DE102016114043B3

DE102016114043B3 - Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben

Info

Publication number: DE102016114043B3
Application number: DE102016114043.0A
Authority: DE
Inventors: Marius Alexander Möbius; Mario Rüdiger; Daniel Freund
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Mdtb Cell Manufacturing De GmbH
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2017-08-10
Anticipated expiration: 2036-07-30
Also published as: CA3032048A1; EP3491113A1; US11535822B2; WO2018020008A1; US20190185809A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben, die eine Inkubationskammer, mindestens eine Pumpe, mindestens einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung, mindestens einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung, optional eine Steuereinheit, optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen und optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe, das unter anderem die mechanische Dissoziation und den enzymatischen Verdau des fötalen Gewebes sowie optional eine Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen umfasst. Die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung sind besonders dazu geeignet, mesenchymale Stammzellen aus fötalen Geweben, wie Nabelschnurgewebe, Plazentagewebe oder fötalem Lungengewebe zu isolieren.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben die eine Inkubationskammer, mindestens eine Pumpe, einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung, einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung, optional eine Steuereinheit, optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen und optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe, das unter anderem die mechanische Dissoziation und den enzymatischen Verdau des fötalen Gewebes sowie optional eine Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen umfasst. Die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung sind besonders dazu geeignet, mesenchymale Stammzellen aus fötalen Geweben, wie Nabelschnurgewebe, Plazentagewebe oder fötalem Lungengewebe, zu isolieren.
Hintergrund der Erfindung
Stammzellen, insbesondere mesenchymale Stromazellen (MSCs) werden auf Grund ihrer immunmodulatorischen und die Geweberegeneration fördernden Eigenschaften erfolgreich in vielen präklinischen und klinischen Studien getestet (Heathman et al., 2015). Die überwiegende Mehrzahl der eingesetzten Zellen stammt jedoch aus dem Knochenmark (sogenannte „Bone Marrow MCSs“, BM-MSCs). Diese sind auf Grund des Spenderalters, der geringen Menge des verwertbaren Knochenmarks und der daraus resultierenden Notwendigkeit einer massiven Zellexpansion qualitativ inhomogen (Mendicino et al., 2014; Wuchter et al., 2015) und somit für die breite Anwendung im Rahmen regenerativer Therapieansätze nur sehr eingeschränkt geeignet. Um BM-MSCs zu gewinnen, muss außerdem eine invasive Maßnahme (Knochenmarkpunktion), die eine kleine Operation mit lokaler Betäubung und Sedierung umfasst, vorgenommen werden. Die Nabelschnur hingegen ist ein Abfallprodukt, aus dem fötale Stammzellen ohne diese Risiken für den Spender gewonnen werden können.
MSCs sind mesenchymale Vorläuferzellen, die in nahezu allen mesodermalen Geweben und der Nabelschnur beziehungsweise der Plazenta vorkommen. MSCs sind potent anti-inflammatorisch und stimulieren das Wachstum sowie die Regeneration verschiedener Gewebe (Gefäße, Lunge usw.). Sie können daher zur Behandlung von Erkrankungen mit überschießender entzündlicher Reaktion, beeinträchtigter Gefäßbildung und/oder daraus folgender Gewebeschädigung eingesetzt werden. Weltweit wurden bisher weit über 1.000 Patienten mit autologen oder allogenen MSCs aus verschiedenen Geweben behandelt (Lalu et al., 2012), nahezu 1.000 klinische Studien sind bereits abgeschlossen oder in Durchführung (Monsarrat et al., 2016). MSCs können zum Beispiel als Zelltherapeutika bei gestörter Funktion oder Unterfunktion der frühgeborenen Lunge eingesetzt werden (van Haaften 2009, Chang 2014). Die Verabreichung exogener MSCs führte zur Interaktion mit dem Lungengewebe und zum „bedarfsgerechten“ Sezernieren von Proteinen, kleinen Molekülen und zellulären Bestandteilen (zum Beispiel Exosomen, Mitochondrien). Die Folge ist ein Schutz der endogenen Lungenzellen sowie eine Stimulierung des Lungenwachstums (Möbius 2016).
Die Verwendung von MSCs als pharmazeutisches Produkt stellt sich jedoch problematisch dar. Keine der bislang in klinischen Studien angewandten MSC-Populationen entsprachen in ihrer Herstellung einem klassischen pharmazeutischen Produkt. Jedes Zellprodukt, jede Charge bzw. jedes Batch ist unterschiedlich und die Ergebnisse der klinischen Studien sind nicht vergleichbar. Gleiches gilt für konventionell hergestellte zellfreie Produkte, z.B. konditioniertes, aufgereinigtes Zellkulturmedium; Exosomen usw.
Zudem stellen MSCs eine inhomogene Zellpopulation dar. Die von einem Spender gewonnenen MSCs differenzieren in Kultur auf Grund verschiedener Faktoren teilweise in therapeutisch inaktive Zellen, zum Teil in transdifferenzierte Zellen und zum Teil in therapeutisch aktive Zellen. Das geerntete und bisher angewandte Zellprodukt ist eine variable Mischung aus therapeutisch aktiven, weniger aktiven bzw. nicht aktiven Zellen.
Nabelschnur MSCs stellen eine Alternative zu den MSCs aus „klassischen“ Quellen wie Knochenmark (BM-MSCs) und Fettgewebe (AT-MSCs) dar. Diese klassisch gewonnenen MSCs haben verschiedene Nachteile. So sind BM-MSCs oftmals stark expandierte Zellen älterer Spender. Der Anteil therapeutisch aktiver Zellen sowohl im Ausgangsmaterial als auch im Endprodukt ist gering. Die Isolation von MSCs aus Knochenmark und Fettgewebe ist immer mit einem invasiven Eingriff (Punktion) verbunden.
Dem gegenüber weisen MSCs aus Nabelschnur Vorteile auf. Die Nabelschnur ist eine de facto unendliche Quelle von „jungen“ MSCs. Bei der Behandlung von Herzinfarkten sind MSCs aus der Nabelschnur den BM-MSCs therapeutisch überlegen (Yannarelli et al., 2013).
Ansätze, um MSCs aus bisher verworfenen Geweben zu isolieren (unter anderem Nabelschnurgewebe), existieren (Hass et al., 2011), weisen aber Probleme auf, welche die breite Anwendung dieser MSCs verhindern. Bisherige Verfahren beruhen entweder auf der graduellen Migration oder dem Auswachsen von MSCs aus kleingeschnittenem Nabelschnurgewebe (Majore et al., 2011) oder der enzymatischen Dissoziation des mechanisch vorbehandelten Gewebes (Sarugaser et al., 2005; Tsagias et al., 2011).
Keines der konventionell angewandten Verfahren liefert eine ausreichend große Anzahl qualitativ hochwertiger MSCs für klinische Anwendungen, da die Populationsverdopplungsanzahl (population doubling number) der individuellen Zellen zu hoch ist und/oder der Verdau bzw. das nachfolgende Weiterverarbeiten des Zellproduktes nicht mit einer geschlossenen Umgebung vereinbar ist, die dem Standard der „Good Manufacturing Practice“ (GMP) gerecht wird.
Die WO 2006/094286 stellt ein Verfahren zur Isolierung von Stromazellen aus Pankreasgewebe bereit. Das Verfahren umfasst sowohl die mechanische Dissoziation als auch einen Enzymverdau des Donorgewebes aus Pankreas. Die isolierten Stromazellen aus dem Pankreas können in vitro zur Differenzierung in komplette oder teilweise differenzierte Pankreaszellen für die Transplantation in einem Patienten induziert werden. Alternativ können die isolierten Stromazellen aus Pankreas direkt in einen Patienten transplantiert werden und in vivo in die gewünschten Zelltypen differenzieren.
EP 2 433 713 stellt ein System zur Verarbeitung und Separation von Proben bereit, das eine Probenverarbeitungseinheit und eine Probentrennungseinheit aufweist. In dem in EP 2 433 713 offenbarten System erfolgt die Trennung der Proben mittels Magnetseparation. Dazu müssen biologische Materialien, wie zum Beispiel Zellen aus verschiedenen Organen und Geweben, mit einem geeigneten spezifischen Bindungsliganden magnetisch markiert werden.
WO 2015/170347 offenbart ein Verfahren zur Trennung, Anreicherung und Co-Kultur einer Mischung von fötalen Zellen, die eine oder mehrere verschiedene Arten von mesenchymalen Stammzellen enthält, die aus Plazenta, Amnion, Fruchtwasser, Chorion und Nabelschnur und/oder anderen Produkten der Empfängnis unter hypoxischen oder normoxischen Bedingungen gewonnen wurden und die für die Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen, die von angeborenen über degenerative bis hin zu malignen Erkrankungen reichen, geeignet ist.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtungen und Verfahren sind aber mit dem Nachteil behaftet, dass qualitativ hochwertige MSCs nicht in ausreichender Anzahl für klinische Anwendungen bereit gestellt werden können und dass die hergestellten Chargen von MSCs nicht den Anforderungen an die „Good Manufacturing Practice“ (GMP) gerecht werden.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht deshalb darin, eine Vorrichtung bereitzustellen, die die GMP-konforme Herstellung qualitativ hochwertiger, therapeutisch einsetzbarer Stammzellen, insbesondere MSCs aus fötalen Geweben für insbesondere regenerative und immunmodulatorische Anwendungen in der Erwachsenen- und Kindermedizin ermöglicht. Weitere Anwendungsmöglichkeiten der isolierten MSCs bestehen in der Tiermedizin, der Arzneimittelentwicklung (MSCs als in vitro Testsystem für pädiatrische oder adulte Medikamente), in der Forschung im Allgemeinen usw. Die erfindungsgemäße Vorrichtung soll insbesondere dazu geeignet sein, die MSCs aus fötalen Geweben GMP-konform und in großen Mengen bereitzustellen.
Fötales Gewebe im Sinne der vorliegenden Erfindung ist Gewebe, welches aus der befruchteten Eizelle und dem daraus entstandenen Embryoblasten plus Trophoblasten hervorgegangen ist, und sich damit vom mütterlichen Gewebe abgrenzt. Fötales Gewebe ist vorzugsweise Gewebe, welches unmittelbar nach der Geburt gewonnen wurde (i) von einem im Mutterleib verstorbenen Fetus (Totgeburt), (ii) vor dem Erreichen der extra-uterinen Lebensfähigkeit geborenen Fetus (Abort) oder (iii) Gewebe, welches von dem Neugeborenen unmittelbar nach der Geburt abgetrennt wird (insbesondere die Eihäute, die Plazenta und die Nabelschnur).
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch Bereitstellung einer Vorrichtung, die die Merkmale gemäß Anspruch 1 aufweist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben weist insbesondere

