JP6006284B2 - 疾病に特異的な結合分子および標的を提供する方法 - Google Patents
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Description
(a) 症状がない患者、または臨床的に異常に安定しているが、疾患に罹患している、もしくは疾患を発症する危険性がある患者から得たサンプルを、所定の病理学的特性がある病理的に変化した細胞もしくは組織の標本に供するステップと、
(b) 該標本に結合するが、健康な対象から派生し得るような病理学的特性がない対応する細胞または組織に結合しない結合分子を同定し、任意に単離するステップと、を含む。
「1つの(aまたはan」」の実体という用語は、1つ以上のその実体を指し、例えば、「1つの抗体」は、1つまたはそれ以上の抗体を示すことを理解されることに留意されたい。また、「1つの(a(またはan))」、「1つ以上の」、および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書で同義的に使用することができる。
本発明は、一般に、臨床的にあらかじめ選択されたヒト対象から治療的に効率的な抗体を発見する手段および方法に関する。実施例において示されるように、ヒト脳疾患における異常構造に対するヒト抗体を、表現型的には健康な、または臨床的に異常に安定した患者から単離することができ、対応する組み換え抗体を、実質的な副作用のない脳機能障害の治療、病状の改善、および予防に有効に使用することができる。疾病の臨床的な安定または非進行は、例として、臨床状態、例えば、認知状態(例えば、神経心理学試験による)の経時的測定、全体的な機能水準の評価、日常生活の能力または行動の欠陥の評価、脳構造の容量分析、脳内の異常タンパク質の病理学的沈着または体液(例えば、タウタンパク質、またはアミロイドβペプチド)における生化学変数の生体内測定(例えば、PETベータアミロイド画像)、および疾病の自然経過/経歴との比較により、同定することができる。したがって、本発明は、天然内因性タンパク質から派生し、例えば、異常タンパク質として、異型において、および/または、それらの正常な生理学的状況から患者の体内に蔓延している疾病関連タンパク質のネオエピトープを認識することが可能である、抗体および結合分子を提供する。特に、実施例に説明される抗体に対して概説されるように、免疫学的結合特性、および/または生物学的特性を示す、抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。存在する場合、すべてのその文法型において、「免疫学的結合特性」という用語、または抗原を有する抗体の他の結合特性は、抗体の特異性、親和性、交差反応性、および他の結合特性を指す。必然的に、本発明はまた、細胞株および組み換え細胞を生成する抗体にまで及ぶ。本発明は、さらに、本発明の結合分子を含む診断アッセイおよびキット、ならびに治療方法、およびそれに基づいた治療効果評価に関する。
(a) 症状はない、または臨床的に異常に安定しているが、疾患に罹患する、または疾患を発症するもしくは疾患の兆候または発生を効果的に抑制される危険性がある患者から得たサンプルを、所定の臨床特性の病理的もしくは生理学的に変化した細胞もしくは組織の標本に供するステップと、
(b) 該標本に選択的に結合するが、健康な対象から派生し得る、このような病理学的特性がない対応する細胞または組織に結合しない、または著しく低い親和性を有する、結合分子を同定し、任意に単離するステップと、を含む。
a) 65歳、好ましくは70歳、さらに好ましくは75歳以上であること、
b) 十分な認知能力および良好な健康状態を有すること、
c) 認知症の臨床的兆候がないこと、または
d) アルツハイマー病であり得る確立された臨床診断の存在にもかかわらず、疾病の進行が異常に遅いこと、または
e) 軽度認識障害(MCI)から末期のアルツハイマー病までの異常に低い変換率を有すること。
a) 結合分子、例えば、該標本に選択的結合するが、健康な対象の対応する細胞または組織に結合しない、または著しくより低い親和性を有する、抗体を含むことが同定されているサンプルからB細胞またはB記憶細胞を精製するステップと、
b) 該B細胞またはB記憶細胞から該抗体をコードする免疫グロブリン遺伝子レパートリーを取得するステップと、
c) 該レパートリーを使用して、該抗体を発現するステップであって、ステップ(b)には、
d) 該B細胞または記憶B細胞からmRNAを取得するステップと、
e) ステップ(iv)の該mRNAからcDNAを取得するステップと、を任意に含み、
f) プライマー伸長反応を使用して、該cDNAから該抗体の重鎖(HC)およびカッパ/ラムダ軽鎖(LC)に対応するフラグメントを増幅するステップと、をさらに含む。
(i) 例えば、病理学的事象の部位で、血液脳関門を横断することが可能である、
(ii) ベータアミロイド斑、脳血管アミロイド、拡散性アミロイドβ沈着、神経原線維変化、過リン酸化タウ、アルファシヌクレイン陽性レヴィー小体またはジストロフィー性軸索に関連する、タンパク質凝集体に結合することが可能である、
(iii) 脳内のベータアミロイド班を除去、および/または脳内のアミロイド班の形成を予防することができる、
(iv) 正常な挙動に実質的に修復することが可能である、および/または
(v) 微小出血を引き起こさないことが可能である。
1. 病理学的事象の部位で、少なくとも少量において、血液脳関門を通過することができる、
2. 1つ以上の病理生理学的に関連のある細胞外または細胞構造に結合することができる、
3. 体外または生体内で、病理生理学的に関連のある構造の減少をもたらすことができる、
4. 病理生理学的に関連のある構造の還元およびそれに関連する毒性の減少をもたらすことができる、
5. 疾病過程の遮断または遅延をもたらすことができる、
6. 細胞の再生、ならびに臓器特異および有機体機能、場合により、病理生理学的に関連のある構造と関連がある毒性の分解後、元の病態生理学の再発の第二次予防をもたらすことができる、および/または
7. 増大する微小出血と関連しない。
本発明は、結合分子、例えば、表2および3に示される、抗体およびその結合フラグメント、変異体、および誘導体等をさらに対象にする。本発明は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、変異体、もしくは誘導体をさらに特異的に対象にし、抗体が、NI−101.10、NI−101.11、NI−101.12、NI−101.13、NI−101.12F6A、NI−101.13A、およびNI−101.13Bからなる群から選択される参照抗体として、疾患関連タンパク質の同一のネオエピトープに特異的に結合する。
