JP5952309B2 - Ｅｘｏｓｏｍｅ検出用モノクローナル抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、Ｅｘｏｓｏｍｅを検出する抗体のセットに関する。より詳しくは、Ｅｘｏｓｏｍｅ表面の特定抗原（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）に対するモノクローナル抗体又はその抗体断片、該モノクローナル抗体又はその抗体断片を含有するセット、該モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いてＥｘｏｓｏｍｅ由来のｍｉＲＮＡを検出する方法、該セットと被検者由来の生体試料との複合体を測定する方法、該セットを用いる癌又は免疫系疾患の診断方法及び該方法を実施するためのキット、ならびに該セットを用いる抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価方法及び該方法を実施するためのキットに関する。
Ｅｘｏｓｏｍｅは、生体内の体液中に存在する小胞顆粒である。Ｅｘｏｓｏｍｅ表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られている。一方、Ｅｘｏｓｏｍｅ内部には、サイトカインなど各種タンパク質以外に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも分かってきた。また、Ｅｘｏｓｏｍｅは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることが報告されており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役として機能し生理現象と関連することや、癌などの疾患との関連性が注目されている。
例えば、非特許文献１では、卵巣癌患者の循環血中のＥｘｏｓｏｍｅを腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭの抗体を用いて分離し、該Ｅｘｏｓｏｍｅ由来のｍｉＲＮＡ発現量と卵巣癌患者との間に関連性が見出されたことが報告されている。よって、癌などの疾患に関連したＥｘｏｓｏｍｅの量的な変化が簡便に捉えられれば、Ｅｘｏｓｏｍｅの診断薬への応用が期待できる。
また、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１は、テトラスパニンファミリーに属する４回膜貫通型の膜タンパク質であり、多くのＥｘｏｓｏｍｅ上に発現する。例えば、非特許文献２では、メラノーマ患者の血漿中のＥｘｏｓｏｍｅをＣＤ６３の抗体や、腫瘍関連マーカーのＣａｖｅｏｌｉｎ−１の抗体で検出、定量化し、健常者に比べて上昇していることを報告している。特許文献１では、遠心後の血漿サンプルに、ＣＤ６３抗体や種々の膜タンパク質に対する抗体等を組み合わせて反応させることで、癌患者におけるＥｘｏｓｏｍｅに由来するシグナルを定量して、解析している。
ＷＯ２０１０／０６５９６８号パンフレット
Ｄ．Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．、２００８、１１０、ｐ１３−２１ Ｍ．Ｌｏｇｏｚｚｉ，ｅｔ ａｌ．、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２００９、４、ｐ１−１０
抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体及び抗ＣＤ８１抗体として、種々の抗体が販売されている。これらの市販抗体は、ＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１を発現する細胞を直接免疫することにより結果として得られた抗体の一つであり、設計した特定抗原により免疫を行って得られた抗体ではない。そのため、感度、特異性の点で未だ十分ではなく、迅速かつ簡便に、しかも正確かつ精度よくＥｘｏｓｏｍｅを検出するために、さらなる技術の開発が必要である。
本発明の課題は、生体内Ｅｘｏｓｏｍｅを良好な感度及び特異性で検出又は捕捉することができるモノクローナル抗体又はその抗体断片、該モノクローナル抗体又はその抗体断片を含有するセット、該セットと被検者由来の生体試料との複合体を測定する方法、該セットを用いる癌又は免疫系疾患の診断方法、ならびに該セットを用いる抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｅｘｏｓｏｍｅ上のＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１の特定配列に対するモノクローナル抗体を調製して用いることにより、生体内Ｅｘｏｓｏｍｅを良好な感度及び特異性で検出及び捕捉することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の＜１＞〜＜１２＞に関する。
＜１＞ 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１９として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ９−１２Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１１３〜１９５を認識し、ＣＤ９に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２０として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−８Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、及び
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２１として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片
からなる群より選ばれる、Ｅｘｏｓｏｍｅ検出又は捕捉用モノクローナル抗体。
＜２＞ 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１９として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ９−１２Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１１３〜１９５を認識し、ＣＤ９に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２０として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−８Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、及び
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２１として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、
からなる群より選ばれる同一又は二種の、抗体もしくはその抗体断片を組み合わせてなる、Ｅｘｏｓｏｍｅ検出又は捕捉に用いるための、モノクローナル抗体もしくはその抗体断片のセット。
＜３＞ 固相抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片、標識抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片であるセット、
固相抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片、標識抗体がＣＤ６３−１３Ｃ８抗体又はその抗体断片であるセット、
固相抗体がＣＤ６３−８Ａ１２抗体又はその抗体断片、標識抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片であるセット、及び
固相抗体がＣＤ６３−８Ａ１２抗体又はその抗体断片、標識抗体がＣＤ６３−１３Ｃ８抗体又はその抗体断片であるセット、
からなる群より選ばれる、前記＜２＞記載のセット。
＜４＞ Ｅｘｏｓｏｍｅ検出用である、前記＜２＞又は＜３＞記載のセット。
＜５＞ 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１９として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ９−１２Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１１３〜１９５を認識し、ＣＤ９に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２０として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−８Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、及び
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２１として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片
からなる群より選ばれる抗体又はその抗体断片と、疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片とを組み合わせてなる、疾患特異的なＥｘｏｓｏｍｅ検出用モノクローナル抗体のセット。
＜６＞ 前記＜２＞〜＜４＞いずれか記載のセットのモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む、癌又は免疫系疾患の診断キット。
＜７＞ 前記＜５＞記載のセットのモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む、癌又は免疫系疾患の診断キット。
＜８＞ 前記＜５＞記載のセットを含有する、癌又は免疫系疾患の診断キット。
＜９＞ 被検者由来の生体試料と、前記＜１＞記載のモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅを捕捉して、該ＥｘｏｓｏｍｅのｍｉＲＮＡを検出する方法。
＜１０＞ 被検者由来の生体試料と、前記＜２＞〜＜４＞いずれか記載のセットのモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅ複合体を形成させて、該複合体由来のシグナル強度を測定する方法。
＜１１＞ 被検者が癌又は免疫系疾患を発症しているか否かを判定するための方法であって、