• eine Inkubationskammer,
• mindestens eine Pumpe,
• mindestens einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung,
• mindestens einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
• optional eine Steuereinheit,
• optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen, beispielsweise in einem Dichtegradienten, und
• optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen auf.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat den Vorteil, dass, verglichen zu herkömmlich verwendeten Vorrichtungen, die Isolation von Stammzellen, insbesondere MSCs, in einer deutlich höheren Ausbeute von Stammzellen, insbesondere primären MSCs resultiert. Besonders vorteilhaft ist die Vorrichtung für die Isolierung von primären MSCs aus der Nabelschnur. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können Ausbeuten, die um einen Faktor > 10 gegenüber herkömmlich verwendeten Vorrichtungen erhöht sind, erreicht werden. Resultierend daraus kann in einer kürzeren Expansionsphase ein preiswerteres sowohl quantitativ als auch qualitativ höherwertiges Zellprodukt generiert werden.
Der Inkubationsbehälter besteht vorzugsweise aus einem Material, das sterilisierbar, insbesondere autoklavierbar ist. Geeignete Materialien zum Beispiel Glas, Edelstahl oder autoklavierbare Kunststoffe.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Inkubationskammer ein heizbarer Behälter. Dies hat den Vorteil, dass der Aufschluss der fötalen Gewebe, der enzymatisch erfolgen kann, bei für die verwendeten Enzyme optimalen Temperaturen durchgeführt werden kann. Die Temperatur in der Inkubationskammer wird beispielsweise auf einen Bereich von 30 °C bis 42 °C eingestellt, vorzugsweise auf einen Bereich zwischen 35 °C und 40 °C. Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Temperatur in der Inkubationskammer auf eine Temperatur von 37 °C eingestellt wird. Diese Temperatur stellt die optimale Temperatur für Enzyme in der Gewebeaufschlusslösung dar, die humanen Ursprungs sind.
Die Temperatur in der Inkubationskammer kann mittels eines Thermostaten, einem Temperaturfühler oder Temperatursensor, der beispielsweise mit der Steuereinheit verbunden ist, geregelt werden.
Das Temperieren des Inhalts der Inkubationskammer kann auch extern mit Hilfe einer elektrischen Heizplatte erfolgen. Denkbar ist, dass die Inkubationskammer 11 doppelwandig gestaltet ist, so dass das Erwärmen des Inhalts der Inkubationskammer mittels eines flüssigen Mediums, wie zum Beispiel Wasser, und eines Thermostaten erfolgen kann. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Temperatur in der Inkubationskammer mittels eines Peltier-Elements, welches mit einer sterilisierbaren oder Einweg-Umhüllung versehen ist, regelbar ist.
In einer anderen Ausführungsform kann die Inkubationskammer auch ein nichtheizbarer Behälter sein.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Inkubationskammer eine pH-Sonde enthalten. Vorzugsweise ist die pH-Sonde mit der Steuereinheit verbunden, so dass Signale der pH-Sonde in der Steuereinheit verarbeitet werden können und dadurch Zeitpunkt und Menge der Zugabe der Spüllösung in die Inkubationskammer gesteuert werden können. Zusätzlich ermöglicht diese Ausführungsform auch die Steuerung der Zugabe weiterer Lösungen, wie etwa die Zugabe einer Waschlösung und/oder weiterer Enzymlösungen zu einem oder mehreren bestimmten Zeitpunkten.
Die Inkubationskammer ist vorzugsweise so ausgestaltet, dass es möglich ist, in der Inkubationskammer eine Atmosphäre zu erzeugen, in der der Sauerstoffgehalt abgereichert ist. Dabei wird der Sauerstoffgehalt in der Atmosphäre der Inkubationskammer auf einen Anteil im Bereich von 2–21%, vorzugsweise 2–15% oder 2–10%, besonders bevorzugt von 2–5% eingestellt. Hierfür kann die Inkubationskammer weitere Anschlüsse aufweisen, die es ermöglichen, einen Gasaustausch der Atmosphäre des Inkubationsbehälters durchzuführen.
In einer weiteren Ausführungsform enthält die Inkubationskammer ein Mittel zur Zerkleinerung des fötalen Gewebes. Das Mittel zur Zerkleinerung wird dazu benutzt, das fötale Gewebe, aus dem die Stammzellen, vorzugsweise MSCs, isoliert werden sollen, mechanisch aufzuschließen bzw. zu dissoziieren. Dies resultiert in einer Oberflächenvergrößerung des fötalen Gewebes, was wiederum einen sich anschließenden enzymatischen Aufschluss des fötalen Gewebes erleichtert, da der Zugang der verwendeten Enzyme zu dem aufzuschließenden Gewebe verbessert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel zur Zerkleinerung des fötalen Gewebes ein mechanisches Mittel, zum Beispiel ein Schneidgerät. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel zur Zerkleinerung des fötalen Gewebes ein rotierendes Messersystem. Mit dem in der Inkubationskammer enthaltenen Mittel zur Zerkleinerung ist es möglich, die mechanische Zerkleinerung des fötalen Gewebes automatisiert durchzuführen. Vorteile dieser Ausgestaltung sind eine Erhöhung der Ausbeute an den zu isolierenden Stammzellen, insbesondere primären MSCs, sowie die Vermeidung bzw. Minimierung von Kontaminationen. Ein weiterer Vorteil dieser Ausgestaltung besteht darin, dass die Reproduzierbarkeit der Isolierung von Stammzellen, insbesondere von primären MSCs, aus fötalen Geweben verbessert werden kann. Durch die automatisierte mechanische Zerkleinerung wird außerdem die GMP-Konformität der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie eines Verfahrens zur Isolierung von Stammzellen, das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird, verbessert.