上記に従って、本発明はまた、例えば、抗体等の本発明の結合分子をコードするポリヌクレオチドに関する。抗体の場合には、ポリヌクレオチドは、上に記載の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードし得る。上に記載の抗体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、例えば、DNA、cDNA、RNA、または合成的に産生されたDNAもしくはRNA、または単独で、あるいは組み合わせのいずれかで、これらのポリヌクレオチドのいずれかを含む、組み換え技術によって産生されたキメラ核酸分子であり得る。好ましくは、該ポリヌクレオチドは、ベクターの一部である。このようなベクターは、適した宿主細胞における、適した条件下で、該ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子等の遺伝子をさらに含み得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核生物または真核生物細胞における発現を可能にする、配列を制御する発現に作動可能的に連結される。該ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞における、発現を確保する調節要素は、当業者に公知である。それらは、通常、転写開始を確保する、調節配列、および転写の終結および転写の安定化を確保する、任意にポリAシグナル含む。追加の調節要素は、転写、ならびに翻訳エンハンサー、および/または自然に関連した、もしくは異種プロモーター領域を含み得る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを有する遺伝子組み換え細胞を含む、本発明の抗体を発現することが可能な細胞、またはその対応する免疫グロブリン鎖を産生する方法にも関与する。本発明の方法により得られる細胞は、例えば、本発明の抗体とその抗原との相互作用を試験するために、使用することができる。
(a) 上に記載される、細胞を培養するステップと、
(b) 該培養物から、該抗原、その結合分子、抗体、もしくは結合フラグメント、または免疫グロブリン鎖を単離するステップと、を含む。
本発明の抗体は、さらなるドメインを含むことができ、該ドメインは、共有または非共有結合により連結される。連鎖は、当技術分野において既知の、また、上に記載の方法に従って、遺伝子融合に基づいて行うことができ、例えば、国際公開第WO94/04686号に記載されるように、例えば、化学的架橋により実施することができる。本発明の抗体を含む、融合タンパク質に存在する追加のドメインは、好ましくは柔軟性リンカー、有利には、ポリペプチドリンカーにより連結され、該ポリペプチドリンカーは、該さらなるドメインのC末端部と、本発明の抗体のN末端部の間の距離、または反対の方向に、またがるのに十分な長さの複数の親水性のペプチド結合アミノ酸を含む。治療的または診断的な活性薬剤は、様々な方法により、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに結合することができる。これは、例えば、治療的または診断的な活性薬剤へのペプチド結合等の共有結合法により結合される本発明の抗体の可変領域を含む一本鎖融合タンパク質を含む。さらなる例には、以下の非限定の一覧表のものを含む、共有結合的に、または非共有結合的に追加の分子に結合される、少なくとも抗原結合フラグメントを含む、分子が挙げられる。Traunecker,Int.J.Cancer Surp.SuDP7(1992),51−52は、CD3に向けられるFv領域を、可溶性CD4、またはOVCAおよびIL−7等の他のリガンドに結合する、二重特異性試薬ヤヌシン(janusin)を記載する。同様に、本発明の抗体の可変領域は、Fv分子に構築され、引用された文献に例示されるもの等の代替リガンドに結合することができる。Higgins,J.Infect Disease166(1992),198−202は、GP120のV3領域において、特定配列を対象にする抗体に交差結合された、OKT3からなるヘテロ共役抗体を記載した。このようなヘテロ共役抗体はまた、本発明の方法の抗体に含有する少なくとも該可変領域を使用して、構築することができる。特異抗体の追加の例は、Fanger,Cancer Treat.Res.68(1993),181−194、およびFanger,Crit.Rev.Immunol.12(1992),101−124により記載されるものを含む。
さらに、本発明は、当該の結合分子、例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、もしくはその化学的誘導体、または本発明のポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞を含む、組成物に関する。本発明の組成物は、医薬的に許容できる担体をさらに含み得る。「化学的誘導体」という用語は、通常は、元の分子の一部ではない、追加の化学部分を含有する分子を説明する。このような部分は、元の分子の溶解性、半減期、吸収等を改善し得る。代替として、該部分は、元の分子の望ましくない副作用を緩和、または塩基分子の毒性を低減し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の使用目的により異なるが、インターロイキンまたはインターフェロン等の薬剤をさらに含み得る。例えば、アルツハイマー病の治療に用いる、追加の薬剤は、有機小分子、抗アミロイドβ抗体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。このように、特に好ましい実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の治療する、またはその進行を予防するため、アルツハイマー病に関連する症状の改善のため、アルツハイマー病の存在について対象を診断またはスクリーニングするため、もしくは対象のアルツハイマー病を発症する危険性を決定するための、医薬または診断組成物を調製するための結合分子、例えば、本発明の抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、またはそれらの任意の1つの同一の結合特異性を実質的に有する結合分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞の使用に関する。該医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、またはエアロゾルとして、投与するように設計することができる。以下も参照されたい。