工程（Ｉ)：被検者由来の生体試料と、前記＜２＞〜＜４＞いずれか記載のセットのモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅ複合体を形成させて、該複合体由来のシグナル強度を測定する工程、及び；
工程（ＩＩ）：前記工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度と、対照者におけるシグナル強度とを対比して、前記被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、前記被検者が癌又は免疫系疾患を発症していると判定する工程
を含む、癌又は免疫系疾患の判定方法。
＜１２＞ 抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価方法であって、
工程（Ａ）：抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料と、前記＜２＞〜＜４＞いずれか記載のセットのモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅ複合体を形成させて、該複合体由来のシグナル強度を測定する工程、及び；
工程（Ｂ）：前記抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与後の被検者由来の生体試料における該複合体由来のシグナル強度が、前記抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与前の被検者由来の生体試料における該複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬が薬効を示している可能性が高いと判定する工程
を含む、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価方法。
本発明のＥｘｏｓｏｍｅ検出用モノクローナル抗体は、生体内Ｅｘｏｓｏｍｅ上のＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１を良好な感度及び特異性で検出及び捕捉することができる。これにより、血液検体内のＥｘｏｓｏｍｅの僅かな変化（Ｅｘｏｓｏｍｅの量的な変化に加え、Ｅｘｏｓｏｍｅ上の膜タンパク質のＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１の量の変化をも含む）を捉えることができ、癌などの疾患に由来するＥｘｏｓｏｍｅの変化の検出を可能とし、変化をもたらす原因となる疾患の診断に応用できるという優れた効果を奏するものである。
図１は、Ｅｘｏｓｏｍｅを利用した診断方法の概念を示す図である。 図２は、テトラスパニンファミリー（ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１）の構造を示す図（図Ａ）と、抗体作製に使用した小ループペプチドコンジュゲート（図Ｂ）と大ループＦｃ融合タンパク質（図Ｃ）を示す図である。 図３は、抗原に用いたＣＤ９及びＣＤ６３の配列情報である。 図４は、モノクローナル抗体のＶＬＰｓ（Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を用いた評価の方法（ＶＬＰ ＥＬＩＳＡ）を示す。 図５は、抗ＣＤ９モノクローナル抗体の２次評価を行った図である。 図６は、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の２次評価を行った図である。 図７は、ＣＤ９のＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡの標準曲線を示した図である。 図８は、ＣＤ６３のＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡの標準曲線を示した図である。 図９は、健常者、乳癌患者、及び大腸癌患者の血清中のＥｘｏｓｏｍｅ由来のシグナル強度を、市販及び本発明（自製）の抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体を使用した Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡで比較した図である。 図１０は、健常者、乳癌患者、及び大腸癌患者の血清中のＥｘｏｓｏｍｅ由来のシグナル強度を、本発明の抗ＣＤ９抗体と抗ＣＤ６３抗体を組み合わせた Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡで測定した図である。 図１１は、健常者、乳癌患者、及び大腸癌患者の血清中のＥｘｏｓｏｍｅ由来のシグナル強度を、本発明の抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体と抗ＥｐＣＡＭ抗体とを組み合わせた Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡで測定した図である。 図１２は、抗原に用いたＣＤ８１の配列情報である。 図１３は、本発明の抗ＣＤ９抗体を市販の抗ＣＤ９抗体と免疫沈降の性能を比較した図である。 図１４は、本発明の抗ＣＤ６３抗体を市販の抗ＣＤ６３抗体と免疫沈降の性能を比較した図である。 図１５は、本発明の抗ＣＤ８１抗体を市販の抗ＣＤ８１抗体と免疫沈降の性能を比較した図である。
本発明のＥｘｏｓｏｍｅ検出用モノクローナル抗体は、生体内Ｅｘｏｓｏｍｅ上のＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１を良好な感度及び特異性で検出又は捕捉することができるという特徴を有する。よって、本発明のモノクローナル抗体を、Ｅｘｏｓｏｍｅ検出又は捕捉用モノクローナル抗体と記載することもある。
Ｅｘｏｓｏｍｅ上のＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１は、それぞれ、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１は、いずれも、図２Ａに示す４回膜貫通型の構造を有するテトラスパンファミリーに属する膜タンパク質である。これらの膜タンパク質は、小ループ（ＥＣ１とする）と大ループ（ＥＣ２とする）の２種類のループ構造を細胞外に提示しており、本発明のモノクローナル抗体は、これらのループに対して特異的な認識を示すことを特徴とする。
以下に、本発明のＥｘｏｓｏｍｅ検出又は捕捉用モノクローナル抗体の調製方法、該抗体を含むセット、該抗体又はセットを利用した評価方法、及び該抗体を使用したＥｘｏｓｏｍｅの捕捉について詳述する。
＜モノクローナル抗体の調製方法＞
(抗原の調製)
本発明のモノクローナル抗体は、抗原を下記のように設計して調製したものであることから、抗原に対する感度及び特異性に優れる。
ＥｘｏｓｏｍｅのＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１の小ループペプチド、即ち、ＣＤ９ポリペプチドのＡｒｇ３６−Ａｓｎ５０、ＣＤ６３ポリペプチドのＶａｌ３８−Ｐｒｏ５４、ＣＤ８１ポリペプチドのＡｒｇ３６−Ａｌa５４のアミノ末端にシステイン残基を付加したペプチドを、公知の方法に従って合成する。得られた各ペプチドについて、マレイミド化したＫＬＨ〔Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ、ピアス社製〕を用いて、ペプチドのＳＨ基を介してハプテン抗原を調製する。図２Ｂに前記免疫原の模式図を、図３Ａ及び図１２Ａにそのペプチド配列を示す。
また、家兎ＩｇＧのＦｃ領域とＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１の大ループペプチドとの融合タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質）も抗原として用いることができる。具体的には、ＣＤ９ポリペプチドのＨｉｓ１１３−Ｉｌｅ１９５、ＣＤ６３ポリペプチドのＧｌｙ１０４−Ａｓｎ２０２、ＣＤ８１ポリペプチドのＰｈｅ１１３−Ｌｙｓ２０１、のカルボキシル末端にＦｃを付加したポリペプチドに対応するポリヌクレオチド配列を導入したプラスミドベクターを、例えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３−Ｆ Ｃｅｌｌｓ（インビトロジェン社製）に導入して一過的に発現させた後、プロテインＡカラム（ＭＡＰＳ ＩＩキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製することにより調製することができる。図２Ｃに前記免疫原の模式図を、図３Ｂ及び図１２Ｂにそのペプチド配列を示す。
(モノクローナル抗体の調製)
本発明のＥｘｏｓｏｍｅ検出用モノクローナル抗体(以下、単に、本発明のモノクローナル抗体ともいう)は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載した方法に従って調製することができる。
具体的には、先ず、上記により得られる抗原を用いて哺乳動物を免疫する。哺乳動物としては、特に制限はないが、一般には、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等を用いることができる。なかでも、マウス及びラットが好ましく、マウスがより好ましく、かかるマウスとしては、Ａ／Ｊ系、ＢＡＬＢ／Ｃ系、ＤＢＡ／２系、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスが例示される。また、該哺乳動物の齢は、用いる動物種により異なり特に限定されないが、マウス又はラットの場合、通常約４〜１２週齢、好ましくは約５〜１０週齢である。なお、これらの哺乳動物は、本発明のモノクローナル抗体の製造のために、細胞融合される形質細胞との適合性を考慮して選択することができる。
抗原は、免疫応答を増強させるためにアジュバントと混合して免疫原として使用される。アジュバントとしては、特に限定はなく公知のものを使用することができる。また、該アジュバントと抗原との混合は、用いるアジュバントについて当該分野で公知の方法に従うことができる。
哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法に従って行われる。例えば、免疫原を哺乳動物の皮下、皮内、静脈、及び／又は、腹腔内に注射投与することによって行われる。また、免疫原の投与は、最初の免疫後に何回か繰り返して行われ、その投与間隔は適宜調整され得る。なお、免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュール及び免疫原の投与量は、使用される動物に合わせて適切に設定され得る。
