JP5945168B2 - 組換え微生物及びそれを用いたポリ−γ−グルタミン酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸生産能を有する組換え微生物、及び当該組換え微生物を用いたポリ−γ−グルタミン酸の製造方法に関する。

ポリ−γ−グルタミン酸は、グルタミン酸のγ−位のカルボキシル基とα−位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物である。また、ポリ−γ−グルタミン酸はγ-ポリグルタミン酸と呼称される場合もある。ポリ−γ−グルタミン酸は、納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）が産生する粘性物質として知られており、種々の性質から有用な高分子素材として近年注目されている。以下の説明において、ポリ−γ−グルタミン酸をＰＧＡと略称する。

ＰＧＡを生産する微生物としては、納豆菌を含む一部のバチルス（Bacillus）属細菌とその近縁種（Bacillus subtilis var.chungkookjang、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans）や、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる。一方、納豆菌は分類学上では枯草菌の亜種であるが、枯草菌の野生型はＰＧＡ非生産性である。

納豆菌を含む多くのBacillus属細菌において、ＰＧＡ合成酵素をコードする遺伝子は、ｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子及びｐｇｓＡ遺伝子である。これらの遺伝子は、同一の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域の下流に存在し、クラスター構造（オペロン）を構成している（例えば、非特許文献１〜３参照）。例えば、納豆菌においては、ＰＧＡは、ＰｇｓＢＣＡと称される膜結合型酵素系によってリボソーム非依存的に生産される。これらＰＧＡ合成酵素系ＰｇｓＢＣＡのなかで、ＰｇｓＢ（ＹｗｓＣと別称）はグルタミン酸におけるγ−位のカルボキシル基に作用するアミドリガーゼ反応に関与することが知られている（例えば、非特許文献１及び４参照）。ＰｇｓＣ（ＹｗｔＡと別称）は膜結合型タンパク質で、ＰＧＡの細胞外への排出に関与すること（非特許文献１）、ＰｇｓＢと共存してグルタミン酸の連結反応に関わっていること（非特許文献４及び５）が推定されている。また、ＰｇｓＡ（ＹｗｔＢと別称）は、ＰＧＡの排出に関わると推定されている（非特許文献４及び５）。さらに、納豆菌のＰＧＡ産生制御機構は、枯草菌の形質転換能獲得機構と同様に、細胞内の多くの制御因子が関与する複雑な制御を受けていると推察されている（例えば、非特許文献６及び７参照）。

上述の非特許文献１では、ＰＧＡ生産能を有する納豆菌（ＩＦＯ１６４４９株）において、ｐｇｓＢ遺伝子（ｙｗｓＣ遺伝子と別称）欠損株、ｐｇｓＣ遺伝子（ｙｗｔＡ遺伝子と別称）欠損株及びｐｇｓＡ遺伝子（ｙｗｔＢ遺伝子と別称）欠損株を構築し、それぞれの欠損株におけるＰＧＡ生産能を検証している。非特許文献１では、ＰＧＡ生産能を有する納豆菌において、ＰＧＡ生産にはｐｇｓＢ遺伝子及びｐｇｓＣ遺伝子が必須であり、さらに最大のＰＧＡ高生産を得るためにはｐｇｓＡ遺伝子が必要であると推論されている。非特許文献８には、染色体上のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子及びｐｇｓＡ遺伝子を欠損した枯草菌に、ｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子及びｐｇｓＡ遺伝子から選ばれる遺伝子を単独で若しくは複数組み合わせて発現するベクターを導入した変異株においてＰＧＡの生産性を調べた結果が報告されている。非特許文献８では、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡの全ての遺伝子が発現しなければＰＧＡが生産されないと結論されている。

他方、特許文献１には、枯草菌野生株にｐｇｓＢ遺伝子及びｐｇｓＣ遺伝子が連結されたベクターを導入して得られた組換え株が高いＰＧＡ生産性を有すること、一方で、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡの全ての遺伝子が連結されたベクターを導入して得られた組換え株ではＰＧＡ生産性が低いことが記載されている。さらに特許文献１には、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣに相当する、枯草菌以外の微生物に由来するｐｇｓＢ、ｐｇｓＣを枯草菌株に導入した場合にも同様の効果が得られることが示されている。また特許文献２には、ａｃｋＡ遺伝子、ａｃｏＡ遺伝子、ａｃｏＢ遺伝子等から選ばれる１以上の遺伝子が欠失又は不活性化されている宿主枯草菌株にｐｇｓＢ遺伝子及びｐｇｓＣ遺伝子が連結されたベクターを導入して得られた組換え株は、同じ宿主株にｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡの全ての遺伝子が連結されたベクターを導入して得られた組換え株と比べて、ＰＧＡ生産性が高いことが記載されている。