記憶B細胞の表示
例えば、危険因子の存在下で疾病の臨床的兆候がない異常に陽性の臨床経過、もしくは、疾病の発現がない中度または前駆兆候の安定した経過により特徴付けられる、臨床的に厳選されたヒト対象、または長期未発症者を、記憶B細胞の単離のための出発材料として、末梢血リンパ球を提供するように採用した。このストラテジーは、対象の記憶B細胞プールは、抗体特異性、場合により、前述の抗原遭遇中、生成された抗体頻度も保存するという、感染免疫学に構築される概念に基づく(McHeyzer−Williams and Ahmed Curr.Opin.Immunol.11(1999),172−179、Bernasconi et al.,Science 298(2002),2199−202、Traggiai et al.,Nat.Med.10(2004),871−875)。本概念は、感染性因子に対する適応免疫、ならびに、液性免疫の説明、次いで、1次感染症を説明するように発展された。本理論によれば、自然に、あるいは予防接種後、対象の経歴において抗体反応を誘発していたすべての抗原に対する抗体の全相補体は、記憶B細胞プール内で完全に示されるはずである。本発明に従って、本理論は、通常は生理学的に関連するタンパク質の異常な凝集または配座の結果として生成される内在性抗原に適用され、したがって、生理学的免疫学耐性に影響されず、したがって、抗原特性を獲得し、立体構造新エピトープ(ネオエピトープ)に対する免疫反応を誘発することができる。
MACS技術およびCD22ミクロビーズを使用して、PBLのバルクからB細胞の選択を実施した(Miltenyi,Bergisch Gladbach,Germany)。PBLを、MACS抗ヒトCD22、フィコエリトリン接合抗ヒトIgD、およびAPC接合抗体抗ヒトIgM、IgA、CD3、CD8、CD56で標識化した(Becton Dickinson,Basel,Switzerland)。CD22陽性細胞を、LSカラムおよびMidi MACSデバイス(Miltenyi)を使用して、単離し、次いで、MoFloセルソーターを使用して、フィコエリトリンおよびAPC陰性細胞を選択した(Dako,Fort Collins,USA)。CD22陽性、IgM、IgD、IgA、およびIgE陰性B細胞を、その後、B細胞培地(10%ウシ胎仔血清(Hyclone,Perbio,Lausanne,Switzerland)が補完されるRPMI1640)中の2.5mg/lの濃度で、B95−8細胞およびCpG2006(Sigma,Buchs,Switzerland)から得られる浮遊物を含有するエプスタイン・バー・ウイルスと共にインキュベートした。任意ドナーから調製された30.000個の照射されたヒトPBL上のB細胞培地中のCostar丸底型96ウェルプレート(Corning,Vitaris,Baar,Switzerland)において、ウェルあたり5〜50個の細胞を播種した。記憶B細胞培養を、加湿した細胞培養インキュベーターにおいて、37℃、5%CO2で2〜4週間維持した後、培養の馴化培地をELISAおよび組織アレイにおいて検査した。
馴化培地における抗体を、アルツハイマー病が挙げられるが、これに限定されない、病理学的に確認された診断を有するヒト患者から得られた組織切片、またはヒト疾患のトランスジェニックマウスモデルの組織切片から得られた、または高齢の非ヒト霊長類を含むヒト疾患の動物モデルから得られた組織切片から、または凝集合成ペプチド調製のELISAにより、タンパク質凝集体、および異常かつ病理学的関連構造を含む、病理学的エピトープに結合するためにスクリーニングされる。本発明の意味において、異常かつ病理学的構造としては、βアミロイド班、神経原線維変化、レヴィー小体におけるアルファシヌクレイン凝集体、およびジストロフィー性軸索に沈着されるタンパク質凝集体が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト組織はまた、正常な細胞または超細胞組織構造を有する抗体の交差反応性を除外するためにも使用される。選択された抗体は、クラスおよび軽鎖サブクラスの決定のためにさらに分析される。記憶B細胞培養からの選択された病理学関連抗体メッセージを、RT−PCRを使用して、転写し、クローン化し、および組み換え生成のために発現ベクターに組み合わされる。
マイクロタイターに適合する組織マイクロアレイを使用する、馴化培地のB細胞のスクリーニング
アレイ生成
パラフィン包埋したヒト検視アルツハイマー病脳組織を、直径1〜2mm、長さ10mmのロッドに切断した。4本のロッドをパラフィン内で垂直に埋め込み、9×9mmのマイクロタイター型に適合する正方形を形成した。5μmの組織スライスを、ミクロトームを用いて、本アセンブリから切断し、2枚のスライスをスライドガラスに、互いに隣接するように取り付け、96ウェルマイクロタイター型に適合する2×4ロッドのアセンブリを得た。代替として、APPトランスジェニックマウスからの組織を使用して、組織アレイを調製した。
記憶B細胞培養からの馴化培地を、マルチチャンネルピペットを使用して、組織アレイスライドに移し、室温で2時間インキュベートした。洗浄ステップ後、組織切片へのヒト抗体の結合を、ヒトIgGへのCy3共役した第2抗体を使用して、分析した(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Suffolk,UK)。蛍光分析を逆蛍光顕微鏡で実施した(Leica,Heerbrugg,Switzerland)。
96ウェルの半エリアマイクロプレート(Corning)を、4℃で一晩、コーティング緩衝剤(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、pH9.42)中で1μg/mlの標準濃度で、合成アミロイドβ−ペプチドを用いて被覆した。プレートを洗浄し、非特異結合部位を、室温で1時間、2%BSA(Sigma,Buchs,Switzerland)を含有する、PBSで遮断した。B細胞の馴化培地を、記憶B細胞培養プレートからELISAプレートに移し、室温で2時間インキュベートした。ヒト抗体の結合を、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)共役ロバ抗ヒトIgGポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Cambridgeshire,UK)を使用して決定した後、標準比色分析において、HRP活性の測定をした。