かくして、免疫された哺乳動物体内において所望の抗体産生細胞を調製することができる。かかる抗体産生細胞としては、免疫原の最終投与の３〜５日後に摘出した脾細胞が好ましい。なお、免疫された哺乳動物の脾臓を肥大させるために、ブースト（免疫原の追加注射）を行ってもよい。ブーストで投与される免疫原の量は、最初に投与される免疫原の量の約４〜５倍とするのが望ましいが、これを目安として適宜増減することができる。
次に、得られた抗体産生細胞は、骨髄腫由来の細胞(ミエローマ細胞)と細胞融合させて、ハイブリドーマを調製する。
ハイブリドーマの増殖能力は細胞融合に用いられるミエローマ細胞の種類に依存するので、ミエローマ細胞としては増殖能力の優れた細胞が好ましい。また、ミエローマ細胞は、融合させる抗体産生細胞の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。かかる例としては、マウスミエローマＰ３Ｕ１、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３等の骨髄腫細胞が例示される。
細胞融合の方法は、当該分野で公知の方法を用いることができ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法等が例示される。
得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って選択培地で培養することにより分離することができる。なお、選択されたハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを確認するために、培養上清を採取して抗体価アッセイを公知の方法、例えば、後述のＥＬＩＳＡ法に基づいて行うことができる。
かくして、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。該ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で半永久的に保存することができる。
所望のモノクローナル抗体は、インビボ及びインビトロにおける培養法により大量調製することができる。インビトロ培養法は、ハイブリドーマを適当な血清培地若しくは無血清培地中で培養することにより実施でき、所望のモノクローナル抗体は培地中に産生される。この培養法によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、インビボ培養法は、ハイブリドーマと適合性のある哺乳類動物、例えばマウスなどの腹腔内に、ハイブリドーマを注射接種して増殖することにより実施でき、所望抗体はマウス腹水として大量に回収することができる。
得られた培養上清及びマウスなどの腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。また、これらは常法に従って、例えば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組合せることにより精製して、精製抗体とすることができる。
かくして得られた、本発明のモノクローナル抗体を表１に示す。本明細書において、各モノクローナル抗体は、抗原タンパクとクローン番号により表示することができ、例えば、ＣＤ９−１２Ａ１２抗体と表すことができる。
なお、本発明においては、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター中央第６、又は千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８)に下記受託番号のもとで寄託された細胞を使用することもできる。
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１９(産生されるモノクローナル抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体、表示ＣＤ９：１２Ａ１２、受託日２０１１年１１月８日）
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２０（産生されるモノクローナル抗体がＣＤ６３−８Ａ１２抗体、表示ＣＤ６３：８Ａ１２、受託日２０１１年１１月８日）
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２１（産生されるモノクローナル抗体がＣＤ６３−１３Ｃ８抗体、表示ＣＤ６３：１３Ｃ８、受託日２０１１年１１月８日）。
ＮＩＴＥ ＢＰ−１４８０(産生されるモノクローナル抗体がＣＤ８１−４Ｇ６抗体、表示ＣＤ８１−４Ｇ６、受託日２０１２年１２月１２日）
ＮＩＴＥ ＢＰ−１４８１（産生されるモノクローナル抗体がＣＤ８１−６Ｄ１２抗体、表示ＣＤ８１−６Ｄ１２、受託日２０１２年１２月１２日）
ＮＩＴＥ ＢＰ−１４８２（産生されるモノクローナル抗体がＣＤ８１−１２Ｃ４抗体、表示ＣＤ８１−１２Ｃ４、受託日２０１２年１２月１２日）
本発明において「モノクローナル抗体断片」とは、前述する本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１に特異的な結合性を有する断片を意味する。ＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１に対して特異的結合性を有する断片とは、具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１〜４５６頁、１９９６年）。
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、Ｅｘｏｓｏｍｅ表面のＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１に対して特異的な認識を示すことから、ＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１を発現する物質を対象とする後述の評価方法に好適に用いられる。
＜モノクローナル抗体のセット＞
また、本発明は、前記本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を少なくとも１種含むモノクローナル抗体のセットを提供する。かかるセットを用いることにより、試料中のＥｘｏｓｏｍｅの捕捉が感度良く行なえるため、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による定量精度が向上する。
セットとしては、本発明のモノクローナル抗体に組み合わせる抗体の種類によって以下の２種の態様が挙げられる。
態様１：本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を２種以上含むセット
態様２：本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片を含むセット
態様１のセットは、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を２種以上含むものであれば特に限定はなく、同種の抗体又はその抗体断片を複数含む態様も含まれる。具体的には、ＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片、ＣＤ６３−８Ａ１２抗体又はその抗体断片、及びＣＤ６３−１３Ｃ８抗体又はその抗体断片からなる群より選ばれる抗体と、ＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片、ＣＤ６３−８Ａ１２抗体又はその抗体断片、及びＣＤ６３−１３Ｃ８抗体又はその抗体断片からなる群より選ばれる抗体とを組み合わせたセットが挙げられ、この場合、一方を固相抗体として、他方を標識抗体として用いることができる。
固相抗体及び標識抗体の調製、即ち、表１に示すモノクローナル抗体又はその抗体断片の固相化及び標識化は、特に限定はなく、公知の方法に従って行うことができる。
固相抗体及び標識抗体の組み合わせについては、公知のＥＬＩＳＡ法に従って、例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅの特異的結合性や定量性を調べて評価することができる。
特異的結合性については、既知量のＥｘｏｓｏｍｅを添加した試料におけるＥｘｏｓｏｍｅを後述の実施例４に記載のサンドイッチＥＩＬＳＡ法により測定する際に、得られるシグナル強度より評価することができる。十分なシグナル強度が得られる組み合わせを、良好な組み合わせと判断する。さらに、血液検体に対するＥｘｏｓｏｍｅの添加回収試験を行い、添加回収率の良し悪しも組み合わせの選択の判断に用いることができる。例えば、添加回収率が８５〜１１５％程度であれば良好な組合せと判断する。
定量性については、後述の実施例４に記載のサンドイッチＥＩＬＳＡ法と同様の方法において、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬまで、好ましくは５０〜２５０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で、Ｅｘｏｓｏｍｅ濃度依存的にシグナル強度の上昇が認められ、直線性の良い標準曲線が得られる組合せを良好な組合せと判断することができる。
上記より、良好な組合せと判断された組合せを以下の表２に示す。
態様１のセットの具体的な使用方法は、後述の測定方法において説明する。
態様２のセットは、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片とを含む。具体的には、ＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片、ＣＤ６３−８Ａ１２抗体又はその抗体断片、及びＣＤ６３−１３Ｃ８抗体又はその抗体断片からなる群より選ばれる抗体と、疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片とを組み合わせたセットが挙げられる。この場合、いずれか一方をＥｘｏｓｏｍｅ固相用（Ｅｘｏｓｏｍｅ固定用ともいう）に、他方をＥｘｏｓｏｍｅ標識用に用いることができるが、Ｅｘｏｓｏｍｅを固定して、疾患に特異的か否かを判別する観点から、本発明のモノクローナル抗体をＥｘｏｓｏｍｅ固相用に、疾患特異的膜タンパク質抗体をＥｘｏｓｏｍｅ標識用に用いることが好ましい。なお、本明細書において、疾患特異的膜タンパク質抗体とは、Ｅｘｏｓｏｍｅ表面に存在する疾患特異的な膜タンパク質に対する抗体のことを意味する。例えば、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＣＤ２７６、ＣＤ５５、ＣＤ７１、ＥｐｈＡ２、ＰＳＭＡ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３が挙げられる。
態様２のセットの具体的な使用方法は、後述の測定方法において説明する。