Die Inkubationskammer enthält in einer weiteren Ausführungsform ein Mittel zum Durchmischen der Gewebeaufschlusssuspension, vorzugsweise ein Mittel zum Rühren der Gewebeaufschlusssuspension, insbesondere bevorzugt einen Rührer oder Rotor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Durchmischen der Gewebeaufschlusssuspension mit dem rotierenden Messersystem erreicht, das zur mechanischen Dissoziation des Gewebes benutzt wird. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Gewebeaufschlusssuspension mit Hilfe des rotierenden Messersystems in der Inkubationskammer kontinuierlich gerührt. Dadurch kann erreicht werden, dass die Substratzugänglichkeit der zum Gewebeaufschluss eingesetzten Enzyme jederzeit gewährleistet ist.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Inkubationskammer Öffnungen / Anschlüsse für Leitungen und Schläuche auf. Vorzugsweise weist die Inkubationskammer mindestens zwei Öffnungen für Anschlüsse und Leitungen auf. Die Inkubationskammer kann auch noch weitere, das heißt mehr als zwei Öffnungen / Anschlüsse für Leitungen und Schläuche aufweisen.
In einer Ausführungsform der Erfindung können über die Öffnungen / Anschlüsse eine Gewebeaufschlusslösung und/oder eine Spüllösung in die Inkubationskammer gegeben werden.
Die Gewebeaufschlusslösung enthält vorzugsweise ein Enzymgemisch, bevorzugt ein Gemisch von Enzymen, besonders bevorzugt Enzyme eukaryotischen Ursprungs, insbesondere bevorzugt Enzyme, die frei von potentiellen Kontaminationen durch tierische Produkte (sog. „animal origin free“ (AoF) Enzyme bzw. Produkte) sind. Solche AoF-Enzyme können zum Beispiel als chromatographisch aufgereinigtes Fermentationsprodukt aus, beispielsweise gentechnisch veränderten Mikroorganismen, industriell gewonnen werden. Ganz besonders bevorzugt sind rekombinante Enzyme humanen Ursprungs.
Vorzugsweise wird der enzymatische Verdau mit einem Enzymgemisch durchgeführt, wobei die Zusammensetzung des Enzymgemisches speziell an die extrazelluläre Matrixzusammensetzung des fötalen Gewebes angepasst ist. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Zusammensetzung des Enzymgemisches speziell an die extrazelluläre Matrixzusammensetzung von Nabelschnurgewebe angepasst ist.
Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Gewebeaufschlusslösung ein Gemisch aus den Enzymen Hyaluronidase und/oder neutraler Protease und/oder Collagenase und/oder DNAse enthält.
Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn die Gewebeaufschlusslösung ein Enzymgemisch aus Collagenase, Hyaluronidase und einer DNAse aufweist. Ebenfalls ganz besonders bevorzugt ist es, wenn die Gewebeaufschlusslösung ein Enzymgemisch aus Collagenase, neutraler Protease und einer DNAse enthält.
Die in der Gewebeaufschlusslösung verwendete DNAse ist vorzugsweise DNAse I, zum Beispiel Pulmozyme (Roche Diagnostics). Die in der Gewebeaufschlusslösung verwendete DNAse dient der Viskositätsminderung, was zu einer optimalen Separation von Zielzellen (beispielsweise primären MSCs) und Verunreinigungen in einer nachfolgenden Dichtegradiententrennung führt. Besonders bevorzugt ist es, wenn in der Gewebeaufschlusslösung Enzyme eingesetzt werden, die frei von tierischen Verunreinigungen sind.
Die in der Gewebeaufschlusslösung verwendete Collagenase ist zum Beispiel Collagenase NB IV/VI (SERVA Electrophoresis).
Weitere Bestandteile der Gewebeaufschlusslösung sind chemisch definierte Pufferlösungen oder chemisch definierte Kulturmedien, wie beispielsweise Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) oder Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Diese können zusätzlich mit spezifischen Salzen und chemisch definierten Stoffen (Cofaktoren bzw. Cosubstraten) versetzt sein, um in ihrer Zusammensetzung den enzymatischen Verdau bestmöglich zu unterstützen und die einzusetzende Enzymmenge so gering wie möglich zu halten. Weiterhin sollten Substrate für den aeroben oder anaeroben Stoffwechsel der Zellen enthalten sein, bevorzugt Glucose oder Natrium-Pyruvat. Die Pufferlösung sollte bevorzugt ein CO₂-unabhängiges Puffersystem enthalten (z.B. HEPES oder Natriumbiphosphat).
In einer alternativen Ausführungsform könnten auch normale, bereits GMP-konforme (CO₂-gepufferte) Medien, wie DMEM, verwendet werden. In dieser alternativen Ausführungsform ist allerdings die Kontrolle der CO₂ Konzentration in der Inkubationskammer zusätzlich zur Kontrolle der O₂ Konzentration notwendig.
Die Spüllösung dient der Neutralisation bzw. dem Umpuffern sowie der Viskositätsverringerung der Zellsuspension nach mechanischer Zerkleinerung und nach dem enzymatischen Gewebeverdau. Die Spüllösung ist vorzugsweise eine chemisch definierte Pufferlösung oder ein chemisch definiertes Kulturmedium, wie beispielsweise Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) oder Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM).
In einer weiteren Ausführungsform weist die Inkubationskammer mindestens einen Auslass auf. Die Inkubationskammer kann auch mehrere Auslässe aufweisen. Der mindestens eine Auslass dient dazu, die nach der mechanischen Dissoziation und dem enzymatischen Verdau erhaltene Gewebeaufschlusssuspension in andere Behälter oder andere Bestandteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu übertragen.
Solch ein weiterer Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann zum Beispiel ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung deshalb eine Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben bereit, wobei die Vorrichtung