特許文献３には、ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌変異株が、酵素の生産性に優れていることが記載されている。しかし、当該変異株においては、プロテアーゼ等の生産性は顕著に向上しているが、一方、アミラーゼの生産性は、欠失させた領域によっては低下する場合のあることが示されている。

特開２００９−０８９７０８号公報 特開２０１０−２１３６６４号公報 特開２００７−１３００１３号公報

J. Bacteriol., 2002, 184:337-343 Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 263:6-12 Microbiology, 1997, 143:3313-3328 Eur. J. Biochem., 2001, 268:5321-5328 未来材料, 2003, 3:44-50 Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63:2034-2037 微生物利用の大展開, 第１章４節, 2002, pp.657-663 Biosci. Biotechnol. Biochem., 2006, 70:1794-1797

本発明は、ＰＧＡを高生産することができる組換え微生物、当該微生物の製造方法、及び当該微生物を用いたＰＧＡの製造方法に関する。

本発明者は、ＰＧＡを効率良く生産することができる微生物株の開発を進めた。その結果、本発明者は、野生株に比べてゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子及びｐｇｓＣ遺伝子を導入し、但し枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子は導入しないで得られた組換え枯草菌株が、顕著に高いＰＧＡ生産能を有することを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、以下に係るものである。
（１）組換え枯草菌であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上が欠失したゲノムを有し、且つ、
枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とが導入されており、但し、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子は導入されていない、
組換え枯草菌。
（２）上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかである、（１）記載の組換え枯草菌：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と６０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（３）上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の（ａ'）〜（ｆ'）のいずれかである、（１）又は（２）記載の組換え枯草菌：
（ａ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号３に示す塩基配列と５５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号４に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（４）上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の組換え枯草菌。
（５）上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、（１）〜（４）のいずれか１に記載の組換え枯草菌。
（６）上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、（１）〜（５）のいずれか１に記載の組換え枯草菌。
（７）組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入する工程を含み、但し、当該枯草菌変異株に枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入する工程を含まない、方法。
（８）上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかである、（７）記載の方法：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と６０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（９）上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の（ａ'）〜（ｆ'）のいずれかである、（７）又は（８）記載の方法：
（ａ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号３に示す塩基配列と５５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号４に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１０）上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子、及び上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、（７）〜（９）のいずれか１に記載の方法。
（１１）上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、（７）〜（１０）のいずれか１に記載の方法。
（１２）上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、（７）〜（１１）のいずれか１に記載の方法。
（１３）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の組換え枯草菌を用いるポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。

本発明の組換え枯草菌は高いＰＧＡ生産能を有する。本発明の組換え枯草菌を用いることによりＰＧＡを効率良く製造することが可能になる。

枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。 枯草菌ゲノムから外来薬剤耐性遺伝子を除去する手順を示す模式図。 ＰＧＡの合成に関与する遺伝子群のクローニング工程の一例を説明するためのＰＧＡ組換え生産用ベクターの構築フロー。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又は塩基の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、１〜１２個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個であり得る。また本明細書において、アミノ酸又は塩基の「付加」には、配列の一末端及び両末端への１〜数個のアミノ酸の又は塩基の付加が含まれる。

本明細書において、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件下」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の条件が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン***ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件であり得る。

本明細書において、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、遺伝子の翻訳開始点からの上流領域及び下流領域には限定されない。

本明細書において、転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７１，１３４２−１３４６，１９７４）。

本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（bacillus.genome.ad.jp/、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。

本発明の組換え枯草菌は、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株を親株（宿主）として用い、当該親株に、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入することによって作製される。但し、本発明の組換え枯草菌には、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子は導入されていない。