＜本発明のモノクローナル抗体又はセットを利用した評価方法＞
(抗体の２次評価法)
ＣＤ９又はＣＤ６３を強制発現させたＶＬＰｓ（Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）に任意の試験抗体を作用させて、試験抗体のＣＤ９又はＣＤ６３への結合性を評価することができる。
具体的には、ＣＤ９又はＣＤ６３とＩ型膜タンパク質（例えば、ＴＥＭ７）とを強制発現させたＶＬＰｓを抗マウスＩｇＧ抗体固相プレートに添加し、さらに各抗ＣＤ試験抗体と標識化Ｉ型膜タンパク質抗体（例えば、ＨＲＰ標識抗ＴＥＭ７抗体Ｆａｂ’）を添加し、反応させる。反応後、プレートを洗浄して残存ＶＬＰｓを抗体の標識を検出することにより定量する（前述の例では、抗体に標識しているＨＲＰ活性を検出することになる）。残存ＶＬＰｓが多いほど、試験抗体の結合性が優れていると評価することができる。
(Ｅｘｏｓｏｍｅの捕捉法)
Ｅｘｏｓｏｍｅを捕捉する際に、本発明のモノクローナル抗体が好適に用いられる。例えば、本発明のモノクローナル抗体をビオチン化してＥｘｏｓｏｍｅと反応させた後、ストレプトアビジン固相磁性ビーズを用いることにより単離が可能となる。
より詳しくは、先ず、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を公知の方法に従ってビオチン化する。次いで、Ｅｘｏｓｏｍｅとビオチン化抗体とを混合し、４℃で終夜反応させる。その後、ストレプトアビジン固相磁性ビーズを添加して、４℃にてさらに２時間反応させた後、磁石を用いて分離を行って、ビオチン化抗体に結合したＥｘｏｓｏｍｅを回収することができる。
(Ｅｘｏｓｏｍｅ由来のｍｉＲＮＡ検出法)
Ｅｘｏｓｏｍｅは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、Ｅｘｏｓｏｍｅ由来のｍｉＲＮＡを検出することができれば、それを解析することにより生理現象や各種疾患の判定が可能になる。
具体的には、被検者由来の生体試料と本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片とを接触させて、前記Ｅｘｏｓｏｍｅの捕捉分離法に従ってＥｘｏｓｏｍｅを単離し、回収されたＥｘｏｓｏｍｅから、ｍｉＲＮＡを公知の方法に従って検出する。
検出されたｍｉＲＮＡについては、公知の方法に従って解析することが可能であり、それにより、生理現象の解析や特定の疾患に罹患していると判定することができる。
なお、本明細書において、生体試料とは、血液、血清、及び血漿からなる群より選択される生体試料であれば、特に限定はない。
(免疫測定法)
本発明のモノクローナル抗体のセットを用いて免疫測定を行う。免疫測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素イムノメトリックアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法等が挙げられ、簡便に感度よく抗体を検出し得ることから、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
ＥＬＩＳＡ法には、一般的な競合法、サンドイッチ法などが挙げられるが、サンドイッチ法における固相抗体に、又は固相抗体及び標識抗体の両方に、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を使用することができることから、サンドイッチ法が好ましい。
次に、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一態様を示す。まず、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を固相化させた後、Ｅｘｏｓｏｍｅを含有する被検試料を接触させて複合体を形成させる。その後、そこに、本発明のセットのうち、態様１の場合はもう一方の本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を、態様２の場合は疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片を、それぞれ修飾した標識抗体を添加して、さらなる複合体を形成させて標識を検出することにより、態様１は試料に含まれるＥｘｏｓｏｍｅに由来するシグナル量を、態様２の場合は試料に含まれる疾患特異的Ｅｘｏｓｏｍｅ量を、それぞれ測定することができる。従って、本発明はまた、被検者由来の生体試料と、本発明のモノクローナル抗体のセットに含まれるモノクローナル抗体とを接触させて複合体を形成させて、該複合体の存在量を測定する方法を提供する。
なお、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を固相化する際には、直接固相化しても、公知の媒体、例えば、ストレプトアビジンを介して固相化してもよい。
(癌又は免疫系疾患の発症予測)
また、本発明は、癌又は免疫系疾患の診断方法（発症予測方法）を提供する。本発明の態様１のセットは、生体内に分布するＥｘｏｓｏｍｅを良好な感度及び特異性で検出することが可能である。態様２のセットは、疾患特異的なＥｘｏｓｏｍｅを良好な感度で検出することが可能である。Ｅｘｏｓｏｍｅは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、癌又は免疫系疾患を発症している場合には、生体内のＥｘｏｓｏｍｅ量が多くなっていると考えられる。また、癌細胞などは、正常細胞と比べ細胞表面に変化が起き、ＣＤ９やＣＤ６３などの膜タンパク質の発現量が亢進する可能性もある。従って、前記Ｅｘｏｓｏｍｅに由来するシグナル量を指標とすることにより癌又は免疫系疾患の診断（発症予測）が可能となり、さらに、態様２の場合は癌又は免疫系疾患の特定を行うことも可能であり、前記方法は、診断方法（発症関連因子の測定方法又は判定方法）としても使用可能である。
発症診断が可能な癌又は免疫系疾患としては、大腸癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚癌などの癌疾患、及びリウマチ、変形性関節症、腎症（糖尿病性腎症、糸球体腎炎）、膵炎、肝炎、アレルギーなどの炎症系疾患が例示される。また、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の免疫活性の指標に応用すれば、癌ワクチンの癌疾患に対する効果判定にも応用できる。
上記予測方法は、具体的には、
工程（Ｉ)：被検者由来の生体試料と、前記本発明のセットのモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅ複合体を形成させて、該複合体由来のシグナル強度を測定する工程、及び；
工程（ＩＩ）：前記工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度と、対照者におけるシグナル強度とを対比して、前記被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、前記被検者が癌又は免疫系疾患を発症していると判定する工程を含む、癌又は免疫系疾患の判定方法を含む。
上記予測方法の工程（Ｉ）における複合体由来のシグナル強度の測定は、本発明のモノクローナル抗体のセットを用いる方法であれば、当業者においては周知の方法を用いることができるが、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が好ましい。
工程（ＩＩ）において、上記により得られたシグナル強度について、対照者におけるシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法としては、特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、被検者由来の生体試料のシグナルが対照者におけるシグナルと比べて多い場合に、癌又は免疫系疾患を発症している可能性が高いと判断される。なお、本発明において、対照者とは、癌又は免疫系疾患を発症していない被検者と同年代・同性の者の平均をいい、対照者におけるシグナル強度は被検者におけるシグナル強度と共に測定してもよく、別途予め測定した値から得られた統計値を用いてもよい。
(癌又は免疫系疾患の発症予測用キット)
本発明の別の態様では、癌又は免疫系疾患の診断を行うためのキットが提供される。
本発明のキットには、本発明のモノクローナル抗体のセットを含有するものが挙げられ、サンプル中のＥｘｏｓｏｍｅを検出する際に本発明のモノクローナル抗体のセットを用いる検出方法であれば、前記キットを用いることができる。本発明のモノクローナル抗体のセットは、生体内Ｅｘｏｓｏｍｅを良好な感度及び特異性で検出することが可能であることから、該キットの使用は癌又は免疫系疾患の診断に大きな貢献をもたらすことができる。
(抗癌剤の薬効評価)
また、本発明の別の態様では、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価方法が提供される。
Ｅｘｏｓｏｍｅは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与の前後での血中Ｅｘｏｓｏｍｅの変化（存在量の増減だけに加え、膜タンパク質の量の変動を含む）を測定することにより、患者における薬効を評価することが可能になると考えられる。また、例えば、癌細胞に特異的な膜タンパク質に対する抗体又はその抗体断片と本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片とを組み合わせれば、癌診断の特異性の向上や癌種の特定などが期待でき、より癌疾患に特異的な診断薬の開発が可能となると考えられる。
上記薬効評価方法は、具体的には、
工程（Ａ）：抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料と、本発明のモノクローナル抗体のセットに含まれるモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅ複合体を形成させて、該複合体由来のシグナル強度を測定する工程
工程（Ｂ）：前記抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与後の被検者由来の生体試料における該複合体由来のシグナル強度が、前記抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与前の被検者由来の生体試料における該複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬が薬効を示している可能性が高いと判定する工程
を含む。