選択された記憶B細胞培養の生体B細胞を、セルソーターを使用して採取する。mRNAを調製し、3´プライマーとしてのすべてのヒトJ−Hセグメントに対して特異的なプライマーと組み合わせて、5´プライマーとしてすべてのヒト可変重鎖および軽鎖枠組み1(FR1)ファミリーに対するIg枠組み特異的プライマーを使用して、免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列を得る(Marks et al.,Mol.Biol.222(1991).,581−597)。代替として、記憶B細胞培養からの単一選別された細胞の単一細胞RT−PCRを、Ig重鎖および軽鎖配列の起源として使用することができる(Babcook et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996),7843−7848、Brezinschek et al.,J.Immunol.155(1995),190−202、Coronella et al.,Nucleic Acids Research 28(2000)、Owens,et al.,J.Immunol.171(2003),2725−2733)。単一細胞選別は、B細胞培養において、最初に産生される抗体クローンの免疫グロブリン重鎖および軽鎖の正しい対合を保存する。
バルクB細胞のRT−PCR
選択された記憶B細胞培養の前方および横への光散乱特性により同定される、生体細胞を、MoFloセルソーターを使用して、20μlのRNAlater(Ambion,Huntingdon,UK)で満たされた0.2mlのPCR管中に直接、100〜2000個の細胞のアリコートに選別した。mRNAを、mRNA−Direct Microキット(Dynal,Invitrogen,Basel,Switzerland)を使用して、調製した。cDNAは、“RT for PCR”キット(Clontech BectonDickinson,Basel,Switzerland)を使用して、調製され、Advantage2 PCRキット(Clontech)を使用し、3´プライマーとしての、ヒトIg重鎖、またはIgカッパもしくはIgラムダ軽鎖の定常ドメインに対して特異的なプライマーと組み合わせて、5´プライマーとしてすべてのヒト可変重鎖および軽鎖フレームワーク1(FR1)ファミリーに対して特異的なプライマーを使用して、免疫グロブリン(Ig)重鎖および軽鎖可変配列のPCRを実施する。プライマーは、Microsynth(Balgach,Switzerland)から購入した。
(ATGGACATGCGGGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTAGATGC, 配列番号1)
のクローニングを促進するために、制限部位Xba1に提供するために設計された。Xba1は、サイレント突然変異生成により導入された。可変重鎖領域のクローニングのために使用される3´制限部位として、制限部位Sal1をベクターにより提供されるIgG1のC1に導入した。同様に、制限部位BsiW1をカッパ軽鎖のC1に導入し、Xho1をラムダ軽鎖のC1に導入した。PCR生成物の制限消化およびレシピエントベクター(recipient vector)へのライゲーションを、標準手順に従って、実施した。プラスミドDNAは、標準キット(Quiagen,Hombrechtikon,Switzerland)を使用して、調製された。レシピエントベクターは、哺乳類細胞において、抗体遺伝子の発現のためのCMVプロモーターを含有した。
培養されたB細胞からのIg重鎖および軽鎖可変領域の単一細胞RT−PCRのために、Owensらによって記載される方法の改変形態を使用した(Owens et al.,2003)。単一細胞を、MoFloセルソーターを使用して、0.2mlのPCR管のアレイのそれぞれの管に直接沈着させた。それぞれの管を、スーパースクリプトII逆転写酵素(Invitrogen)用の10μlのRT緩衝剤を含有するように調製した。PCR管を、ドライアイス上で衝撃冷却し、RT−PCR前に直ちに凍結した。cDNAは、ランダムヘキサマー(Clontech)およびスーパースクリプトII逆転写酵素(Invitrogen)を使用して、調製した。Ig可変領域ファミリーの間で保存されるすべてのシグナルペプチドで抗原刺激を受けた1組のプライマーを、5´プライマーとして、使用して、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の第1ラウンドPCRを実施した。3´位では、IgC1重鎖またはIgカッパもしくはIgラムダ軽鎖の定常領域に対して特異的な単一プライマーを使用した。バルクB細胞RT−PCRのために記載される、プライマーを使用して、第2ラウンドのPCRを、第1ラウンドPCR中に得られたPCR生成物に対して実施した。このように、レシピエントベクターへのクローニングを実施した。
クローニングを、標準限定された希釈法を使用して、またはセルソーター(MoFlo,Dako,Fort Collins,USA)を使用して、96ウェル培養プレートに単一細胞を沈着することにより、実施した。限定希釈のために、記憶B細胞培養の細胞を採取し、培地中に再懸濁された30μmのナイロンメッシュ(Falcon,Becton Dickinson,Basel,Switzerland)を通過させ、ウェルあたり0.3細胞の濃度で、96ウェルプレートもしくは384ウェルプレートに播種した。
クローン免疫グロブリン可変領域配列の配列決定を、発現ベクターにおいて、5´の挿入Ig可変領域配列に存在するCMVプロモーターに対して特異的なプライマーを使用して、実施した。代替として、Ig重鎖および軽鎖の定常ドメインで抗原刺激を受けたプライマーを使用した。得られた配列を、ベクターNTIソフトウェア(Informax−Invitrogen)を使用して、分析および整列した。リーダーペプチドおよび定常ドメインを有するフレーム内に完全免疫グロブリン可変領域をコードする配列を含有するプラスミドを発現のために使用した。
