JP5945168B2 - 組換え微生物及びそれを用いたポリ−γ−グルタミン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)組換え枯草菌であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上が欠失したゲノムを有し、且つ、
枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とが導入されており、但し、枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子は導入されていない、
組換え枯草菌。
(2)上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の(a)〜(f)のいずれかである、(1)記載の組換え枯草菌:
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と60%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)上記枯草菌pgsC遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の(a')〜(f')のいずれかである、(1)又は(2)記載の組換え枯草菌:
(a')配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号3に示す塩基配列と55%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c')配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d')配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e')配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f')配列番号4に示すアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(4)上記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、上記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び上記枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、(1)〜(3)のいずれか1に記載の組換え枯草菌。
(5)上記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、上記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、(1)〜(4)のいずれか1に記載の組換え枯草菌。
(6)上記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、(1)〜(5)のいずれか1に記載の組換え枯草菌。
(7)組換え枯草菌の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入する工程を含み、但し、当該枯草菌変異株に枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入する工程を含まない、方法。
(8)上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の(a)〜(f)のいずれかである、(7)記載の方法:
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と60%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(9)上記枯草菌pgsC遺伝子又はそれに相当する遺伝子が以下の(a')〜(f')のいずれかである、(7)又は(8)記載の方法:
(a')配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号3に示す塩基配列と55%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c')配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d')配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e')配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f')配列番号4に示すアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(10)上記枯草菌pgsB遺伝子に相当する遺伝子、上記枯草菌pgsC遺伝子に相当する遺伝子、及び上記枯草菌pgsA遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、(7)〜(9)のいずれか1に記載の方法。
(11)上記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び上記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、(7)〜(10)のいずれか1に記載の方法。
(12)上記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、(7)〜(11)のいずれか1に記載の方法。
(13)上記(1)〜(6)のいずれか1に記載の組換え枯草菌を用いるポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
また例えば、Bacillus sp.KSM−366株(FERM BP−6262)、Bacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株、及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsC遺伝子は、枯草菌168株のpgsC遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ100%、78%、84%及び59%であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ100%、90%、94%及び51%である。これらは、枯草菌pgsC遺伝子に相当する遺伝子であり得る(特開2010−213664号公報)。
また例えば、Bacillus sp.KSM−366株(FERM BP−6262)、Bacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株、及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsA遺伝子は、枯草菌168株のpgsA遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ100%、69%、75%及び49%であり、またそのアミノ酸配列においてそれぞれ100%、67%、79%及び30%である。これらは、枯草菌pgsA遺伝子に相当する遺伝子であり得る(特開2010−213664号公報)。
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上が欠失したゲノムを有し、且つ、
枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とが導入されており、但し、枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子は導入されていない、組換え枯草菌。
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と60%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(a')配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号3に示す塩基配列と55%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c')配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d')配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e')配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f')配列番号4に示すアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本製造例は、PGA合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示す(図3参照)。
まず、Bacillus sp.KSM−366株(FERM BP−6262)から調製した染色体DNAを鋳型とし、表3に示したP-S237/BSpgsB atg FW(配列番号32)及びHindIII_BSpgsBC RV(配列番号33)のプライマーセットを用いてpgsBC遺伝子1.7kbのDNA断片(BC)をそれぞれ調製した。Bacillus sp.KSM−366株のpgsB遺伝子の塩基配列を配列番号8に、上記pgsB遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号9に、pgsC遺伝子の塩基配列を配列番号10に、上記pgsC遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号11に示す。さらに、Bacillus sp.KSM−S237株(FERM BP−7875)から調製した染色体DNAを鋳型とし、表3に示したCm_S237 FW(配列番号34)とP_S237-RV(配列番号35)のプライマーセットを用いて、KSM−S237株由来のセルラーゼ遺伝子(特開2000−210081号公報参照)プロモーター領域0.6kbのDNA断片(P_S237)(配列番号7)を調製した。
DNA断片(P_BC)の挿入が確認できた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクターpHY_PS237/pgsBCとした。本製造例において、PCR反応はGeneAmp9700(PE Applied Biosystems)とTaKaRa LA Taq(Takara)を用い、キット添付のプロトコールに従い実施した。
枯草菌168株、及び枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株MGB874株(特開2007−130013号公報)を宿主とした。
製造例1で構築したPGA組換え生産用ベクターpHY_PS237/pgsBCを用いて、プロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.,168,111,1979)により両宿主を形質転換した。テトラサイクリン−塩酸塩50ppmを添加したDM3プロトプラスト再生培地(0.5Mコハク酸ナトリウム(pH7.3)、0.5%カザミノ酸(ディフコ社製)、0.5%酵母エキス(ディフコ社製)、0.35% K2HPO4、0.15% KH2PO4、0.5%グルコース、20mM MgCl2、0.01%牛血清アルブミン(シグマ社製)、1%バクト寒天(ディフコ社製))上に生育したコロニーを目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。
以上の手順により、枯草菌168株及びMGB874株にBacillus sp.KSM−S237株(FERM BP−7875)由来のセルラーゼ遺伝子(特開2000−210081)のプロモーター領域及びBacillus sp.KSM−366株(FERM BP−6262)由来のpgsB及びpgsC遺伝子を導入した株を得た。
実施例1にて得られた形質転換体を15ppmのテトラサイクリンを含む5mLのLB培地(1.0%トリプトン(ディフコ社製)、0.5%酵母エキス(ディフコ社製)、1.0%NaCl)で30℃において15時間振盪培養を行い、さらにこの培養液に、OD≒0.05になるように30mLの2×L−マルトース+MSG培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、8%グルタミン酸ナトリウム1水和物、7.5ppm硫酸マンガン4−5水和物、15ppmテトラサイクリン)に接種し、37℃、210rpmで3日間、振盪培養を行った(N=5)。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてPGA生産量及び分子量を測定した。PGA生産量は、プラスミドpHY_PS237/pgsBCAを導入した枯草菌168株(特開2009−89708号公報)におけるPGA生産量を100%とした場合の相対値で示した。
株にpgsBCを導入した組換え枯草菌は、168株からの組換え枯草菌と比較して、培養1日目ではより高分子量のPGAを生産し、培養2日目及び3日目ではより低分子量のPGAを生産した(表5)。