上記親株として用いられる枯草菌変異株は、枯草菌野生株（Bacillus subtilis Marburg No.168；本明細書において以下、枯草菌１６８株又は単に１６８株、あるいは野生株と称する）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の１以上が欠失している。好ましくは、当該親株としては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の全てを欠失している枯草菌変異株が挙げられる。このような枯草菌変異株の例としては、特開２００７−１３００１３号公報に記載の枯草菌ＭＧＢ８７４株が挙げられる。あるいは、当該枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株のゲノム領域から、さらに遺伝子又はゲノム領域を欠失させた枯草菌変異株を親株としてもよい。

上記親株は、例えば、１６８株等の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノムを、公開されている枯草菌１６８株のゲノムと対比することにより決定することができる。枯草菌１６８株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のＢＳＯＲＦ ＤＢ、又はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335）から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、１又は数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個）の塩基における天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において５０％以上同一、好ましくは６０％以上同一、より好ましくは７０％以上同一、さらに好ましくは８０％以上同一、さらにより好ましくは９０％以上同一、なお好ましくは９５％以上同一なゲノム領域であり得る。

あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表１記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばＳＯＥ−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）等により調製された欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開２００７−１３００１３号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。

ＳＯＥ−ＰＣＲ法による欠失用ＤＮＡ断片の調製と当該欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図１に示す。初めに、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したＤＮＡ断片を調製する。

まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片（図１中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Ｃｍ）の３断片を調製する。上流断片及び下流断片のＰＣＲ増幅の際には、後に連結される断片の末端１０〜３０塩基対の配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で連結させる場合、上流断片Ａの下流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０塩基に相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０塩基に相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ’の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ’の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。

次に、１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ’、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ’を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に位置する（アニールする）プライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に位置する（アニールする）プライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる。

上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用ＤＮＡ断片を調製した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。

上記手順で構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で２重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、形質転換処理をした菌を、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。

次に、得られた形質転換体から、さらにゲノムＤＮＡに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図２に示すような２段階相同組換え法を用いることができる。当該方法では、初めに第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（下流断片）が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したＤＮＡ断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第１のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第２のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図２を参照）。

次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第１のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した第２のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第２のマーカー遺伝子、第１のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図２参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第１のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。

ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第１のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。例えば、ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ，１９７０）。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第２のマーカーとしてchpA遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる（特開２００９-２５４３５０号公報を参照）。

以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。

本発明の組換え枯草菌は、上述した親株に、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入することにより得ることができる。但し、本発明の組換え枯草菌には、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子は導入されていない。上記遺伝子が導入された本発明の組換え枯草菌は、優れたＰＧＡ産生能を有する。

上記枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子、又はそれらに相当する遺伝子とは、ＰＧＡ合成に関与することができるバチルス属菌または他の微生物由来の遺伝子であり得る。例えば、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子は、ｙｗｓＣ遺伝子又はｃａｐＢ遺伝子とも称され、上述のＢＳＯＲＦにＢＧ１２５３１として登録されている遺伝子であり得る。枯草菌ｐｇｓＣ遺伝は、ｙｗｔＡ遺伝子又はｃａｐＣ遺伝子とも称され、上述のＢＳＯＲＦにＢＧ１２５３２として登録されている遺伝子であり得る。枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子は、ｙｗｔＢ遺伝子又はｃａｐＡ遺伝子とも称され、上述のＢＳＯＲＦにＢＧ１２５３３として登録されている遺伝子であり得る。これらの遺伝子は、染色体上でクラスター構造（オペロン）を構成していることが知られている（非特許文献１〜３参照）。

上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子、又は当該ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；及び、配列番号１に示す塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

また、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子、又は当該ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

さらに、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子、又は当該ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び、配列番号２に示すアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子、又は当該ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；及び、配列番号３に示す塩基配列と５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

また、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子、又は当該ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

さらに、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子、又は当該ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び、配列番号４に示すアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

上記枯草菌ｐｇｓＡ伝子、又は当該ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；及び、配列番号５に示す塩基配列と４５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との共存下、ＰＧＡ合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

また、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子、又は当該ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との共存下、ＰＧＡ合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

さらに、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子、又は当該ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との共存下、ＰＧＡ合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び、配列番号６に示すアミノ酸配列と３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との共存下、ＰＧＡ合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

本明細書において、タンパク質の「アミドリガーゼ活性」は、グルタミン酸及びＡＴＰ又はＧＴＰを基質とし、これに塩化マンガン加えた反応溶液中におけるＰＧＡの生成を検出することにより測定することができる（Ｕｒｕｓｈｉｂａｔａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４，３３７−３４３，２００２）。