上記薬効評価方法の工程（Ａ）における複合体由来のシグナル強度の測定は、本発明のモノクローナル抗体のセットを用いる方法であれば、当業者においては周知の方法を用いることができるが、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が好ましい。
工程（Ｂ）において、上記により得られたシグナル強度について、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与前の生体試料におけるシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法としては、特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与後の生体試料におけるシグナル量が投与前の生体試料におけるシグナル量と比べて少ない場合に、該抗癌剤又は抗免疫系疾患薬が癌又は免疫系疾患を抑える効果を有している可能性が高いと判断される。
(抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価用キット)
本発明の別の態様では、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価を行うためのキットが提供される。
本発明のキットには、本発明のモノクローナル抗体のセットを含有するものが挙げられ、サンプル中のＥｘｏｓｏｍｅを検出する際に本発明のモノクローナル抗体のセットを用いる検出方法であれば、前記キットを用いることができる。本発明のモノクローナル抗体のセットは生体内Ｅｘｏｓｏｍｅを良好な感度及び特異性で検出することが可能であることから、該キットの使用は抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価に大きな貢献をもたらすことができる。
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
実施例１〔抗ＣＤ９及びＣＤ６３モノクローナル抗体の調製〕
（抗原の調製）
ＣＤ９及びＣＤ６３タンパクの部分ペプチド、即ち、ＣＤ９ポリペプチドのＡｒｇ３６−Ａｓｎ５０、ＣＤ６３ポリペプチドのＶａｌ３８−Ｐｒｏ５４の各アミノ末端にシステイン残基を付加した２種類のペプチドをシグマアルドリッチ社にて合成した。これらをマレイミド化したＫＬＨ〔Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ、サーモサイエンティフィック社製〕を用いて、ペプチドのＳＨ基を介してハプテン抗原を調製した。図２Ａにテトラスパニンファミリー（ＣＤ９、ＣＤ６３）の構造、図２Ｂに抗原を模式的に示した。また、図３Ａにペプチドの配列を示した。
また、家兎ＩｇＧのＦｃ領域とＣＤ９及びＣＤ６３の各大ループ部分との融合タンパクも抗原として調製した（Ｆｃ融合タンパク質）。図２Ｃと図３Ｂに抗原の情報を示した。即ち、Ｆｃ融合タンパク質は、各ＣＤ抗原の大ループのカルボキシル末端にＦｃを付加したポリヌクレオチド配列を導入したプラスミドベクターを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３−Ｆ Ｃｅｌｌｓ（インビトロジェン社製）に導入して一過的に発現させた後、プロテインＡカラム（ＭＡＰＳ ＩＩキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製することにより調製した。
（モノクローナル抗体の調製）
ＣＤ９及びＣＤ６３のハプテン抗原、Ｆｃ融合タンパク質を、初回免疫には完全アジュバントと、２回目以降は不完全アジュバントと等量混和することにより、免疫原としての乳剤を調製した。
モノクローナル抗体は、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載した方法で作製した。即ち、５週齢の雌Ａ／Ｊ系マウスに、投与１回につき、一匹当り５０μｇのハプテン抗原又は１０μｇのＦｃ融合タンパク質を皮下と腹腔内に等量に分けて投与した。その後、４回目又は５回目の免疫後に、最終のブースター（細胞融合の４日前）を行ったマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）との細胞融合は、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載した方法で行った。
（モノクローナル抗体の評価）
抗血清とハイブリドーマ上清の抗体価の評価（１次評価）は下記に記述するＥＬＩＳＡ法にて行った。即ち、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を固相した９６穴マイクロプレートに、抗血清又はハイブリドーマ上清を添加し、さらにビオチン化ＣＤ９、ＣＤ６３タンパク質とＨＲＰ標識ストレプトアビジンを混合攪拌後、室温で２時間あるいは４℃で終夜反応させた。反応後、洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０と０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ １５０を含む生理食塩水）にて３回洗浄を行い、１００μＬ ＴＭＢ試薬を加え、攪拌後１５〜２０分間静置し、１Ｎ 硫酸溶液５０μＬを添加して反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をＡＲＶＯ ＭＸ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）にて測定し、抗血清やハイブリドーマを未添加の場合に得られるシグナルの３倍を超えるシグナル強度を示す場合を陽性と判断した。
得られた各モノクローナル抗体は、抗体産生ハイブリドーマの無血清培地あるいはハイブリドーマをマウスに投与して得られた腹水より、プロテインＡカラム（ＭＡＰＳ ＩＩキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。以上のようにして、後述の全てのモノクローナル抗体を調製した。
実施例２〔ハプテン抗原又はＦｃ融合タンパク質免疫で得られたモノクローナル抗体の膜表面タンパク質への反応性確認：２次評価（Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡ）〕
インビトロジェン社のＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏ機能性タンパク質発現キットを用い、ＣＤ９又はＣＤ６３とＩ型膜タンパク質ＴＥＭ７とを共発現させたＶＬＰｓ（ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を調製した。具体的には、ＣＤ９又はＣＤ６３とＴＥＭ７遺伝子をｐＥＦ Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＡ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔに組み込んだプラスミドベクターを、２９３ＦＴ細胞（インビトロジェン社製）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００にてトランスフェクトした。トランスフェクト後の培養上清にＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｍｉｘ試薬を添加し、ＶＬＰｓを沈殿させた。ＶＬＰｓにおけるＴＥＭ７及び各ＣＤ抗原の発現はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＷＢ）により確認した（結果示さず）。
次に、このように調製したＶＬＰｓを用いて、図４に示したようにサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。具体的には、前記ＶＬＰｓを抗マウスＩｇＧ抗体固相プレートに添加し、さらに各抗ＣＤ抗体とＨＲＰ標識抗ＴＥＭ７抗体Ｆａｂ’を添加し、４℃にて終夜反応させた。比較対照として、市販の抗ＣＤ抗体を添加させたウエルも調製した。終夜反応後、洗浄液で洗浄後ＴＭＢ溶液を１００μＬ添加し、攪拌後１５〜２０分間静置し、１Ｎ 硫酸溶液を５０μＬ添加して反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をＡＲＶＯ ＭＸ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）にて測定した。なお、市販抗体はＶＬＰ ＥＬＩＳＡにより立体構造を認識する抗体をそれぞれ選択し、抗ＣＤ９抗体はＡｂｎｏｖａ社製の抗体（クローンＩＶＡ５０）、抗ＣＤ６３抗体はＢＤ社製の抗体（クローンＨ５Ｃ６）を用いた。吸光度の結果をそれぞれ図５、６に示す。
結果、ＣＤ９−１２Ａ１２抗体、ＣＤ６３−８Ａ１２抗体、ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体は、市販の抗体、即ちＦＡＣＳに使用可能な立体構造を認識する市販抗体と同程度、またはそれ以上の反応性で、Ｅｘｏｓｏｍｅを立体的に捕らえることが可能であることが分かった。
実施例３〔抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の組合せ〕
血中Ｅｘｏｓｏｍｅの測定が可能となるサンドイッチＥＬＩＳＡ法における抗体の組合せを探索するため、前記実施例１で得られた全てのモノクローナル抗体に関して固相抗体及び標識抗体を調製して、血中Ｅｘｏｓｏｍｅ測定用のサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。
まず、前記全てのモノクローナル抗体を固相した９６穴マイクロプレートを調製した。即ち、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて１０μｇ／ｍＬに調製した各抗体溶液を、９６穴マイクロプレートに１００μＬ／ウエルずつ添加し、終夜反応させた。その後、反応液を除き、洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０と０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ １５０を含む生理食塩水）で３回洗浄後、２％ブロックエース（大日本住友製薬社製）を２００μＬ／ウエルずつ添加し、４℃で終夜放置することによりブロッキングを行った。一方、標識抗体としては、表３〜４に示す全ての抗体について、２０倍モル量のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（サーモサイエンティフィック社製）を反応させ、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）でゲルろ過することにより調製した。