抗体は、当技術分野において既知の技術を使用して、組み換え発現による十分な量で産生することができる(Trill et al.,Curr.Opin.Biotechnol.6(1995),553−601)。最大1mgまでの組み換えヒトモノクローナル抗体を、293HEK細胞の過渡的トランスフェクション後、産生した。最大100mgまでの組み換えヒトモノクローナル抗体を、組み換えレンチウイルスベクターを使用して、293HEK細胞またはマウスNSO細胞の安定な形質導入後、産生した。
Ig重鎖ベクターおよびIg軽鎖ベクターを、標準リン酸カルシウム共沈法を使用して、HEK293細胞に同時遺伝子導入した。組み換え抗体を、タンパク質Aカラム精製(GE−Healthcare,Otelfingen,Switzerland)を使用して、トランスフェクトHEK293細胞により馴化された培地から精製した。
ここで、レンチウイルスベースのトランスフェクション系を利用して、ヒト組み換え抗体を産生する安定に形質導入された細胞株を生成した(Zufferey et al.,J.Virol.72(1998),9873−9880)。HEK293細胞を、組み換え抗体のIg重鎖の発現カセットを持つものと、もう1つはIg軽鎖のカセットを持つものとの、2つのはっきり異なるレンチベクターを用いて同時形質導入した。形質導入のこの方法は、CHOおよびNSO細胞等の広範囲の哺乳類細胞株に使用することができる。
トランスジェニックマウスを、C57Bl/6およびDBA2のハイブリッドバックグラウンドにおいて前に記載されるように、生成した(Knobloch et al.,Neurobiol.Aging July 28(2006))。試験群を、一度、C57Bl/6に戻し交配した。マウスは、12時間:12時間の明/暗サイクルで反転する標準居住条件下で飼育され、餌および水を自由に摂取させた。処置群は、年歳(第1の試験で24月齢、第2の試験で26月齢)および性別に対してバランスを保った。マウスは、動物あたり8回の注射を行う2ヶ月の期間にわたって週1回の腹腔内注射による抗体(3mg/kg体重)で処置される。
アーム寸法40×20×10cmを有するY字型のプラスチック製の迷路を使用して、交替行動の自然発生率を評価した。5分間のセッション中、一連のアーム侵入を記録し、交替行動は、重複する三重項セットにおける、3つのアームへの連続侵入として定義された。交替行動率は、実際の交替行動数と起こり得る交替行動数との比率により算出した。抗体処置から2ヶ月後、マウスをY字型の迷路で再度試験した。実験者は、常に、全実験中、処置および遺伝子型の両方に対してブラインド試験で行う。
選択された抗体またはそのフラグメントが、血液脳関門に浸透し、脳において、それらの異常に凝集された、または立体構造的に変化したタンパク質標的に結合することができるか否かを評価するために、有効量の抗体を、脳において、凝集された、または立体構造的に変化したタンパク質標的の非生理学的な蓄積により特徴付けられる、トランスジェニック動物に、全身的、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、または鼻腔内投与する。脳における病理学的特定構造への抗体の結合は、その後、標識化抗ヒトIg第2の抗体で免疫染色した後、標準免疫組織化学的検出により評価される。
アルツハイマー病のPS−1/APPsweトランスジェニックモデルマウスは、1日目と3日目に、150μgのNI−101.11を2回末梢注射した。マウスを2回目の注射をしてから24時間後に殺処分し、PBSで還流した。脳を冷凍し、組織スライスを、クライオトームを使用して、冷凍した組織から調製した。クリオスタット切片上のヒト抗体の存在を、Cy3標識化抗ヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch Europe,Suffolk,UK)で染色することにより分析した。アミロイド班の局在を、マウスアミロイドβ−特異対照抗体6E10(Covanceから市販、カタログ番号SIG−39320)、次いで、FITC標識化抗マウスIgG抗体でクリオスタット切片を同時染色することにより、実施した。代替として、Cy3標識化抗ヒトIgG抗体で染色したものを単独で使用した。蛍光分析を逆蛍光顕微鏡において実施した(Leica)。
脳において、凝集された、または立体構造的に変化したタンパク質標的のレベルにおける抗体処置の効果を、抗体の全身的治療または標的脳送達(頭蓋内、くも膜下腔内、または脳室内)、ならびに脳において、凝集された、または立体構造的に変化したタンパク質標的の特徴のある非生理学的な蓄積を有するトランスジェニック動物への非関連抗体対照により評価する。処置効果は、変化した、もしくは凝集されたタンパク質標的の免疫染色または組織化学的染色、ならびに異なる脳エリアにおける、このような凝集により覆われたエリア、凝集の大きさ、凝集数、およびタンパク質標的の濃度の生化学的定量を測定することにより、評価される。
抗体処置の起こり得る標的関連の有害効果を、抗体の全身的投与または標的脳送達(頭蓋内、くも膜下腔内、または脳室内)、ならびに脳において、凝集された、または立体構造的に変化したタンパク質標的の特徴のある非生理学的な蓄積を有するトランスジェニック動物への非関連抗体対照により評価する。起こり得る副作用は、免疫染色または組織化学的染色(例えば、微小出血、ヘマトキシリン−エオシン、活性化した白血球に対するプルシアンブルー)および生化学的定量(例えば、ELISAによるサイトカインレベル)により評価される。
HEK293細胞を、黄色蛍光タンパク質変異体シトリンに、細胞内C末端で融合されたヒト野生型APPを発現するベクターで、一時的にトランスフェクした。細胞をトランスフェクションしてから24時間後、4℃で30分間、ヒト組み換え抗体または対照抗体と共にインキュベートした。洗浄ステップ後、細胞を固定し、表面結合抗体を、ヒトまたはマウスIgG(Jackson ImmunoResearch)へのCy−3標識化2次抗体を使用して、検出した。蛍光分析を共焦点顕微鏡において実施した(Leica)。
アミロイドβペプチドを、Bachem(Bubendorf,Switzerland)から購入した。凍結乾燥ペプチドを、アッセイにおいて、単量体アミロイドβとして使用する直前に、TFA中で再構成し、PBS中で再懸濁した。アミロイドβ原線維を、37℃で24時間PBS中で、100μg/mlの濃度で、単量体アミロイドβ1−42ペプチドをインキュベートすることにより調製した。単量体アミロイドβペプチドおよび線維調製物はまた、ELISAプレートを被覆するための基質としても使用された。