あるいは、上述のｐｇｓＢ又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「アミドリガーゼ活性」とは、当該ｐｇｓＢ又はその相当遺伝子を、上記ｐｇｓＣ又はその相当遺伝子とともに上述した親株に導入した際に、当該株におけるＰＧＡの生産と菌体外への分泌をもたらす能力であり得る。所定の微生物におけるＰＧＡ生産能の評価は、例えばグルタミン酸又はその塩を含有するＰＧＡ生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＰＧＡを検出する方法（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，２５５−２５８，１９９６）、酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法（Ｏｇａｗａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，１６８４−１６８７，１９９７）、培養液から精製し乾燥重量を求める定量法（Ａｓｈｉｕｃｈｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６３，６−１２，１９９９）、ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法（Ｋｕｂｏｔａ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，１２１２−１２１３，１９９３）等によって行うことができる。

また本明細書において、上述のｐｇｓＣ又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能」とは、上述の親株にて上記ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子とともに当該ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子を発現させた際に、当該株にＰＧＡを生産させる能力であり得る。このことは、ｐｇｓＢ遺伝子を単独で発現させた株ではＰＧＡが生産されず、ｐｇｓＢ遺伝子とともにｐｇｓＣ遺伝子を発現させた株ではＰＧＡが生産されるという本発明者らが見出した知見に基づいている。

さらに、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子は、微生物から通常の方法に従って同定することができる。上記微生物は、ＰＧＡ生産能を有する微生物でもＰＧＡ非生産微生物でもよい。ＰＧＡ生産能を有する微生物としては、Bacillus subtilisの他に、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus pumilus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる。ＰＧＡ非生産微生物としては、Oceanobacillus iheyensis等を挙げることができる。ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ又はｐｇｓＡに相当する遺伝子は、例えば、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、上記配列番号１、３又は５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、又はｐｇｓＡ遺伝子のヌクレオチド配列とを比較することによって、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ又はｐｇｓＡに相当する遺伝子を同定することができる。

例えば、Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１４５８０株、Bacillus amyloliquefacience ＦＺＢ４２株、及びOceanobacillus iheyensis ＨＴＥ８３１株由来のｐｇｓＢ遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＢ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ９９．９％、７９％、８２％及び６２％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９９．７％、９０％、９３％及び５５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子であり得る（特開２０１０−２１３６６４号公報）。
また例えば、Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１４５８０株、Bacillus amyloliquefacience ＦＺＢ４２株、及びOceanobacillus iheyensis ＨＴＥ８３１株由来のｐｇｓＣ遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＣ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ１００％、７８％、８４％及び５９％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ１００％、９０％、９４％及び５１％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子であり得る（特開２０１０−２１３６６４号公報）。
また例えば、Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１４５８０株、Bacillus amyloliquefacience ＦＺＢ４２株、及びOceanobacillus iheyensis ＨＴＥ８３１株由来のｐｇｓＡ遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＡ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ１００％、６９％、７５％及び４９％であり、またそのアミノ酸配列においてそれぞれ１００％、６７％、７９％及び３０％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子であり得る（特開２０１０−２１３６６４号公報）。

上記枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ又はｐｇｓＡに相当する遺伝子の好適な例としては、表２に示す塩基配列からなる遺伝子や、表２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。具体的には、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号９、１５、２１又は２７に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号８、１４、２０又は２６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）が挙げられる。

また、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号１１、１７、２３又は２９に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つＰｇｓＢタンパク質の共存下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１０、１６、２２又は２８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）が挙げられる。

また、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列又はそれぞれのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つＰｇｓＢ及びＰｇｓＣタンパク質との共存下でポリ−γ−グルタミン酸合成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１２、１８、２４又は３０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）が挙げられる。

上記ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の宿主への導入には、プラスミド等の通常のベクターを使用することができる。当該ベクターの種類は、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。また当該ベクターは、宿主内で自己複製可能なベクター（例えばプラスミド）であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が宿主ゲノム（染色体）に対し、２以上１００コピー以下であれば良く、好ましくは２以上５０コピー以下、より好ましくは２以上３０コピー以下であれば良い。好ましいプラスミドの例としては、例えば、ｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

好ましくは、親株に導入される枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の上流には、当該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている。当該制御領域としては、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が挙げられる。当該制御領域は、好ましくは、宿主内における下流の遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する。当該制御領域の例としては、バチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が例示されるが、特に限定されない。