次に、各抗体が固相化されたプレートにＥｘｏｓｏｍｅ溶液（０〜２５μｇ／ｍＬ）２５μＬを添加後、１μｇ／ｍＬの上記で調製した標識抗体と０．４μｇ／ｍＬ ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識ストレプトアビジンを含む溶液５０μＬを添加し、攪拌後４℃で終夜反応させた。その後、反応液を除き、上記洗浄液で３回洗浄後、ＴＭＢ溶液（Ｃｏｌｏｒｂｕｒｓｔ Ｂｌｕｅ、ＡＬｅｒＣＨＥＫ社製）を１００μＬ添加し、室温で１５分間反応させた。そこに、１Ｎ 硫酸を５０μＬ添加して反応を停止し、各ウエルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の数値より、最も良い組み合わせ（感度が１００ｎｇ／ｍＬ以上、かつ、各群において最も感度が良い組み合わせ）を「◎」、アッセイが可能な組み合わせ（感度が１００ｎｇ／ｍＬ以上）を「○」、弱い反応性が認められた組み合わせ（感度が１００ｎｇ／ｍＬ未満）を「△」、反応が認められなかった組み合わせを「×」、検討を行わなかった組み合わせについては「−」として、評価を行なった。結果を表３及び４に示す。なお、市販抗体は実施例２と同じものを用いた。
結果、抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３のモノクローナル抗体を用いた何れのＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡにおいても、最も良い組み合わせとして、以下の本願発明で調製した抗体同士の組み合わせが見出された。
固相抗体：ＣＤ９−１２Ａ１２抗体、標識抗体：ＣＤ９−１２Ａ１２抗体
固相抗体：ＣＤ６３−８Ａ１２抗体、標識抗体：ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体
また、特定の標識抗体との組み合わせにおいて、固相抗体として用いるのに適した抗体は、一般的に他の標識抗体との組み合わせにおいても固相抗体として用いることに適していることが知られている。同様のことが、特定の固相抗体との組み合わせにおいて、標識抗体として用いるのに適した抗体は、一般的に他の固相抗体との組み合わせにおいても標識抗体として用いることに適していることが知られている。
したがって、上記の実験結果から、以下の組み合わせも、同様に良い組み合わせであることが十分に予測される。
固相抗体：ＣＤ９−１２Ａ１２抗体、標識抗体：ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体、
固相抗体：ＣＤ６３−８Ａ１２抗体、標識抗体：ＣＤ９−１２Ａ１２抗体
以上、本発明及び市販の抗体をまとめたものが表５及び６である。なお、抗体適正について、前記結果より、非常に強い抗体（至適な抗体）を「◎」、使用可能な抗体を「○」、弱いが反応性がある抗体を「△」、使用不可な抗体を「×」として評価した。
実施例４〔抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３を用いたＥｘｏｓｏｍｅのＥＬＩＳＡ法の構築〕
実施例３で選択した最も良い抗体の組合せについて、さらに感度を上げるため、抗体に直接標識を行うことにより調製した標識抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を構築した。
まず検出に適した抗体のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識を行った。ペプシン処理によるＦａｂ’化が不可能なサブクラスＩｇＧ２ｂのＣＤ９−１２Ａ１２抗体に関しては、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（ＡＬＰ標識試薬、同仁社製）を用いて、ＩｇＧを還元して生じるＳＨ基を介してＡＬＰ標識を行った。
また、サブクラスＩｇＧ２ａであるＣＤ６３−１３Ｃ８抗体に関しては、Ｆａｂ’を調製後、ヒンジ法を用いて酵素標識を行った。即ち、抗体１ｍｇに対しペプシン５０μｇを反応させ消化を行いＦ（ａｂ’）２を調製後、ＨＰＬＣのＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム（東ソー社製）を用いたゲルろ過による精製を行った。次に、１０ｍＭの２−メルカプトエチルアミンによる還元及び上記カラムによりＦａｂ’を調製した。一方、ＡＬＰは、Ｓｕｌｆｏ−ＨＭＣＳによりマレイミド化を行い、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にて精製を行った。等モルのＦａｂ’とマレイミド化したＡＬＰを混和し、４℃で終夜反応させた後、上記ＨＰＬＣのＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬカラムで精製を行い、標識抗体を調製した。
具体的には、ＣＤ９に関しては、ＣＤ９−１２Ａ１２抗体固相プレートに、予めアッセイ緩衝液（１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．５％ＢＳＡ、１％ＢＳＡを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．４）を７５μＬ添加し、Ｅｘｏｓｏｍｅ標準液（０〜２５μｇ／ｍＬ）２５μＬを添加し、振とうしながら室温で２時間反応させた。洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ１５０を含む生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ））で３回洗浄後、２．５ｎｇ／ｍＬ ＡＬＰ標識ＣＤ９−１２Ａ１２抗体１００μＬを添加後、攪拌後室温にて３時間静置反応させた。その後、反応液を除き、上記洗浄液で４回洗浄後、化学発光基質溶液（Ｌｕｍｉｇｅｎ ＡＰＳ−５）を１００μＬ添加し、攪拌後、各ウエルの化学発光量を測定した。その結果を図７に示す。
ＣＤ６３に関しては、予めビオチン化ＣＤ６３−８Ａ１２抗体を１μｇ／ｍＬ濃度で４℃終夜反応させておいた。ＣＤ９と同様の洗浄液で３回洗浄後、上記アッセイ緩衝液を７５μＬ添加し、Ｅｘｏｓｏｍｅ標準液（０〜２５μｇ／ｍＬ）２５μＬを添加し、振とうしながら室温で２時間反応させた。上記洗浄液で３回洗浄後、１２．５ｎｇ／ｍＬ ＡＬＰ標識ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体１００μＬを添加後、攪拌後室温にて３時間静置反応させた。その後、反応液を除き、上記洗浄液で４回洗浄後、上記化学発光基質溶液を１００μＬ添加し、攪拌後、各ウエルの化学発光量を測定した。その結果を図８に示す。
その結果、抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３のモノクローナル抗体を用いた何れのＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡにおいても、２．５ｎｇ／ａｓｓａｙ（１００ｎｇ／ｍＬ）のＥｘｏｓｏｍｅが検出可能であった。Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡ法による検出に関しては、Ｍ．Ｌｏｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＤ６３ ａｎｄ Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｐａｔｉｅｎｔｓ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．４（２００９），１−１０に、３μｇのＥｘｏｓｏｍｅが検出可能と報告されている。一方、今回構築した抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３のＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡでは何れも２．５ｎｇのＥｘｏｓｏｍｅ検出が可能であり、報告されているＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡに比べて３オーダー高感度である。また、何れのＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡにおいても、市販の抗体同士を用いたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡに比べ高感度であった。
またさらに、前記本発明の抗ＣＤ９抗体の組み合わせ、抗ＣＤ６３抗体の組み合わせを用いたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡに関して、添加回収試験を行い、結合の特異性を評価した。具体的には、血清検体へのＣ３２メラノーマ細胞由来Ｅｘｏｓｏｍｅの添加回収を調べた結果、回収率が抗ＣＤ９抗体を用いた場合８７．９〜１１３．４％、抗ＣＤ６３抗体を用いた場合９６．２〜９９．３％、と良好な添加回収率が得られた。一方、抗ＣＤ９市販抗体を用いたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡでは、回収率が３２．１〜４１．８％と、十分な添加回収率が得られなかった。なお、市販抗体は実施例２と同じものを用いた。
実施例５〔抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３抗体による癌患者血液検体中のＥｘｏｓｏｍｅの検出〕
健常者、乳癌患者、及び大腸癌患者各１０名の血清中Ｅｘｏｓｏｍｅ量を、固相抗体：ＣＤ９−１２Ａ１２抗体、標識抗体：ＣＤ９−１２Ａ１２抗体の組合せ、固相抗体：ＣＤ６３−８Ａ１２抗体、標識抗体：ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体の組合せを用いて、実施例４と同様にしてＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡにて測定した。結果を図９に示す。なお、群間比較はｔ検定により行なった。
結果、抗ＣＤ９抗体を使用した Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡでは、乳癌患者と大腸癌患者の双方が健常者に比べ有意に高値を示した。また、抗ＣＤ６３抗体を使用した Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡでも、同様の結果だった。よって、本発明の抗ＣＤ９抗体の組み合わせ、抗ＣＤ６３抗体の組み合わせを用いたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡは、乳癌や大腸癌の診断への適用が可能であることが示唆される。一方、市販抗体（抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体）を用いたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡでは、有意な差が認められなかった。なお、市販抗体は抗ＣＤ９抗体はＡｂｎｏｖａ社製抗体（クローンＩＶＡ５０）、抗ＣＤ６３抗体はＳａｎｔａＣｒｕｚ社製抗体（ｓｃ−５２７５）をそれぞれ用いた。