単量体アミロイドβペプチドをローディングダイと混合し、熱変性させ、レーンごとに0.2μgを装填し、勾配SDS−PAGE上で分離した。ブロットを、2時間、1次抗体と共にインキュベートした。1次ヒトモノクローナル抗体またはマウス対照抗体6E10の結合を、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)で共役された2次抗ヒトまたは抗マウス抗体を使用して、示した。ブロットは、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce,Fisher Scientific,Wohlen,Switzerland)を使用して、発達させた。
組み換えヒトNI−101.11抗体を、アミロイドβペプチド調製物と共に、2時間、インキュベートした。抗体/アミロイドβ調製物をその後、神経病理学的に確認されたアルツハイマー病に罹患する患者から取得した脳切片の免疫組織化学染色のために使用した。5μmの低温切開片を調製し、室温で1時間、PBS中で4%BSA、5%ヤギ血清、および5%ウマ血清で遮断し、室温で1時間、NI−101.11/アミロイドβ調製物で染色した。洗浄ステップ後、組織切片へのヒト抗体の結合を、ヒトIgGへのCy3共役した第2抗体を使用して、分析した(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd)。蛍光分析を逆蛍光顕微鏡において実施した(Leica,Heerbrugg,Switzerland)。
ヒト脳疾患に蔓延している異常構造に対するヒト抗体の検出
表現型上は健康な対象からの抗体、またはアルツハイマー病に罹患する臨床的に異常に安定した患者を、病理学的に確認されたアルツハイマー病に罹患する患者から取得した脳切片上で免疫組織化学により試験した。図1Aは、ヒトベータアミロイドに対して公知の抗体(抗体4G8、図1B)で共染色することにより確認されるように、ベータアミロイド斑に結合する、臨床的に異常に安定した患者における抗体の存在を示す。アルツハイマー病に罹患する患者から得られた組織切片における、健康なヒト対象における神経原線維変化への抗体の存在を図2Aに示す。本結果は、ヒトタウ(HT7)に対する公知の抗体で共染色することにより確認された。図3Aは、健康なヒト対象における、アルツハイマー病に罹患する患者から得られた組織切片における、ジストロフィー性軸索に対する抗体の存在を表す。ヒトタウ(HT7)に対する公知の抗体を有する対照染色を図3Bに示す。これらの結果は、病理組織学的に確認された診断を有するヒト組織サンプルにおいて、同定可能な病理学的構造に対する、表現型上では健康な、または臨床的に異常に安定した患者の抗体における存在を実証する。
組み換えヒト抗体は、生体内の異常構造への特異性を維持し、生理学的前駆体またはその非病原性誘導体ではなく、脳アミロイド班における疾病関連ベータアミロイドタンパク質の立体構造エピトープを認識する
抗体NI−101.11、NI−101.12、NI−101.13A、およびNI−101.13Bを、認識衰退率が著しく低下した、臨床的に異常に安定したアルツハイマー病患者から得た。補正方法に指定されるように、抗体単離および組み換え生成を実施した。
組み換えNI−101.11を脳ベータアミロイド班への結合について試験した(図4)。神経病理学的に確認されたアルツハイマー病に罹患する患者から得た脳切片を、指示された濃度で染色した。50pMの濃度でベータアミロイド班に結合する抗体は、高親和性結合を示唆する。0.5nMの濃度による抗体NI−101.11のベータアミロイド班との結合は、最大1μMまでの濃度で1位〜16位を示す、線状合成N末端アミロイドβから派生されたポリペプチドの超過量の追加によって競合することができない(図5)。さらに、8nMの濃度による脳切片上でのNI−101.11のベータアミロイド班との結合は、アミロイドβ1−42原線維(4μM)の超過量により競合し、4μMの濃度の線状合成アミロイドβ1−42モノマーでは競合しなかった。これは、NI−101.11が、単量体のアミロイドβには存在しない立体構造エピトープを認識することを示唆する(図6)。
組み換えNI−101.11の、合成アミロイドβ1−42ペプチドおよび単量体アミロイドβから調製された人工アミロイド原線維への結合は、ELISAによって判定された(図8)。等しい被覆密度でELISAプレートに被覆された合成アミロイドβ原線維または単量体合成アミロイドβを、指示された濃度でNI−101.11と共にインキュベートした。人工アミロイド線維(白抜き四角)への結合は、単量体アミロイドβ(塗りつぶし四角)と比較して、100倍以上高い。アミロイドβのC末端に対する対照抗体22C4は、単量体アミロイドβ(塗りつぶし丸)に選択的に結合し、あまり線維(白抜き丸)に選択的に結合しない。これは、NI−101−10が合成アミロイドβペプチドから調製された人工アミロイド線維にも存在する立体構造エピトープを認識することを示唆する。
組み換えヒト抗体NI−101.13Aおよび13Bはを、アルツハイマー病のAPPトランスジェニックマウスモデル(Tg2576)から取得した脳切片への結合について試験した。NI−101.13AおよびNI−101.13Bは、10nMの濃度で、ベータアミロイド班の顕著な染色を生成した(図12)。合成アミロイドβ1−42ペプチドおよび単量体アミロイドβから調製された人工アミロイド線維への組み換えNI−101.13AおよびNI−101.13Bへの結合は、ELISAによって判定された。等しい被覆密度でELISAプレートに被覆された合成アミロイドβ原線維または単量体合成アミロイドβを、指示された濃度でNI−101.13AおよびNI−101.13Bと共にインキュベートした。単量体アミロイドβと比較して、人工アミロイド線維への優先的な結合が試験した両方の抗体に対して観察された。(図13)
NI−101.12
合成アミロイドβ1−42ペプチドへの組み換えNI−101.12の結合は、ELISAにより確認された(図14A)。133nMの濃度で、NI−101.12結合は超過のアミロイドβ1−42ペプチドにより競合された(図14B)。
脳ベータアミロイドに対する組み換えヒト抗体は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、血液脳関門を横断し、生体内で脳ベータアミロイド班に結合する