– eine Inkubationskammer,
– mindestens eine Pumpe,
– einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung,
– einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
– optional eine Steuereinheit,
– ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten, und
– optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen

Das Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten kann zum Beispiel eine Zentrifuge sein. Geeignet hierfür ist jeder herkömmliche Typ von Zentrifugen, die dazu geeignet sind, eine Dichtegradientenzentrifugation durchzuführen. Vorzugsweise wird die Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung eines Saccharose–Epichlorhydrin-Copolymers durchgeführt, das Beispielsweise unter dem Markennamen Ficoll^®, Histopaque^® oder Polysucrose^® erhältlich ist. Diese Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung hat den Vorteil, dass für die spätere Expansion eine sehr homogene Ausgangspopulation an Stammzellen, insbesondere primären MSCs, bereitgestellt werden kann, da Verunreinigungen, wie Endothelzellen, Epithelzellen und Blutzellen in der Dichtegradientenzentrifugation abgetrennt werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Vorrichtung kein Mittel zur Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten auf.
In einer weiteren Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Vorrichtung ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen, insbesondere von primären MSCs auf.
Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird deshalb eine Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben bereitgestellt, wobei die Vorrichtung

– eine Inkubationskammer,
– mindestens eine Pumpe,
– mindestens einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung,
– mindestens einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
– optional eine Steuereinheit,
– optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten, und
– ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen

Das Mittel zur Expansion der Stammzellen, insbesondere primären MSCs kann beispielsweise ein Mittel zur Adhärenzanreicherung sein. Solch ein Mittel zur Adhärenzanreicherung stellt typischerweise eine Kulturoberfläche für die isolierten Zellen bereit, auf der die isolierten Zellen aufwachsen und sich vermehren können. Vorzugsweise ist diese Kulturoberfläche eine Kunststoffoberfläche. Ein Mittel zur Adhärenzanreicherung ist zum Beispiel das HYPERStack^® System (Corning). Alternativ kann die Adhärenzanreicherung der isolieren Zellen in einem Bioreaktor erfolgen, wobei der Bioreaktor Kügelchen (Beads) enthält und die Kulturoberfläche für die isolierten Zellen von den Kügelchen bereitgestellt wird. Vorzugsweise wird die Adhärenzanreicherung der isolierten Zellen in selektiven Medien für Stammzellen, insbesondere primäre MSCs, durchgeführt. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Expansion der isolierten Stammzellen, insbesondere primäre MSCs, in einem Kulturmedium durchgeführt wird, das Zusatzstoffe enthält, die spezifisch das Wachstum von Stammzellen, insbesondere der primären MSCs, unterstützen. Das Kulturmedium für die Expansion der isolierten Stammzellen ist außerdem vorzugsweise chemisch definiert, frei von potentiellen Kontaminationen durch tierische Produkte (AoF) und GMP-konform. Solche Zusatzstoffe können beispielsweise humanes Blutplättchen-reiches Plasma oder humanes Blutplättchenlysat sein.
Das Mittel zur Adhärenzanreicherung der isolierten Stammzellen, insbesondere der isolierten primären MSCs, ist vorzugsweise mit einem Schlauch mit dem Auslass der Inkubationskammer für den Gewebeaufschluss verbunden. Vorzugsweise erfolgt also die Verbindung des HYPERStack^® Systems mit dem Inkubationsbehälter über einen Schlauch. Durch diese Ausgestaltung kann sichergestellt werden, dass der Aufschluss von fötalen Geweben bis hin zur Expansion der isolierten Zellen in einem geschlossenen System erfolgen kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind auch der Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung und/oder der Vorratsbehälter für die Spüllösungen mittels Schläuchen über Öffnungen / Anschlüsse mit dem Inkubationsbehälter verbindbar.
Die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltene mindestens ein Pumpe, vorzugsweise zwei, drei oder mehr Pumpen, je nach den Anforderungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung, können jede Art von herkömmlich erhältlichen Pumpen sein. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltenen Pumpen Peristaltikpumpen sind. Besonders bevorzugt ist es also, wenn die Gewebeaufschlusslösung aus dem entsprechenden Vorratsbehälter und/oder die Spüllösung aus dem entsprechenden Vorratsbehälter mittels je einer separaten Peristaltikpumpe in den Inkubationsbehälter eingefüllt werden können. Ebenso bevorzugt ist es, wenn die Gewebeaufschlusssuspension nach erfolgter mechanischer Zerkleinerung und enzymatischem Verdau mittels einer Peristaltikpumpe in entweder das nachgelagerte Mittel zur Abtrennung von Verunreinigungen im Dichtegradienten, zum Beispiel eine Dichtegradientenzentrifuge, und/oder in das nachfolgende Mittel zur Adhärenzanreicherung, zum Beispiel ein HYPERStack^® Gefäß oder einen Bead-basierten Bioreaktor übertragen werden können. Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, dass die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltenen Pumpen keinen direkten Kontakt mit den in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltenen Flüssigkeiten haben. Damit wird sichergestellt, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung ein komplett geschlossenes System zur Isolierung von Stammzellen, insbesondere primären MSCs, darstellt.
Die Dichtegradientenzentrifuge kann beispielsweise nach dem Prinzip einer Peeler-Zentrifuge arbeiten oder kann eine kontinuierlich laufende Zentrifuge sein (z.B. eine modifizierte, langsam laufende CEPA-Zentrifuge, Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die erfindungsgemäße Vorrichtung also ein geschlossenes System dar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Vorrichtung als geschlossenes System desinfizierbar oder sterilisierbar, zum Beispiel autoklavierbar.
In einer alternativen Ausführungsform ist die Vorrichtung ganz oder teilweise als prästerilisiertes Einwegsystem zur einmaligen Verwendung ausgestaltet. Insbesondere die Schläuche und Vorratsbehälter, gegebenenfalls auch die Inkubationskammer, und das HYPERStack^® System sind dazu geeignet, als prästerilisiertes Einwegsystem ausgestaltet zu sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass sie keine Mittel zur Magnetseparation von Zielzellen (Stammzellen, insbesondere MSCs) und Verunreinigungen, wie zum Beispiel Endothelzellen, Blutzellen oder Epithelzellen, enthält.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben ein geschlossenes System, dass

– eine Inkubationskammer,
– einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung,
– eine Pumpe, insbesondere eine Peristaltikpumpe, zur Übertragung der Gewebeaufschlusslösung in die Inkubationskammer,
– einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
– eine Pumpe, insbesondere eine Peristaltikpumpe, für die Übertragung der Spüllösung in die Inkubationskammer,
– ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten, vorzugsweise eine Dichtegradientenzentrifuge,
– und/oder ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen

In dieser Ausführungsform sind der Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung, der Vorratsbehälter für die Spüllösung und das Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen im Dichtegradienten und/oder das Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen über autoklavierbare Schläuche oder vorzugsweise über Einwegschläuche mit der Inkubationskammer verbunden.
Diese Ausgestaltung als geschlossenes System hat zahlreiche Vorteile. Die Zellernte und Zellausbeute ist im Vergleich zu herkömmlichen, offenen Systemen und Verfahren (SERVA, Miltenyi Biotec) deutlich verbessert. Mit diesem geschlossenen System kann ein geschlossenes und automatisiertes Isolationsverfahren der Stammzellen, insbesondere primären MSCs, durchgeführt werden. Manuelle Tätigkeiten an diesem geschlossenen System können auf ein Minimum reduziert werden. Im Falle der Isolierung von primären MSCs wird eine sehr hohe initiale Menge an MSCs durch einen besonders effizienten Gewebeverdau, insbesondere bei Verwendung von Nabelschnurgewebe, erzielt. Das so gestaltete komplett geschlossene System ermöglicht außerdem den Einsatz bzw. Anschluss eines ebenfalls geschlossenen Systems zur Expansion der Zellen (beispielsweise HYPERStack^®, Corning). Da auf Grund der Geschlossenheit des Systems jeglicher Kontakt der Anwender mit den isolierten Zellen vermieden werden kann, ist das Risiko der Kontamination stark reduziert. Letztlich ist die erfindungsgemäße Vorrichtung, insbesondere wenn sie als geschlossenes System ausgeführt ist, besonders vorteilhaft, da sie hohe Mengen an jungen, gering expandierten Zellen für klinische Anwendungen bereitstellen kann.
Optional kann die erfindungsgemäße Vorrichtung weiterhin eine Steuereinheit enthalten. Diese Steuereinheit ist optional von der erfindungsgemäßen Vorrichtung abkoppelbar, insbesondere wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung als geschlossenes System desinfiziert oder sterilisiert, wie zum Beispiel autoklaviert, werden soll oder als geschlossenes System mit teilweise sterilisierbaren Komponenten (Isolationskammer, Zerkleinerungseinrichtung usw.) und teilweise als Einweg-Produkt ausgeführten Komponenten, wie zum Beispiel Schläuchen und Beutelsystemen, die steril vor Beginn der Isolation der MSCs zu einem geschlossenen System verbunden werden können, verwendet werden soll.
Die Steuereinheit kann ein Prozessrechner sein oder ein konventionell erhältliches Computersystem, wie zum Beispiel ein Laptop oder ein Personalcomputer. Es ist auch möglich, dass die Steuereinheit ein Smartphone oder ein Tablet-Computer ist. In diesem Fall ist die Steuereinheit vorzugsweise drahtlos (zum Beispiel über WLAN oder Bluetooth^®) mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verbunden. Die Steuereinheit dient dazu, alle notwendigen Prozesse in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu steuern und zu regeln, bzw. die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen Vorrichtung anzusteuern. So kann mittels der Steuereinheit, vorzugsweise mittels einer auf der Steuereinheit installierten Prozesssoftware, die Drehzahl des rotierenden Messersystems für die mechanische Dissoziation des fötalen Gewebes geregelt werden. Das rotierende Messersystem arbeitet beispielweise bei einer Drehzahl im Bereich von 1.000 bis 10.000 min^–1, vorzugsweise im Bereich von 1.000 bis 9.000 min^–1, 1.000 bis 8.000 min^–1, 1.000 bis 7.000 min^–1, 1.000 bis 6.000 min^–1, 1.500 bis 5.000 min^–1 oder 1.500 bis 4.000 min^–1, besonders bevorzugt im Bereich von 2.000 bis 3.000 min^–1. Mit der Steuereinheit kann außerdem die Temperatur in der Inkubationskammer während des Gewebeaufschlusses gesteuert werden. Die Steuereinheit kann auch die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltenen Pumpen ansteuern. So ist es zum Beispiel möglich, dass Zeitpunkt und Menge der Zugabe der Gewebeaufschlusslösung aus dem entsprechenden Vorratsbehälter bzw. Zeitpunkt und Menge der Zugabe der Spüllösung durch die Steuereinheit geregelt werden. Auch die Pumpen, die die Gewebeaufschlusssuspension nach mechanischer Dissoziation und enzymatischem Verdau in eine nachfolgende Dichtegradientenzentrifuge und/oder ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen befördern, können mittels der Steuereinheit gesteuert bzw. geregelt werden.
Das fötale Gewebe, das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verarbeitet werden kann, ist beispielsweise ausgewählt aus Nabelschnurgewebe, Plazentagewebe, fötalem Lungengewebe usw.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung fötales Gewebe aus Nabelschnur verarbeitet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Stammzellen, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung isoliert werden können, mesenchymale Stammzellen, wie zum Beispiel mesenchymale Stammzellen, die aus den zuvor genannten Geweben isoliert werden können. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den mesenchymalen Stammzellen um MSCs aus Nabelschnurgewebe.
Die Isolierung der Stammzellen aus fötalen Geweben mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann im Batch-Verfahren oder in kontinuierlichen Verfahren erfolgen. Vorzugsweise wird die Isolierung der Stammzellen, insbesondere von MSCs, mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Batch-Verfahren durchgeführt, wobei pro Batch jeweils eine ganze Nabelschnur als Ausgangsprodukt für die Isolierung der Stammzellen eingesetzt wird. Ein Produktbatch (isolierte und/oder expandierte Stammzellen) besteht dann jeweils aus den Stammzellen, insbesondere primären MSCs, die aus einer Nabelschnur isoliert wurden und ggf. danach expandiert worden sind.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus anderen fötalen und/oder adulten Geweben.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe bereit, das speziell an die erfindungsgemäße Vorrichtung, und insbesondere deren Ausführung als geschlossenes System, adaptiert ist.
In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Stammzellen, insbesondere primären MSCs aus fötalem Gewebe folgende Schritte:

a. mechanische Dissoziation des fötalen Gewebes,
b. enzymatischer Verdau des fötalen Gewebes,
c. optional Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen, und
d. optional Expansion der isolierten Stammzellen, insbesondere der primären MSCs.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die mechanische Dissoziation und der enzymatische Verdau gleichzeitig in der Inkubationskammer der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden können.
Zum enzymatischen Verdau des fötalen Gewebes kommt vorzugsweise ein Enzymgemisch zum Einsatz, das bereits oben für die erfindungsgemäße Vorrichtung beschrieben worden ist.
Vorzugsweise wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Inkubationskammer der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Mischung zum enzymatischen Verdau kontinuierlich gerührt und/oder erwärmt.
In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in einer Sauerstoff-abgereicherten Atmosphäre, die beispielsweise eine Sauerstoffkonzentration im Bereich von 2–21%, vorzugsweise 2–15% oder 2–10%, besonders bevorzugt von 2–5% enthält, durchgeführt. Dadurch kann oxidativer Stress für die normalerweise in hypoxischen Kompartimenten residierenden Stammzellen, insbesondere primäre MSCs, die isoliert werden sollen, vermieden werden. Dadurch kann die Qualität des Zellprodukts nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich erhöht werden. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Isolation spezieller Zellen, wie z.B. adulter Lungenzellen, ist es vorteilhaft, die Sauerstoffkonzentration in der Atmosphäre der Inkubationskammer auf 21% einzustellen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren nach der Expansion der Stammzellen weiterhin das Ernten des Kulturüberstands. Der Kulturüberstand kann nachfolgend verarbeitet und als therapeutisches zellfreies Produkt verwendet werden.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, dass das so erhaltene Produkt (Kulturüberstand) mittels herkömmlicher Filtrations- und Dialysetechniken inline konzentriert wird. Dies hat den Vorteil, dass mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren auch zellfreie Produkte, z.B. konditioniertes, aufgereinigtes Zellkulturmedium; Exosomen usw. GMP-konform hergestellt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch das Ernten der Stammzellen, insbesondere der primären MSCs.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe die Schritte

a. Entnehmen einer Probe aus fötalem Gewebe,
b. mechanische Dissoziation des fötalen Gewebes,
c. enzymatischer Verdau des fötalen Gewebes,
d. optional Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen, und
e. optional Expansion der isolierten Stammzellen,
f. optional inline Konzentrierung des Kulturüberstands nach der Ernte der expandierten Zellen