本明細書において「制御領域と作動可能に連結された遺伝子」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されている遺伝子をいう。

好ましい例として、Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点の上流０．４〜１．０ｋｂ領域の塩基配列を配列番号７に示す。また好ましい制御領域としては、配列番号７に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列が挙げられる。

上記ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子、あるいは上記制御領域のベクターへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、上記ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子、及び制御領域の断片をＰＣＲ等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミド等のベクターに挿入し、連結すればよい。あるいは、上記遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミド等のベクターに挿入してもよい。その際、ベクター上において、上流から制御領域断片、ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子の断片、ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の断片の順で連結されているようにする。

構築された目的遺伝子を含むベクターは、通常の手法、例えばプロトプラスト法（Ｃｈａｍｇ Ｓ．＆Ｃｏｈｅｎ，ＳＨ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１−１１５，１９７９）やコンピテントセル法（Ｙｏｕｎｇ ＦＥ．＆Ｓｐｉｚｉｚｅｎ Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，８６，３９２−４００，１９６３）により、宿主に導入され得る。

以上の手順で、ゲノムの大領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とが導入された、本発明の組換え枯草菌を作製することができる。本発明の組換え枯草菌は高いＰＧＡ生産能を有しているので、当該本発明の組換え枯草菌を用いることにより、ＰＧＡを効率よく製造することが可能になる。したがって、本発明の別の態様は、上述した本発明の組換え枯草菌を用いるＰＧＡの製造方法に関する。

本発明のＰＧＡの製造方法においては、先ず、適切な培地において上記本発明の組換え枯草菌を培養し、菌体外に生産されたＰＧＡを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。当該培地は、合成培地であっても天然培地であってもよい。

ＰＧＡの生産性をより向上させるためには、本発明の組換え枯草菌が生育に最低限必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地で、当該組換え枯草菌を培養することが好ましい。グルタミン酸は、培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度（グルタミン酸換算）は、例えば培地中、好ましくは０．００５〜６００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜４００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜３００ｇ／Ｌであり得る。培地中のグルタミン酸濃度は、ＰＧＡの生産性向上の点から、０．００５ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、他方、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分の析出を回避する点から、グルタミン酸濃度６００ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。

培養条件として、至適温度は、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃である。至適ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、より好ましくは５〜８である。また、培養日数は、菌接種後、好ましくは１〜１０日間であり、より好ましくは２〜５日間である。培養は、特に限定されないが、振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養などが挙げられる。

培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際には、ＰＧＡを生産させた菌体と分離する必要がある。ＰＧＡを分離する手段としては、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、ｐＨをＰＧＡの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法、さらに上記手法の組み合わせ等が挙げられる。

本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、あるいは用途を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

＜１＞組換え枯草菌であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上が欠失したゲノムを有し、且つ、
枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とが導入されており、但し、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子は導入されていない、組換え枯草菌。

＜２＞上記ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有する、＜１＞記載の組換え枯草菌。

＜３＞上記各領域が上述の表１記載の各ヌクレオチドセットによって挟み込まれる領域である、＜１＞又は＜２＞記載の組換え枯草菌。

＜４＞上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の組換え枯草菌：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と６０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

＜５＞上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の（ａ'）〜（ｆ'）のいずれかである、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の組換え枯草菌
（ａ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号３に示す塩基配列と５５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号４に示すアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

＜６＞上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の組換え枯草菌。

＜７＞上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の組換え枯草菌。

＜８＞上記自己複製可能なベクターがｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、又はｐＨＹ３００ＰＬＫである、＜７＞記載の組換え枯草菌。

＜９＞上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、＜１＞〜＜８＞のいずれか１記載の組換え枯草菌。

＜１０＞上記制御領域がバチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域である、＜９＞記載の組換え枯草菌。

＜１１＞上記Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が配列番号７に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列である＜１０＞記載の組換え枯草菌。

＜１２＞上記Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が配列番号７に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、且つ当該制御領域と同等の機能を有する塩基配列である＜１０＞記載の組換え枯草菌。

＜１３＞＜１＞〜＜１２＞のいずれか１記載の組換え枯草菌を用いるポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