生体内において組み換えヒトNI−101.11抗体が、血液脳関門を横断し、脳ベータアミロイド班に結合するか否かを測定するために、トランスジェニックPS−1/APPsweアルツハイマー病モデルマウスは、1日目と3日目に150μgのNI−101.11を2回末梢注射で受けた。マウスを2回目の注射をしてから24時間後に殺処分し、PBSで還流した。脳を摘出し、脳切片をヒトIgGに対するFITC標識化抗体またはマウスモノクローナル抗体アミロイドβ抗体6E10、次いで、マウスIgGに対するFITC標識化抗体で染色し、脳ベータアミロイド班の存在を確認した。抗ヒトIgGを有するアミロイド班の強い染色は、組み換えヒトNI−101.11抗体がトランスジェニックマウスの血液脳関門を横断し、生きている動物において、脳ベータアミロイド班に結合することを示した(図15)。
ベータアミロイドに対する組み換えヒト抗体は、微小出血の頻度を増加することなく、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、異常な認知挙動を改善し、ベータアミロイド班負荷、星膠症(Astrogliosis)および小膠細胞症を低減する。
脳ベータアミロイドに対する組み換えヒト抗体は、体外への合成アミロイドβ原線維の形成を阻害する。
BV−2小グリア派生細胞によるアミロイドβ原線維の生体外でのファゴサイトーシスにおけるNI−101.11の効果
アミロイドβ原線維のFcガンマ受容体媒介ファゴサイトーシスにおけるNI−101.11の効果をBV−2小グリア派生細胞株内で研究した。BV−2細胞を、5%FBS、Pen/Step、およびグルタミンが補完されるDMEMに維持した。細胞をトリプシン処理し、120´000個のBV−2細胞/ウェルを平底24ウェルプレートにおいて、播種した。12時間後、培地を、20mMのHEPES(pH7.3)、1%BSA、10μg/mlのPen/Stepが補完される400ulのDMEM/F12/ウェルで置き換えた。100μg/mlのフコイダン、すなわち、スカベンジャー受容体の阻害剤を、実験の30分前に加えた。50μMのFITC標識化アミロイドβ原線維を、指示された濃度の抗体と共に、37℃で30分間プリインキュベートし、2回洗浄し、次いで、5分間、14´000xgで遠心分離した。本懸濁液を組織培養プレートに加えた。30分後、BV−2細胞をHBSSで2回洗浄し、非関連の線維状アミロイドβを除去した。
本発明に従って実施された上記の実験において示されるように、表現型の上では健康な、無症候性ヒト対象、ならびに、認識機能障害もしくはアルツハイマー病の診断にもかかわらず、異常に安定した臨床的疾病経過を有する患者において、驚くことには、保護および治療効果のある抗体および抗体産生B細胞を検出することが可能であった。さらに具体的には、ヒト抗体の新クラスを、検出および単離することができ、抗原から生理学的に機能的な型を識別し、それによって、免疫療法において問題がある、従来の自己細胞原性の副作用の危険性を最小化する。したがって、病理生理学的に関連のある構造において、抗原の変異体を特異的に認識する抗体および等価結合分子が提供される。その構造に、その抗体は、例えば、FcR発現マクロファージもしくは小神経膠細胞のための病原体を可視化することによって、その毒性を減退、またはその濃度を低減、またはその分解を促進する、ひいては、それを無害の状態にするために、結合することが予期される。実施例においてさらに示されるように、このような抗体は、治療効果があり、脳微小出血の頻度を増加することなく、異常病理学的タンパク質およびその凝集の有害効果の中断ならびに防止の両方を可能にする。
Claims (22)
- 内因性タンパク質の病理学的変異体に対するヒト由来組換え抗体を調製する方法であって、前記内因性タンパク質は前記病理学的変異体の病理学的タンパク質構造の存在によって特徴付けられる疾患に関連したものであり、
(a)(i)表現型上は健康な対象、または(ii)臨床的に異常に安定な前記疾患の疾病経過がある患者から得た、記憶B細胞を含む、又は該細胞に由来するサンプルを、前記疾患のヒト患者又は動物モデルに由来する、病理的に変化した細胞もしくは組織の標本に供するステップであって、前記細胞もしくは組織が前記タンパク質変異体の前記病理学的タンパク質構造を含み、前記サンプル中の抗体が前記標本へ結合する一方で健康な対象の対応する細胞または組織には結合しないことが、前記内因性タンパク質の前記疾患関連病理学的変異体に特異的な抗体が前記サンプル中に存在することの指標となるステップ、
(b)以下のステップ、即ち、
(i)前記標本へ結合する一方で健康な対象の対応する細胞または組織には結合しない抗体を含むサンプルから、IgM抗体を発現しない記憶B細胞を精製するステップと、
(ii)前記記憶B細胞から前記抗体に対する免疫グロブリン遺伝子レパートリーを取得するステップと、及び
(iii)前記レパートリーを使用して、前記抗体を発現するステップと、
によって、前記標本へ結合する一方で健康な対象の対応する細胞または組織には結合しない抗体を同定及び単離するステップと、及び
(c)前記抗体を単離するステップと、
を含み、
前記疾患は、脳の疾患であり且つ神経変性病、タンパク質の折り畳み異常、組織アミロイド症、及び病理学的タンパク質沈着に関連した他の疾病の中から選択されるものである、方法。 - 前記患者および対象は、それぞれ、ヒトである、請求項1に記載の方法。
- 前記患者は、代理マーカーの存否により、まだ明確でない前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険性があると判定されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記代理マーカーは、老齢期、脳アミロイド負荷、アポE遺伝子型、APP遺伝子型、PS1遺伝子型、アミロイドβペプチド、イソプラスタン、タウ(Tau)、およびホスホタウ(phospho−Tau)の体液におけるレベルからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記疾患は、神経疾患である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内因性タンパク質の前記変異体が、SAA(血清アミロイドタンパク質A)、AL(免疫グロブリンのkまたはl軽鎖)、AH(g1 