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von drei Figuren und einem Ausführungsbeispiel erläutert.
1 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 als geschlossenes System. Die Vorrichtung umfasst eine Inkubationskammer 11 mit Deckel 28, einen Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung 12 und einen Vorratsbehälter für die Spüllösung 13. Die Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung 12 und die Spüllösung 13 sind jeweils über Schläuche 20 und die Anschlüsse 16 und 17 mit der Inkubationskammer 11 verbunden. Die Gewebeaufschlusslösung kann mittels der Peristaltikpumpe 14 aus dem Vorratsbehälter 12 in die Inkubationskammer 11 befördert werden. Die Spüllösung kann aus dem Vorratsbehälter 13 mittels der Peristaltikpumpe 15 in die Inkubationskammer 11 eingefüllt werden. Die Inkubationskammer 11 enthält ein rotierendes Schneidmesser 21 zur mechanischen Dissoziation des fötalen Gewebes. Die Temperatur in der Inkubationskammer 11 kann mittels eines elektrischen Heizstabes 24 und einem Temperatursensor 23 geregelt werden. Alternativ kann die Temperatur in der Inkubationskammer auch mittels eines Peltier-Elements, welches mit einer sterilisierbaren oder Einweg-Umhüllung versehen ist, geregelt werden. Der pH-Wert der Gewebeaufschlusslösung in der Inkubationskammer 11 kann mittels der optionalen pH-Sonde 22 überwacht werden. Die Inkubationskammer 11 verfügt weiterhin über einen Auslass 18 der über Schläuche 20 mit einem HYPERStack^® System der Fa. Corning zur nachfolgenden adhärenten Zellexpansion verbunden ist. Nach erfolgter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Verdau kann die Gewebeaufschlusssuspension mittels der Peristaltikpumpe 19 aus der Inkubationskammer 11 in das HYPERStack^® System 25 überführt werden. Die Vorrichtung 10 kann mit einem Smartphone oder Tablet-PC 29 als Steuereinheit gesteuert werden. Diese Steuereinheit kann beispielsweise drahtlos mit der Vorrichtung 10 verbunden sein.
Die 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung, die, wie in 1, als geschlossenes System ausgeführt ist. Im Unterschied zu der Ausführungsform in 1 enthält die Vorrichtung gemäß 2 eine Dichtegradientenzentrifuge 26 anstelle des HYPERStack^® Systems 25.
Alternativ kann die erfindungsgemäße Vorrichtung auch eine Dichtegradientenzentrifuge 26 und ein HYPERStack^® Systems 25 enthalten.
3 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung als geschlossenes System, wie in 1 gezeigt. Im Unterschied zu 1 wird die Temperatur in der Inkubationskammer 11 mittels einer Heizplatte 27 anstelle eines elektrischen Heizstabes 24 eingestellt. Alternativ kann die Temperatur in der Inkubationskammer auch mittels eines Peltier-Elements, welches mit einer sterilisierbaren oder Einweg-Umhüllung versehen ist, geregelt werden.
Die Vorrichtung 10 kann mit einem PC 30 als Steuereinheit gesteuert werden, wobei PC 30 und Vorrichtung 10 beispielsweise über das Kabel 31 kabelgebunden sind.
Ausführungsbeispiel: Isolation eines Batches primärer MSCs aus einer Nabelschnur
Ein Batch MSCs wurde aus einer Nabelschnur mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem Verfahren gemäß der Erfindung gewonnen. Dazu erfolgte zunächst die kontrollierte Lagerung der Nabelschnur bis zum Transport zur erfindungsgemäßen Vorrichtung 10. Die Lagerung erfolgte bei einer Temperatur von 4°C und in einem spezifischen Medium, dass zusammengesetzt war aus einer Citrat-Phosphat-Dextrose-Adenin Lösung (CPDA1) und PBS (CDPA1/PBS).
Der Transport zur erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 erfolgte ebenfalls unter kontrollierten Bedingungen bei einer Temperatur von 4°C im Medium CPDA1/PBS.
Die Isolation der MSCs aus der Nabelschnur wurde dann in der erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 durchgeführt. Dazu wurde die ganze Nabelschnur in den Inkubationsbehälter 11 gegeben, der mit dem Deckel 28 verschlossen wurde. Die gesamte Vorrichtung 10 wurde vor der Durchführung der MSC-Isolation sterilisiert. Der mechanische Aufschluss der Nabelschnur erfolgte nach Schließen des Deckels 28 in der Inkubationskammer 11 mittels dem rotierenden Messersystem 21 automatisch.
Anschließend erfolgte die enzymatische Dissoziation mit einem AoF-Enzymgemisch, das rekombinante Collagenase, Hyaluronidase und DNAse eukaryotischen Ursprungs enthielt. Bei der DNAse handelte es sich um Pulmozyme (Roche Diagnostics). Bei der verwendeten Collagenase handelte es sich um Collagenase NB IV/VI (SERVA Electrophoresis). Die Gewebeaufschlusslösung (50 ml) enthielt weiterhin Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). In der Gewebeaufschlusslösung waren außerdem Glukose und HEPES enthalten. Die Gewebeaufschlusslösung wurde aus dem Vorratsbehälter 12 mittels Peristaltikpumpe 14 über den Einlass 16 in die Inkubationskammer 11 eingebracht.
Nach der enzymatischen Dissoziation, die für 3 h durchgeführt wurde, erfolgte eine Dichtegradientenseparation in einer CEPA-Zentrifuge (Carl Padberg, Zentrifugenbau GmbH) 26. Hierzu wurde die Inkubationskammer 11 zunächst durch Einleiten von 50 ml Spüllösung (Dulbeccoo’s Phosphate Buffered Saline (PBS)) aus dem Vorratsbehälter 13 mittels der Peristaltikpumpe 15 gespült. Über den Auslass 18 und mittels der Peristaltikpumpe 19 wurde die Gewebeaufschlusslösung dann über die Schläuche 20 in die Dichtegradientenzentrifuge 26 übertragen. Die Dichtegradientenzentrifugation wurde unter Verwendung von Ficol^® Röhrchen durchgeführt. Nach Durchführung der Dichtegradientenseparation erfolgte die Übertragung und Aussaat der Primärkultur in ein geschlossenes Zellkultursystem der Firma HYPERStack^® (Corning) 25. Die Ausbeute vor Expansion der Zielzellen betrug ca. 1 × 10⁶ Zellen pro Nabelschnur. Die anschließende Zellexpansion, notwendige Medienwechsel und die Zellernte erfolgte mit AoF-Reagenzien in dem geschlossenen System der Vorrichtung 10. Es waren insgesamt nur zwei Passagen nötig, um eine Zielzellzahl von 1 × 10⁹ Zellen zu erreichen. Nach der Zellernte erfolgte die Kryokonservierung. Zur Qualitätsprüfung wurden eine Sterilitätsprüfung, eine FACS–Analyse und ein Wirksamkeitstest (Potency-Assay) durchgeführt.
Die Zielzellen des so aufgebarbeiteten MSC-Batches tragen die Oberflächenmarker CD73, CD90 und CD105, tragen aber nicht die Oberflächenmarker CD14, CD34 und CD45. Mit der mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 durchgeführten Aufreinigung eines Batches MSCs aus einer Nabelschnur konnte eine Reinheit von größer als 95 % der Zielzellen erreicht werden, die die Oberflächenmarker CD73, CD90 und CD105 tragen. Weniger als 2 % der aufgereinigten Zellen trugen die unterwünschten Marker CD14, CD34 und CD45.