またさらに、抗ＣＤ９抗体と抗ＣＤ６３抗体を組み合わせたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡを構築し、同様に健常者、乳癌患者、及び大腸癌患者の血清中Ｅｘｏｓｏｍｅを測定した。具体的には、固相抗体：ＣＤ９−１２Ａ１２抗体、標識抗体：ＣＤ６３−８Ａ１２抗体の組合せ、固相抗体：ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体、標識抗体：ＣＤ９−１２Ａ１２抗体の組合せを用いて行なった。結果を図１０に示す。なお、標識抗体はいずれもＡＬＰ直接標識抗体を用いた。
図１０の左（固相抗体：抗ＣＤ９抗体、ＡＬＰ標識抗体：抗ＣＤ６３抗体）と右（固相抗体：抗ＣＤ６３抗体、ＡＬＰ標識抗体：抗ＣＤ９抗体）に示したように、どちらも癌患者と健常者との差が大きくなり、乳癌患者と大腸癌患者のいずれにおいても有意に高値を示した。
実施例６〔疾患特異的膜タンパク質に対する抗体を組み合わせたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡの診断応用〕
上記抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３抗体と疾患特異的膜タンパク質に対する抗体を組み合わせ、癌に関連したＥｘｏｓｏｍｅの定量の可能性を調べた。具体的には、癌に関連した膜タンパク質抗体としてＥｐＣＡＭ抗体を選択し、ＡｂＣＡＭ社製の抗体（クローンＡＵＡ１）を用いた。
なお、Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡを行なう前に、予め、ＥｐＣＡＭが乳癌細胞株（ＺＲ７５−１、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）や大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）などで細胞ｌｙｓａｔｅや培養上清中のＥｘｏｓｏｍｅで強く発現していることを確認した。一方、正常乳腺細胞１８４Ａ１では発現が認められないことを確認した（両結果示さず）。
抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡを構築するため、ＥｐＣＡＭ抗体をＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（ＡＬＰ標識試薬、同仁社製）を用いてＡＬＰ標識を行った。大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６由来Ｅｘｏｓｏｍｅを対象として、ＡＬＰ標識ＥｐＣＡＭ抗体と抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３抗体を固相抗体として用い、Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡを行って血液検体の定量を行った。結果を図１１に示す。なお、群間比較はｔ検定により行なった。
結果、健常者と比べ乳癌患者、大腸癌患者のいずれか又は双方において、有意に高値を示すＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡがあることが分かった。この結果は、癌などの疾患に関連した膜タンパク質抗体と抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３抗体を組み合わせたＥｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡにより、今まで診断応用が困難であった膜タンパク質を診断マーカーとして応用できる可能性を示すデータである。
実施例７〔抗ＣＤ８１モノクローナル抗体の調製〕
（抗原の調製）
さらに抗ＣＤ８１抗体を作製するため、ＣＤ８１の小ループペプチド、即ち、ＣＤ８１ポリペプチドのＡｒｇ３６−Ａｌa５４のアミノ末端にシステイン残基を付加したペプチドをシグマアルドリッチ社にて合成した。これをマレイミド化したＫＬＨ〔Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ、サーモサイエンティフィック社製〕を用いて、ペプチドのＳＨ基を介してハプテン抗原を調製した。図２Ａにテトラスパニンファミリー（ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１）の構造、図２Ｂに抗原を模式的に示した。また、図１２Ａにペプチドの配列を示した。
また、家兎ＩｇＧのＦｃ領域とＣＤ８１の大ループ部分との融合タンパクも抗原として調製した（Ｆｃ融合タンパク質）。図２Ｃと図１２Ｂに抗原の情報を示した。即ち、Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ抗原の大ループのカルボキシル末端にＦｃを付加したポリヌクレオチド配列を導入したプラスミドベクターを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３−Ｆ Ｃｅｌｌｓ（インビトロジェン社製）に導入して一過的に発現させた後、プロテインＡカラム（ＭＡＰＳ ＩＩキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製することにより調製した。
（モノクローナル抗体の調製）
ＣＤ８１のハプテン抗原、Ｆｃ融合タンパク質を、初回免疫には完全アジュバントと、２回目以降は不完全アジュバントと等量混和することにより、免疫原としての乳剤を調製した。
モノクローナル抗体は、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載した方法で作製した。即ち、５週齢の雌Ａ／Ｊ系マウスに、投与１回につき、一匹当り５０μｇのハプテン抗原又は１０μｇのＦｃ融合タンパク質を皮下と腹腔内に等量に分けて投与した。その後、４回目又は５回目の免疫後に、最終のブースター（細胞融合の４日前）を行ったマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）との細胞融合は、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載した方法で行った。
（モノクローナル抗体の評価）
抗血清とハイブリドーマ上清の抗体価の評価（１次評価）は下記に記述するＥＬＩＳＡ法にて行った。即ち、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を固相した９６穴マイクロプレートに、抗血清又はハイブリドーマ上清を添加し、さらにビオチン化ＣＤ８１タンパク質とＨＲＰ標識ストレプトアビジンを混合攪拌後、室温で２時間あるいは４℃で終夜反応させた。反応後、洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０と０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ １５０を含む生理食塩水）にて３回洗浄を行い、１００μＬ ＴＭＢ試薬を加え、攪拌後１５〜２０分間静置し、１Ｎ 硫酸溶液５０μＬを添加して反応を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をＡＲＶＯ ＭＸ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）にて測定し、抗血清やハイブリドーマを未添加の場合に得られるシグナルの３倍を超えるシグナル強度を示す場合を陽性と判断した。
得られた各モノクローナル抗体は、抗体産生ハイブリドーマの無血清培地あるいはハイブリドーマをマウスに投与して得られた腹水より、プロテインＡカラム（ＭＡＰＳ ＩＩキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。以上のようにして、後述の全ての抗ＣＤ８１のモノクローナル抗体を調製した。
実施例８〔抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３及び抗ＣＤ８１抗体によるＥｘｏｓｏｍｅの免疫沈降による捕捉〕
実施例１及び７で得られた抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３及び抗ＣＤ８１モノクローナル抗体を使用したＥｘｏｓｏｍｅの免疫沈降による精製の可能性を調べた。なお、比較に用いた市販抗体としては、それぞれ任意の３つの市販抗体より免疫沈降能が良い抗体を予め選択して用いた。具体的には、抗ＣＤ９抗体はＡｂｎｏｖａ社の抗体（ＩＶＡ５０）、抗ＣＤ６３抗体はＥｘｏＢｉｏ社の抗体（ＭＥＭ−２５９）及びＢＤ社の抗体（Ｈ５Ｃ６）、抗ＣＤ８１抗体はＧＥＮＥＴＥＸ社の抗体（１Ｄ６）を用いた。
免疫沈降に用いた試料は、以下のものを用いた。抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体については、ＣＤ６３あるいはＣＤ８１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのＣ末にＦＬＡＧタグを付加したプラスミドを導入したＣＯＳ７細胞の培養上清から調製したＥｘｏｓｏｍｅを用いた。ＣＤ９抗体については、健常者の血清を用いた。
免疫沈降は、以下の様に行った。
抗ＣＤ６３あるいは抗ＣＤ８１抗体の場合は、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液に溶解した１μｇのＥｘｏｓｏｍｅ溶液に、抗体１μｇを加え、終夜４℃にて反応させた。２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎＧアガロース（５０％ ｓｌｕｒｒｙ）を添加した後、４℃にて２時間攪拌しながら反応させた。反応後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて２回遠心洗浄を行った後、ビーズに捕捉されたＥｘｏｓｏｍｅ上のＣＤ６３あるいはＣＤ８１量をＨＲＰ標識抗ＦＬＡＧ抗体用いたウエスタンブロッティング（ＷＢ）にて評価を行った。抗ＣＤ９抗体に関しては、血清１００μＬに１％ＢＳＡを含むＰＢＳを１００μＬ添加し、抗ＣＤ９抗体を固相したＭ２８０磁性ビーズを抗体１μｇ分となる量を添加し、４℃にて終夜反応させた。反応後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて、磁石を用いて洗浄を行い、ビーズに捕捉されたＥｘｏｓｏｍｅ上のＣＤ９量を抗ＣＤ９抗体とＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いたＷＢにて評価を行った。各巧ＣＤ抗体のＥｘｏｓｏｍｅの免疫沈降の性能を比較した図を図１３、１４、１５に示す。