Ig重鎖)、ATTR(トランスサイレチン、血清プレアルブミン)、AApo−A−1(アポリポタンパク質A1)、AApoA2(アポリポタンパク質A2)、AGel(ゲルゾリン)、ACys(シスタチンC)、ALys(リゾチーム)、AFib(フィブリノゲン)、ベータアミロイド(アミロイド前駆タンパク質)、タウ、アルファシヌクレイン、ベータアミロイド2M(ベータ2−ミクログロブリン)、APrP(プリオンタンパク質)、ACal(プロカルシトニン)、AIAPP(膵島アミロイドポリペプチド);APro(プロラクチン)、AIns(インシュリン);AMed(ラクタドヘリン);Aker(ケラトエプセリン);ALac(ラクトフェリン)、Abri(AbriPP)、ADan(ADanPP);またはAANP(心房性ナトリウム利尿ペプチド)、から派生する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患は、アルツハイマー病である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サンプルは、以下の基準:
(i)65歳以上であること、
(ii)十分な認知能力および良好な健康状態を有すること、
(iii)認知症の臨床的兆候がないこと、または
(iv)アルツハイマー病であり得る確立された臨床診断の存在にもかかわらず、疾病の進行が異常に遅いこと、を満たす患者から採取される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(b)(ii)は、
(ii)(A)前記記憶B細胞からmRNAを取得するステップと、
(ii)(B)ステップ(ii)(A)の前記mRNAからcDNAを取得するステップと、
(ii)(C)プライマー伸長反応を使用して、前記cDNAから前記抗体の重鎖(HC)およびκ軽鎖(LC)に対応するフラグメントを増幅するステップと、
を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記抗体が、内因性疾患関連変異体タンパク質のネオエピトープを選択的に認識することが可能であり、且つ前記タンパク質をその非疾患関連型において実質的には認識しない、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体が、IgG抗体である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体が、一本鎖Fvフラグメント(scFv)、F(ab’)フラグメント、F(ab)フラグメント、およびF(ab’)2フラグメントからなる群から選択される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 内因性タンパク質の病理学的変異体に対する抗体、もしくはその結合フラグメント、または免疫グロブリン鎖を調製する方法であって、前記内因性タンパク質は前記病理学的変異体の病理学的タンパク質構造の存在によって特徴付けられる疾患に関連したものであり、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法を含むとともに、
(a)前記抗体、もしくはその結合フラグメント、または免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチド、或いは該ポリヌクレオチドを含むベクター、を含んだ細胞を培養するステップと、
(b)前記培養物から、前記抗体、もしくは結合フラグメント、または免疫グロブリン鎖を単離するステップと、を含む、方法。 - 前記抗体、または結合フラグメントが、検出可能に標識化されている、請求項13に記載の方法。
- 前記検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、および重金属からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記抗体、または結合フラグメントが、薬剤に結合される、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体、または結合フラグメントが医薬組成物として構成され、医薬的に許容可能な担体を含む、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記医薬組成物がアルツハイマー病を治療するために有用な、有機小分子、抗アミロイドβ抗体、およびその組み合わせからなる群から選択される追加剤をさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記抗体、または結合フラグメントが診断組成物として構成され、免疫または核酸ベースの診断方法に通常使用される、試薬をさらに含む、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 中枢神経系におけるタンパク質の異常蓄積および/または沈着を特徴とする神経疾患を治療することに使用することを目的として、内因性タンパク質の病理学的変異体に対する治療上有効量の抗体を提供するための、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法であって、前記内因性タンパク質は前記病理学的変異体の病理学的タンパク質構造の存在によって特徴付けられる疾患に関連したものである、方法。
- 前記疾患は、アルツハイマー病、ダウン症、軽度認識障害、脳アミロイド血管症、血管性認知症、多発脳梗塞性認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、またはゴーシェ病からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 脳内の疾患関連タンパク質の生体内検出、もしくは疾患関連タンパク質への治療薬および/または診断用薬の標的化、対象における病理学タンパク質凝集体もしくは構造の検出、それらの形成の抑制、もしくはそれらの低減、または認知の改善、もしくは疾病に関連する認識衰退の緩徐化または回復、または病理的化合物または体液からのそれらの前駆物質の体外への抽出を目的として、内因性タンパク質の病理学的変異体に対する治療上有効量の抗体を提供するための、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法であって、前記内因性タンパク質は前記病理学的変異体の病理学的タンパク質構造の存在によって特徴付けられる疾患に関連したものである、方法。
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