Die nachfolgende Tabelle veranschaulicht den Herstellungsprozess eines Batches MSCs aus Nabelschnurgewebe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

	Erfindung	Stand der Technik
Gewinnung Ausgangsmaterial (Nabelschnur)	kontrollierte Lagerung bis zum Transport (spezif. Temperatur und spezif. Medium)	unkontrollierte Lagerung / nicht spezifiziert
Gewinnung Ausgangsmaterial (Nabelschnur)	kontrollierter Transport zur Aufarbeitung (spezif. Temperatur und spezif. Medium)	unkontrollierter Transport / nicht spezifiziert

Isolation der MSC aus der Nabelschnur	Automatische, mechanische Dissoziation	manuelle Bearbeitung durch z.B. einritzen der Oberfläche bzw. manuelle Dissoziation
	enzymatische Dissoziation mit spezif. AoF-Enzymcocktail
	Dichtegradientenseparation mit spezif. Separationsmedium	-
	Aussaat Primärkultur in geschlossenem Zellkultursystem	Ausplattieren der Gewebestücke in Petrischalen (offenes System)

Expansion	Zellexpansion, Mediumwechsel und Zellernte mit AoF-Reagenzien in komplett geschlossenem System	Zellexpansion, Mediumwechsel und Zellernte teilweise mit Kälberserum und Trypsin in offenem System
Expansion
	geringe Anzahl von Passagen nötig (< P3), um Zielzellzahl von 1 × 10^9 Zellen zu erreichen	deutlich mehr Passagen nötig (> P5), um Zielzellzahl von 1 × 10^9 Zellen zu erreichen

Kryokonservierung	Kryokonservierung	Kryokonservierung

Qualitätsprüfung	Sterilitätsprüfung	Sterilitätsprüfung
	FACS-Analyse mit erweitertem Panel	FACS-Analyse mit Standard-Panel
	Potency-Assay	-

Ausbeute	ca. 1 × 10^6 Zellen/Nabelschnur	ca. 1 × 10^5 Zellen/Nabelschnur
Reinheit CD73+, CD90+, CD105+	> 95%	> 80%
Reinheit CD14–, CD34–, CD45–	< 2%	< 10%

Bezugszeichenliste

10: Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben
11: Inkubationskammer
12: Vorratsbehälter für Gewebeaufschlusslösung
13: Vorratsbehälter für Spüllösung
14: Peristaltikpumpe zum Pumpen der Gewebeaufschlusslösung
15: Peristaltikpumpe zum Pumpen der Spüllösung
16: Anschluss für die Gewebeaufschlusslösung
17: Anschluss für die Spüllösung
18: Auslass
19: Peristaltikpumpe zum Pumpen der Gewebeaufschlusssuspension
20: Schläuche
21: rotierendes Messersystem
22: pH-Sonde
23: Temperatursensor
24: elektrischer Heizstab oder Peltier-Element
25: HYPERStack^® System
26: Dichtegradientenzentrifuge
27: elektrische Heizplatte
28: Deckel
29: Smartphone, Tablet-PC
30: PC
31: Kabel

Referenzen

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Claims

Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben, dadurch charakterisiert, dass die Vorrichtung – eine Inkubationskammer, – mindestens eine Pumpe, – mindestens einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung, – mindestens einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung, – optional eine Steuereinheit, – optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen, beispielsweise in einem Dichtegradienten, und – optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationskammer ein heizbarer oder ein nicht heizbarer Behälter ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationskammer ein Mittel zur Zerkleinerung des fetalen Gewebes aufweist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Zerkleinerung des fetalen Gewebes ein Schneidgerät, zum Beispiel ein rotierendes Messersystem, ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten eine Zentrifuge ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationskammer Öffnungen/Anschlüsse für Leitungen und Schläuche aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass über die Öffnungen/Anschlüsse die Gewebeaufschlusslösung und/oder die Spüllösung in die Inkubationskammer gegeben werden können.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationskammer mindestens einen Auslass aufweist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeaufschlusssuspension über den Auslass in andere Behälter übertragen werden kann.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein geschlossenes System darstellt, das optional sterilisierbar ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Pumpe eine Peristaltikpumpe ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung und/oder der Vorratsbehälter für die Spüllösung über die Öffnungen/Anschlüsse durch Schläuche mit dem Inkubationsbehälter verbunden sind.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Auslass durch Schläuche mit dem Mittel für die Expansion der isolierten Zellen verbunden ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur inline-Konzentrierung des Kulturüberstand nach dem Ernten der expandierten Zellen enthält.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das fötale Gewebe ausgewählt ist aus Nabelschnurgewebe, Plazentagewebe, Gewebe aus den Eihäuten und fötalem Lungengewebe.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das fötale Gewebe mindestens eine ganze Nabelschnur ist.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen mesenchymale Stammzellen sind.
Verwendung der Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Isolierung von Stammzellen, insbesondere mesenchymalen Stammzellen, aus fötalem Gewebe.
Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Schritte a. Entnehmen einer Probe aus fötalem Gewebe, b. mechanische Dissoziation des fötalen Gewebes, c. enzymatischer Verdau des fötalen Gewebes, d. optional Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen, und e. optional Expansion der isolierten Stammzellen, f. optional inline Konzentrierung des Kulturüberstands nach dem Ernte der expandierten Zellen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das gesamte Verfahren in einem geschlossenen System durchgeführt wird.
Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 oder Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass zellfreie Produkte, wie beispielsweise konditioniertes, aufgereinigtes Zellkulturmedium oder Exosomen, gewonnen werden.