチドについての提示プロフィールおよび/または提示スコアを計算することにより、MHCリガンドペプチドの過剰提示を決定する工程、
h)前記 MHC リガンドペプチドを無標識定量する工程、ならびに
i)MHCリガンドペプチドが腫瘍関連ペプチド(TAA)または疾病関連ペプチド(DAA)から選択されるものであって、合成ペプチドである前記MHC リガンドペプチドについて、免疫原性をテストする工程、
を含む、一次組織サンプル中のペプチドワクチン候補の同定/無標識定量の方法。 - 腫瘍特異的 MHC リガンドペプチドの選択をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程d)において、配列についての知識なしに反復測定内で対応するシグナルを割り当てるために保持時間を調整する工程、および/または
配列の知識無しに保持時間を調整することにより異なるサンプル間に対応するシグナルを割り当てる工程、
をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - in vitro で実施される方法である、請求項1〜3のいずれか一に記載の方法。
- 各工程が示される順序で実施される、請求項1〜4のいずれか一に記載の方法。
- 示される各工程からなる方法である、請求項1〜5のいずれか一に記載の方法。
- 合成機または手動で同定および/または定量される、1つ以上のMHC リガンドペプチドを合成する工程をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一に記載の方法。
- MHC リガンドペプチドを、免疫原性について合成ペプチドとしてテストする工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- サンプルは一個人に由来する、請求項1〜8のいずれか一に記載の方法。
- 同定および/または定量時のMHC リガンドペプチドに基づいた、個人用の MHC リガンドプロフィールを生成することをさらに含んだ、請求項9に記載の方法。
- 個人用の疾病特異的 MHC リガンドプロフィールを生成するものである、請求項10に記載の方法。
- 同定配列の総数の配列数は5、25、50、または100を超える、請求項1〜11のいずれか一に記載の方法。
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