（製造例１）ベクターの構築
本製造例は、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示す（図３参照）。
まず、Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、表３に示したP-S237/BSpgsB atg FW（配列番号３２）及びHindIII_BSpgsBC RV（配列番号３３）のプライマーセットを用いてｐｇｓＢＣ遺伝子１．７ｋｂのＤＮＡ断片（ＢＣ）をそれぞれ調製した。Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株のｐｇｓＢ遺伝子の塩基配列を配列番号８に、上記ｐｇｓＢ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号９に、ｐｇｓＣ遺伝子の塩基配列を配列番号１０に、上記ｐｇｓＣ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。さらに、Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、表３に示したCm_S237 FW（配列番号３４）とP_S237-RV（配列番号３５）のプライマーセットを用いて、ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）プロモーター領域０．６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ＿Ｓ２３７）（配列番号７）を調製した。

次に、断片（Ｐ＿Ｓ２３７）及び（ＢＣ）を鋳型とし、Cm_S237 FWとHindIII_BSpgsBC RVとのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲ法にて（Ｐ＿Ｓ２３７）及び（ＢＣ）を１断片化した２．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ＿ＢＣ）を得た。続いて、このＤＮＡ断片（Ｐ＿ＢＣ）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理し、それぞれを同様の制限酵素処理を施したプラスミドベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）とＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いてライゲーション反応（結合化）を行なった。

上記ライゲーション試料を用いて、大腸菌（ＨＢ１０１株）をコンピテントセル法にて形質転換し、テトラサイクリン−塩酸塩（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を１５ｐｐｍ添加したＬＢ寒天培地（ＬＢＴｃ寒天培地）上に出現したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を再度ＬＢＴｃ寒天培地にて生育させ、得られた菌体からハイピュア プラスミドアイソレーションキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス）を用い組換えプラスミドを調製した。これらを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラスミドベクター上のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位に目的とする上記ＤＮＡ断片（Ｐ＿ＢＣ）が挿入していることを確認した。
ＤＮＡ断片（Ｐ＿ＢＣ）の挿入が確認できた組換えプラスミドをＰＧＡ組換え生産用ベクターｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣとした。本製造例において、ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、キット添付のプロトコールに従い実施した。

（実施例１）ｐｇｓＢＣが導入された組換え枯草菌の作製
枯草菌１６８株、及び枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株（特開２００７−１３００１３号公報）を宿主とした。
製造例１で構築したＰＧＡ組換え生産用ベクターｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣを用いて、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１，１９７９）により両宿主を形質転換した。テトラサイクリン−塩酸塩５０ｐｐｍを添加したＤＭ３プロトプラスト再生培地（０．５Ｍコハク酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、０．５％カザミノ酸（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、０．３５％ Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．１５％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．５％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ社製）、１％バクト寒天（ディフコ社製））上に生育したコロニーを目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。
以上の手順により、枯草菌１６８株及びＭＧＢ８７４株にBacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１）のプロモーター領域及びBacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）由来のｐｇｓＢ及びｐｇｓＣ遺伝子を導入した株を得た。

（実施例２）ＰＧＡ生産性評価（１）
実施例１にて得られた形質転換体を１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含む５ｍＬのＬＢ培地（１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ＮａＣｌ）で３０℃において１５時間振盪培養を行い、さらにこの培養液に、ＯＤ≒０．０５になるように３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース＋ＭＳＧ培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース、８％グルタミン酸ナトリウム１水和物、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行った（Ｎ＝５）。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量及び分子量を測定した。ＰＧＡ生産量は、プラスミドｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣＡを導入した枯草菌１６８株（特開２００９−８９７０８号公報）におけるＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。

結果を表４及び表５に示す。ＭＧＢ８７４株にｐｇｓＢＣを導入した組換え枯草菌は、培養２日目及び３日目において、１６８株からの組換え枯草菌と比較してＰＧＡ生産量が高かった（表４）。また、特開２０１０−２１３６６４号公報に記載の１遺伝子欠失株（例えばΔｃｏｄ株）と比べても、高いＰＧＡ生産性を有していた。さらに、ＭＧＢ８７４
株にｐｇｓＢＣを導入した組換え枯草菌は、１６８株からの組換え枯草菌と比較して、培養１日目ではより高分子量のＰＧＡを生産し、培養２日目及び３日目ではより低分子量のＰＧＡを生産した（表５）。