実施例1にて得られた形質転換体を15ppmのテトラサイクリンを含む5mLのLB培地で30℃において15時間振盪培養を行い、さらにこの培養液にOD≒0.05になるようにM培地(Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996, 60:1239-1242)にグルタミン酸ナトリウム1水和物(MSG)を添加した培地(10%グルコース、1.8%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、3%炭酸カルシウム、その他微量金属、8%グルタミン酸ナトリウム1水和物、15ppmテトラサイクリン)30mLに接種し、37℃、210rpmで3日間、振盪培養を行った(N=5)。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてPGA生産量及び分子量を測定した。PGA生産量は、プラスミドpHY_PS237/pgsBCを導入した枯草菌168株(特開2009−89708号公報)におけるPGA生産量を100%とした場合の相対値で示した。
培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間の遠心分離(日立工機、himacCF15RX)に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるPGAについて、HPLC法にて定量分析及び分子量分析を行った。使用したHPLC装置は、送液ポンプ(島津、LC−9A)、オートサンプラー(日立計測機器、AS−2000)、カラムオーブン(島津、CTO−6A)、UV検出計(島津、SPD−10A)、脱ガス装置(GLサイエンス、DG660B)及びクロマトデータ解析装置(日立計測機器、D−2500)を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる2種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムTSKgel G6000PWXL(7.8mm I.D.×30cm、排除限界>5×107)及びTSKgel G4000PWXL(7.8mm I.D.×30cm、排除限界1×106)を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムTSK guardcolumn PWXL(6.0mm I.D.×4.0cm)を接続した。溶離液には0.1M硫酸ナトリウム、流速1.0mL/分、カラム温度は50℃、溶出ピークの検出波長は210nmを用いた。試料注入量はサンプルループ(レオダイン)を用い、1分析あたり20μLとした。HPLC分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてMULTI SCREEN MNHV45(MILLIPORE製、0.45μmデュラポア膜)にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量80万のPGA(明治フードマテリアル)を用いて検量線を作成した。さらに、分子量検定には、プルラン Shodex STANRD P−82(昭和電工)を用いて予め重量平均分子量を求めた各種分子量の異なるポリグルタミン酸(和光純薬工業:162−21411及び162−21401、SIGMA−ALDRICH:P−4886及びP−4761、明治フードマテリアル:分子量88万)を用いた。
Claims (9)
- 組換え枯草菌であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域が欠失したゲノムを有し、
枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とが導入されており、但し、枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子は導入されておらず、
該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下:
配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
配列番号1に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号2に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号9、15、21又は27に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号9、15、21又は27に示すアミノ酸配列において1〜12個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
のいずれかであり、
該枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下:
配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
配列番号3に示す塩基配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号11、17、23又は29に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号11、17、23又は29に示すアミノ酸配列において1〜12個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌pgsB遺伝子がコードするタンパク質の共存下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
のいずれかであり、且つ、
該枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下:
配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
配列番号5に示す塩基配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と該枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子との共存下、ポリ−γ−グルタミン酸合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号6に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と該枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子との共存下、ポリ−γ−グルタミン酸合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
配列番号13、19、25又は31に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号13、19、25又は31に示すアミノ酸配列において1〜12個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌pgsB遺伝子がコードするタンパク質及び該枯草菌pgsC遺伝子がコードするタンパク質との共存下でポリ−γ−グルタミン酸合成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
のいずれかである、
組換え枯草菌。 - 前記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、前記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、請求項1記載の組換え枯草菌。
- 前記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、請求項1又は2記載の組換え枯草菌。
- 前記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と前記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、請求項1〜3のいずれか1項記載の組換え枯草菌。
- 組換え枯草菌の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株に、枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とを導入する工程を含み、但し、当該枯草菌変異株に枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を導入する工程を含まず、
該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下:
配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
配列番号1に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号2に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号9、15、21又は27に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号9、15、21又は27に示すアミノ酸配列において1〜12個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
のいずれかであり、
該枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下:
配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
配列番号3に示す塩基配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号11、17、23又は29に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号11、17、23又は29に示すアミノ酸配列において1〜12個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌pgsB遺伝子がコードするタンパク質の共存下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
のいずれかであり、且つ、
該枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、以下:
配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
配列番号5に示す塩基配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と該枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子との共存下、ポリ−γ−グルタミン酸合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号6に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と該枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子との共存下、ポリ−γ−グルタミン酸合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
配列番号13、19、25又は31に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
配列番号13、19、25又は31に示すアミノ酸配列において1〜12個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ該枯草菌pgsB遺伝子がコードするタンパク質及び該枯草菌pgsC遺伝子がコードするタンパク質との共存下でポリ−γ−グルタミン酸合成能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
のいずれかである、
方法。 - 前記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、前記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記枯草菌pgsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、バチルス属菌の遺伝子である、請求項5記載の方法。
- 前記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が、組換え枯草菌で自己複製可能なベクターに組み込まれている、請求項5又は6記載の方法。
- 前記枯草菌pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と前記枯草菌pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、該遺伝子の発現を正的に制御する制御領域が作動可能に連結されている、請求項5〜7のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の組換え枯草菌を用いるポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
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