結果、ＣＤ９−１２Ａ１２抗体、ＣＤ６３−８Ａ１２抗体、ＣＤ８１−６Ｄ１２抗体、ＣＤ８１−４Ｇ６抗体ＣＤ８１−１２Ｃ４抗体は、市販抗体に比べ強いＥｘｏｓｏｍｅの免疫沈降能力を示した。
実施例９〔捕捉したＥｘｏｓｏｍｅ由来のｍｉＲＮＡ検出による疾患の診断〕
実施例８の方法を参照にして捕捉されたＥｘｏｓｏｍｅから、ｍｉＲＮＡ又はタンパク質を公知の方法に従って検出する。検出したｍｉＲＮＡ又はタンパク質については、公知の方法に従って解析することが可能であり、それにより、生理現象の解析や特定の疾患に罹患していると判定することができる。
Ｅｘｏｓｏｍｅ内のｍｉＲＮＡは、例えば、Ｋ．Ｏｈｓｈｉｍａ、ｅｔ ａｌ、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１０、５、ｐ１−１０を参照して、マイクロアレイ解析、又は定量ＰＣＲで解析することが出来る。
本発明のＥｘｏｓｏｍｅ検出用モノクローナル抗体は、生体内Ｅｘｏｓｏｍｅ上のＣＤ９、ＣＤ６３又はＣＤ８１を良好な感度及び特異性で検出することができる。よって、例えば、疾患特異的膜タンパク質に対する抗体と組み合わせてＥｘｏｓｏｍｅの定量を行なうことにより、特定疾患の診断が可能となることから、診断薬への適用が期待される。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、免疫沈降によるＥｘｏｓｏｍｅ精製が可能であることを示し、Ｅｘｏｓｏｍｅ内のｍｉＲＮＡやタンパク質の変動を応用した診断薬の開発も期待される。
配列表の配列番号１は、Ｅｘｏｓｏｍｅ膜タンパク質ＣＤ９ポリペプチドである。
配列表の配列番号２は、Ｅｘｏｓｏｍｅ膜タンパク質ＣＤ６３ポリペプチドである。
配列表の配列番号３は、Ｅｘｏｓｏｍｅ膜タンパク質ＣＤ８１ポリペプチドである。

Claims (12)

  1. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１９として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ９−１２Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１１３〜１９５を認識し、ＣＤ９に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、
    受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２０として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−８Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、及び
    受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２１として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片
    からなる群より選ばれる、Ｅｘｏｓｏｍｅ検出又は捕捉用モノクローナル抗体。
  2. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１９として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ９−１２Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１１３〜１９５を認識し、ＣＤ９に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、
    受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２０として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−８Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、及び
    受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２１として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、
    からなる群より選ばれる同一又は二種の、抗体もしくはその抗体断片を組み合わせてなる、Ｅｘｏｓｏｍｅ検出又は捕捉に用いるための、モノクローナル抗体もしくはその抗体断片のセット。
  3. 固相抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片、標識抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片であるセット、
    固相抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片、標識抗体がＣＤ６３−１３Ｃ８抗体又はその抗体断片であるセット、
    固相抗体がＣＤ６３−８Ａ１２抗体又はその抗体断片、標識抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体又はその抗体断片であるセット、及び
    固相抗体がＣＤ６３−８Ａ１２抗体又はその抗体断片、標識抗体がＣＤ６３−１３Ｃ８抗体又はその抗体断片であるセット、
    からなる群より選ばれる、請求項２記載のセット。
  4. Ｅｘｏｓｏｍｅ検出用である、請求項２又は３記載のセット。
  5. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１９として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ９−１２Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１１３〜１９５を認識し、ＣＤ９に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、
    受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２０として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−８Ａ１２抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片、及び
    受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５２１として寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＣＤ６３−１３Ｃ８抗体）もしくはその断片であって配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０４〜２０２を認識し、ＣＤ６３に特異的な結合性を有するモノクローナル抗体断片
    からなる群より選ばれる抗体又はその抗体断片と、疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片とを組み合わせてなる、疾患特異的なＥｘｏｓｏｍｅ検出用モノクローナル抗体のセット。
  6. 請求項２〜４いずれか記載のセットのモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む、癌又は免疫系疾患の診断キット。
  7. 請求項５記載のセットのモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む、癌又は免疫系疾患の診断キット。
  8. 請求項５記載のセットを含有する、癌又は免疫系疾患の診断キット。
  9. 被検者由来の生体試料と、請求項１記載のモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅを捕捉して、該ＥｘｏｓｏｍｅのｍｉＲＮＡを検出する方法。
  10. 被検者由来の生体試料と、請求項２〜４いずれか記載のセットのモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅ複合体を形成させて、該複合体由来のシグナル強度を測定する方法。
  11. 被検者が癌又は免疫系疾患を発症しているか否かを判定するための方法であって、
    工程（Ｉ)：被検者由来の生体試料と、請求項２〜４いずれか記載のセットのモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅ複合体を形成させて、該複合体由来のシグナル強度を測定する工程、及び；
    工程（ＩＩ）：前記工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度と、対照者におけるシグナル強度とを対比して、前記被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、前記被検者が癌又は免疫系疾患を発症していると判定する工程
    を含む、癌又は免疫系疾患の判定方法。
  12. 抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価方法であって、
    工程（Ａ）：抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料と、請求項２〜４いずれか記載のセットのモノクローナル抗体とを接触させてＥｘｏｓｏｍｅ複合体を形成させて、該複合体由来のシグナル強度を測定する工程、及び；
    工程（Ｂ）：前記抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与後の被検者由来の生体試料における該複合体由来のシグナル強度が、前記抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の投与前の被検者由来の生体試料における該複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬が薬効を示している可能性が高いと判定する工程
    を含む、抗癌剤又は抗免疫系疾患薬の薬効評価方法。
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