（実施例３）ＰＧＡ生産性評価（２）
実施例１にて得られた形質転換体を１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含む５ｍＬのＬＢ培地で３０℃において１５時間振盪培養を行い、さらにこの培養液にＯＤ≒０．０５になるようにＭ培地（Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996, 60:1239-1242）にグルタミン酸ナトリウム１水和物（ＭＳＧ）を添加した培地（１０％グルコース、１．８％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、３％炭酸カルシウム、その他微量金属、８％グルタミン酸ナトリウム１水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）３０ｍLに接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行った（Ｎ＝５）。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量及び分子量を測定した。ＰＧＡ生産量は、プラスミドｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣを導入した枯草菌１６８株（特開２００９−８９７０８号公報）におけるＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。

結果を表６及び表７に示す。ＭＧＢ８７４株にｐｇｓＢＣを導入した組換え枯草菌は、１６８株からの組換え枯草菌と比較してＰＧＡ生産量が高かった（表６）。またＭＧＢ８７４株にｐｇｓＢＣを導入した組換え枯草菌は、１６８株からの組換え枯草菌と比較して、より高分子量のＰＧＡを生産した（表７）。

（測定例）ＰＧＡの定量分析及び分子量分析
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＰＧＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量分析及び分子量分析を行った。使用したＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる２種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界＞５×１０⁷）及びＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界１×１０⁶）を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムＴＳＫ ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＰＷＸＬ（６．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×４．０ｃｍ）を接続した。溶離液には０．１Ｍ硫酸ナトリウム、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度は５０℃、溶出ピークの検出波長は２１０ｎｍを用いた。試料注入量はサンプルループ（レオダイン）を用い、１分析あたり２０μＬとした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてＭＵＬＴＩ ＳＣＲＥＥＮ ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量８０万のＰＧＡ（明治フードマテリアル）を用いて検量線を作成した。さらに、分子量検定には、プルラン Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＲＤ Ｐ−８２（昭和電工）を用いて予め重量平均分子量を求めた各種分子量の異なるポリグルタミン酸（和光純薬工業：１６２−２１４１１及び１６２−２１４０１、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ：Ｐ−４８８６及びＰ−４７６１、明治フードマテリアル：分子量８８万）を用いた。

Claims (9)

1. 組換え枯草菌であって、
   ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有し、
   枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とが導入されており、但し、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子は導入されておらず、
   該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下：
   配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号９、１５、２１又は２７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号９、１５、２１又は２７に示すアミノ酸配列において１〜１２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   のいずれかであり、
   該枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下：
   配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   配列番号３に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号４に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号１１、１７、２３又は２９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号１１、１７、２３又は２９に示すアミノ酸配列において１〜１２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子がコードするタンパク質の共存下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   のいずれかであり、且つ、
   該枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下：
   配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   配列番号５に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と該枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子との共存下、ポリ−γ−グルタミン酸合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号６に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と該枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子との共存下、ポリ−γ−グルタミン酸合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列において１〜１２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子がコードするタンパク質及び該枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子がコードするタンパク質との共存下でポリ−γ−グルタミン酸合成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   のいずれかである、
   組換え枯草菌。
2. 前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、請求項１記載の組換え枯草菌。
3. 前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、請求項１又は２記載の組換え枯草菌。
4. 前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え枯草菌。
5. 組換え枯草菌の製造方法であって、
   ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入する工程を含み、但し、当該枯草菌変異株に枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入する工程を含まず、
   該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下：
   配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号９、１５、２１又は２７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号９、１５、２１又は２７に示すアミノ酸配列において１〜１２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   のいずれかであり、
   該枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下：
   配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   配列番号３に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号４に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号１１、１７、２３又は２９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号１１、１７、２３又は２９に示すアミノ酸配列において１〜１２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子がコードするタンパク質の共存下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   のいずれかであり、且つ、
   該枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下：
   配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   配列番号５に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と該枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子との共存下、ポリ−γ−グルタミン酸合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号６に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と該枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子との共存下、ポリ−γ−グルタミン酸合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号１３、１９、２５又は３１に示すアミノ酸配列において１〜１２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子がコードするタンパク質及び該枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子がコードするタンパク質との共存下でポリ−γ−グルタミン酸合成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   のいずれかである、
   方法。
6. 前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、請求項５記載の方法。
7. 前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、請求項５又は６記載の方法。
8. 前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 請求項１〜４のいずれか１項記載の組換え枯草菌を用いるポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。